CN107400642A - 一种细菌营养培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于制备细菌营养培养基的方法，该培养基制备过程科学，包含了兔肝粉的制备过程，制得的培养基对于细菌的培养效果较好。本发明还提供了一种细菌营养培养基，细菌营养培养基能够对一般细菌均可进行培养，可利用此培养基进行药敏实验，达到准确有效的利用药物对病原菌导致的疾病进行治疗的效果。

Description

一种细菌营养培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽医微生物领域，尤其涉及一种细菌营养培养基及其制备方 法。

背景技术

目前，畜牧业养殖场中病原菌会导致牲畜患病，并且难以通过临床症状 对病原菌导致的疾病进行准确的诊断，导致用药不准以及药物滥用。例如， 对于兔场而言，巴氏杆菌、波氏杆菌和魏氏梭菌等为獭兔发病的主要病原菌， 但是难以通过临床症状对上述病原菌导致的疾病进行准确的诊断，导致用药 不对症，或者用药对症但是用量过多过少造成致病菌对一些常用抗生素产生 耐药性，导致用药对症却没有明显效果。为了能够有效快捷的治疗病原菌， 一般的方式是：通过提供一种能够对一般细菌均可进行培养的全营养培养基，进行细菌的培养，然后通过药敏实验对培养基中的细菌进行药物敏感度 测定，通过细菌对药物敏感度的高低以决定使用哪种药物以及使用多少含 量，从而准确有效的对病原菌导致的疾病进行治疗。

目前被相关技术人员广泛接受的可用于对一般细菌均能够进行培养且 用来进行快速药敏实验的全营养培养基为三种：(1)高氏一号培养基、(2) 营养琼脂培养基、(3)加血清血红素的普通兔鲜血培养基。但是这三种培 养基均存在一定的问题，例如高氏一号培养基属于合成培养基，这种培养基 的各种成分是已知的各种化学物质，微生物在这类培养基中生长较慢。

另外，培养基的质量受培养基制备过程的影响。目前，培养基制备过程 中通常会存在以下问题：培养基制备过程不科学，导致制得的培养基对于细 菌的培养效果不好。

因此，提供一种能够对一般细菌均可进行培养的全营养培养基，并且可 利用此培养基进行药敏实验，从而准确有效的利用药物对病原菌导致的疾病 进行治疗以及提供一种能够制备这种全营养培养基的制备方法，使制得的培 养基对于一般细菌具有良好的培养效果具有重要意义。

发明内容

本发明旨在解决上面描述的问题。本发明的目的是提供一种针对一般细 菌均可培养的全营养培养基及其制备方法。

根据本发明的一个方面，提供一种用于制备细菌营养培养基的方法，所 述细菌为导致兔发病的病原菌，所述制备方法包括下述步骤：

步骤1，制备兔肝粉；

步骤2，取0.6～1.0L的水加入烧杯中，量取兔肝粉25～35g，NaCl 3～7g， 柠檬酸钠1～3g，葡萄糖5～15g，乳糖5～15g，甘露醇5～15g溶解于水中并 搅拌均匀，得到混合均匀的混合液，然后量取琼脂15～25g加入混合液中， 在90℃～98℃下对混合液加热至琼脂完全融化，并在此加热过程中不断搅拌 混合液；

步骤3，在步骤2中所得的加入琼脂的混合液中补加水0.1～0.3L，然后 加入pH调节剂，将混合液的pH值调节至6.8～7.5；

步骤4，将步骤3所得调节PH值之后的混合溶液在120℃～122℃， 101～102KPa的条件下高温灭菌18～22分钟，得到高温灭菌后的混合溶液；

步骤5，将步骤4中高温灭菌后的混合溶液冷却至44℃～55℃，加入兔 鲜血75～85ml搅拌均匀得到所述细菌营养培养基。

具体地，所述制备兔肝粉的步骤还包括：

步骤11，取生兔肝脏140～160g，加水150～200ml煮沸8～12分钟，去水 研磨成肉糊；

步骤12，在步骤11所得肉糊中添加蛋白酶搅拌均匀，将搅拌均匀的肉 糊置于55～65℃下保温11～13小时得到保温后的肉糊，对保温后的肉糊加水 300～500ml进行水煮煮沸12～17分钟使保温后的肉糊中的蛋白酶失活，并形 成兔肝脏浆液；

步骤13，将步骤12中获得的兔肝脏浆液在离心机中以2800～3200转/分 钟的转速离心处理4～6分钟，过滤掉残渣和油，得到过滤后的兔肝脏浆液， 将所述过滤后的兔肝脏浆液干燥形成兔肝粉。

其中，蛋白酶用量为0.29～0.31万U/g。

具体地，所述制备方法包括下述步骤：

步骤1，制备兔肝粉；

步骤2，取0.8L的水加入烧杯中，量取兔肝粉30g，NaCl 5g，柠檬酸钠 2g，葡萄糖10g，乳糖10g，甘露醇10g溶解于水中并搅拌均匀，得到混合 均匀的混合液，然后量取琼脂20g加入混合液中，在95℃下对混合液加热至 琼脂完全融化，并在此加热过程中不断搅拌混合液；

步骤3，在步骤2中所得的加入琼脂的混合液中补加水0.2L，然后加入 pH调节剂，将混合液的pH值调节至7.2；

步骤4，将步骤3所得调节PH值之后的混合溶液在121℃，101KPa的 条件下高温灭菌20分钟，得到高温灭菌后的混合溶液；

步骤5，将步骤4中高温灭菌后的混合溶液冷却至50℃，加入兔鲜血80ml 搅拌均匀得到所述细菌营养培养基。

具体地，所述制备兔肝粉的步骤还包括：

步骤11，取生兔肝脏150g，加水170ml煮沸10分钟，去水研磨成肉糊；

步骤12，在步骤11所得肉糊中添加蛋白酶搅拌均匀，将搅拌均匀的肉 糊置于60℃下保温12小时得到保温后的肉糊，对保温后的肉糊加水400ml 进行煮沸15分钟使保温后的肉糊中的蛋白酶失活，并形成兔肝脏浆液；

步骤13，将步骤12中获得的兔肝脏浆液在离心机中以3000转/分钟的 转速离心处理5分钟，过滤掉残渣和油，得到过滤后的兔肝脏浆液，将所述 过滤后的兔肝脏浆液干燥形成兔肝粉。

具体地，所述蛋白酶用量为0.3万U/g。

具体地，所述pH调节剂包括碱性调节剂或酸性调节剂，其中所述碱性 调节剂包括NaHCO₃、NaOH中的至少一种，所述酸性调节剂包括HCl。

根据本发明的另一个方面，所述方法制备的细菌营养培养基，其特征在 于，所述细菌为导致兔发病的病原菌，所述细菌营养培养基包括兔肝粉、 NaCl、柠檬酸钠、葡萄糖、乳糖、甘露醇、兔鲜血、水以及琼脂；其中，各 组分的含量为：

具体地，所述细菌营养培养基包括兔肝粉、NaCl、柠檬酸钠、葡萄糖、 乳糖、甘露醇、兔鲜血、水以及琼脂；其中，各组分的含量为：

根据本发明提供的制备细菌营养培养基的方法，上述制备方法按照步骤 1～步骤5的顺序依次进行。其中，兔肝粉作为原料参与细菌营养培养基的制 备，步骤2中水的含量与步骤3中水的含量计入本发明提供的细菌营养培养 基制备的组分关系中。本发明中的兔肝粉是由兔肝脏为原料，通过步骤11～ 步骤13的顺序依次进行制得。兔肝粉可以以纯组分的形式作为细菌营养培 养基配方中的组分参与到制备过程中的步骤2中，即将兔肝粉混于步骤2中 的混合液中；也可由步骤13制备得到的过滤后的兔肝脏浆液的形式作为细 菌营养培养基配方中的组分参与到制备过程中的步骤2中，即将过滤后的兔 肝脏浆液混于步骤2中的混合液中，此时过滤后的兔肝脏浆液中的兔肝脏及 作为溶剂的水的含量需满足本发明的细菌营养培养基制备的组分关系。也就 是说，本发明中的培养基的配方可以为兔肝粉，也可以为过滤后的兔肝脏浆 液。由此可见，本发明中的兔肝粉以及过滤后的兔肝脏浆液均可用来配制培 养基。兔肝粉可储藏保存，当配制培养基时可直接取用加水配制。兔肝脏浆 液可以通过兔场就地取材兔肝脏，制得兔肝脏浆液而不干燥成兔肝粉，以浆 液的形式参与到配方配制中。

由步骤2可知，首先取0.6～1.0L的水加入烧杯中，然后量取兔肝粉 25～35g，NaCl3～7g，柠檬酸钠1～3g，葡萄糖5～15g，甘露醇5～15g溶 解于水中搅拌均匀，得到混合均匀的混合液。首先在烧杯中加入0.6～1.0L 的水，然后将兔肝粉、NaCl等各组分按相应含量溶解于水中，先加入水再添 加其他组分溶解，避免了因先添加其他组分对于烧杯内壁造成粘附。先将除 琼脂之外的药品溶解，再加入琼脂，因为部分药品很难溶解，而加入琼脂后 不便于观察这些药品的溶解情况。在混合液中加入琼脂，并且对混合液以 90℃～98℃的温度进行加热以使琼脂完全融化，加热过程中不断搅拌混合液。 90℃～98℃的加热温度既可以保证琼脂的完全融化，又可以防止温度过高导 致混合液的爆沸外溅。并且，在加热过程中不断进行搅拌混合液，不仅使得 混合液中各处温度均匀稳定，防止混合液爆沸，同时防止了琼脂粘于烧杯底 部。

在步骤3中，在加入琼脂的混合液中补加水0.1～0.3L，然后加入pH调 节剂，将混合液的pH值调节至6.8～7.5。具体地，进行pH调节剂的滴加时 以缓慢的速度持续滴加，并在此过程不断搅拌，这可以有效避免混合液局部 pH过高或过低的问题。pH值调节至6.8～7.5，可以较好的满足一般细菌所需 的酸碱度，保证微生物的良好生长。在步骤3中补水0.1～0.3L以达到所需水 总体积，而不在步骤2中直接一次加足所需水总体积，避免了由于加热蒸发、 搅拌过度液体外溅等操作造成的水分损失，同样也可以冲洗瓶口粘附的药 品，保证了配制的准确度。

在步骤5中，将加热后的初级细菌营养培养基冷却至44℃～55℃后，加 入兔鲜血75～85ml搅拌均匀。兔鲜血的加入是为微生物生长提供微量元素， 将加热后的营养基冷却至44℃～55℃，既避免了高温加热对兔鲜血中微量元 素的破坏，又保证了此时的培养基仍为液体状态以便加入兔鲜血形成各组分 混合均匀的培养基。

制备兔肝粉的步骤是本发明的一个重要技术点，兔肝粉制备步骤包括步 骤11，步骤12，步骤13，这些步骤依次进行。

在步骤11中，取生兔肝脏140～160g，加水150～200ml煮沸8～12分钟， 去水研磨成肉糊。此处的生兔肝脏为去掉油脂、胆囊等杂质后，保留了蛋白 质等天然营养物质的高质量兔肝脏。加水150～200ml煮沸8～12分钟，保证 了此时兔肝脏可以被研磨成肉糊。

在步骤12中，对所得肉糊中添加蛋白酶搅拌均匀，对保温后的肉糊加 水300～500ml进行水煮煮沸12～17分钟使保温后的肉糊中的蛋白酶失活。肉 糊中添加蛋白酶作为嫩肉剂，可以将大分子蛋白切为短肽，保留兔肝脏中的 可利用营养物质，有效的保证了最终所得兔肝粉的质量。

在步骤13中，将获得的兔肝脏浆液在离心机中以2800～3200转/分钟的 转速离心处理4～6分钟。2800～3200转/分钟的转速离心处理4～6分钟，此时 可以有效分离出残渣和油，得到不含杂质的高质量的兔肝脏浆液。

需要说明的是，以上制备过程中各组分的用量需满足本发明所述的比例 关系，本领域技术人员可以根据实际情况基于上述制备方法进行适应性调 整。

根据本发明的第二个方面，提供了上述细菌营养培养基制备方法制备的 细菌营养培养基。

细菌营养培养基包括兔肝粉、NaCl、柠檬酸钠、葡萄糖、乳糖、甘露醇、 兔鲜血、水以及琼脂；其中，各组分的含量为：

兔肝粉是制备本发明中细菌营养培养基的重要组分。兔肝粉为微生物的 生长提供主要的营养物质。本发明使用的兔肝粉杂质含量少，对于兔场来说 兔肝粉容易获得且质量有保障，可为微生物的代谢提供主要营养物质。而且， 兔肝粉做的培养基其营养成分更加接近于兔病菌的原始生活环境，从而可以 更好地促进兔病菌的生长，有利于高效快速的进行兔疾病的治疗。

不同种类的细菌生长可分解利用柠檬酸钠、葡萄糖、乳糖、甘露醇等不 同的营养物质，例如巴氏杆菌可分解利用甘露醇，添加甘露醇促进巴氏杆菌 生长；波氏杆菌可分解利用柠檬酸盐，添加柠檬酸盐促进波氏杆菌生长；魏 氏杆菌可分解利用乳糖和葡萄糖，添加乳糖和葡萄糖促进魏氏杆菌生长的的 等。因此，本发明中通过添加柠檬酸钠、葡萄糖、乳糖、甘露醇等营养物质 满足了不同种类细菌所需的不同代谢条件，促进了不同细菌的良好生长。

琼脂的主要作用是使液体培养基变为固体培养基，本发明中的培养基也 可以为液体培养基，即配方中不添加琼脂。

通过大量的研究试验，上述成分的相互配合，制得的该细菌营养培养基 能够对一般细菌均可进行培养，另外，可以通过药敏实验对培养基中的细菌 进行药物敏感度测定，从而准确有效的对病原菌导致的疾病进行治疗。

作为本发明的优选示例，所述细菌营养培养基包括兔肝粉、NaCl、柠檬 酸钠、葡萄糖、乳糖、甘露醇、兔鲜血、水以及琼脂；其中，各组分的含量 为：

以上制备过程中各组分的用量需满足本发明所述的比例关系，本领域技 术人员可以根据实际情况基于上述制备方法进行适应性调整。

本发明与现有技术相比，其有益效果体现在：

第一，本发明制备细菌营养培养基的方法，严格控制过程中原料的称量、 制备顺序、灭菌等过程或者参数，制得的培养基质量高，可以为一般细菌的 生长提供充足的营养物质，对一般细菌具有良好的培养效果。

第二，本发明提供的细菌营养培养基，是一种能够对一般细菌均可进行 培养的全营养培养基，尤其是加入了柠檬酸钠、葡萄糖、乳糖、甘露醇等营 养物质满足了不同类型的细菌的代谢需求，促进了一般细菌的良好生长。

第三，本发明提供的营养培养基，使用的主要原料为兔肝粉和兔鲜血， 对于兔场而言取材方便，且成本较低，有利于降低兔子疾病快速治疗的成本。

本发明制备的细菌营养培养基的各组分及其含量的选择、细菌营养培养 基的制备方法，以及细菌营养培养基对细菌培养的有益效果将通过实施例给 出的具体实验数据进行说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例 中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部 分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术 人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明 保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施 例中的特征可以相互任意组合。

本发明的用于制备细菌营养培养基的方法，细菌为导致兔发病的病原 菌，制备方法包括下述步骤：

步骤1，制备兔肝粉；

步骤2，取0.6～1.0L的水加入烧杯中，量取兔肝粉25～35g，NaCl 3～7g， 柠檬酸钠1～3g，葡萄糖5～15g，乳糖5～15g，甘露醇5～15g溶解于水中并 搅拌均匀，得到混合均匀的混合液，然后量取琼脂15～25g加入混合液中， 在90℃～98℃下对混合液加热至琼脂完全融化，并在此加热过程中不断搅拌 混合液；

步骤3，在步骤2中所得的加入琼脂的混合液中补加水0.1～0.3L，然后 加入pH调节剂，将混合液的pH值调节至6.8～7.5；

步骤4，将步骤3所得调节PH值之后的混合溶液在120℃～122℃， 101～102KPa的条件下高温灭菌18～22分钟，得到高温灭菌后的混合溶液；

步骤5，将步骤4中高温灭菌后的混合溶液冷却至44℃～55℃，加入兔 鲜血75～85ml搅拌均匀得到所述细菌营养培养基。

所述制备兔肝粉的步骤还包括：

步骤11，取生兔肝脏140～160g，加水150～200ml煮沸8～12分钟，去水 研磨成肉糊；

步骤12，在步骤11所得肉糊中添加蛋白酶搅拌均匀，将搅拌均匀的肉 糊置于55～65℃下保温11～13小时得到保温后的肉糊，对保温后的肉糊加水 300～500ml进行水煮煮沸12～17分钟使保温后的肉糊中的蛋白酶失活，并形 成兔肝脏浆液；

步骤13，将步骤12中获得的兔肝脏浆液在离心机中以2800～3200转/分 钟的转速离心处理4～6分钟，过滤掉残渣和油，得到过滤后的兔肝脏浆液， 将所述过滤后的兔肝脏浆液干燥形成兔肝粉。

下面通过实施例的方式详细说明工艺步骤：

实施例1

步骤101，制备兔肝粉；

步骤1011，取生兔肝脏150g，加水170ml煮沸10分钟，去水研磨成肉 糊；

步骤1012，在步骤1011所得肉糊中以0.3万U/g的用量添加蛋白酶并 搅拌均匀，将搅拌均匀的肉糊置于60℃下保温12小时得到保温后的肉糊， 对保温后的肉糊加水400ml煮沸15分钟使保温后的肉糊中的蛋白酶失活， 并形成兔肝脏浆液；

步骤1013，将步骤1012中获得的兔肝脏浆液在离心机中以3000转/分 钟的转速离心处理5分钟，过滤掉残渣和油，得到过滤后的兔肝脏浆液，将 所述过滤后的兔肝脏浆液干燥形成兔肝粉。

步骤102，取0.8L的水加入烧杯中，取兔肝粉30g，NaCl 5g，柠檬酸钠 2g，葡萄糖10g，乳糖10g，甘露醇10g溶解于水中并搅拌均匀，得到混合 均匀的混合液，在混合液中加入琼脂20g，在95℃下对混合液加热至琼脂完 全融化，并在此加热过程中不断搅拌混合液；

步骤103，在步骤102中所得的加入琼脂的混合液中补加水0.2L，然后 加入pH调节剂NaHCO₃，将混合液的pH值调节至7.2；

步骤104，将步骤103所得调节PH值之后的混合溶液在121℃，101KPa 的条件下高温灭菌20分钟，得到高温灭菌后的混合溶液；

步骤105，将步骤104中高温灭菌后的混合溶液冷却至50℃，加入兔鲜 血80ml搅拌均匀得到所述细菌营养培养基。

实施例2

步骤101，制备兔肝粉；

步骤1011，取生兔肝脏140g，加水150煮沸8分钟，去水研磨成肉糊；

步骤1012，在步骤1011所得肉糊中以0.29万U/g的用量添加蛋白酶并 搅拌均匀，将搅拌均匀的肉糊置于65℃下保温11小时得到保温后的肉糊， 对保温后的肉糊加水300ml水煮煮沸12分钟使保温后的肉糊中的蛋白酶失 活，并形成兔肝脏浆液；

步骤1013，将步骤1012中获得的兔肝脏浆液在离心机中以3200转/分 钟的转速离心处理4分钟，过滤掉残渣和油，得到过滤后的兔肝脏浆液，将 所述过滤后的兔肝脏浆液干燥形成兔肝粉。

步骤102，取1.0L的水加入烧杯中，取兔肝粉25g，NaCl 7g，柠檬酸钠 1g，葡萄糖5g，乳糖15g，甘露醇5g溶解于水中并搅拌均匀，得到混合均 匀的混合液，在混合液中加入琼脂25g，在90℃下对混合液加热至琼脂完全 融化，并在此加热过程中不断搅拌混合液；

步骤103，在步骤102中所得的加入琼脂的混合液中补加水0.3L，然后 加入pH调节剂HCl，将混合液的pH值调节至6.8；

步骤104，将步骤103所得调节PH值之后的混合溶液在122℃，102KPa 的条件下高温灭菌18分钟，得到高温灭菌后的混合溶液；

步骤105，将步骤104中加热后的高温灭菌后的混合溶液冷却至44℃， 加入兔鲜血85ml搅拌均匀得到所述细菌营养培养基。

实施例3

步骤101，制备兔肝粉；

步骤1011，取生兔肝脏160g，加水200ml煮沸12分钟，去水研磨成肉 糊；；

步骤1012，在步骤1011所得肉糊中以0.31万U/肉糊的用量添加蛋白酶 并搅拌均匀，将搅拌均匀的肉糊置于55℃下保温13小时得到保温后的肉糊， 对保温后的肉糊加水500ml进行水煮煮沸17分钟使保温后的肉糊中的蛋白 酶失活，并形成兔肝脏浆液；

步骤1013，将步骤1012中获得的兔肝脏浆液在离心机中以2800转/分 钟的转速离心处理6分钟，过滤掉残渣和油，得到过滤后的兔肝脏浆液，将 所述过滤后的兔肝脏浆液干燥形成兔肝粉。

步骤102，取0.5L的水加入烧杯中，取兔肝粉35g，NaCl 3g，柠檬酸钠 3g，葡萄糖15g，乳糖5g，甘露醇15g溶解于水中并搅拌均匀，得到混合均 匀的混合液，在混合液中加入琼脂15g，在98℃下对混合液加热至琼脂完全 融化，并在此加热过程中不断搅拌混合液；

步骤103，在步骤2中所得的加入琼脂的混合液中补加水0.2L，然后加 入pH调节剂NaHCO₃，将混合液的pH值调节至7.5；

步骤104，将步骤3所得调节PH值之后的混合溶液在120℃，102KPa 的条件下高温灭菌22分钟，得到高温灭菌后的混合溶液；

步骤105，将步骤104中的高温灭菌后的混合溶液冷却至55℃，加入兔 鲜血75ml搅拌均匀得到所述细菌营养培养基。

实施例1～实施例3，各组分的用量需满足本发明所述的比例关系，本领 域技术人员可以根据实际情况基于上述制备方法进行适应性调整。具体实施 例情况如表1所示：

表1细菌营养培养基具体实施例列表

对比例

为了进一步说明本发明的有益效果，选择目前较为常用的兔鲜血培养基 作为对比实施例，制备该兔鲜血培养基各组分的含量如表2所示：

表2对比例组分含量列表

组分

牛肉膏

蛋白胨

NaCl

水

兔鲜血

琼脂

含量

3g

10g

5g

1L

80ml

20g

测试例1

为了全面的说明本细菌营养培养基对于一般细菌的培养效果，使用本细 菌营养培养基对巴氏杆菌、波氏杆菌、魏氏梭菌以及葡萄球菌进行接种培养，

并对培养结果进行测试。将上述实施例与对比例应用于巴氏杆菌、波氏杆菌、 魏氏梭菌以及葡萄球菌进行接种培养，具体过程如下：

巴氏杆菌菌液制备：取巴氏杆菌标准菌株1株，接种于固体普通肉汤培 养基中进行复苏处理后，挑取固体普通肉汤培养基上生长的一个巴氏杆菌菌 落接种于4ml液体普通肉汤培养基中，在36～38℃富集(即培养)46～50h后 得到巴氏杆菌培养基溶液(即巴氏杆菌菌液)。

波氏杆菌菌液、魏氏梭菌菌液以及葡萄球菌菌液制备方法与巴氏杆菌菌 液配方法相同。需要说明的是，菌液配制过程中使用的普通肉汤培养基的配 方为：蛋白胨：10g，牛肉膏：3g，氯化钠：5g，水：1L。

实施例1的具体培养过程如下：取培养皿A1、培养皿A2、培养皿A3 以及培养皿A4共四个培养皿，每个培养皿上均加入实施例1中的细菌营养 培养基3ml，在培养皿A1、培养皿A2、培养皿A3以及培养皿A4中分别依 次涂布接种500μl的巴氏杆菌菌液，500μl的波氏杆菌菌液，500μl的魏氏 梭菌菌液，500μl的葡萄球菌菌液(倒平板)。将培养皿A1、培养皿A2、 培养皿A3以及培养皿A4在37℃下培养48h。

实施例2的具体培养过程如下：取培养皿B1、培养皿B2、培养皿B3 以及培养皿B4共四个培养皿，每个培养皿上均加入实施例2中的细菌营养 培养基3ml，在培养皿B1、培养皿B2、培养皿B3以及培养皿B4分别依次 涂布接种500μl的巴氏杆菌菌液，500μl的波氏杆菌菌液，500μl的魏氏梭 菌菌液，500μl的葡萄球菌菌液(倒平板)。将培养皿B1、培养皿B2、培 养皿B3以及培养皿B4在37℃下培养48h。

实施例3的具体培养过程如下：取培养皿C1、培养皿C2、培养皿C3 以及培养皿C4共四个培养皿，每个培养皿上均加入实施例3中的细菌营养 培养基3ml，在培养皿C1、培养皿C2、培养皿C3以及培养皿C4分别依次 涂布接种500μl的巴氏杆菌菌液，500μl的波氏杆菌菌液，500μl的魏氏梭 菌菌液，500μl的葡萄球菌菌液(倒平板)。将培养皿C1、培养皿C2、培 养皿C3以及培养皿C4在37℃下培养48h。

对比例应用于细菌菌株的接种培养，具体培养过程如下：取培养皿D1、 培养皿D2、培养皿D3以及培养皿D4共四个培养皿，每个培养皿上均加入 对比例中的兔鲜血培养基3ml，在培养皿D1、培养皿D2、培养皿D3以及 培养皿D4分别依次涂布接种500μl的巴氏杆菌菌液，500μl的波氏杆菌菌 液，500μl的魏氏梭菌菌液，500μl的葡萄球菌菌液(倒平板)。将培养皿 D1、培养皿D2、培养皿D3以及培养皿D4在37℃下培养48h。

对比例与实施例应用于细菌的接种培养结果进行测试，具体测试结果如 表3所示：

表3实施例与对比例应用于细菌培养的实验测试结果

由上述测试例可知，本发明的细菌营养培养基对一般细菌具有良好的培 养效果：实施例中平均菌落个数以及平均菌落直径均高于对比例，由此可见 本发明中的细菌营养培养基中的一般细菌的生长状况都较为良好。

综上所述，本发明具有下述有益效果：

第一，本发明制备细菌营养培养基的方法，严格控制过程中原料的称量、 制备顺序、灭菌等过程或者参数，制得的培养基灭菌效果好，营养成分全面， 可以为一般细菌的生长提供充足的营养物质，促进对一般细菌的良好培养。

第二，本发明提供的营养培养基，是一种能够对一般细菌均可进行培养 的全营养培养基，尤其是加入了柠檬酸钠、葡萄糖、乳糖、甘露醇等营养物 质满足了不同类型的细菌的代谢需求，促进了一般细菌的良好生长。

第三，本发明提供的营养培养基，使用的主要原料为兔肝粉和兔鲜血， 对于兔场而言取材方便，且成本较低，有利于降低兔子疾病快速治疗的成本。

最后应说明的是：在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他 变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包含一系列要素的过程、方法、物 品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者 是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制 的情况下，由语句“包括一个…”限定的要素，并不排除在包括所述要素的 过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前 述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其 依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术 特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离 本发明各实施例技术方案的精神和范围。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例 中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部 分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术 人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明 保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施 例中的特征可以相互任意组合。

Claims (9)

1.一种用于制备细菌营养培养基的方法，其特征在于，所述细菌为导致兔发病的病原菌，所述制备方法包括下述步骤：

步骤1，制备兔肝粉；

步骤2，取0.6～1.0L的水加入烧杯中，量取兔肝粉25～35g，NaCl 3～7g，柠檬酸钠1～3g，葡萄糖5～15g，乳糖5～15g，甘露醇5～15g溶解于水中并搅拌均匀，得到混合均匀的混合液，然后量取琼脂15～25g加入混合液中，在90℃～98℃下对混合液加热至琼脂完全融化，并在此加热过程中不断搅拌混合液；

步骤3，在步骤2中所得的加入琼脂的混合液中补加水0.1～0.3L，然后加入pH调节剂，将混合液的pH值调节至6.8～7.5；

步骤4，将步骤3所得调节PH值之后的混合溶液在120℃～122℃，101～102KPa的条件下高温灭菌18～22分钟，得到高温灭菌后的混合溶液；

步骤5，将步骤4中高温灭菌后的混合溶液冷却至44℃～55℃，加入兔鲜血75～85ml搅拌均匀得到所述细菌营养培养基。

2.如权利要求1所述的细菌营养培养基制备方法，其特征在于，所述制备兔肝粉的步骤还包括：

步骤11，取生兔肝脏140～160g，加水150～200ml煮沸8～12分钟，去水研磨成肉糊；

步骤12，在步骤11所得肉糊中添加蛋白酶搅拌均匀，将搅拌均匀的肉糊置于55～65℃下保温11～13小时得到保温后的肉糊，对保温后的肉糊加水300～500ml进行水煮煮沸12～17分钟使保温后的肉糊中的蛋白酶失活，并形成兔肝脏浆液；

步骤13，将步骤12中获得的兔肝脏浆液在离心机中以2800～3200转/分钟的转速离心处理4～6分钟，过滤掉残渣和油，得到过滤后的兔肝脏浆液，将所述过滤后的兔肝脏浆液干燥形成兔肝粉。

3.如权利要求2所述的细菌营养培养基制备方法，其特征在于，所述蛋白酶用量为0.29～0.31万U/g。

4.如权利要求1或2所述的细菌营养培养基制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：

步骤1，制备兔肝粉；

步骤2，取0.8L的水加入烧杯中，量取兔肝粉30g，NaCl 5g，柠檬酸钠2g，葡萄糖10g，乳糖10g，甘露醇10g溶解于水中并搅拌均匀，得到混合均匀的混合液，然后量取琼脂20g加入混合液中，在95℃下对混合液加热至琼脂完全融化，并在此加热过程中不断搅拌混合液；

步骤3，在步骤2中所得的加入琼脂的混合液中补加水0.2L，然后加入pH调节剂，将混合液的pH值调节至7.2；

步骤4，将步骤3所得调节PH值之后的混合溶液在121℃，101KPa的条件下高温灭菌20分钟，得到高温灭菌后的混合溶液；

步骤5，将步骤4中高温灭菌后的混合溶液冷却至50℃，加入兔鲜血80ml搅拌均匀得到所述细菌营养培养基。

5.如权利要求4所述的细菌营养培养基制备方法，其特征在于，所述制备兔肝粉的步骤还包括：

步骤11，取生兔肝脏150g，加水170ml煮沸10分钟，去水研磨成肉糊；

步骤12，在步骤11所得肉糊中添加蛋白酶搅拌均匀，将搅拌均匀的肉糊置于60℃下保温12小时得到保温后的肉糊，对保温后的肉糊加水400ml进行煮沸15分钟使保温后的肉糊中的蛋白酶失活，并形成兔肝脏浆液；

步骤13，将步骤12中获得的兔肝脏浆液在离心机中以3000转/分钟的转速离心处理5分钟，过滤掉残渣和油，得到过滤后的兔肝脏浆液，将所述过滤后的兔肝脏浆液干燥形成兔肝粉。

6.如权利要求4所述的细菌营养培养基制备方法，其特征在于，所述蛋白酶用量为0.3万U/g。

7.如权利要求1所述的用于制备细菌营养培养基的方法，其特征在于，所述pH调节剂包括碱性调节剂或酸性调节剂，其中所述碱性调节剂包括NaHCO₃、NaOH中的至少一种，所述酸性调节剂包括HCl。

8.一种如权利要求1～7中任一项所述方法制备的细菌营养培养基，其特征在于，所述细菌为导致兔发病的病原菌，所述细菌营养培养基包括兔肝粉、NaCl、柠檬酸钠、葡萄糖、乳糖、甘露醇、兔鲜血、水以及琼脂；其中，各组分的含量为：

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9.如权利要求8所述细菌营养培养基，其特征在于，所述细菌营养培养基包括兔肝粉、NaCl、柠檬酸钠、葡萄糖、乳糖、甘露醇、兔鲜血、水以及琼脂；其中，各组分的含量为：

。