CN104789500B - 一种鸡白痢染色凝集抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸡白痢染色凝集抗原及其制备方法和应用，属于兽医诊断技术领域。该抗原是将鸡白痢沙门氏菌菌种SP7220、SP7701、SP8441和SP9905分别复苏传代后制成种子菌液，再将种子菌液接种固体培养基增殖，经福尔马林灭活后，通过比浊法调整菌液浓度，最后加入结晶紫溶液染色后充分混匀分装即制成鸡白痢凝集抗原。本发明工艺方法简单合理、科学、生产稳定，成本低廉，选用的鸡白痢染色凝集抗原生产菌种抗原性好、变异率低，制成的鸡白痢染色凝集抗原产品具有敏感性高、特异性强、诊断快速、凝集图像清晰的优点，是一种较为理想的检测鸡白痢的染色凝集抗原。

Description

一种鸡白痢染色凝集抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于兽医诊断技术领域，尤其涉及一种鸡白痢染色凝集抗原及其制备方法和应用。
背景技术
鸡白痢是严重危害养鸡业健康发展的重要疾病之一，可造成雏鸡较高的发病死亡率，以及成年鸡生产性能降低。经蛋传播是该病的主要途径，因而对种鸡及其所产的蛋有计划地进行检测，淘汰阳性鸡，培育无白痢种鸡群，切断垂直传播途径，是控制该病的关键所在。国内外对种鸡鸡白痢的净化方法主要采取全血或血清玻板凝集试验，发现阳性鸡及时淘汰，直至全群的阳性率不超过0.1％为止。虽然我国已有用于检测鸡白痢的平板染色抗原产品如“鸡白痢、鸡伤寒多价染色平板凝集试验抗原”，但该抗原在实际应用中存在敏感度低、诊断速度慢、凝集图像不够清晰等缺陷，导致检测后的种鸡群不能达到彻底净化的目标，给养殖者造成了严重的经济损失。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡白痢染色凝集抗原及其制备方法，该抗原由鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905制成，用于在鸡白痢检测试剂中的用途。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种鸡白痢染色凝集抗原，该抗原由鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905制成。鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905是从历年来收集、保存的500余株自然病例所分离的鸡白痢沙门氏菌菌种中，经多年反复筛选验证后获得的4株抗原性好、变异率低的鸡白痢沙门氏菌菌种。
鸡白痢沙门氏菌SP7220(Salmonella pullorum SP7220)、SP7701(Salmonellapullorum SP7701)、SP8441(Salmonella pullorum SP8441)、SP9905(Salmonellapullorum SP9905)已于2014年10月15日在中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)保藏，名称及鉴别特征：鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)，株号：SP7220，保藏编号：CCTCC NO.M 2014476；鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)，株号：SP7701，保藏编号：CCTCC NO.M 2014475；鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)，株号：SP8441，保藏编号：CCTCC NO.M 2014477；鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)，株号：SP9905，保藏编号：CCTCC NO.M 2014478。
本发明提供了鸡白痢染色凝集抗原的制备方法，包括如下具体步骤：
1)种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905菌种分别经液体培养基复苏繁殖后，接种固体平板培养基，37℃培养22h，挑选典型菌落接种固体斜面培养基，37℃培养24h后用液体培养基洗下菌苔，再接种固体扁瓶培养基，37℃培养24h后用液体培养基洗下菌苔检验合格后作为种子菌液；
2)细菌培养：将种子菌液按培养基体积的4.0％接种固体扁瓶培养基，经37℃培养48h后取出，用含有0.3％福尔马林生理盐水洗下菌苔，经灭菌纱布过滤后收集菌液，置4℃过夜灭活；
3)抗原制备：将灭活菌液经4000r/min离心15min去上清，用0.2％福尔马林生理盐水重新悬浮菌泥，将4个抗原生产菌种按比浊度调整菌液浓度至每毫升1.2×1010CFU，充分混匀，用2.0％结晶紫溶液按体积比1：10加入上述菌液中，间隔2h后再加一次，加入后充分混匀，于37℃放置24h充分染色后，无菌分装制成鸡白痢染色凝集抗原。
本发明所述的液体培养基组成为：牛肉汤500ml、猪胃消化液500ml、甘油12.0ml、硫代硫酸钠5.0g、柠檬酸钠3.0g、硫酸锰0.5g、硫酸镁0.4g、硫酸亚铁0.1g、磷酸氢二钾3.5g、海藻糖12.0g、水解乳蛋白5.0g。所述的固体培养基通过液体培养基中加入1.5％的纯化琼脂粉制成。
本发明方法所述的鸡白痢染色凝集抗原含有的细菌浓度为每毫升1.0×1010CFU，其中含有鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905的细菌数量分别为40％、25％、20％和15％。
本发明还提供了上述鸡白痢染色凝集抗原在鸡白痢检测试剂中的用途。
本发明还要求保护上述鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905。
本发明的有益效果为：本发明工艺方法简单合理、科学、生产稳定，成本低廉，选用的鸡白痢染色凝集抗原生产菌种抗原性好、变异率低，制成的鸡白痢染色凝集抗原产品具有敏感性高、特异性强、诊断快速、凝集图像清晰的优点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1。
1)分离纯化与染色镜检
鸡白痢沙门氏菌SP9905株于1999年5月从江苏省扬州市某鸡场的11月龄狼山鸡盲肠内容物中分离所得。其具体分离方法为：无菌采集盲肠内容物加入亚硒酸盐胱氨酸增菌液中37℃过夜培养，再接种麦康凯琼脂37℃培养24小时，挑取直径为0.5mm-1.0mm、灰白色透明、表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。
鸡白痢沙门氏菌SP8441株于1984年12月从北京市某鸡场的6月龄白来航蛋鸡输卵管中分离所得。其具体分离方法为：无菌剪取输卵管一小段加入营养肉汤中37℃过夜培养，再接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。挑取直径为1.0mm-2.0mm、灰白色透明、表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。
鸡白痢沙门氏菌SP7701株于1977年2月从江苏省扬州市某鸡场死亡的白洛克雏鸡肝脏中分离所得。其具体分离方法为：无菌采集死亡雏鸡的肝脏置营养肉汤中37℃过夜培养后，再接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。挑取直径为1.0mm-2.0mm、灰白色透明、表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。
鸡白痢沙门氏菌SP7220株于1972年11月从山东省青岛市某鸡场死亡的白来航雏鸡肝脏中分离所得。其具体分离方法为：无菌采集死亡雏鸡的肝脏置营养肉汤中37℃过夜培养后，再接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。挑取直径为1.0mm-2.0mm、灰白色透明、表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。
2)生化鉴定
从马丁琼脂平板上挑取菌落，进行生化鉴定试验。微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司，按照说明书进行操作。结果菌株的各项生化指标(见表1)均符合鸡白痢沙门氏菌生化特性。
表1 鸡白痢沙门氏菌生化鉴定结果
菌株 靛基质 尿素 氰化钾 赖氨酸 鸟氨酸 甘露醇 山梨醇
SP9905 - - - + + + -
SP8441 - - - + + + -
SP7701 - - - + + + -
SP7220 - - - + + + -
菌株 水杨苷 丙二酸盐 ONPG 卫矛醇 葡萄糖 麦芽糖 乳糖
SP9905 - - - - + + -
SP8441 - - - - + - -
SP7701 - - - - + + -
SP7220 - - - - + - -
菌株 蔗糖 阿拉伯糖 伯胶糖 鼠李糖 酒石酸 硫化氢 运动性
SP9905 - + + + - + -
SP8441 - + + + - - -
SP7701 - + + + - + -
SP7220 - + + + - - -
3)血清学分型
从马丁琼脂平板上挑取菌落至生理盐水中，用比浊法调整细菌浓度至每毫升1.0×1010CFU，采用玻片凝集的方法对菌株进行血清学分型鉴定。具体操作方法如下：取洁净玻片1张，用微量移液器吸取25μl沙门氏菌阳性血清(除O122和O123购自中国兽医药品检查所外，其余血清均购自丹麦哥本哈根国立血清研究所)滴于载玻片上，另吸取25μl生理盐水做对照，然后吸取25μl菌液分别加入血清和生理盐水中，充分混匀。轻轻摇动载玻片，2min后判定结果。检测结果如表2：SP9905和SP7701为标准型，SP7220为中间型，SP8441为变异型。
表2鸡白痢沙门氏菌血清学分型结果
菌株 A-F O1 O2 O4 O7 O8 O9
SP9905 ++++ ++ - - - - +++
SP8441 ++++ - - - - - +++
SP7701 ++++ - - - - - +++
SP7220 ++++ - - - - - ++++
菌株 O10 O11 O15 O19 O122 O123
SP9905 - - - - + ++++
SP8441 - - - - ++++ +
SP7701 - - - - + ++++
SP7220 - - - - +++ +++
注：“++++”代表100％凝集，“+++”代表75％凝集，“++”代表50％凝集，“+”代表25％凝集，“-”代表未发生凝集。
结合具体实施例说明上述鸡白痢染色凝集抗原制备及其应用效果。
A.培养基配置
液体培养基组成为：牛肉汤500ml、猪胃消化液500ml、甘油12.0ml、硫代硫酸钠5.0g、柠檬酸钠3.0g、硫酸锰0.5g、硫酸镁0.4g、硫酸亚铁0.1g、磷酸氢二钾3.5g、海藻糖12.0g、水解乳蛋白5.0g。
固体培养基通过液体培养基中加入1.5％的纯化琼脂粉制成。
B.鸡白痢染色凝集抗原的制备方法
1)种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905菌种分别经液体培养基复苏繁殖后，接种固体平板培养基，37℃培养22h，挑选典型菌落接种固体斜面培养基，37℃培养24h后用液体培养基洗下菌苔，再接种固体扁瓶培养基，37℃培养24h后用液体培养基洗下菌苔检验合格后作为种子菌液；
2)细菌培养：将种子菌液按培养基体积的4.0％接种固体扁瓶培养基，经37℃培养48h后取出，用含有0.3％福尔马林生理盐水洗下菌苔，经灭菌纱布过滤后收集菌液，置4℃过夜灭活；
3)抗原制备：将灭活菌液经4000r/min离心15min去上清，用0.2％福尔马林生理盐水重新悬浮菌泥，将4个抗原生产菌种按比浊度调整菌液浓度至每毫升1.2×1010CFU，充分混匀。用2.0％结晶紫溶液按体积比1：10加入上述菌液中，间隔2h后再加一次，加入后充分混匀，于37℃放置24h充分染色后，无菌分装制成鸡白痢染色凝集抗原。
实施例2。
将鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905冻干菌种分别经液体培养基复苏繁殖后，在人工培养基上不加选择地连续传递数50代，每传递10代通过固体培养一次，并随意选择50个单菌落，观察记录菌落形态，并使用沙门氏菌O122和O123单因子测定血清型。统计每传递10代后，菌落型与血清型的变异率。
结果见表3，4株抗原生产菌种在连续传代20次以后，仅SP9905的菌落型出现2％变异；在传代30、40和50代后，菌落型平均变异率分别为3.5％、11％和17.5％，血清型平均变异率分别为2％、6％和11％。上述结果表明，本发明选用的4株抗原生产菌种均具有较好的遗传稳定性。
表3 鸡白痢抗原生产菌种传代后的变异率测定
实施例3。
将鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905菌种分别经液体培养基复苏繁殖后，接种固体平板培养基，37℃培养22h，挑选典型菌落制备种子菌液。将种子菌液按培养基体积的4.0％接种固体扁瓶培养基，经37℃培养48h后用含有0.3％福尔马林生理盐水洗下菌苔，经灭菌纱布过滤后收集菌液，置4℃过夜灭活；将灭活菌液经4000r/min离心15min去上清，再用0.2％福尔马林生理盐水重新悬浮菌泥，将4个抗原生产菌种按比浊度调整至每毫升1.2×1010CFU的菌液浓度后按比例充分混匀。用2.0％结晶紫溶液按1：10加入上述菌液中，间隔2h后再加一次，加入后充分混匀，于37℃放置24h充分染色后，无菌分装制成鸡白痢染色凝集抗原。
选取32份鸡白痢阳性血清，用研制的鸡白痢染色凝集抗原分别测定不同血清的平板凝集反应效价(以++++、+++、++、+、-表示)；凝集反应时间，以0.5(凝集反应在0.5min内出现)、1(凝集反应在1min内出现)、2(凝集反应在2min内出现)、＞2(凝集反应在2min后出现)表示；凝集图像清晰度，以“c”(表示反应底液澄清)，“m”(表示反应底液浑浊)来表示。同时使用商品化的鸡白痢、鸡伤寒多价染色平板凝集试验抗原(购自青岛易邦生物工程有限公司)作为对照抗原。
结果详见表4，根据鸡白痢平板凝集试验判断标准(平板凝集效价为“++++”或“+++”判为阳性，“++”或“+”判为可疑，“-”判为阴性)，用本发明方法制备的实验抗原阳性检出率为100％(32/32)，高于对照抗原的阳性检出率84.4％(27/32)；在凝集反应时间方面，实验抗原在0.5min、1min、2min内出现凝集反应的分别占59.4％(19/32)、31.3％(10/32)、9.4(3/32)，在1min内完全凝集的比例超过90％，没有出现2min后凝集的血清，而对照抗原在0.5min、1min、2min内出现凝集反应的分别占12.5％(4/32)、37.5％(12/32)、18.8％(6/32)，另外还有31.3(10/32)血清在2min后凝集；在凝集图像清晰度方面，实验抗原没有出现反应底液浑浊的现象，而对照抗原则有31.3％(10/32)血清反应底液浑浊。上述结果表明，在平板凝集效价、凝集反应时间和凝集图像清晰度方面，用本发明方法制备的抗原检测效果明显优于商品化抗原。
表4 不同凝集抗原的检测效果比较
实施例4。
按实施例3所述制备方法制成的鸡白痢染色凝集抗原，对26-37周龄的京粉蛋鸡、海兰蛋鸡、伊莎蛋鸡与绿壳蛋鸡进行全血平板凝集试验，并剖检进行细菌分离，观察脏器病变，结果见表3。
由表5可见在剖检的53只阳性反应鸡中，有肉眼病变的为52只，占98.1％；分离出鸡白痢沙门氏菌的蛋鸡为53只，细菌分离率为100％。剖检的309只阴性反应鸡和18只可疑反应鸡中，无一只有病变或分离到鸡白痢沙门氏菌。根据阳性反应率和细菌分离结果计算，该染色抗原对蛋鸡的敏感性与特异性均为100％(敏感性＝真阳性/真阳性+假阴性；特异性＝真阴性/真阴性+假阳性)。
表5 不同蛋鸡品种鸡白痢检测结果
实施例6。
按实施例3所述制备方法制成的鸡白痢染色凝集抗原，对31-37周龄的爱拔益加肉鸡、苏禽黄鸡与艾维茵肉鸡进行全血平板凝集试验，并剖检进行细菌分离，观察脏器病变，结果见表6。
由表6可见在剖检的49只阳性反应鸡中，有肉眼病变的为45只，占91.8％；分离出鸡白痢沙门氏菌的肉鸡为49只，细菌分离率为100％。剖检的358只阴性反应鸡和16只可疑反应鸡中，无一只有病变或分离到鸡白痢沙门氏菌。根据阳性反应率和细菌分离结果计算，该染色抗原对肉鸡的敏感性与特异性均为100％。
表6 不同肉鸡品种鸡白痢检测结果

Claims (3)

1.一种鸡白痢染色凝集抗原，其特征在于：由鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905制成，所述的鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905均已于2014年10月15日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号分别为：CCTCC NO.M 2014476、CCTCC NO.M2014475、CCTCC NO.M 2014477、CCTCC NO.M 2014478。
2.根据权利要求1所述的一种鸡白痢染色凝集抗原，其特征在于：所述的鸡白痢染色凝集抗原含有的细菌浓度为每毫升1.0×1010CFU，其中含有鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905的细菌数量比例分别为40％、25％、20％和15％。
3.根据权利要求1或2所述的一种鸡白痢染色凝集抗原，其特征在于，通过以下方法制备：
1)种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905菌种分别经液体培养基复苏繁殖后，接种固体平板培养基，37℃培养22h，挑选典型菌落接种固体斜面培养基，37℃培养24h后用液体培养基洗下菌苔，再接种固体扁瓶培养基，37℃培养24h后用液体培养基洗下菌苔检验合格后作为种子菌液；所述液体培养基组成为：牛肉汤500ml、猪胃消化液500ml、甘油12.0ml、硫代硫酸钠5.0g、柠檬酸钠3.0g、硫酸锰0.5g、硫酸镁0.4g、硫酸亚铁0.1g、磷酸氢二钾3.5g、海藻糖12.0g、水解乳蛋白5.0g；所述固体平板培养基和固体斜面培养基通过液体培养基中加入1.5％的纯化琼脂粉制成；
2)细菌培养：将种子菌液按培养基体积的4.0％接种固体扁瓶培养基，经37℃培养48h后取出，用含有0.3％福尔马林生理盐水洗下菌苔，经灭菌纱布过滤后收集菌液，置4℃过夜灭活；
3)抗原制备：将灭活菌液经4000r/min离心15min去上清，用0.2％福尔马林生理盐水重新悬浮菌泥，将4个抗原生产菌种按比浊度调整菌液浓度至每毫升1.2×1010CFU的菌液浓度后充分混匀，用2.0％结晶紫溶液按体积比1：10加入上述菌液中，间隔2h后再加一次，加入后充分混匀，于37℃放置24h充分染色后，无菌分装制成鸡白痢染色凝集抗原；所述鸡白痢染色凝集抗原含有的细菌浓度为每毫升1.0×1010CFU，其中含有鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905的细菌数量比例分别为40％、25％、20％和15％。
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