CN117025488A

CN117025488A - 一种提高益生菌在肠道定植率的工艺方法及益生菌冻干粉

Info

Publication number: CN117025488A
Application number: CN202311294192.7A
Authority: CN
Inventors: 金庭飞; 陶纯长
Original assignee: Guangdong Yike Weisheng Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Yike Weisheng Technology Co ltd
Priority date: 2023-10-09
Filing date: 2023-10-09
Publication date: 2023-11-10
Anticipated expiration: 2043-10-09
Also published as: CN117025488B

Abstract

本发明公开了一种提高益生菌在肠道定植率的工艺方法及益生菌冻干粉，包括以下步骤：益生菌发酵培养：将益生菌活化液接种于培养基中，培养，离心，获得益生菌菌泥；培养基包括麦芽糊精、低聚半乳糖和菊粉；益生菌冻干粉制备：将益生菌菌泥与冻干保护剂混合均匀，冻干，获得益生菌冻干粉；冻干保护剂包括L‑半胱氨酸和低聚果糖。本发明提供的工艺方法采用合理的培养基配方以及合理的冻干保护剂配方，能够使得益生菌菌株的冻干存活率和耐胃酸耐胆盐能力得到提升，依据本发明工艺方法获得的益生菌冻干粉在食用后，通过冻干保护剂中各组分与益生菌在肠道内相互作用，促进该菌株在肠道内形成生物膜，提高其粘附力，助力益生菌在肠道内成功定植。

Description

一种提高益生菌在肠道定植率的工艺方法及益生菌冻干粉

技术领域

本发明涉及益生菌技术领域，尤其涉及一种提高益生菌在肠道定植率的工艺方法及益生菌冻干粉。

背景技术

在通常情况下，益生菌经口服进入体内后大部分将随着胃肠道的蠕动排出体外，只有少部分在肠道定植。定植于肠道是益生菌在肠道内持续发挥益生作用的前提。益生菌的定植能力因菌种甚至菌株的不同而有差异，一般来说，对益生菌体内定植能力的评价通常是从定植于体内的数量和位点两方面进行。

影响益生菌在肠道定植的主要因素有耐胃酸耐胆盐性，粘附性，乳酸的分泌，与肠道菌群的相互作用，分裂繁殖的速度等。益生菌在肠道中定植的首要条件是对胃酸和小肠胆盐具有一定的耐受性，因为人体胃酸环境（pH3）和小肠高胆盐环境（胆盐质量分数0.1%～0.3%）会杀死部分的益生菌或对其活性产生抑制作用。益生菌的各种表面成分介导了益生菌与其环境的接触和相互作用，形成各菌株独特的表面特性，对益生菌在肠道内生存起着至关重要的作用。益生菌进入肠道后会跟肠道内的病原菌竞争粘附空间和营养，还会分泌细菌素、乳酸等代谢产物抑制病原菌生长，还会与肠道内的有益菌产生协同作用，促进有益菌的生长。然而益生菌的个体差异性对胃酸和胆盐的耐受性存在差异。益生菌对胃酸、胆盐有较好的耐受能力，才能保证菌株到达定植位点时有较高活性和增殖能力。并且益生菌只有在定植位点达到一定的数量，才可能成为局部优势菌且在局部微环境起到调节肠道菌群作用并发挥其功能。益生菌肠道定植能够给宿主带来诸多有益作用，如缓解便秘、降低胆固醇、减轻性结肠炎及降低血糖等。但复杂的胃肠道环境有诸多干扰益生菌定植的因素。

目前益生菌的生产工艺的研究聚焦于高密度发酵、提高冻干存活率，提高贮藏稳定性。2020年，中国食品科学技术学会发布了《益生菌的科学共识（2020 年版）》，进一步明确了益生菌的3个核心特征，即：足够数量、活菌状态及有益健康功能。其中要求益生菌为活菌状态，是因为益生菌在生长过程中会产生如细菌素、GABA、乳酸、短链脂肪酸等对身体健康有益的物质，进而起到调节肠道环境、提高免疫力、减脂降糖等作用，活的益生菌定植于肠道中，才能起到与有害菌竞争黏糊位点，分泌胞外多糖，形成保护膜保护肠道。现有益生菌存在在体内定植量少，定植时间短的问题，使得消费者食用益生菌后表现出较强的依赖性：即停用1-2周后，又出现了嗳气、泛酸、软便等肠胃不适的症状，益生菌没有在体内起到长期的作用。

因此研究一种提高益生菌在肠道内定植率的技术对促进益生菌在人体内发挥更大作用有重要意义。现有生产工艺多聚焦在益生菌的高活菌数和贮藏稳定性这两个方面，聚焦于益生菌在体内的成功定植的生产技术还鲜有人研究，因此本技术方案提供一种具有高定植活性的益生菌生产工艺，在益生菌高活菌数和高贮藏稳定性的基础上，对提高益生菌的体内稳定性进行进一步研究。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种提高益生菌在肠道定植率的工艺方法，能有效提升益生菌在体内的存活率和生长速率。

本发明的目的之二在于提供一种益生菌冻干粉，以及，提供一种能提高益生菌在肠道定植率的益生菌食品。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种提高益生菌在肠道定植率的工艺方法，包括以下步骤：

益生菌发酵培养：将益生菌活化液接种于培养基中，培养，离心，获得益生菌菌泥；所述培养基包括麦芽糊精、低聚半乳糖和菊粉中的一种或任意组合；

益生菌冻干粉制备：将所述益生菌菌泥与冻干保护剂混合均匀，冻干，获得益生菌冻干粉；所述冻干保护剂包括L-半胱氨酸、甘氨酸、木聚糖和低聚果糖中的一种或任意组合。

作为本发明的一个优选方案，所述培养基包括麦芽糊精、低聚半乳糖和菊粉。当培养基中包括了麦芽糊精、低聚半乳糖和菊粉时，发酵培养液中益生菌的浓度会更高。

作为本发明的一个优选方案，所述冻干保护剂包括L-半胱氨酸和低聚果糖。当冻干保护剂中包括了L-半胱氨酸和低聚果糖时，益生菌冻干粉中益生菌的存活率会更高。

低聚果糖是一种对益生菌生长有益的益生元，可以提高益生菌在胃肠道中的存活率。L-半胱氨酸对促进益生菌增殖效果较明显，且有保护作用。使用混合壁材可以弥补单一壁材对益生菌包埋保护性能的缺陷，加快芯材与壁材的交联反应，从而提高包埋率。

特别地，当发酵培养基中包括了麦芽糊精、低聚半乳糖和菊粉，且冻干保护剂中包括了L-半胱氨酸和低聚果糖时，所获得的益生菌冻干粉益生菌的存活率更高，在肠道中的存活率和生长速度更高。

作为本发明的一个优选方案，所述培养基包括按照重量百分比计的以下组分：酵母浸粉0.6~0.8%，牛肉浸粉0.5~0.7%，蛋白胨0.7~0.9%，柠檬酸氢二铵0.1~0.2%，磷酸氢二钾0.1~0.3%，无水硫酸镁0.01~0.03%，硫酸锰0.003~0.005%，乙酸钠0.4~0.6%，吐温80 0.05~0.15%，葡萄糖0.5~1.5%，麦芽糊精0.5~1.5%，低聚半乳糖0.3~0.8%，菊粉0.3~0.8%，蒸馏水余量。

作为本发明的一个优选方案，所述培养基包括按照重量百分比计的以下组分：酵母浸粉0.7%，牛肉浸粉0.6%，蛋白胨0.8%，柠檬酸氢二铵0.15%，磷酸氢二钾0.2%，无水硫酸镁0.02%，硫酸锰0.004%，乙酸钠0.5%，吐温80 0.1%，葡萄糖1%，麦芽糊精1%，低聚半乳糖0.5%，菊粉0.5%，蒸馏水余量。

合适的发酵培养基能够提高益生菌的高密度发酵，本发明优化了益生菌发酵培养基的配方，使得发酵完成后，发酵培养液中益生菌的浓度更高。

作为本发明的一个优选方案，所述冻干保护剂包括按照重量百分比计的以下组分：大豆分离蛋白0.5~1.5%，酪蛋白0.5~1.5%，乳清蛋白0.5~1.5%，L-半胱氨酸2~4%，低聚果糖1~2%，海藻糖1~3%，海藻酸钙0.5~1.5%，无菌水余量。

作为本发明的一个优选方案，所述冻干保护剂包括按照重量百分比计的以下组分：大豆分离蛋白1%，酪蛋白1%，乳清蛋白1%，L-半胱氨酸3%，低聚果糖1.5%，海藻糖2%，海藻酸钙1%，无菌水余量。

益生菌在肠道内保持局部高活菌数是促进益生菌成功定殖的关键之一，本发明优化了冻干保护剂配方，能够使到达肠道内并存活的益生菌数量增大，从而促进益生菌在肠道内快速的分裂、生长，持续分泌有益代谢产物，达到长期改善肠道内环境的效果。

作为本发明的一个优选方案，所述益生菌包括戊糖片球菌LN-PT16，和/或，副干酪乳酪杆菌K9。

戊糖片球菌LN-PT16，以及，副干酪乳酪杆菌K9的耐胃酸和耐胆盐能力均较强。本发明提供的工艺方法，采用戊糖片球菌LN-PT16，和/或，副干酪乳酪杆菌K9为菌株，它们的耐胃酸和耐胆盐能力强，本发明在高活菌数、高贮藏稳定性的基础上，提高了菌株的体内稳定性，使更多数量的益生菌在肠道定植，持续发挥益生作用。当戊糖片球菌LN-PT16，以及，副干酪乳酪杆菌K9采用本发明的发酵培养基进行培养，并采用本发明的冻干保护剂进行益生菌冻干粉制备时，益生菌在冻干粉中的存活率高。且能够提高它们在肠道中的存活率、定植率，同时它们在肠道中的生长活力较强，分裂活跃，速度快。

作为本发明的一个优选方案，一种提高益生菌在肠道定植率的工艺方法，包括以下步骤：

益生菌发酵培养：接种1.5~2.5%的益生菌活化液于培养基中，35~38℃恒温厌氧培养14~18h，然后于2~6℃，4000~5000r/min条件下离心8~12min，获得益生菌菌泥；所述培养基包括麦芽糊精、低聚半乳糖和菊粉；所述益生菌为戊糖片球菌LN-PT16或副干酪乳酪杆菌K9；

益生菌冻干粉制备：将所述益生菌菌泥与冻干保护剂混合均匀，迅速置于-90~-70℃预冻0.8~1.2h，然后置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，时间为45~50h，温度为-90~-70℃，真空度为22~28Pa，获得益生菌冻干粉；所述冻干保护剂包括L-半胱氨酸和低聚果糖。

作为本发明的一个优选方案，本发明提高益生菌在肠道定植率的工艺方法，还包括益生菌筛选步骤：筛选耐胃酸和耐胆盐能力强的益生菌菌株，然后再进行益生菌发酵培养步骤。本发明首先筛选出耐胃酸和耐胆盐能力强的益生菌菌株，再依次进行后续的益生菌发酵培养步骤和益生菌冻干粉制备步骤，能够充分发挥益生菌菌株耐胃酸耐胆盐能力优势，能够进一步提高益生菌在肠道的定植率。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种益生菌冻干粉，由目的之一任一项所述的工艺方法制备而成。

一种能提高益生菌在肠道定植率的益生菌食品，包括目的之一任一项所述的益生菌冻干粉。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

（1）本发明提供的工艺方法，采用合理的培养基配方以及合理的冻干保护剂配方，能够使得益生菌菌株的冻干存活率和耐胃酸耐胆盐能力得到提升，依据本发明工艺方法获得的益生菌冻干粉在食用后，通过冻干保护剂中各组分与益生菌在肠道内相互作用，促进该菌株在肠道内形成生物膜，提高其粘附力，助力益生菌在肠道内成功定植。

（2）本发明提供的工艺方法，筛选出具有优良耐胃酸耐胆盐特性的菌株，接着以进一步以提升它们在体内稳定性为目的，对发酵培养步骤和冻干粉制备步骤进行优化，所获得益生菌冻干粉能够最大程度地保护益生菌在体内的活性，使益生菌到达人体内后能耐胃酸耐胆盐，成功定殖，持续发挥健康作用。

附图说明

图1为本发明实施例1所提供的益生菌菌株的耐胃酸实验结果展示图；

图2为本发明实施例1所提供的益生菌菌株的耐胆盐实验结果展示图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。

实施例1 耐胃酸耐胆盐菌株的筛选

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料益生菌菌株：

副干酪乳酪杆菌K9（副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）K9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15025）。

戊糖片球菌LN-PT16（戊糖片球菌（Ped iococcus pentosaceus）LN-PT16，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62044）。

动物双歧杆菌乳亚种Y6（动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalissubsp. lactis）Y6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15026）。

唾液乳杆菌K2（唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）K2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15701）。

罗伊氏乳杆菌K07（罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri ）K07，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No15703）。

长双歧乳杆菌W68（长双歧乳杆菌（Bifidobacterium longum）W68，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15028）。

植物乳植杆菌FEED8（植物乳植杆菌（Lactobacillus plantarum）FEED8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15029）。

鼠李糖乳酪杆菌YGG（鼠李糖乳酪杆菌（Lactobacillus rhamnosus）YGG，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15027）。

上述菌株均为申请人广东益可维生物技术有限公司的自有菌株。

1.1.2试剂胰蛋白酶、猪胆盐（广州环凯生物）、氢氧化钠、磷酸二氢钾、盐酸标准溶液。

1.2.3仪器与设备立式高压灭菌锅、恒温培养箱、显微镜。

1.2方法

耐胃酸耐胆盐实验

模拟胃液：取100mL0.3mol/L的NaCl溶液，用盐酸溶液调节pH值至2.5，灭菌后加入1g的胃蛋白酶，运用磁力搅拌器将其充分溶解，4℃保存备用。分别称取1g菌粉（菌液为1mL，活菌数≥10⁹CFU/g）至20mL模拟胃液中，37℃、90r/min厌氧条件下模拟胃消化过程，于0，2h后取样，采用平板计数法测定活菌数，平行实验3次。实验结果如图1所示。

模拟小肠消化液：取3.4gKH₂PO₄用适量超纯水进行溶解并定容至500mL。取100mL已制备好的KH₂PO₄溶液，1mol/L NaOH调节pH值至8.0，灭菌后加入1g胰蛋白酶，0.3g猪胆盐，用磁力搅拌器将其充分溶解后，4℃保存备用。分别称取1g菌粉（菌液为1mL，活菌数≥10¹⁰CFU/g）至40mL模拟小肠消化液中，37℃、90r/min厌氧条件下模拟小肠消化过程，于0，4h后取样，采用平板计数法测定活菌数，平行实验3次。实验结果如图2所示。

从图1-2中的可得，在耐胃酸实验中，鼠李糖乳酪杆菌YGG和戊糖片球菌LN-PT16的存活率较高，其次是唾液乳杆菌K2、罗伊氏乳杆菌K07、副干酪乳酪杆菌K9、长双歧乳杆菌W68。在耐胆盐实验中，唾液乳杆菌K2、副干酪乳酪杆菌K9和戊糖片球菌LN-PT16的存活率明显高于其他益生菌。

综合耐胃酸和耐胆盐性能，选择副干酪乳酪杆菌K9和戊糖片球菌LN-PT16为本发明的益生菌菌株。

实施例2 肠道定植率高的益生菌冻干粉工艺方法研究

1.实验材料

1.1发酵培养基配方

表1 发酵培养基配方表

1.2冻干保护剂配方

表2 冻干保护剂配方表

2.实验方法

2.1高密度发酵培养基筛选

将2%的戊糖片球菌LN-PT16和副干酪乳酪杆菌K9活化液分别接种至培养基1-8中，37℃恒温厌氧培养16h，取发酵液，测其在OD_600nm的吸光值，OD值越大说明发酵液中益生菌浓度越高。

2.2益生菌冻干粉制备

将2%的戊糖片球菌LN-PT16和副干酪乳酪杆菌K9活化液分别接种至培养基2、培养基4和培养基8（常规MRS培养基）中，37℃恒温厌氧培养16h，在4℃，4500r/min条件下离心10min，得到益生菌菌泥。将得到的益生菌菌泥与冻干保护剂充分混合，然后迅速预冻1h（-80℃），接着置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥48h（−80℃、真空度25Pa），得到益生菌冻干粉。

2.3培养基和冻干保护剂筛选

测定不同培养基中获得的发酵培养液的OD_600nm吸光值，以及，测定使用不同的保护剂冻干得到的益生菌冻干粉的活菌数。益生菌活菌数的检测方法参照国标 GB4789.35-2016《食品微生物学检验-益生菌检验》。

3.实验结果

表3 高密度发酵培养基的筛选记录表

从表3中的记录可得，戊糖片球菌LN-PT16和副干酪乳酪杆菌K9在培养基4中进行发酵培养时，发酵培养液的OD_600nm吸光值最大，益生菌的发酵密度最大，这说明了培养基中同时包含麦芽糊精、低聚半乳糖和菊粉这几种成分时，能够使得戊糖片球菌LN-PT16和副干酪乳酪杆菌K9均得到较好的生长。

表4 菌粉冻干保护剂的筛选

从表4中的记录可得，在冻干保护剂相同的情况下，培养基8和培养基2得到的益生菌冻干粉，益生菌的存活率要比培养基4低。而在培养基相同的情况下，采用冻干保护剂1时，益生菌的存活率是最高的。综合可得，当采用培养基4（含有麦芽糊精、低聚半乳糖和菊粉）和冻干保护剂1（含有L-半胱氨酸和低聚果糖）时，获得益生菌冻干粉益生菌的存活率最高。

在冻干过程中，由于受到各种因素影响，导致细胞活力下降，甚至会导致菌体死亡。合适的培养基可以使益生菌活力增强，菌体较粗大，繁殖速度快，使其更能抵抗恶劣环境存活下来。冻干保护剂可以改变益生菌冻干时的环境，减少冷冻干燥过程中对细胞的损害，尽可能保持微生物原有的各种生理生化特性和生物活性。

实施例3 肠道定殖实验

1.实验目的

给小鼠灌胃被荧光标记的菌悬液，在不同时间对小鼠肠道不同部位进行取样，通过流式细胞术检测，确定益生菌在小鼠体内的生存情况。

2.实验方法

2.1菌悬液制备

样品1：戊糖片球菌LN-PT16冻干菌粉，采用培养基4培养16h后，4℃下4500r/min离心10min，将得到的益生菌菌泥与冻干保护剂1充分混合，然后迅速预冻1h（-80℃），接着置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥48h（−80℃、真空度25Pa），得到益生菌冻干粉；用无菌生理盐水稀释至活菌数为10⁸CFU/mL。

样品2：戊糖片球菌LN-PT16采用培养基4培养16h后，4℃下4500r/min离心10min，弃上清液，用无菌生理盐水重悬，细胞浓度调整到10⁸CFU/mL。

样品3：戊糖片球菌LN-PT16采用培养基8（常规MRS培养基）基培养16h后，4℃下4500r/min离心10min，弃上清液，用无菌生理盐水重悬，细胞浓度调整到10⁸CFU/mL。

样品4：副干酪乳酪杆菌K9冻干菌粉，采用培养基4培养16h后，4℃下4500r/min离心10min，将得到的益生菌菌泥与冻干保护剂1充分混合，然后迅速预冻1h（-80℃），接着置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥48h（−80℃、真空度25Pa），得到益生菌冻干粉；用无菌生理盐水稀释至活菌数为10⁸CFU/mL。

2.2用荧光探针培养和标记细菌：琥珀酰亚胺酯（cFDA-SE），是一种非荧光膜渗透酯，非特异性原核和真核胞内酯酶转化为荧光衍生物，然后通过探针的琥珀酰亚胺与细胞内蛋白共价连接。用无菌生理盐水稀释菌粉然后用cFDA-SE（50mol/L）在37°C下标记20min。用PBS洗涤两次以去除多余的cFDA-SE，并在PBS中重悬来终止荧光标记。流式细胞术结果显示，约99%的细胞被标记。

2.3动物实验方案：将6周龄的SPF级雄性BALA/c小鼠饲养于温度、湿度恒定的屏障环境中，控制12h光照和12h黑夜，每日饲喂小鼠基础饲料与纯净水。将60只小鼠随机分为5组，实验一、二、三、四组为实验组，实验五组为对照组。5组小鼠经过1周的适应期后，进入干预期。期间，每日灌胃总量为4×10⁸CFU的标记菌液（实验一组灌胃样品1，实验二组灌胃样品2，实验三组灌胃样品3，实验四组灌胃样品4），持续灌胃1周。对照组小鼠同时灌胃等量的脱脂乳。五组小鼠第1、2、4、6天分别处死3只小鼠，取每只小鼠的十二指肠、回肠、结肠。纵向切割单个切片，并去除任何可见的残留食物颗粒或粪便物质。为了测定肠道水量，每个肠道部分用预先称重的滤纸（直径90nm）。细胞提取物用0.75%甲醛（v/v）固定。

2.4流式细胞术分析：从细胞中提取cFDA-SE染色的乳酸菌在流式细胞仪中，在488nm的激发波长下，用15mw的氩激光和75mm的压力。在流式细胞仪中，在488nm处的激发下，cFDA-SE在518nm处给出了最大的绿色发射信号。由于细菌繁殖时细胞分裂会导致荧光强度减弱，即第一次分裂后细胞荧光强度为1/2初试荧光强度，第二次分裂时为1/4初试荧光强度。

3.实验结果

表5 灌胃不同天数从小鼠十二指肠黏膜表面采集的益生菌的荧光强度谱

表6 灌胃不同天数从小鼠回肠黏膜表面采集的益生菌的荧光强度谱

表7 灌胃不同天数从小鼠结肠黏膜表面采集的益生菌的荧光强度谱

对照组小鼠均未检测到荧光强度。

表5~7的实验数据表明，随着灌胃益生菌的时间增加，荧光强度大于1/4初始值的细胞占比呈现上升趋势，说明在肠道内成功定殖并分裂繁殖的细菌越多。荧光强度大于初始值的细胞占比越来越小，则说明在肠道内的益生菌数量越多，越有利于细胞加速分裂，使得这部分细胞占比越来越小。实验一组、二组与实验三组对比可知，一、二组检测到的荧光强度在初始值的占比比较大，说明益生菌在体内没有进行分裂的细胞占比较大，这部分菌细胞最终会被消化，随着粪便排出体外。在荧光强度≥1/4初始值这部分数据看，实验一组明显高于实验二组和实验三组，说明实验一组的益生菌能在体内分裂繁殖，也就是在体内成功定植的数量较实验二组、三组多。因此，本发明的培养基4（含有麦芽糊精、低聚半乳糖和菊粉）在提高益生菌稳定性上有所帮助，但要达到刚好的效果还需要配合冻干保护剂1（含有L-半胱氨酸和低聚果糖）。随着灌胃天数增加，在荧光强度≥1/4初始值这部分占比显著提高，说明实验一组的益生菌不仅在体内成功定植，且生长活力较强。

实验四组的益生菌为副干酪乳酪杆菌K9，其呈现的实验结果趋势与实验一组的戊糖片球菌LN-PT16类似。

分裂得足够快的益生菌才得以维持局部细胞浓度较高，才能在粘膜表面定植。除了肠道细菌之间对粘附的直接竞争外，生长和分裂的速度或产生时间也决定了益生菌在粘膜表面定植和持续存在的能力。

上述实验结果说明，本发明实施例选定特定的工艺方法，合理设计培养基配方和冻干保护剂配方，获得的益生菌冻干粉能够有效提升益生菌在体内的存活率和生长速率。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims

1.一种提高益生菌在肠道定植率的工艺方法，其特征在于，包括以下步骤：

益生菌发酵培养：将益生菌活化液接种于培养基中，培养，离心，获得益生菌菌泥；所述培养基包括麦芽糊精、低聚半乳糖和菊粉；

益生菌冻干粉制备：将所述益生菌菌泥与冻干保护剂混合均匀，冻干，获得益生菌冻干粉；所述冻干保护剂包括L-半胱氨酸和低聚果糖。

2.如权利要求1所述的提高益生菌在肠道定植率的工艺方法，其特征在于，所述培养基包括按照重量百分比计的以下组分：酵母浸粉0.6~0.8%，牛肉浸粉0.5~0.7%，蛋白胨0.7~0.9%，柠檬酸氢二铵0.1~0.2%，磷酸氢二钾0.1~0.3%，无水硫酸镁0.01~0.03%，硫酸锰0.003~0.005%，乙酸钠0.4~0.6%，吐温80 0.05~0.15%，葡萄糖0.5~1.5%，麦芽糊精0.5~1.5%，低聚半乳糖0.3~0.8%，菊粉0.3~0.8%，蒸馏水余量。

3.如权利要求2所述的提高益生菌在肠道定植率的工艺方法，其特征在于，所述培养基包括按照重量百分比计的以下组分：酵母浸粉0.7%，牛肉浸粉0.6%，蛋白胨0.8%，柠檬酸氢二铵0.15%，磷酸氢二钾0.2%，无水硫酸镁0.02%，硫酸锰0.004%，乙酸钠0.5%，吐温80 0.1%，葡萄糖1%，麦芽糊精1%，低聚半乳糖0.5%，菊粉0.5%，蒸馏水余量。

4.如权利要求1所述的提高益生菌在肠道定植率的工艺方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括按照重量百分比计的以下组分：大豆分离蛋白0.5~1.5%，酪蛋白0.5~1.5%，乳清蛋白0.5~1.5%，L-半胱氨酸2~4%，低聚果糖1~2%，海藻糖1~3%，海藻酸钙0.5~1.5%，无菌水余量。

5.如权利要求4所述的提高益生菌在肠道定植率的工艺方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括按照重量百分比计的以下组分：大豆分离蛋白1%，酪蛋白1%，乳清蛋白1%，L-半胱氨酸3%，低聚果糖1.5%，海藻糖2%，海藻酸钙1%，无菌水余量。

6.如权利要求1所述的提高益生菌在肠道定植率的工艺方法，其特征在于，所述益生菌包括戊糖片球菌LN-PT16，和/或，副干酪乳酪杆菌K9。

7.如权利要求1所述的提高益生菌在肠道定植率的工艺方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.如权利要求1-7任一项所述的提高益生菌在肠道定植率的工艺方法，其特征在于，还包括益生菌筛选步骤：筛选耐胃酸和耐胆盐能力强的益生菌菌株，然后再进行益生菌发酵培养步骤。

9.一种益生菌冻干粉，其特征在于，由权利要求1-9任一项所述的工艺方法制备而成。

10.一种能提高益生菌在肠道定植率的益生菌食品，其特征在于，包括权利要求9所述的益生菌冻干粉。