CN103911327B - 地衣芽孢杆菌益生菌制剂及制备 - Google Patents

Abstract

本发明为地衣芽孢杆菌益生菌制剂及制备，属于饲料微生物技术领域，涉及一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质，以益生菌地衣芽孢杆菌BL‑09(BacilluslicheniformisBL‑09)为菌种的固态发酵技术，可广泛应用于动物微生态等方面。具体包括地衣芽孢杆菌BL‑09的种子培养及其固态发酵培养。其种子培养基质量百分比组成为：蛋白胨1%，葡萄糖2%，加水至100%，pH7.0‑7.2。固态发酵培养基质量百分比组成为：29%豆粕，29%麸皮，2%玉米粉，水分含量40%。采用地衣芽孢杆菌BL‑09发酵，可提高营养物质的降解率，其良好的耐酸性、耐热性、耐胆盐性是其适应饲料复杂的加工步骤，能保持较高的活菌数和高活性的保证。

Description

地衣芽孢杆菌益生菌制剂及制备

技术领域

本发明属于饲料微生物技术领域，涉及一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质，以益生菌地衣芽孢杆菌BL-09(BacilluslicheniformisBL-09)为菌种的固态发酵技术，此技术可广泛应用于动物微生态等方面。

背景技术

益生菌具有防治腹泻、增强免疫、促进消化系统健康、降低血清胆固醇等诸多益处，因而越来越多地受到人们的关注，益生菌的研究和应用在中国正处于快速发展时期，但这种快速发展仍没有由活性乳酸菌上升到益生菌层面上来，应用及接受度比较广泛的仍限于乳酸菌直接与液态牛乳和豆乳发酵，得到功能性的酸牛奶或者酸豆奶，其它比较常见的是采用液态发酵，直接收集益生菌菌体，制作成益生菌粉剂、片剂或者胶囊。

公开号为103181460A的中国发明专利《一种饲用植物乳杆菌的制备方法及其应用》公开了一种饲用植物乳杆菌的制备方法。针对当前养殖中抗生素的滥用、抗药性的产生等问题，新型抗生素替代产品——益生菌的应用是现代养殖的趋势；本益生菌采用单菌深层液态发酵，生产成本低廉、活菌数高，是稳定高效的绿色饲料添加剂。

公开号为103194406A的中国发明专利《益生菌高浓度活性菌粉的生产方法》涉及一种益生菌高浓度活性菌粉的生产方法，在益生菌液态发酵后的发酵液中，加入生物安全性高的酸性壳聚糖溶液作为生物沉降剂，将菌体得以自然沉降分离，沉降得到的菌体浓缩浆液经冷冻干燥得到具有高浓度活菌含量的益生菌菌粉。由于采用的生物沉降剂生物毒性低、用量小，因而分离过程中对益生菌伤害小且稀释度低，生产出的益生菌菌粉具有很高的活菌含量，每克菌粉中的活菌数量可以达到1013数量级，且操作简便，成本低，污染小，具有很高的应用价值。

但是采用液态发酵会产生大量的废水，对环境污染较大，后处理比较困难，机器设备操作繁琐。而开发利用新的益生菌菌种，优化培养条件，提高益生菌制剂中活菌含量及活性，应是本领域重点研究的方向。本申请采用地衣芽孢杆菌BL-09混合固态发酵豆粕、麸皮和玉米粉，采用固态发酵，其生产成本低，投资的资金较少，在下游处理方便，污染小，设备结构简单、易操作。采用地衣芽孢杆菌BL-09进行固态发酵，可改善动物饲料的适口性。其蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，有利于动物肠胃消化吸收。

发明内容

本发明目的在于提供一种地衣芽孢杆菌BL-09固态发酵豆粕、麸皮和玉米粉制备的益生菌制剂，同时提供该益生菌制剂的制备方法，可广泛应用于微生态领域，该益生菌制剂的活菌数高，豆粕蛋白质的降解率高。该制备方法生产成本低，可以提高经济效益并且操作简单。

本发明是通过下述技术方案实现的：

一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质可广泛应用于微生态领域的益生菌制剂，其制备方法包括地衣芽孢杆菌BL-09的种子培养及其固态发酵培养。所述地衣芽孢杆菌BL-09种子培养基质量百分比组成为：蛋白胨1%，葡萄糖2%，加水至100%，pH7.0-7.2。固态发酵培养基质量百分比组成为：29%豆粕，29%麸皮，2%玉米粉，水分含量40%。

所述的地衣芽孢杆菌BL-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为150r/min，温度为37℃，培养24h。

所述固态发酵培养条件为：地衣芽孢杆菌BL-09接种量为2.0-8.0%(v/w),温度为37℃，培养12-48h。发酵初期，pH呈下降趋势，pH最小值为5.50，在发酵的后期，其pH呈上升趋势，发酵48h后，其pH为6.50。

地衣芽孢杆菌BL-09在发酵48h后，游离氨基态氮含量可达到750.1umol/g，较发酵前提高约7倍多。

本发明产品添加于饲料中，用于动物饲喂时，能有效提高饲料的利用效率12-30%。用于鱼类养殖时，日增重提高了5-20%。本发明产品在饲料中的添加量为20-200克/吨。

地衣芽孢杆菌BL-09，分类名称为BacilluslicheniformisBL-09。于2011年12月31日保藏，保藏号为CGMCCNo.5686。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

地衣芽孢杆菌BL-09分离自内蒙古自治区呼和浩特市地区健康牛肠道样品中芽孢杆菌，属于兼性厌氧的、革兰氏阳性芽孢杆菌；菌体呈棒杆状，偶尔见长杆状，芽孢中生，呈椭圆形；最适生长温度为37±1℃，最适生长pH为7.0-7.4，固态发酵烘干产物常温储存6个月，芽孢损失率低于5%；营养琼脂平板培养12h左右，菌落不规则、边缘不光滑，菌落中央具有明显的凸起峰，培养至24-36h，菌落褶皱明显且褶皱内物质呈液体状，接种环挑取具有拉丝情况，镜检芽孢基本脱落，经过伯杰氏细菌手册（第9版）生理生化试验及细菌、菌落形态确定为地衣芽孢杆菌，命名为地衣芽孢杆菌BL-09。体外实验证实，该菌株具有良好的耐高温、耐酸、耐胆盐等生化特性地衣芽孢杆菌BL-09还具有高产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种酶类及氨基酸、维生素、抗菌物质等多种生理活性物质，发酵后的固态培养基粘度很大，拉丝严重，培养器皿底部可见少量液体物质，证明其固态发酵中的保湿能力相对较强。

耐酸试验：

地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37℃，150r/min培养24h，于4℃、4000r/min离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，悬浮于pH分别为2.0、3.0及4.0的缓冲溶液中，37℃培养1-3h，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢杆菌BL-09具有良好的耐酸性。

耐热试验：

地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37℃，150r/min培养24h，于4℃、4000r/min离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，获得的菌体用适量无菌生理盐水稀释后于80℃水浴加热处理10min以获得芽孢，再分别于80℃、90℃和100℃下分别处理5-30min，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢杆菌BL-09具有良好的耐热性。

耐胆盐试验：

地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37℃，180r/min培养24h，于4℃、4000r/min离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，悬浮于含胆盐浓度分别为0.03%、0.10%、0.30%的生理盐水中，37℃培养1-6h，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢杆菌BL-09具有良好的耐胆盐性。

有益效果

1.本发明中采用地衣芽孢杆菌BL-09进行固态发酵豆粕。

2.本发明采用固态发酵生产成本低，投资的资金较少，在下游处理方便，污染小，设备结构简单、易操作；

3.采用地衣芽孢杆菌BL-09发酵豆粕、麸皮和玉米粉，可以使豆粕和玉米粉中的蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，提高营养物质的降解率，利于肠胃消化吸收，地衣芽孢杆菌BL-09良好的耐酸性、耐热性、耐胆盐性是其适应饲料复杂的加工步骤，能保持较高的活菌数和高活性的保证。

附图说明

图1地衣芽孢杆菌BL-09接种量对活菌数的影响

图2地衣芽孢杆菌BL-09发酵时间对活菌数的影响。

图3地衣芽孢杆菌BL-09进行固态发酵时，氨基态氮含量随时间变化趋势。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。

1.菌体的种子液制备

地衣芽孢杆菌BL-09从冻藏的甘油管中接到装有液体种子的培养基中，放置于摇床上，转速为150r/min，温度为37℃，培养24h。其中液体种子培养基质量百分比组成为：蛋白胨1%，葡萄糖2%，加水至100%，pH7.0-7.2。

2.固态发酵

地衣芽孢杆菌BL-09接种到湿灭好的豆粕、麸皮和玉米粉培养基，密封之后置于恒温培养箱静置培养。

固态发酵培养基质量百分比组成为：29%豆粕，29%麸皮，2%玉米粉，水分含量40%，115℃高压灭菌25min。

3.测定活菌数

一般采用平板计数法，操作步骤为：称取制备好的豆粕发酵制品10g，置于90ml的无菌生理盐水中，放置到摇床上震荡30min，摇匀后用移液枪取1ml的菌液加进另一个9ml的无菌生理盐水中，进行稀释，按照国标方法，依次做十倍梯度稀释。稀释完后，用移液枪分别取合适的稀释度1ml打进平板，倒入培养基混匀，依次做三个平行，置于培养箱中在37℃静置培养48h。

4.pH值的测定

称取10g发酵后的产品，放入三角瓶中，加入90ml的蒸馏水。用磁力搅拌器搅拌30min，静置10min后用精密pH计测定其pH值。

5.氨基态氮含量的测定

取10g发酵后的产品，用匀浆器破碎，之后与90ml的蒸馏水混合，在4℃冰箱放置1天。样品离心7000r/min，离心15min。上清液0.8ml置于试管中，然后加3.2ml蒸馏水、2.0ml显色剂，混匀，放入沸水浴中加热15min，同时作空白对照。然后冷水冷却，加入5.0ml40%乙醇溶液混匀，放置15min后用1cm比色杯，以空白管调零于570nm处测定A值。

实施例1:结合图1对地衣芽孢杆菌BL-09接种量对活菌数的影响进行说明

如图1所示，当地衣芽孢杆菌BL-09的接种量为2.0%(v/w)，培养温度37±1℃，培养时间24h，测得衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.11×10¹⁰cfu/g。

当地衣芽孢杆菌BL-09的接种量为5.0%(v/w)，培养温度37±1℃，培养时间24h，测得地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.55×10¹⁰cfu/g。

当地衣芽孢杆菌BL-09的接种量为8.0%(v/w)，培养温度37±1℃，培养时间24h，测得地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.31×10¹⁰cfu/g。

结果：地衣芽孢杆菌BL-09发酵时，其最适接种量为5.0%(v/w)。

实施例2:结合图2对固态发酵时间对活菌数的影响进行说明

细菌生长分别经历了延滞期、对数生长期、平衡期和衰退期，在不同时期，生长情况不同，分别对其取样进行活菌计数。

固态发酵培养基为：29%豆粕，29%麸皮，2%玉米粉，水分含量40%，115℃高压灭菌25min。

如图2所示，地衣芽孢杆菌BL-09接种量为5.0%(v/w)，培养温度37±1℃，培养时间24h，测得地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.10×10¹⁰cfu/g。

地衣芽孢杆菌BL-09接种量为5.0%(v/w)，培养温度37±1℃，培养时间36h，测得地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.36×10¹⁰cfu/g。

地衣芽孢杆菌BL-09接种量为5.0%(v/w)，培养温度37±1℃，培养时间48h，地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.57×10¹⁰cfu/g。

结果：综合考虑到生产成本和生产周期时，当地衣芽孢杆菌BL-09发酵时，最适发酵时间为48h。

结论：

当地衣芽孢杆菌BL-09接种量为5.0%(v/w)，培养温度37±1℃，培养时间48h后，其活菌数较高，测得地衣芽孢杆菌BL-09的活菌数为1.57×10¹⁰cfu/g,如图3所示，游离氨基态氮含量可达到750.1umol/g，较发酵前提高约7倍多。

Claims (6)

1.一种地衣芽孢杆菌益生菌制剂，所述地衣芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法包括地衣芽孢杆菌BL-09的种子培养及其固态发酵培养，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌BL-09保藏号为CGMCCNo.5686；

所述地衣芽孢杆菌BL-09的种子培养基质量百分比组成为：蛋白胨1％，葡萄糖2％，加水至100％，pH7.0-7.2；培养条件：放置于摇床上，转速为150r/min，温度为37℃，培养24h；

所述的地衣芽孢杆菌BL-09的固态发酵培养基质量百分比组成为：29％豆粕，29％麸皮，2％玉米粉，水分含量40％；

所述固态发酵的培养条件为：接种量为2.0-8.0％,单位为体积重量百分比，温度为37℃，培养12-48h。

2.根据权利要求1所述地衣芽孢杆菌益生菌制剂，其特征在于，地衣芽孢杆菌BL-09在发酵48h后，游离氨基态氮含量达到750.1μmol/g。

3.制备权利要求1所述地衣芽孢杆菌益生菌制剂的方法，包括地衣芽孢杆菌BL-09的种子培养及其固态发酵培养，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌BL-09保藏号为CGMCC No.5686；

所述地衣芽孢杆菌BL-09的种子培养条件：放置于摇床上，转速为150r/min，温度为37℃，培养24h；所述种子培养基质量百分比组成为：蛋白胨1％，葡萄糖2％，加水至100％，pH7.0-7.2；

所述固态发酵的培养条件为：接种量为2.0-8.0％,单位为体积重量百分比，温度为37℃，培养12-48h；所述地衣芽孢杆菌BL-09的固态发酵培养基质量百分比组成为：29％豆粕，29％麸皮，2％玉米粉，水分含量40％。

4.根据权利要求3所述地衣芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，其特征在于，发酵初期，pH呈下降趋势，pH最小值为5.50，在发酵的后期，其pH呈上升趋势，发酵48h后，其pH为6.50。

5.根据权利要求3所述地衣芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，其特征在于，地衣芽孢杆菌BL-09在发酵48h后，游离氨基态氮含量达到750.1μmol/g。

6.根据权利要求1-2任一所述地衣芽孢杆菌益生菌制剂在饲料中的应用，添加量为20-200克/吨。