CN103911328B - 凝结芽孢杆菌和干酪乳杆菌复合菌剂的制备 - Google Patents

Abstract

本发明属于饲料微生物技术领域，涉及一种凝结芽孢杆菌HM‑09和干酪乳杆菌HM‑09复合菌剂的制备。其制备方法包括种子培养及其固态发酵培养；步骤为：固态发酵培养基上首先接种凝结芽孢杆菌HM‑09种子液，2.0‑8.0%（v/w），温度30‑37℃,湿度60‑85%，发酵0‑12h，再接种干酪乳杆菌HM‑09，2.0‑8.0%（v/w），发酵总时间共计24‑48h；凝结芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No.6729，干酪乳杆菌保藏编号为CGMCC No.6736。采用混菌固态发酵，能提高产率和菌体浓度等，能提高饲料的储存性及稳定性，增强免疫，改善动物产品质量。

Description

凝结芽孢杆菌和干酪乳杆菌复合菌剂的制备

技术领域

本发明属于饲料微生物技术领域，涉及一种以豆粕、麸皮、玉米粉为基质，以益生菌凝结芽孢杆菌HM-09(Bacillus coagulansHM-09)和干酪乳杆菌HM-09(Lactobacilluscasei HM-09)进行固态发酵的应用技术，此技术可广泛应用于动物益生菌微生态等方面。

背景技术

目前，益生菌制品的研究和应用正日益受到人们的关注，比较常见的为采用益生菌直接与液态牛乳和豆乳发酵，得到功能性的酸牛奶或者酸豆奶，常用菌种为乳酸菌和保加利亚乳杆菌，其余则采用液态发酵，直接收集益生菌菌体，制作成益生菌粉剂、片剂或者胶囊。采用液态发酵会产生大量的废水，对环境污染较大，后处理比较困难，机器设备操作繁琐。而开发新的菌种、优化培养条件，提高益生菌产品中活菌含量，并提高益生菌活力，应是益生菌领域关注的发展方向。

公开号为103202391A的中国发明专利《一种有效预防及改善牛乳房炎的复合乳酸菌微生态制剂》，公开了一种预防及改善牛乳房炎的复合微生态制剂，此复合微生态制剂由一株干酪乳杆菌HM-09(L.casei HM-09)和一株植物乳杆菌HM-10（L.plantarum HM-10）组成，属于饲用微生态制剂领域。每克复合微生态制剂中干酪乳杆菌HM-09(L.caseiHM-09)质量分数为10%，植物乳杆菌HM-10（L.plan tarum HM-10）质量分数为10%，其余80%为沸石粉，同时复合微生态制剂中L.casei HM-09活菌数量≥2.5×10⁸cfu/_g，L.plan tarum HM-10活菌数量≥2.5×10⁸cfu/g。饲喂该复合微生态制剂能够有效预防及改善牛乳房炎，而且乳房炎越严重的乳区得到改善的效果越明显;同时能够增强动物机体免疫，有效降低患乳房炎牛乳中的体细胞数，提高牛奶品质。

公开号为103255080A的中国发明专利《一株用于乳仔猪养殖的优良凝结芽孢杆菌及其应用》，公开了一株用于乳仔猪养殖的优良凝结芽孢杆菌HM-09（Bacillus coagulansHM-09），属于饲用微生态制剂领域。凝结芽孢杆菌在饲料中的添加量为1×105cfu/g。本发明的凝结芽孢杆菌HM-09（Bacillus coagulans HM-09）已于2012年10月29日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心（国家专利局指定专利微生物保藏中心）保藏，保藏号：CGMCC No.6729。凝结芽孢杆菌HM-09饲喂断奶仔猪，能显著提高生长速度，降低料重比，减少断奶仔猪腹泻发生率，提高仔猪饲料利用率，提高断奶仔猪养殖的经济效益。

本申请采用凝结芽孢杆菌HM-09(Bacillus coagulans)和干酪乳杆菌HM-09混合固态发酵豆粕、麸皮和玉米粉，采用凝结芽孢杆菌HM-09和干酪乳杆菌HM-09进行混合固态发酵豆粕，可生产出一种具有酸香气味的发酵制品，改善动物饲料的适口性。且其生产成本低，投资的资金较少，在下游处理方便，污染小，设备结构简单、易操作。

发明内容

本发明目的在于提供一种采用凝结芽孢杆菌HM-09和干酪乳杆菌HM-09进行混合固态发酵豆粕、麸皮和玉米粉，可广泛应用于微生态领域的复合菌剂，并提供该复合菌剂的制备方法，此方法可以生产出具有特殊酸香味，且豆粕、麸皮和玉米粉发酵产品的活菌数高，豆粕蛋白质的降解率高。此制备方法生产成本低，可以提高经济效益并且操作简单。

本发明是通过下述技术方案实现的：

一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质可广泛应用于微生态领域的凝结芽孢杆菌和干酪乳杆菌复合菌剂，其制备方法：包括凝结芽孢杆菌HM-09和干酪乳杆菌HM-09的种子培养及其固态发酵培养。所述种子培养基为：蛋白胨2-5%，葡萄糖2-5%，加水至100%，pH7.0-7.2。固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:8-10:0.5-1，水份含量控制在40-75%，pH7.0-7.2。

所述种子培养条件：凝结芽孢杆菌HM-09于恒温箱中35-38℃，160-180转摇床培养20-24h；干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中33-38℃培养20-24h。

所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上首先接种凝结芽孢杆菌HM-09种子液，接种量为2.0-8.0%（v/w），控制发酵温度30-37℃,湿度60-85%，单菌发酵0-12h，再添加干酪乳杆菌HM-09，接种量为2.0-8.0%（v/w），其他条件不变，再发酵12-36h，共计发酵总时间为24-48h。

当先利用凝结芽孢杆菌HM-09单菌发酵12h后，再与干酪乳杆菌HM-09混菌发酵36h，共发酵48h后，游离氨基态氮含量可达到500.2umol/g，较发酵前提高约6倍；发酵制品中凝结芽孢杆菌HM-09活菌数为2.48×10⁹CFU/_g，干酪乳杆菌HM-09活菌数为3.50×10⁹CFU/_g。

所述复合菌剂的制备方法为：发酵结束后经流化床干燥获得干燥的培养物。

本发明产品应用于饲料，用于动物饲喂时，能有效提高饲料的利用效率15-33%。用于禽类饲喂时，料重比降低了1-5%，可延长产蛋期，增加单枚蛋重，经计算能提高禽类的年产蛋量1-10公斤以上。本发明产品在饲料中的添加量为20-100克/吨。

凝结芽孢杆菌HM-09和干酪乳杆菌HM-09分类名称分别为Bacillus coagulans和Lactobac illus casei，于2012年10月29日保藏，保藏号分别为CGMCC No.6729和CGMCCNo.6736。保藏地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

有益效果

1.本发明采用凝结芽孢杆菌HM-09和干酪乳杆菌HM-09进行混合固态发酵豆粕、麸皮和玉米粉。在混菌固态发酵中，菌株间的互利共栖协同作用，能提高产率和菌体浓度；多菌株的产酶、产酸和产营养物质能力、对基质的分解能力等要显著优于单菌发酵。混菌固态发酵还具有获得纯种发酵无法获得的产物，生长速度快，对底物利用率高，可多级转化，发酵后的微生物群体稳定，省工节能，简化工艺及发酵设备和易控制等诸多优点，且不易染菌。

采用凝结芽孢杆菌HM-09和干酪乳杆菌HM-09进行混合固态发酵豆粕，可生产出一种具有酸香气味的发酵制品，改善动物饲料的适口性。重要的是，凝结芽孢杆菌发酵饲料能提高发酵饲料中的营养物质及其适口性、饲料转化率的同时还具有以下诸多功能：产生苯乳酸等抑菌物质，提高饲料的储存性及稳定性；可替代抗生素作为动物生长促进剂，增强免疫，改善动物产品质量；产生胞外多糖，去除肠道内的活性氧，预防疾病；能产生芽孢，耐高温、耐磨损及肠道内各种消化液的作用，调节肠道微生态平衡，补充机体营养物质等多种保健功能。

2.本发明采用固态发酵生产成本低，投资的资金较少，在下游处理方便，污染小，设备结构简单、易操作，可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术；

3.采用凝结芽孢杆菌HM-09干酪乳杆菌HM-09进行混合发酵，可以产生乳酸及乙酸等酸味小分子物质，这些小分子物质赋予产品特有的酸香味、色泽和口感等感官特征的改善和多样化，发酵产品提高动物适口性；

4.采用凝结芽孢杆菌HM-09干酪乳杆菌HM-09混合发酵豆粕、麸皮和玉米粉，可以使豆粕和玉米粉中的蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，利于动物肠胃的消化吸收。微生物的相关酶的作用能有效的分解豆粕中的胰蛋白酶抑制剂、植酸、大豆凝血素、脲酶等多种抗营养因子，同时产生苯乳酸、乳酸、氨基酸、酶、维生素和生长促进剂等多种益生元，为动物提供一种富含凝结芽孢杆菌、干酪乳杆菌复合益生菌及益生元的高蛋白饲料。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。

1.菌体的种子液制备

将凝结芽孢杆菌HM-09和干酪乳杆菌HM-09从冻藏的甘油管中接到装有液体种子的培养基中，所述种子培养条件：凝结芽孢杆菌HM-09于恒温箱中35-38℃，160-180转摇床培养20-24h；干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中33-38℃培养20-24h。。

所述种子培养基为：蛋白胨2-5%，葡萄糖2-5%，加水至100%，pH7.0-7.2。

2.固态发酵

所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上首先接种凝结芽孢杆菌HM-09种子液，接种量为2.0-8.0%（v/w），控制发酵温度30-37℃,湿度60-85%，单菌发酵0-12h，再添加干酪乳杆菌HM-09，接种量为2.0-8.0%（v/w），其他条件不变，再发酵12-36h，共计发酵总时间为24-48h。

固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:8-10:0.5-1，水份含量控制在40-75%，pH7.0-7.2，115℃高压灭菌25min。

3.活菌数的测定

一般采用平板计数法，操作步骤为：称取制备好的豆粕发酵制品10g，置于90ml的无菌生理盐水中，放置到摇床上震荡30min，摇匀后用移液枪取1ml的菌液加进另一个9ml的无菌生理盐水中，进行稀释，按照国标方法，依次做十倍梯度稀释。稀释完后，用移液枪分别取合适的稀释度1ml打进平板，倒入培养基混匀，依次做三个平行，置于培养箱中在37℃静置培养48h。

4.pH值的测定

称取10g发酵后样品，放入三角瓶中，加入90ml的蒸馏水。用磁力搅拌器搅拌30min，静置10min后用精密pH计测定其pH值。

5.氨基态氮含量的测定

取10g发酵后样品，用匀浆器破碎，之后与90ml的蒸馏水混合，在4℃冰箱放置1天。样品离心7000r/min，离心15min。上清液0.8ml置于试管中，然后加3.2ml蒸馏水、2.0ml显色剂，混匀，放入沸水浴中加热15min，同时作空白对照。然后冷水冷却，加入5.0ml40%乙醇溶液混匀，放置15min后用1cm比色杯，以空白管调零于570nm处测定A值。

实施例1：

凝结芽孢杆菌和干酪乳杆菌复合菌剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养。

所述种子培养条件：凝结芽孢杆菌HM-09于恒温箱中35℃，160转摇床培养24h；干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中33℃培养20h。

所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上首先接种凝结芽孢杆菌HM-09种子液，接种量为2.0%（v/w），控制发酵温度30℃,湿度85%，培养12h，再添加干酪乳杆菌HM-09，接种量为5.0%（v/w），其他条件不变，混合发酵24h，发酵总时间共计36h。发酵结束经流化床干燥获得干燥的培养物。

所述种子培养基为：蛋白胨2%，葡萄糖5%，加水至100%，pH7.0-7.2。

所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在55%。

发酵结束后，测得凝结芽孢杆菌HM-09活菌数为1.27×10⁹cfu/g，干酪乳杆菌HM-09活菌数为3.33×10⁹cfu/g，游离氨基态氮含量达到487.5umol/g。

实施例2：

凝结芽孢杆菌和干酪乳杆菌复合菌剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养。

所述种子培养条件：凝结芽孢杆菌HM-09于恒温箱中38℃，180转摇床培养20h；干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中38℃培养24h。

所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上首先接种凝结芽孢杆菌HM-09种子液，接种量为8.0%（v/w），控制发酵温度37℃,湿度60%，单菌发酵6h，再添加干酪乳杆菌HM-09，接种量为2.0%（v/w），其他条件不变，再发酵36h，共计发酵总时间为42h。

发酵结束经流化床干燥方法获得干燥的培养物。

所述种子培养基为：蛋白胨5%，葡萄糖3%，加水至100%，pH7.0-7.2。

所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:9:1，水份含量控制在65%。

发酵结束后，测得凝结芽孢杆菌HM-09活菌数为1.61×10⁹cfu/g，干酪乳杆菌HM-09活菌数为2.86×10⁹cfu/g，游离氨基态氮含量达到451.0umol/g。

实施例3：

凝结芽孢杆菌和干酪乳杆菌复合菌剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养。

所述种子培养条件：凝结芽孢杆菌HM-09于恒温箱中37℃，170转摇床培养22h；干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中35℃培养22h。

所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上共同接种凝结芽孢杆菌HM-09种子液与干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量分别为5.0%(v/w)和2.0%(v/w)，控制发酵温度37℃,湿度70%混菌发酵时间为48h。发酵结束经流化床干燥方法获得干燥的培养物。

所述种子培养基为：蛋白胨2%，葡萄糖5%，加水至100%，pH7.0-7.2。

所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在55%。

发酵结束后，测得凝结芽孢杆菌HM-09活菌数为2.15×10⁹cfu/g，干酪乳杆菌HM-09活菌数为1.97×10⁹cfu/g，游离氨基态氮含量达到463.9umol/g。

实施例4：

凝结芽孢杆菌和干酪乳杆菌复合菌剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养。

所述种子培养条件：凝结芽孢杆菌HM-09于恒温箱中37℃，160转摇床培养24h；干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中36℃培养24h。

所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上首先接种凝结芽孢杆菌HM-09种子液，接种量为5.0%(v/w)，控制发酵温度37℃,湿度70%，混菌培养12h；再添加干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为5.0%(v/w)，其他条件不变，再发酵12h，共计发酵总时间为24h。发酵结束经流化床干燥方法获得干燥的培养物。

所述种子培养基为：蛋白胨2%，葡萄糖5%，加水至100%，pH7.0-7.2。

所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:10:1，水份含量控制在60%。

发酵结束后，测得凝结芽孢杆菌HM-09活菌数为1.04×10⁹cfu/g，干酪乳杆菌HM-09活菌数为1.85×10⁹cfu/g，游离氨基态氮含量达到403.3umol/_g。

实施例5：

凝结芽孢杆菌和干酪乳杆菌复合菌剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养。

所述种子培养条件：凝结芽孢杆菌HM-09于恒温箱中37℃，180转摇床培养24h；干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中37℃培养24h。

所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上首先接种凝结芽孢杆菌HM-09种子液，接种量为5.0%(v/w)，控制发酵温度37℃,湿度80%，混菌培养12h；再添加干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为2.0%(v/w)，其他条件不变，再发酵36h，共计发酵总时间为48h。发酵结束经流化床干燥方法获得干燥的培养物。

所述种子培养基为：蛋白胨2%，葡萄糖5%，加水至100%，pH7.0-7.2。

所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%。

发酵结束后，测得凝结芽孢杆菌HM-09活菌数为2.48×10⁹cfu/g，干酪乳杆菌HM-09活菌数为3.50×10⁹cfu/g，游离氨基态氮含量达到500.2umol/g。

Claims (9)

1.一种凝结芽孢杆菌和干酪乳杆菌复合菌剂，其制备方法包括凝结芽孢杆菌HM-09和干酪乳杆菌HM-09的种子培养及其固态发酵培养；

其特征在于，所述固态发酵培养的方法为：固态发酵培养基上首先接种凝结芽孢杆菌HM-09种子液，接种量为2.0-8.0％，控制发酵温度30-37℃,湿度60-85％，单菌发酵0-12h，再添加干酪乳杆菌HM-09，接种量为2.0-8.0％，其他条件不变，再发酵12-36h，共计发酵总时间为24-48h；

所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉＝10:8-10:0.5-1，水分含量控制在40-75％，pH7.0-7.2；

所述接种量单位为体积重量百分比；

所述凝结芽孢杆菌HM-09保藏编号为CGMCC No.6729，干酪乳杆菌HM-09保藏编号为CGMCC No.6736。

2.根据权利要求1所述凝结芽孢杆菌和干酪乳杆菌复合菌剂，其特征在于，所述种子培养的条件：凝结芽孢杆菌HM-09于恒温箱中35-38℃，160-180转摇床培养20-24h；干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中33-38℃培养20-24h；

所述种子培养的培养基为：蛋白胨2-5％，葡萄糖2-5％，加水至100％，pH7.0-7.2。

3.根据权利要求1所述凝结芽孢杆菌和干酪乳杆菌复合菌剂，其特征在于，

所述种子培养的条件：凝结芽孢杆菌HM-09于恒温箱中37℃，180转摇床培养24h；干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中37℃培养24h；

所述固态发酵培养的方法为：固态发酵培养基上首先接种凝结芽孢杆菌HM-09种子液，接种量为5.0％，控制发酵温度37℃,湿度80％，混菌培养12h；再添加干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为2.0％，其他条件不变，再发酵36h，共计发酵总时间为48h；

所述接种量单位为体积重量百分比；

所述种子培养的培养基为：蛋白胨2％，葡萄糖5％，加水至100％，pH7.0-7.2；

所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉＝10:10:0.5，水分含量控制在60％。

4.根据权利要求3所述凝结芽孢杆菌和干酪乳杆菌复合菌剂，其特征在于，发酵结束，凝结芽孢杆菌HM-09活菌数为2.48×10⁹cfu/g，干酪乳杆菌HM-09活菌数为3.50×10⁹cfu/g，游离氨基态氮含量达到500.2μmol/g。

5.权利要求1-4任一所述复合菌剂的制备方法，由凝结芽孢杆菌HM-09和干酪乳杆菌HM-09经种子培养及其固态发酵培养后，流化床干燥获得；其特征在于，

所述固态发酵培养的方法为：固态发酵培养基上首先接种凝结芽孢杆菌HM-09种子液，接种量为2.0-8.0％，控制发酵温度30-37℃,湿度60-85％，单菌发酵0-12h，再添加干酪乳杆菌HM-09，接种量为2.0-8.0％，其他条件不变，再发酵12-36h，共计发酵总时间为24-48h；

所述接种量单位为体积重量百分比；

所述凝结芽孢杆菌HM-09保藏编号为CGMCC No.6729，干酪乳杆菌HM-09保藏编号为CGMCC No.6736。

6.根据权利要求5所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述种子培养的条件：凝结芽孢杆菌HM-09于恒温箱中35-38℃，160-180转摇床培养20-24h；干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中33-38℃培养20-24h；

所述种子培养的培养基为：蛋白胨2-5％，葡萄糖2-5％，加水至100％，pH7.0-7.2。

7.根据权利要求5所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉＝10:8-10:0.5-1，水分含量控制在40-75％，pH7.0-7.2。

8.根据权利要求5所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，

所述种子培养的条件：凝结芽孢杆菌HM-09于恒温箱中37℃，180转摇床培养24h；干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中37℃培养24h；

所述固态发酵培养的方法为：固态发酵培养基上首先接种凝结芽孢杆菌HM-09种子液，接种量为5.0％，控制发酵温度37℃,湿度80％，混菌培养12h；再添加干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为2.0％，其他条件不变，再发酵36h，共计发酵总时间为48h，发酵完成经流化床干燥获得；

所述接种量单位为体积重量百分比；

所述种子培养的培养基为：蛋白胨2％，葡萄糖5％，加水至100％，pH7.0-7.2；

所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉＝10:10:0.5，水分含量控制在60％。

9.权利要求1-4任一所述复合菌剂在饲料中的应用，添加量为20-100克/吨。