CN103911326A - 凝结芽孢杆菌益生菌制剂的制备 - Google Patents

Abstract

本发明为凝结芽孢杆菌益生菌制剂的制备，属于益生菌制剂技术领域，所述益生菌制剂由固态发酵制备，固态发酵培养方法为：首先接种凝结芽孢杆菌HM-09，2.0-8.0%(v/w)，温度32-42℃，湿度70-85%，至pH降至6.5-6.8，接种乳双歧杆菌V9，3.0-5.0%(v/w)，温度32-37℃，湿度70-80%，混合培养24-48h后经流化床干燥获得。凝结芽孢杆菌HM-09保藏号：CGMCCNo.6729；乳双歧杆菌V9保藏号：CGMCCNo.5470。本发明利用分段接种技术，混菌发酵对菌种的生长、增殖具有互相促进作用，发酵后产品的色泽和口感等感官特征得到改善和多样化，同时提高了营养物质降解率。

Description

凝结芽孢杆菌益生菌制剂的制备

技术领域

本发明属于益生菌制剂技术领域，涉及一种以豆粕、麸皮、玉米粉为基质，以益生菌凝结芽孢杆菌HM-09(BacilluscoagulansHM-09)进行固态发酵的应用技术，此技术可广泛应用于动物益生菌微生态等方面。

背景技术

目前，益生菌制品多采用益生菌直接与液态牛乳和豆乳发酵，得到功能性的酸牛奶或者酸豆奶，其余则采用液态发酵，直接收集益生菌菌体，制作成益生菌粉剂、片剂或者胶囊。采用液态发酵会产生大量的废水，对环境污染较大，后处理比较困难，机器设备操作繁琐。因此本申请采用凝结芽孢杆菌HM-09(BacilluscoagulansHM-09)固态发酵豆粕、麸皮和玉米粉，采用固态发酵，其生产成本低，投资的资金较少，在下游处理方便，污染小，设备结构简单、易操作。采用凝结芽孢杆菌HM-09进行固态发酵豆粕，可生产出一种具有酸香气味的发酵制品，改善动物饲料的适口性。其蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，有利于动物肠胃消化吸收。

中国发明专利《一株用于乳仔猪养殖的优良凝结芽孢杆菌及其应用》公开了一株用于乳仔猪养殖的优良凝结芽孢杆菌，所述凝结芽孢杆菌HM-09（Bacilluscoagulans）已于2012年10月29日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号：CGMCCNo.6729。中国发明专利《一株用于母猪养殖的优良凝结芽孢杆菌及其应用》，公开了一株增强机体免疫功能、提高抗病能力以及改善妊娠母猪的繁殖性能的用于母猪养殖的优良凝结芽孢杆菌。所述凝结芽孢杆菌HM-09（Bacilluscoagulans）已于2012年10月29日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCCNo.6729。本发明还公开了其应用方法。中国发明专利《一株用于改善次等猪苗养殖的优良凝结芽孢杆菌及其应用》公开了一株可改善猪苗的健康状况、提高次等猪苗养殖的生产性能用于次等猪苗养殖的优良凝结芽孢杆菌。所述凝结芽孢杆菌HM-09（BacilluscoagulansHM-09）已于2012年10月29日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCCNo.6729。该发明还公开了其应用方法。

中国发明专利《用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌》，公开用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌HM-66、干酪乳杆菌F-08、植物乳杆菌HM-20和动物双歧杆菌V9均为益生菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为CGMCCNo.6733、CGMCCNo.6735、CGMCCNo.6744和CGMCCNo.5470，枯草芽孢杆菌HM-66、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20的保藏日期为2012年10月29日，动物双歧杆菌V9的保藏日期为2011年11月18日。该发明还公开了其应用方法。

发明内容

本发明目的在于采用凝结芽孢杆菌HM-09进行固态发酵。利用分段接种技术，先接种凝结芽孢杆菌HM-09一定时间后，再接种动物双歧杆菌乳亚种V9。凝结芽孢杆菌HM-09为兼性厌氧菌，而动物双歧杆菌乳亚种V9为严格厌氧菌，发酵前期凝结芽孢杆菌HM-09的生长、增殖及新陈代谢能够为动物双歧杆菌乳亚种V9的增殖提供丰富的营养物质及必要的厌氧环境，更利于动物双歧杆菌乳亚种V9生长的启动，且实验证明，加入动物双歧杆菌乳亚种V9混菌分段发酵后，凝结芽孢杆菌HM-09的活菌数有所增加。

本发明提供一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质可广泛应用于微生态领域的凝结芽孢杆菌益生菌制剂，并提供该益生菌制剂的固体发酵制备方法，该方法可以生产出具有特殊酸香味，可显著提高发酵产品的活菌数，提高饲料原料蛋白质的降解率及氨基态氮的含量。此制备方法生产成本低，可以提高经济效益并且操作简单。

本发明通过下述技术方案实现：

一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质可广泛应用于微生态领域的益生菌制剂，所述益生菌制剂的制备方法为固态发酵，步骤包括凝结芽孢杆菌HM-09和动物双歧杆菌乳亚种V9的种子培养及其固态发酵培养。

所述凝结芽孢杆菌HM-09种子培养基组成如下：蛋白胨10.0-15.0g，酵母膏10.0-15.0g，葡萄糖5.0-10.0g，MgSO₄·7H₂O0.5-1.0g，K₂HPO₄1.0-2.0g，MnSO₄50-100mg，加入1L蒸馏水，调节pH至7.0-7.2，动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养基组成为：蛋白胨20-50g，葡萄糖20-50g，加水至1L，pH7.0-7.2。固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:8-10:0.5-1，水份含量控制在40-75%，pH7.0-7.2。

所述凝结芽孢杆菌HM-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为160-180r/min，温度为35-45℃，培养20-24h；

所述动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养条件为30-38℃，静置培养20-24h；

所述固态发酵培养方法为：首先接种凝结芽孢杆菌HM-09，接种量为2.0-8.0%(v/w)，控制发酵温度32-42℃,湿度70-85%，至pH降至6.5-6.8，接种动物双歧杆菌乳亚种V9，接种量为3.0-5.0%(v/w)，控制发酵温度32-37℃,湿度70-80%，混合培养24-48h。

混合发酵初期，pH呈缓慢下降趋势，最低可降至5.0-5.5，在发酵的后期，pH呈上升趋势。最佳条件下，两者混合发酵48h后，其游离氨基态氮含量为：318.2umol/g，较发酵前游离氨基态氮含量提高约3倍；发酵制品中凝结芽孢杆菌HM-09活菌数为2.90×10⁹CFU/g，动物双歧杆菌乳亚种V9活菌数为5.22×10⁸CFU/g，凝结芽孢杆菌HM-09芽孢率较单独发酵提高了2.3倍。

所述益生菌制剂的制备方法为：发酵结束后经流化床干燥获得干燥的培养物。

本发明产品添加于饲料中，用于动物饲喂时，能有效提高饲料的利用效率12-30%。用于禽类饲喂时，可显著提高日增重、提高产蛋率，经计算能提高禽类的年产蛋量8-20%以上。本发明产品在饲料中的添加量为50-150克/吨。

凝结芽孢杆菌HM-09（Bacilluscoagulans）HM-09已于2012年10月29日保藏，保藏号：CGMCC No.6729。保藏地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。凝结芽孢杆菌HM-09分离自健康猪肠道中，可有效抑制有害菌的生长，改良肠道微生态环境，促进肠道发育，增强肠道功能，提高饲料品质，促进饲料的消化吸收，降低料重比。

动物双歧杆菌乳亚种V9（Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis）V9于2011年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号：CGMCCNo.5470。动物双歧杆菌乳亚种V9具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力；能够有效拮抗肠道致病菌，提高肠道抗致病菌感染能力；

有效预防缓解腹泻、便秘、腹痛、腹胀等肠应激综合症。

有益效果：

1.本发明中采用凝结芽孢杆菌HM-09和动物双歧杆菌乳亚种V9混合固态发酵豆粕、麸皮和玉米粉。凝结芽孢杆菌HM-09为兼性厌氧菌，而动物双歧杆菌乳亚种V9为严格厌氧菌。利用分段接种技术，混菌发酵中先接种凝结芽孢杆菌HM-09一定时间后，再接种动物双歧杆菌乳亚种V9。发酵前期凝结芽孢杆菌HM-09的生长、增殖及新陈代谢能够为动物双歧杆菌乳亚种V9的增殖提供丰富的营养物质及必要的厌氧环境，更利于动物双歧杆菌乳亚种V9生长的启动，且实验证明，加入动物双歧杆菌乳亚种V9混菌分段发酵后，凝结芽孢杆菌HM-09的活菌数有所增加。

2.采用凝结芽孢杆菌HM-09和动物双歧杆菌乳亚种V9混合固态发酵制备的产品，具有乳酸菌的基本特性，富含乳酸及乙酸等酸味小分子物质，赋予产品特有的酸香味，使产品的色泽和口感等感官特征得到改善和多样化，同时提高了营养物质降解率，增强了产品的营养价值和消化吸收率，提高了产品的适口性；同时具备芽孢菌的耐酸、耐盐及耐热等基本特性，使发酵产品具有良好的实用性与储存性。

3.采用凝结芽孢杆菌HM-09和动物双歧杆菌乳亚种V9发酵豆粕、麸皮和玉米粉，可以使豆粕和玉米粉中的蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，利于动物肠胃的消化吸收；能够降解豆粕中的多种抗营养因子，使得豆粕源性高蛋白饲料的生产及应用成为可能。应用于动物饲养，凝结芽孢杆菌产生的乳酸可抑制多种有害致病菌，促进肠道蠕动，有效治疗便秘，并能抑制酚、吲哚等有害物质，防治细胞老化。动物双歧杆菌乳亚种V9也同时具有防治便秘、肿瘤防治、保护肝脏等多种功效。

4.本发明采用固态发酵生产成本低，投资的资金较少，在下游处理方便，污染小，设备结构简单、易操作，可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明以豆粕、麸皮、玉米粉为基质，以益生菌凝结芽孢杆菌HM-09(Bacilluscoagulans)和动物双歧杆菌乳亚种V9进行固态发酵的应用技术。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

凝结芽孢杆菌HM-09分类名称为Bacilluscoagulans，于2012年10月29日保藏，保藏号：CGMCCNo.6729，保藏地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

动物双歧杆菌乳亚种V9分类名称为Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis，于2011年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号：CGMCCNo.5470。

1.菌体的种子液制备

将凝结芽孢杆菌HM-09、动物双歧杆菌乳亚种V9从冻藏的甘油管中分别接入液体种子培养基中培养。

所述凝结芽孢杆菌HM-09种子培养基组成如下：蛋白胨10.0-15.0g，酵母膏10.0-15.0g，葡萄糖5.0-10.0g，MgSO₄·7H₂O0.5-1.0g，K₂HPO₄1.0-2.0g，MnSO₄50-100mg，加入1L蒸馏水，调节pH至7.0-7.2；动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养基组成为：蛋白胨20-50g，葡萄糖20-50g，加水至1L，pH7.0-7.2。

所述凝结芽孢杆菌HM-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为160-180r/min，温度为35-45℃，培养20-24h；

所述动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养条件为30-38℃，静置培养20-24h；

2.固态发酵

首先接种凝结芽孢杆菌HM-09，接种量为2-8%(v/w)，控制发酵温度32-42℃,湿度70-85%，至pH降至6.5-6.8，接种动物双歧杆菌乳亚种V9，接种量为3.0-5.0%(v/w)，控制发酵温度32-37℃,湿度70-80%，混合培养24-48h。

所述固态发酵培养基质量比例组成为豆粕：麸皮：玉米粉=10:8-10:0.5-1，水份含量控制在40-75%，pH7.0-7.2，115℃高压灭菌25min后使用。

3.活菌数的测定

一般采用平板计数法，操作步骤为：称取制备好的发酵后样品10g，置于90ml的无菌生理盐水中，放置到摇床上震荡30min，摇匀后用移液枪取1ml的菌液加进另一个9ml的无菌生理盐水中，进行稀释，按照国标方法，依次做十倍梯度稀释。稀释完后，用移液枪分别取合适的稀释度1ml打进平板，倒入培养基混匀，依次做三个平行，置于培养箱中在37℃静置培养48h。

4.pH值的测定

称取10g发酵后样品，放入三角瓶中，加入90ml的蒸馏水。用磁力搅拌器搅拌30min，静置10min后用精密pH计测定其pH值。

5.氨基态氮含量的测定

取10g发酵后样品，用匀浆器破碎，之后与90ml的蒸馏水混合，在4℃冰箱放置1天。样品离心7000r/min，离心15min。上清液0.8ml置于试管中，然后加3.2ml蒸馏水、2.0ml显色剂，混匀，放入沸水浴中加热15min，同时作空白对照。然后冷水冷却，加入5.0ml40%乙醇溶液混匀，放置15min后用1cm比色杯，以空白管调零于570nm处测定A值。

实施例1：凝结芽孢杆菌HM-09益生菌制剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养。

凝结芽孢杆菌HM-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为170r/min，温度为37℃，培养24h；

凝结芽孢杆菌HM-09种子培养基组成如下：蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖6.0g，MgSO₄·7H₂O1.0g，K₂HPO₄2.0g，MnSO₄50mg，加入1L蒸馏水，调节pH至7.0-7.2；

固态发酵培养基质量比例组成为豆粕：麸皮：玉米粉=10:8:1，水份含量控制在60%，115℃高压灭菌25min。

凝结芽孢杆菌HM-09的接种量分别为2.0%（v/w）、5.0%（v/w）和8.0%（v/w），培养温度37℃,湿度70%，单菌固态发酵48h后测其活菌数及游离氨基态氮的含量。

当凝结芽孢杆菌HM-09的接种量分别为2.0%（v/w）、5.0%（v/w）和8.0%（v/w），发酵制品中凝结芽孢杆菌HM-09活菌数分别为1.67×10⁹CFU/g、1.94×10⁹CFU/g和1.85×10⁹CFU/g，游离氨基态氮的含量分别为187.9umol/g、224.8umol/g和216.2umol/g。

实施例2：凝结芽孢杆菌HM-09益生菌制剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养。

凝结芽孢杆菌HM-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为170r/min，温度为37℃，培养24h；

凝结芽孢杆菌HM-09种子培养基组成如下：蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖6.0g，MgSO₄·7H₂O1.0g，K₂HPO₄2.0g，MnSO₄50mg，加入1L蒸馏水，调节pH至7.0-7.2；

动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养条件为37℃，静置培养24h；

动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养基组成为：蛋白胨20g，葡萄糖20g，加水至1L，pH7.0-7.2。

固态发酵培养基质量比例组成为豆粕：麸皮：玉米粉=10:8:1，水份含量控制在60%，115℃高压灭菌25min。

首先接种凝结芽孢杆菌HM-09，接种量为2.0%（v/w），培养温度32℃,湿度70%，至pH降至6.5，接种动物双歧杆菌乳亚种V9，接种量为3.0%（v/w），控制发酵温度35℃,湿度75%，共计混合培养36h。

发酵制品中凝结芽孢杆菌HM-09活菌数为1.88×10⁹CFU/g，动物双歧杆菌乳亚种V9活菌数为3.71×10⁸CFU/g，游离氨基态氮的含量为:264.6umol/g。

实施例3:凝结芽孢杆菌HM-09益生菌制剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养。凝结芽孢杆菌HM-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为160r/min，温度为37℃，培养20h；

凝结芽孢杆菌HM-09种子培养基组成如下：蛋白胨15.0g，酵母膏15.0g，葡萄糖10.0g，MgSO₄·7H₂O1.0g，K₂HPO₄2.0g，MnSO₄50mg，加入1L蒸馏水，调节pH至7.0-7.2；

动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养条件为37℃，静置培养20h；

动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养基组成为：蛋白胨50g，葡萄糖20g，加水至1L，pH7.0-7.2。

固态发酵培养基质量比例组成为豆粕：麸皮：玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%，115℃高压灭菌25min。

首先接种凝结芽孢杆菌HM-09，接种量为5.0%（v/w），培养温度32℃,湿度70%，至pH降至6.5，接种动物双歧杆菌乳亚种V9，接种量为3.0%（v/w），控制发酵温度35℃,湿度75%，共计混合培养36h。

发酵制品中凝结芽孢杆菌HM-09活菌数为2.19×10⁹CFU/g，动物双歧杆菌乳亚种V9活菌数为3.71×10⁸CFU/g，游离氨基态氮的含量为281.1umol/g。

实施例4:凝结芽孢杆菌HM-09益生菌制剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养。

凝结芽孢杆菌HM-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为180r/min，温度为45℃，培养24h；

凝结芽孢杆菌HM-09种子培养基组成如下：蛋白胨12.0g，酵母膏12.0g，葡萄糖6.0g，MgSO₄·7H₂O0.5g，K₂HPO₄2.0g，MnSO₄100mg，加入1L蒸馏水，调节pH至7.0-7.2；

动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养条件为35℃，静置培养24h；

动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养基组成为：蛋白胨30g，葡萄糖30g，加水至1L，pH7.0-7.2。

固态发酵培养基质量比例组成为豆粕：麸皮：玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%，115℃高压灭菌25min。

首先接种凝结芽孢杆菌HM-09，接种量为8.0%（v/w），培养温度35℃,湿度70%，至pH降至6.5，接种动物双歧杆菌乳亚种V9，接种量为3.0%（v/w），控制发酵温度37℃,湿度75%，共计混合培养48h。

发酵制品中凝结芽孢杆菌HM-09活菌数为2.34×10⁹CFU/g，动物双歧杆菌乳亚种V9活菌数为4.13×10⁸CFU/g，游离氨基态氮的含量为300.7umol/g。

实施例5:凝结芽孢杆菌HM-09益生菌制剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养。

凝结芽孢杆菌HM-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为170r/min，温度为37℃，培养24h；

凝结芽孢杆菌HM-09种子培养基组成如下：蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖6.0g，MgSO₄·7H₂O1.0g，K₂HPO₄2.0g，MnSO₄50mg，加入1L蒸馏水，调节pH至7.0-7.2；

动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养条件为37℃，静置培养24h；

动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养基组成为：蛋白胨20g，葡萄糖20g，加水至1L，pH7.0-7.2。

固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%，115℃高压灭菌25min。

首先接种凝结芽孢杆菌HM-09，接种量为5.0%（v/w），培养温度37℃,湿度80%，至pH降至6.5，接种动物双歧杆菌乳亚种V9，接种量为3.0%（v/w），控制发酵温度37℃,湿度80%，共计混合培养48h。

发酵制品中凝结芽孢杆菌HM-09活菌数为2.90×10⁹CFU/g，动物双歧杆菌乳亚种V9活菌数为5.22×10⁸CFU/g，游离氨基态氮的含量为；318.2umol/g。

实施例6:凝结芽孢杆菌HM-09益生菌制剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养。

凝结芽孢杆菌HM-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为170r/min，温度为37℃，培养24h；

凝结芽孢杆菌HM-09种子培养基组成如下：蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖6.0g，MgSO₄·7H₂O1.0g，K₂HPO₄2.0g，MnSO₄50mg，加入1L蒸馏水，调节pH至7.0-7.2；

动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养条件为37℃，静置培养24h；

动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养基组成为：蛋白胨20g，葡萄糖20g，加水至1L，pH7.0-7.2。

固态发酵培养基质量比例组成为豆粕：麸皮：玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%，115℃高压灭菌25min。

固态培养基同时接种接种凝结芽孢杆菌HM-09与动物双歧杆菌乳亚种V9，接种量分别为5.0%（v/w）与3.0%（v/w），控制发酵温度37℃,湿度70%，共计混合培养48h。

发酵制品中凝结芽孢杆菌HM-09活菌数为2.08×10⁹CFU/g，动物双歧杆菌乳亚种V9活菌数为3.19×10⁸CFU/g，游离氨基态氮的含量为；275.6umol/g。

综合考虑到生产成本和生产周期时，凝结芽孢杆菌HM-09制备益生菌制剂的最佳固态发酵培养工艺为：首先接种凝结芽孢杆菌HM-09，接种量为5.0(v/w)，控制发酵温度37℃,湿度80%，至pH降至6.5，再接种动物双歧杆菌乳亚种V9，接种量为3.0(v/w)，控制发酵温度37℃,湿度80%，共计混合培养48h，发酵结束后游离氨基态氮的含量为318.2umol/g。

Claims (10)

1.一种凝结芽孢杆菌益生菌制剂，所述益生菌制剂由固态发酵制备，包括菌种培养及其固态发酵培养，其特征在于，固态发酵培养方法为：首先接种凝结芽孢杆菌HM-09，接种量为2.0-8.0%，控制发酵温度32-42℃,湿度70-85%，至pH降至6.5-6.8，接种动物双歧杆菌乳亚种V9，接种量为3.0-5.0%，控制发酵温度32-37℃,湿度70-80%，混合培养24-48h；

所述接种量单位为体积重量百分比；

所述凝结芽孢杆菌HM-09（Bacilluscoagulans），保藏号：CGMCCNo.6729；

所述动物双歧杆菌乳亚种V9（Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis），保藏号：CGMCCNo.5470。

2.根据权利要求1所述凝结芽孢杆菌益生菌制剂，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌HM-09种子培养基组成如下：蛋白胨10.0-15.0g，酵母膏10.0-15.0g，葡萄糖5.0-10.0g，MgSO₄·7H₂O0.5-1.0g，K₂HPO₄1.0-2.0g，MnSO₄50-100mg，加入1L蒸馏水，调节pH至7.0-7.2；动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养基组成为：蛋白胨20-50g，葡萄糖20-50g，加水至1L，pH7.0-7.2；固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:8-10:0.5-1，水份含量控制在40-75%，pH7.0-7.2。

3.根据权利要求1所述凝结芽孢杆菌益生菌制剂，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌HM-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为160-180r/min，温度为35-45℃，培养20-24h；所述动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养条件为30-38℃，静置培养20-24h。

4.根据权利要求1所述凝结芽孢杆菌益生菌制剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养；其特征在于，

首先接种凝结芽孢杆菌HM-09，接种量为5.0%，培养温度37℃,湿度80%，至pH降至6.5，接种动物双歧杆菌乳亚种V9，接种量为3.0%，控制发酵温度37℃,湿度80%，共计混合培养48h；

所述接种量单位为体积重量百分比；

所述凝结芽孢杆菌HM-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为170r/min，温度为37℃，培养24h；

所述动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养条件为37℃，静置培养24h；

所述凝结芽孢杆菌HM-09种子培养基组成如下：蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖6.0g，MgSO₄·7H₂O1.0g，K₂HPO₄2.0g，MnSO₄50mg，加入1L蒸馏水，调节pH至7.0-7.2；动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养基组成为：蛋白胨20g，葡萄糖20g，加水至1L，pH7.0-7.2；

所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%，115℃高压灭菌25min。

5.根据权利要求4所述凝结芽孢杆菌益生菌制剂，其特征在于，发酵制品中凝结芽孢杆菌HM-09活菌数为2.90×10⁹CFU/g，动物双歧杆菌乳亚种V9活菌数为5.22×10⁸CFU/g，游离氨基态氮的含量为318.2umol/g。

6.权利要求1-5任一所述凝结芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，步骤包括菌种培养及其固态发酵培养，其特征在于，固态发酵培养方法为：首先接种凝结芽孢杆菌HM-09，接种量为2.0-8.0%，控制发酵温度32-42℃,湿度70-85%，至pH降至6.5-6.8，接种动物双歧杆菌乳亚种V9，接种量为3.0-5.0%，控制发酵温度32-37℃,湿度70-80%，混合培养24-48h；

所述接种量单位为体积重量百分比；

所述凝结芽孢杆菌HM-09（Bacilluscoagulans），保藏号：CGMCCNo.6729；

所述动物双歧杆菌乳亚种V9（Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis），保藏号：CGMCCNo.5470。

7.根据权利要求6所述凝结芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌HM-09种子培养基组成如下：蛋白胨10.0-15.0g，酵母膏10.0-15.0g，葡萄糖5.0-10.0g，MgSO₄·7H₂O0.5-1.0g，K₂HPO₄1.0-2.0g，MnSO₄50-100mg，加入1L蒸馏水，调节pH至7.0-7.2；动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养基组成为：蛋白胨20-50g，葡萄糖20-50g，加水至1L，pH7.0-7.2；固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:8-10:0.5-1，水份含量控制在40-75%，pH7.0-7.2。

8.根据权利要求6所述凝结芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌HM-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为160-180r/min，温度为35-45℃，培养20-24h；所述动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养条件为30-38℃，静置培养20-24h。

9.根据权利要求6所述凝结芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，包括菌种培养及其固态发酵培养，发酵结束后经流化床干燥获得干燥的培养物，其特征在于，首先接种凝结芽孢杆菌HM-09，接种量为5.0%，培养温度37℃,湿度80%，至pH降至6.5，接种动物双歧杆菌乳亚种V9，接种量为3.0%，控制发酵温度37℃,湿度80%，共计混合培养48h；

所述接种量单位为体积重量百分比；

所述凝结芽孢杆菌HM-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为170r/min，温度为37℃，培养24h；

所述动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养条件为37℃，静置培养24h；

所述凝结芽孢杆菌HM-09种子培养基组成如下：蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖6.0g，MgSO₄·7H₂O1.0g，K₂HPO₄2.0g，MnSO₄50mg，加入1L蒸馏水，调节pH至7.0-7.2；动物双歧杆菌乳亚种V9种子培养基组成为：蛋白胨20g，葡萄糖20g，加水至1L，pH7.0-7.2；

所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%，115℃高压灭菌25min。

10.权利要求1-5任一所述凝结芽孢杆菌益生菌制剂在饲料中的应用，添加量为50-150克/吨。