CN116855413A - 利用鼠李糖乳杆菌YSs069制备调节人体微生态平衡的生物活性物质及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体提供了一种利用鼠李糖乳杆菌YSs069制备调节人体微生态平衡的生物活性物质及其应用。本发明所述的包含鼠李糖乳杆菌YSs069的生物活性物质，包括如下组分：膳食纤维、木糖醇、海藻糖、蔓越莓果粉和鼠李糖乳杆菌YSs069。本发明的生物活性物质制备工艺简单、成本低廉、使用方便，且具有良好的调节肠道菌群的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种利用鼠李糖乳杆菌YSs069制备调节人体微生态平衡的生物活性物质及其应用。
背景技术
人体所携带的微生物细胞数达百万亿之多，这些数量庞大的共生微生物群体主要分布于人体的皮肤、口腔以及胃肠道，其中肠道是微生物最为集中的部位。实验证实，在人体微生态系统中，肠道微生态是主要的，最活跃的，对人体健康具有显著的影响。肠道微生态系统是指由肠道菌群等生物成分与食源性非生物成分(未被消化的食物)以及来自胃、肠、胰和肝的分泌物(如激素、酶、黏液和胆盐等)共同构成的位于肠道的局部的生态系统。可以说肠道菌群对宿主的营养、代谢以及免疫功能起到了至关重要的作用，对维持人体健康十分重要，是实现宿主正常生理功能不可或缺的一部分。
肠道是人体消化吸收的重要场所，也是人体最大的免疫器官，并有研究称肠道为人体第二个大脑，原因在于肠道内广泛分布的神经系统。肠道的健康取决于肠道的活动性。健康人体中病菌会受到肠内有益菌群的抵抗，不能在短时间内侵入人体其他的循环，很快就随着大小便排出体外，不能致使人生病，但是一旦肠道内的菌群失衡，有害细菌与食物发酵产生气体会导致腹胀、恶心、呕吐；肠道运动畅，大便很容易积累在肠内，形成宿便，成为各种疾病的根源。肠道菌群间的平衡受宿主的生理、食物、药物和肠道菌的相互作用等影响，各种因素都会破坏菌相间的平衡，导致肠道从有益菌占优势转向有害菌占优势，从而造成许多肠道疾病。因此，增加肠道有益菌的数量，减少有害菌数量，是保证肠胃健康运转的关键所在。
目前，调整肠道菌群的方式主要以补充益生菌种类和数量、补充益生菌所需营养物质、抑制或杀灭肠道有害菌、增强人体免疫力以提高巨噬细胞对有害菌的吞噬作用等方式以达到肠道菌群平衡的目的。尽管如此，但是现有包含益生菌的补剂大多在加工、运输及保质期储存的过程中容易丧失活性，不易维持长期稳定，或进入人体胃肠道，与胃酸、胆汁或消化液等人体内环境接触后，会大量死亡或凋亡，益生菌的效用减弱。因此，获得一种长期温度，且能改善肠道微生态平衡的组合物尤其重要。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)多存在于人和动物的肠道内，细菌分类学属于乳杆菌属，鼠李糖亚种，是厌氧耐酸、不产芽孢的一种革兰氏阳性益生菌。在厌氧情况下能很好生长，肠道黏着率较高，定植能力强，其耐肠道环境的能力优于普通酸奶菌种和其它益生菌菌种，起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻等作用。
发明内容
本发明的目的就在于利用鼠李糖乳杆菌YSs069制备调节人体微生态平衡的生物活性物质，该生物活性物质制备工艺简单、成本低廉、使用方便，且具有良好的调节肠道菌群的作用。
本发明的目的是通过如下方案实现的：
一种鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）YSs069，所述鼠李糖乳杆菌YSs069于2023年03月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉，保藏编号为CCTCC NO：M 2023346。
一种生物活性物质，包含鼠李糖乳杆菌YSs069。
一种包含鼠李糖乳杆菌YSs069的生物活性物质，包括如下组分：膳食纤维、木糖醇、海藻糖、蔓越莓果粉和鼠李糖乳杆菌YSs069。
进一步地，以重量份数计算，包括如下组分：1～20份膳食纤维、3～8份木糖醇、1～20份海藻糖、3～8份蔓越莓果粉和10～35份鼠李糖乳杆菌YSs069。
进一步地，以重量份数计算，所述膳食纤维：木糖醇：海藻糖；蔓越莓果粉为0.5～4:0.5～1.5:0.5～4:0.5～1.5。
进一步地，以重量份数计算，所述膳食纤维：木糖醇：海藻糖；蔓越莓果粉为3:1:1:1或1:1:3:1；优选1:1:3:1。
进一步的，还包括罗伊氏乳杆菌、乳双歧杆菌和副干酪乳杆菌中的一种或多种；优选地，所述罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）YSs207，所述罗伊氏乳杆菌YSs207于2023年03月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉，保藏编号为CCTCC NO：M 2023347。
在本发明的一个实施方式中，所述生物活性物质，按重量份数计算，包括如下组分：1～20份膳食纤维、3～8份木糖醇、1～20份海藻糖、3～8份蔓越莓果粉、10～35份鼠李糖乳杆菌YSs069、15～20份罗伊氏乳杆菌、12～17份乳双歧杆菌和10～17份副干酪乳杆菌。
进一步地，还包含低聚木糖。
优选地，以重量份数计算，所述低聚木糖为5～15份。
在本发明的一种实施方式中，所述生物活性物质，按重量分数计算，包括如下组分：1～20份膳食纤维、3～8份木糖醇、1～20份海藻糖、3～8份蔓越莓果粉、5～15份低聚木糖、10～35份鼠李糖乳杆菌YSs069、15～20份罗伊氏乳杆菌、12～17份乳双歧杆菌和10～17份副干酪乳杆菌。
本发明还提供一种鼠李糖乳杆菌YSs069在制备调节人体微生态平衡药物中的应用；优选地，在制备调节肠道微生态平衡药物中的应用。
本发明还提供一种上述包含鼠李糖乳杆菌YSs069的生物活性物质在制备调节人体微生态平衡药物中的应用；优选地，在制备调节肠道微生态平衡药物中的应用。
在本发明中，所述调节人体肠道微生态平衡包括抑制肠道有害菌增殖，所述有害菌可选地包括大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等；优选大肠杆菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。
本发明的有益效果：
本发明提供的鼠李糖乳杆菌YSs069的生物活性物质，一方面可耐受胃酸、胆盐等机体胃肠内环境，增加益生菌存活率，使益生菌能够在肠道发挥作用；另一方面可调节肠道环境，辅助人体微生态平衡。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1
按重量份数计算，分别称取12份膳食纤维、5份木糖醇、5份海藻糖、5份蔓越莓果粉，使用无菌注射用水溶解，混匀，配制成溶液；再加入17份罗伊氏乳杆菌YSs207、15份鼠李糖乳杆菌YSs069、15份乳双歧杆菌V9、15份副干酪乳杆菌N1115，混匀，将混匀后的溶液在-60℃经预冻处理12h后依次在真空环境下(0.1Pa)进行冷冻干燥处理(设定冷陷温度≤-50℃)至粉末的水分含量低至2.0wt％以下，将冻干粉过90目筛即得。
实施例2
按重量份数计算，分别称取15份膳食纤维、5份木糖醇、5份海藻糖、5份蔓越莓果粉，使用无菌注射用水溶解，混匀，配制成溶液；再加入17份罗伊氏乳杆菌YSs207、15份鼠李糖乳杆菌YSs069、15份乳双歧杆菌V9、15份副干酪乳杆菌N1115，混匀，将混匀后的组合物在-60℃经预冻处理12h后依次在真空环境下(0.1Pa)进行冷冻干燥处理(设定冷陷温度≤-50℃)至粉末的水分含量低至2.0wt％以下，将冻干粉过90目筛即得。
实施例3
按重量份数计算，分别称取5份膳食纤维、5份木糖醇、15份海藻糖、5份蔓越莓果粉，使用无菌注射用水溶解，混匀，配制成溶液；再加入17份罗伊氏乳杆菌YSs207、15份鼠李糖乳杆菌YSs069、15份乳双歧杆菌V9、15份副干酪乳杆菌N1115，混匀，将混匀后的组合物在-60℃经预冻处理12h后依次在真空环境下(0.1Pa)进行冷冻干燥处理(设定冷陷温度≤-50℃)至粉末的水分含量低至2.0wt％以下，将冻干粉过90目筛即得。
实施例4
按重量份数计算，分别称取5份膳食纤维、5份木糖醇、15份海藻糖、5份蔓越莓果粉，使用无菌注射用水溶解，混匀，配制成溶液；再加入30份鼠李糖乳杆菌YSs069，混匀，将混匀后的组合物在-60℃经预冻处理12h后依次在真空环境下(0.1Pa)进行冷冻干燥处理(设定冷陷温度≤-50℃)至粉末的水分含量低至2.0wt％以下，将冻干粉过90目筛即得。
实施例5
按重量份数计算，分别称取5份膳食纤维、5份木糖醇、15份海藻糖、5份蔓越莓果粉，使用无菌注射用水溶解，混匀，配制成溶液；再加入17份罗伊氏乳杆菌YSs207、15份乳双歧杆菌V9、15份副干酪乳杆菌N1115，混匀，将混匀后的组合物在-60℃经预冻处理12h后依次在真空环境下(0.1Pa)进行冷冻干燥处理(设定冷陷温度≤-50℃)至粉末的水分含量低至2.0wt％以下，将冻干粉过90目筛即得。
实施例6
按重量份数计算，分别称取12份膳食纤维、8份桑叶粉、4份菊粉、4份甘草粉、10份低聚木糖，使用无菌注射用水溶解，混匀，配制成溶液；再加入17份罗伊氏乳杆菌YSs207、15份鼠李糖乳杆菌YSs069、15份乳双歧杆菌V9、15份副干酪乳杆菌N1115，混匀，将混匀后的组合物在-60℃经预冻处理12h后依次在真空环境下(0.1Pa)进行冷冻干燥处理(设定冷陷温度≤-50℃)至粉末的水分含量低至2.0wt％以下，将冻干粉过90目筛即得。
实验例1稳定性考察
分别取实施例1-6制备的组合物5g，根据《国标GB4789.—2016食品微生物菌落总数的测定》中的方法测定活菌数量，然后于温度为38-40℃、湿度为50-60％的培养箱中放置2个月，再次测定活菌数量，计算活菌存活率。
表1活菌存活率测定结果
本发明实施例制备的益生菌粉储存2个月后，益生菌存活率较高，表明其存放稳定性较好。
实验例2不同条件下的耐受性实验
2.1酸性条件下耐受考察
在500mL的纯化水中加入0.5mol的稀盐酸调节pH值至1.5，然后加入1.5g胃蛋白酶，充分溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌得到人工胃液。取实施例3制备的组合物0.5g加入到上述人工胃液中，充分溶解，在37℃恒温震荡环境中反应4h，每隔2h取样，稀释，用固体MRS培养基划线检测鼠李糖乳杆菌活菌数量。
表2酸性条件下活菌存活率
从上表可以看出，本发明的组合物在胃液类似的环境中有很高的存活率，充分的表明本发明的组合物具有很强的耐酸性。
2.2碱性环境下耐受考察
准确称取6.8gKH2PO4加入500mL纯化水充分溶解，用0.25MmNaOH调节pH值为6.8；然后加入2.5g胰蛋白酶，充分溶解，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，得到人工肠液。取实施例3制备的组合物0.5g加入到上述人工肠液中，充分溶解，在37℃恒温条件下震荡消化3h，每隔1h取样，稀释，用固体MRS培养基划线检测鼠李糖乳杆菌活菌数量。
表3碱性条件下活菌存活率
实验例3体外抑菌实验
将实施例3组合物使用无菌注射用水溶解，按2.0％接种量接种于MRS培养液中，在37℃环境中180rpm/min震荡培养24h，6000rpm/min，4℃离心10min，取上清液，0.2μm无菌滤膜过滤，备用，采用牛津杯法(牛津杯外径×内径×高度＝8mm×6mm×10mm)测定抑菌活性，每杯150μL上清液，取大肠杆菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC 25923，沙门氏菌ATCC14028，37℃培养24h，测量抑菌圈直径，结果显示对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径可达17mm以上，对大肠杆菌抑菌圈可达15mm以上，对沙门氏菌抑菌圈可达20mm以上。
实验例4对小鼠肠道菌群变化量的影响实验
4.1健康成年雌性BALB/C小鼠60只(SPF级)，体重范围20g±2g，实验动物随机分为3组，即空白对照组、实施例3一组、实施例4一组，每组20只，按20/kg灌胃给予相应受试物(空白对照组灌胃给予等量生理盐水)，每日一次，连续给样20d。给予受试物前及末次给样24h后检测肠道菌群。
4.2实验试剂：双歧杆菌选择性培养基(BBL)、乳酸杆菌选择性培养基(LS)、肠杆菌培养基(EMB)，肠球菌培养基(EC)、产气荚膜梭菌培养基(TSC)。
4.3在给药前，无菌采集小鼠粪便，加20％灭菌甘油生理盐水，以1：10稀释，制成均匀混悬液，1000转速离心，取上清，存于-80℃冰箱，待分析，最后一次给予组合物24h后，与实验前同样方式取直肠粪便，处理方法同上。
4.4肠道菌实验样品处理方法：将采集到的肠道菌实验粪便样品，依次10倍递增稀释成一系列不同稀释度的含菌液至10-8，选择合适的稀释浓度分别接种在各培养基上，按要求进行培养，按灌胃前后各肠道菌群数量的对数的差值进行成组资料分析。
4、雄性Balb/c小鼠给予受试物前及末次给样后24h，根据《国标GB4789.—2016食品微生物菌落总数的测定》中的方法检测肠道菌群菌落数，连续两只小鼠的粪便放入同一无菌离心管，结果以菌落数的对数值(lg CFU)表示，并按规范规定的结果判定标准对实验结果进行分析，结果见下表。
表4组合物对小鼠肠道菌群的影响
与空白对照组比较，实施例3和4组降低小鼠肠道内肠球菌、肠杆菌和产气荚膜梭菌数量；实施例3和4组乳酸杆菌和双歧杆菌数量明显增加。
实验例5小鼠腹泻模型中组合物对肠道微生态的影响试验
为验证组合物对肠道菌群的调节作用，采用小鼠腹泻模型进行验证。
配制组合物溶液：取5g组合物，加入10mL的纯净水，充分混匀。参照赵艳玲等(2009)的方法建立小鼠腹泻模型，取腹泻小鼠，设置实验例3、4和空白对照组、及正常对照组(不进行任何腹泻干预，仅提供正常饲喂条件)，每组10只，雌雄各半，模型建立后第一天和第二天饲喂约10cells的沙门氏菌，在正常饮食的情况下，从第三天开始分别管饲不同实验例的组合物溶液，每只小鼠0.8mL/天，连续饲喂7天，空白对照组用生理盐水替代微生态混合溶液。每日观察小鼠活动和粪便性状。在实验第10天处死小鼠，取肠道内容物，空白对照组如在10天内死亡的，则取肠道内容物，并及时提取内容物DNA。对小鼠肠道微生物相对丰度进行检测，采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒，按照说明书提取第十天时小鼠小肠内容物DNA。进行肠道微生物16S rDNA的检测，对肠道微生物相对丰度进行分析。
表5小鼠肠道菌群相对丰度
通过小鼠肠道微生物相对丰度的分析来看，益生菌的加入可以显著抑制肠道内沙门氏菌的增殖，并增加有益菌的含量。
Claims (10)
1.一种鼠李糖乳杆菌YSs069，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌YSs069于2023年3月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2023346。
2.一种包含鼠李糖乳杆菌的生物活性物质，其特征在于，包括鼠李糖乳杆菌YSs069。
3.根据权利要求2所述的生物活性物质，其特征在于，包括如下组分：膳食纤维、木糖醇、海藻糖、蔓越莓果粉和鼠李糖乳杆菌YSs069。
4.根据权利要求3所述的生物活性物质，其特征在于，以重量份数计算，包括如下组分：1～20份膳食纤维、3～8份木糖醇、1～20份海藻糖、3～8份蔓越莓果粉和10～35份鼠李糖乳杆菌YSs069。
5.根据权利要求3所述的生物活性物质，其特征在于，以重量份数计算，所述膳食纤维：木糖醇：海藻糖；蔓越莓果粉为0.5～4:0.5～1.5:0.5～4:0.5～1.5。
6.根据权利要求3所述的生物活性物质，其特征在于，，以重量份数计算，所述膳食纤维：木糖醇：海藻糖；蔓越莓果粉为3:1:1:1或1:1:3:1。
7.根据权利要求3所述的生物活性物质，其特征在于，还包括罗伊氏乳杆菌、乳双歧杆菌和副干酪乳杆菌中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的生物活性物质，其特征在于，所述生物活性物质，按重量份数计算，包括如下组分：1～20份膳食纤维、3～8份木糖醇、1～20份海藻糖、3～8份蔓越莓果粉、10～35份鼠李糖乳杆菌YSs069、15～20份罗伊氏乳杆菌、12～17份乳双歧杆菌和10～17份副干酪乳杆菌。
9.根据权利要求3所述的生物活性物质，其特征在于，还包含低聚木糖；以重量份数计算，所述低聚木糖为5～15份。
10.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌YSs069或权利要求2～9任意一项所述的生物活性物质在制备调节人体微生态平衡药物中的应用。
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