JP2005508617A - プロバイオティックビフィドバクテリウム株類 - Google Patents

Abstract

【課題】
【解決手段】ビフィドバクテリウム株ＡＨ２０８，ＡＨ２０９，ＡＨ２１０、ＡＨ２１１、ＡＨ２１２またはＡＨ２１４またはその変異体類またはバリアント類は、炎症活性、特に炎症性腸疾患または過敏性腸症候群のような望ましくない消化管炎症活性の予防および／または治療において有用である。

Description

本発明は、ビフィドバクテリウム株類およびそれらのプロバイオティック菌類としての用途、特に免疫調節バイオセラピー剤としての用途に関する。

腸内細菌によるコロニー形成からヒト消化管を保護する防御機構は非常に複雑で免疫および非免疫面の両者が関連している（１）。先天的防御機構には、胃の低ｐＨ、胆汁塩類、蠕動運動、ムチン層およびリゾチームのような抗菌性化合物類が含まれる（２）。免疫機構には、小腸および結腸全体に分布しパイエル板と呼ばれる特殊なリンパ系凝集物類すなわち根底にあるＭ細胞類が含まれる（３）。これらの部位で提示された管腔抗原類は適切なＴおよびＢ細胞サブセット類を刺激することになり、サイトカインネットワークの確立と消化管中への抗体類分泌を伴う（４）。さらに、抗原提示は、上皮細胞により上皮内リンパ細胞類およびその下にある固有層免疫細胞類に対して起こり得る（５）。したがって、宿主は、実質的に消化管免疫防御を手に入れる。しかし、消化管粘膜は宿主が外的環境に接触する最大表面であるので、平均寿命にわたり消化管が処理する食料１００トンに対する免疫応答を制御するために特殊なコントロール機構が存在するはずである。さらに、腸には５００種を超える細菌がコロニーを形成しており、結腸における数は１０^１１〜１０^１２個／ｇである。これらのコントロール機構は、従って、非病原性の接着性細菌を宿主に重大な傷害をもたらす侵襲性病原体から識別できなければならない。実際、腸内菌叢は、新たに摂取された潜在的に病原性の微生物類と競合することによって、宿主の防御に寄与している。

ヒト消化管中に存在する細菌は、炎症を促進できる。摂取された微生物菌叢に対する通常と異なる免疫応答が、炎症性腸疾患のようなある疾患状態に関係していると示唆されている。正常菌叢に関連する抗原類は免疫寛容と免疫不全を導き、この寛容が粘膜炎症の主要機構となるようにする（６）。寛容のこの崩壊の証拠として、ＩＢＤ患者における腸内菌叢に対する抗体レベルの増加が含まれる。

本発明はビフィドバクテリウム株類に関し、これらはサイトカインレベルを調節することによってまたは前炎症性微生物類に拮抗し消化管から排除することによって、免疫調節効果を有することが明らかになった。

本発明によれば、ＡＨ２０８，ＡＨ２０９，ＡＨ２１０，ＡＨ２１１、ＡＨ２１２、ＡＨ２１４のいずれかひとつから選択されたビフィドバクテリウム株およびその変異体またはバリアントを提供する。

前記変異体は、遺伝的に修飾された変異体であることができる。前記バリアントは、ビフィドバクテリウムの天然のバリアントであることができる。

本発明の１態様において、ビフィドバクテリウム株類は、生細胞の形状である。また別に、ビフィドバクテリウム株類は、非生細胞の形状である。

本発明の１態様において、前記株類は、生物学的に純粋な培養物の形状である。

本発明の１態様において、前記ビフィドバクテリウム株類は、切除し洗浄したヒト消化管から単離される。好適には、前記ビフィドバクテリウム株類は、ヒトにおける経口的消費後において、有意に免疫調節性である。

本発明はまた、本発明の少なくとも１種のビフィドバクテリウム株を含む製剤を提供する。前記製剤は、ビフィドバクテリウムの２種以上の株類を含むこともできる。

本発明の１態様において、前記製剤は、別のプロバイオティック物質を含む。

本発明の１態様において、前記製剤は、プレバイオティック物質を含む。

好適には、前記製剤は、摂取可能な担体を含む。この摂取可能な担体は、カプセル、錠剤または散剤のような薬学的に許容できる担体であることができる。好適には、前記摂取可能な担体は、酸性化させたミルク、ヨーグルト、冷凍ヨーグルト、粉ミルク、ミルク濃縮物、チーズスプレッド類、ドレッシング類または飲料類のような食品である。

本発明の１態様において、本発明の製剤はさらに、蛋白質および／またはペプチド、特にグルタミン／グルタメートを多量に含む蛋白質類および／またはペプチド類、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラルおよび／または微量元素を含む。

本発明の１態様において、ビフィドバクテリウム株類は、前記製剤中デリバリシステム１ｇ当たり１０^６ｃｆｕを超えて存在する。好適には、前記製剤は、アジュバント、細菌性成分、薬物体または生体化合物を１種以上含む。

本発明の１態様において、前記製剤は、免疫化およびワクチンプロトコール類用である。

本発明はさらに、食物として医薬としての用途、望ましくない炎症活性の予防および／または治療用途、クローン病または潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、嚢炎または感染後大腸炎のような望ましくない消化管炎症活性の予防および／または治療用途、消化管腫瘍（類）の予防および／または治療用途、リウマチ性関節炎のような全身疾患の予防および／または治療用途、望ましくない炎症活性による自己免疫疾患の予防および／または治療用途、望ましくない炎症活性による腫瘍の予防および／または治療用途、腫瘍の予防用途、クロストリジウムディフィシレ関連下痢、ロタウイルス関連下痢または感染後下痢のような望ましくない炎症活性による下痢疾患の予防および／または治療用途、大腸菌のような感染性物質による下痢疾患の予防および／または治療用途のため、本発明によるビフィドバクテリウム株類または製剤を提供する。

本発明はまた、望ましくない炎症活性の予防および／または治療用抗炎症バイオセラピー剤の調製に使用するためまたは望ましくない炎症活性の予防および／または治療用抗炎症バイオセラピー剤類の調製に使用するため、本発明のビフィドバクテリウム株類または製剤を提供する。

本発明の１態様において、本発明の株類は、前炎症性微生物類に拮抗し消化管から排除することによって、作用する。

本発明はまた、前炎症性サイトカイン類のレベル低下用抗炎症バイオセラピー剤の調製において使用するため、本発明のビフィドバクテリウム株類または製剤を提供する。

本発明はまた、ＩＦＮγレベル修飾用抗炎症バイオセラピー剤の調製において使用するため、ビフィドバクテリウム株類を提供する。

本発明はさらに、ＩＬ−１０レベル修飾用抗炎症バイオセラピー剤調製において使用するため、ビフィドバクテリウム株類を提供する。この場合好適には、前記株は、ＡＨ２０８，ＡＨ２１１またはＡＨ２１２のいずれかから選択される。

本発明はさらに、ＩＬ−１２レベル修飾用抗炎症バイオセラピー剤調製において使用するため、ビフィドバクテリウム株類を提供する。好適には、前記株は、ＡＨ２０８，ＡＨ２１０またはＡＨ２１２のいずれかから選択される。

本発明はさらに、病原性種の増殖に拮抗するそれらの能力のゆえにビフィドバクテリウム株類の抗感染性プロバイオティック株類としての用途を提供する。

我々は、ビフィドバクテリウムの特定株類が免疫調節効果をインビトロで惹起することを見出した。

本発明は従って、例えば炎症性腸疾患のような、望ましくない炎症反応のような制御異常免疫応答の予防および／または治療において大きな潜在的治療価値を有している。

前記株類は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−８、ＩＬ−１０および／またはＩＬ−１２のレベル修飾のために選択できるバイオセラピー剤パネルとして使用できる。

本発明の株類または製剤類は、炎症性障害、免疫不全、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、腫瘍（特に、消化管および免疫系の）、下痢疾患、抗生物質関連下痢、小児下痢、虫垂炎、自己免疫疾患、多発性硬化症、アルツハイマー病、リウマチ性関節炎、腹腔疾患、糖尿病、臓器移植、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、歯周病、泌尿器疾患、性感染症、ＨＩＶ感染、ＨＩＶ複製、ＨＩＶ関連下痢、外科手術関連外傷、外科手術誘発転移性疾患、敗血症、体重減少、食欲不振、発熱コントロール、悪液質、創傷治癒、潰瘍類、腸バリア機能、アレルギー、喘息、呼吸器障害、循環系障害、冠心疾患、貧血、血液凝固系障害、腎疾患、中枢神経系障害、肝疾患、虚血、栄養障害、骨粗しょう症、内分泌障害、表皮障害、乾癬および／またはにきびの予防および／または治療において使用できる。

前記ビフィドバクテリウム株類は、共生微生物類である。それらは、ヒト消化管内部の微生物菌叢から単離された。消化管内部の免疫系はこの菌叢のメンバーに対して顕著な反応を有することができないが、その理由は、生成した炎症活性が宿主細胞類および組織機能をも破壊してしまうからである。したがって、免疫系が共生している非病原性消化管菌叢のメンバーを病原性生物類と異なるとして認識できるなんらかの機構（類）が存在する。これによって、確実に、宿主組織に対する傷害が限定され、防御バリアが維持されたままになる。

ビフィドバクテリウムロンガムインファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）ＡＨ２０８の寄託は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１０５０として２０００年４月２０日、ＮＣＩＭＢ（国立産業および海洋微生物コレクション）に対して行われた。

ビフィドバクテリウムロンガムインファンティスＡＨ２０９の寄託は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１０５１として２０００年４月２０日、ＮＣＩＭＢ（国立産業および海洋微生物コレクション）に対して行われた。

ビフィドバクテリウムロンガムインファンティスＡＨ２１０の寄託は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１０５２として２０００年４月２０日、ＮＣＩＭＢ（国立産業および海洋微生物コレクション）に対して行われた。

ビフィドバクテリウムロンガムインファンティスＡＨ２１１の寄託は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１０５３として２０００年４月２０日、ＮＣＩＭＢ（国立産業および海洋微生物コレクション）に対して行われた。

ビフィドバクテリウムロンガムインファンティスＡＨ２１２の寄託は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１０９９として２００１年３月２２日、ＮＣＩＭＢ（国立産業および海洋微生物コレクション）に対して行われた。

ビフィドバクテリウムロンガムインファンティスＡＨ２１４の寄託は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１１００として２００１年３月２２日、ＮＣＩＭＢ（国立産業および海洋微生物コレクション）に対して行われた。

ビフィドバクテリウムロンガムインファンティスは、遺伝的に修飾した変異体であることもでき、あるいはそれは、その天然のバリアントであることもできる。

好適には、前記ビフィドバクテリウムロンガムインファンティスは、生細胞の形状である。

これとは別に、前記ビフィドバクテリウムロンガムインファンティスは、非生細胞の形状であることもできる。

本発明の特定のビフィドバクテリウムロンガムインファンティス株類を、カプセル、ミクロカプセル、錠剤、顆粒剤、散剤、トローチ、丸剤、坐剤、懸濁剤およびシロップのような従来製剤となっている経口摂取可能な形状で動物（ヒトを含む）に対して投与できることがわかるであろう。適切な製剤類は、従来の有機および無機添加物類を用いて一般的に用いられる方法により、調製することもできる。前記医薬組成物中活性成分量は、所望の治療効果をもたらすであろうレベルにあるであろう。

前記製剤は、また、細菌性成分、薬物体または生体化合物を含む。

さらに、本発明の株類の１種以上を含むワクチンは、あらゆる適切な公知の方法を用いて調製でき、薬学的に許容できる担体またはアジュバントを含むことができる。

本明細書では、用語変異体、バリアントおよび遺伝的に修飾された変異体は、親株に比べてその遺伝的および／または表現性質が変化したビフィドバクテリウム菌の株を含む。ビフィドバクテリウムロンガムインファンティスの天然バリアントは選択的に単離した標的性質の天然の変化を含み、一方、親株性質を故意に変化させることも、遺伝子破壊、結合性トランスファなどの従来の遺伝操作技術を用いて達成できる。

我々は、ビフィドバクテリウムロンガムインファンティス株類ＡＨ２０８、ＡＨ２０９、ＡＨ２１０、ＡＨ２１１、ＡＨ２１２およびＡＨ２１４が酸性で胆汁に耐性でヒト小腸細胞株に接着するばかりでなく、驚くべきことに、サイトカインレベルを調節するかまたは前炎症性すなわち免疫調節性微生物に拮抗し消化管から排除することによって免疫調節効果を有することを見出した。

プロバイオティック細菌の一般的使用は生細胞形状においてなされている。しかし、また、前記プロバイオティック細菌によって発現される有益な因子類を含む殺培養物類または組成物類のような非生細胞類にもそれは拡張できる。これには、熱死滅微生物類または変化させたｐＨに暴露させるかまたは圧力に供することによって死滅させた微生物類も含めることができた。非生細胞類による産物調製はより簡易であり、細胞類は容易に薬剤に取り込まれ、生細胞の場合よりもはるかに保存要件が限定されない。ラクトバチラスカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）ＹＩＴ９０１８は、米国特許ＵＳ４３４７２４０において記載されているように腫瘍増殖の治療および／または防止のための方法として熱死滅細胞類の効果的使用例を提供する。

未変性菌類が免疫調節効果を発現するために必要であるかまたは本発明のそれぞれの活性成分類を単独で使用できるかについては、わかっていない。ある菌株類の前炎症性成分類が同定されている。グラム陰性菌の前炎症性効果は、糖脂質（ＬＰＳ）によって媒介される。ＬＰＳ単独では、部分的にではあるが単球上でＣＤ１４レセプターにＬＰＳが結合することにより、前炎症性ネットワークを誘発する。プロバイオティック菌の成分類は、細胞全体の効果により免疫調節活性を有すると想定されている。これらの成分類を単離する際に、薬学等級の操作が予想される。

インタロイキン−８（ＩＬ−８）は、マクロファージ炎症蛋白質ファミリー（ＭＩＰ）を含むサイトカイン類のひとつである。ＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２ファミリーは、白血球および線維芽細胞に対しての走化性因子である蛋白質群を代表する。この蛋白質ファミリーはまた、マクロファージ以外の細胞類がそれらを合成できるので、インタクリン類とも称されている。これらの細胞類には、ＴおよびＢ細胞類、線維芽細胞類、内皮細胞類、ケラチノサイト類、平滑筋細胞類、滑膜細胞類、好中球類、軟骨細胞類、肝細胞類、血小板類および腫瘍細胞類が含まれる。ＭＩＰ−１α、−１β、結合組織活性化蛋白質（ＣＴＡＰ）、血小板第ＩＶ因子（ＰＦ４）およびＩＬ−８は、好中球走化を刺激する。単球走化蛋白質（ＭＣＰ−１）およびＲＡＮＴＥＳは、単球に対して走化性であり、ＩＬ−８は好中球およびリンパ球に対して走化性であり、一方、ＰＦ４とＣＴＡＰは、線維芽細胞に対して走化性である。走化性以外の役割についても、これらのファミリー構成員のいくつかについて、記載されている。ＭＣＰ−１は、単球細胞増殖抑制活性とスーパーオキサイドアニオン放出を刺激する。ＣＴＡＰおよびＰＦ４は、線維芽細胞増殖を増大させ、ＩＬ−８は血管透過性を高め、一方、ＭＩＰ−１αおよび−１βは、発熱性である。ＩＬ−８は、消化管内部において炎症応答に緊密に関与している。ＩＬ−８（および他の前炎症性サイトカイン類）の刺激は、消化管病巣の進展に寄与しており、それゆえに、プロバイオティック菌がこのサイトカイン産生を刺激しないことが重要となっている。

ＩＬ−１０は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球およびマクロファージによって産生される。このサイトカインは、Ｂ細胞の増殖と抗体分泌細胞への分化を促進する。ＩＬ−１０はほとんどの場合抗炎症性活性を示す。それは、単球によるＩＬ−１ＲＡ発現をアップレギュレーションし、単球炎症活性の大半を抑制する。ＩＬ−１０は、サイトカイン類、反応性酸素および窒素中間体類の単球産生、ＭＨＣクラスＩＩ発現、寄生体死滅およびフィードバックメカニズムによるＩＬ−１０産生を阻害する（７）。このサイトカインはまた、ＰＧＥ_２−ｃＡＭＰ依存性経路に干渉することによって小腸コラゲナーゼとＩＶ型コラゲナーゼの単球産生をブロックすることが明らかにされており、従って、慢性炎症性疾患で見られる結合組織破壊の重要な制御剤となることもできる。

ＩＬ−１２は、３５ｋＤと４０ｋＤが２個の共有結合で結合した鎖で構成された７０ｋＤのヘテロダイマー蛋白質である。それは、主に、マクロファージのような抗原提示細胞によって炎症カスケード初期に産生される。細胞内菌は、高レベルのＩＬ−１２産生を刺激する。それは、ＩＦＮγ産生の強力な誘発剤でありかつナチュラルキラー細胞の活性化剤である。ＩＬ−１２は、主に、ＩＦＮγを高産生させるために細胞を賦活するその能力により、細胞媒介すなわちＴｈ１免疫応答の産生に必要な重要サイトカイン類のひとつである（８）。ＩＬ−１２はＩＬ−１０の産生を誘発させ、そのフィードバックは、ＩＬ−１２産生を阻害し、従って、無制御なサイトカイン産生を限定する。ＴＧＦ−βもまた、ＩＬ−１２産生をダウンレギュレーションする。ＩＬ−４およびＩＬ−１３は、ＩＬ−１２産生に対して刺激性のまたは阻害性の効果を有することができる。ＩＬ−１２のインビボ阻害は、多発性硬化症のようなＴｈ１関連炎症性疾患治療において何らかの治療上の価値を有するであろう（９）。

インタフェロン−ガンマＩＦＮγは本質的に活性化Ｔリンパ球の産物であり、さまざまなグリコシル化により、大きさが２０乃至２５ｋＤａの範囲にわたることが見出される。このサイトカインは他のサイトカイン類と相乗作用し、さらに強力に単球、マクロファージ、好中球および内皮細胞を刺激する結果となる。ＩＦＮγもまた、サイトカイン産生（１０）、反応性中間体放出増加、貪食作用および細胞毒性によって、単球およびマクロファージの糖脂質（ＬＰＳ）誘導を増幅させる。ＩＦＮγは、単球細胞上および上皮、内皮および結合組織由来細胞類上で主要組織適合複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）抗原類の発現を誘発するかまたは増大させる。これによって、炎症組織内部の細胞から免疫系へ抗原がより強く提示されるようになる。ＩＦＮγはまた、抗炎症効果を有することもできる。このサイトカインは、ホスホリパーゼＡ_２を阻害し、それによってＰＧＥ_２およびコラゲナーゼの単球産生を低下させる（１１）。ＩＦＮγはまた、ＴＧＦβ、ＴＮＦαおよびＣ５ａに対して単球およびマクロファージレセプター発現を修飾し（１１）、それによって、このサイトカインの抗炎症性に寄与している。このサイトカインをプロバイオティックにより刺激すると、宿主の現在の炎症状態、他のサイトカイン類の刺激および投与経路に応じて、さまざまなインビボ効果を有するであろう。

ＴＮＦαは前炎症性サイトカインであり、炎症応答で見られる局所および全身効果の多くを媒介する。このサイトカインは本来単球またはマクロファージ由来産物であるが、リンパ球、好中球、ＮＫ細胞、マスト細胞、星状細胞、上皮細胞、内皮細胞および平滑筋細胞を含む他の細胞型も同様にＴＮＦαを合成できる。ＴＮＦαはプロホルモンとして合成され、プロセッシングにより、成熟した１７．５ｋＤａ種が観察できる。精製したＴＮＦαは、ダイマー、３量体および５量体として観察されており、この３量体形状がインビボにおける活性形態であると仮定されている。ＴＮＦαについて、３種のレセプターが同定されている。可溶性レセプターは、ＴＮＦα阻害剤として機能するようであり（１２）、一方、２種の膜結合型形態は、分子量がそれぞれ６０乃至８０ｋＤａであると同定された。炎症部位における局所ＴＮＦα産生はエンドトキシンにより誘発でき、グルココルチコイドであるデキサメタゾンは、サイトカイン産生を阻害する（１３）。ＴＮＦα産生の結果多くの細胞型が刺激されることになる。有意な抗ウイルス効果が、ＴＮＦα処理細胞株で観察でき（１４）、前記ＩＦＮ類は、この効果を増強するＴＮＦαと相乗作用する。内皮細胞が刺激され、プロコアグラント活性、接着性分子類、ＩＬ−１、造血増殖因子、血小板活性化因子（ＰＡＦ）およびアラキドン酸代謝物の発現をもたらす。ＴＮＦαは、好中球接着、貪食作用、脱顆粒化（１５）、反応性酸素中間体産生を刺激し、細胞移動に影響を及ぼすこともある。ＧＭ−ＣＳＦ，ＴＧＦβ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＰＧＥ_２およびＴＮＦαの白血球合成それ自体も全て、ＴＮＦα投与によって刺激できる（１６，１７）。プログラムされた細胞死（アポトーシス）は単球中で遅くすることができ（１８）、一方、線維芽細胞に対する効果には、走化性の促進とＩＬ−６，ＰＧＦ_２およびコラゲナーゼ合成の促進が含まれる。局所ＴＮＦα産生は創傷治癒および免疫応答を促進する一方、ＴＮＦαの脱制御全身放出は極めて毒性が高く、悪液質、発熱および急性蛋白質産生のような効果が観察されている（１９）。

本発明は下記の実施例からより明確に理解されるであろう。

切除し洗浄したヒト消化管から単離した細菌の特性解析。プロバイオティック性質の実証
プロバイオティック菌の単離
再建手術の際に得た虫垂およびヒト消化管（Ｇ．Ｉ．Ｔ．）の大腸および小腸部位について、プロバイオティック菌株をスクリーニングした。全サンプルは、手術直後に−８０℃で無菌容器中に保存した。

凍結組織を融解させ、秤量し、システイン化（０．０５％）１／４強度のリンゲル液中に入れた。サンプルを静かに振とうし、接着の弱い微生物類（−洗浄‘Ｗ’と命名）を除去した。さらに別容量のリンゲル液に移した後、サンプルを７分間ボルテックスし、強く接着している菌を除去した（サンプル‘Ｓ’と命名）。 組織に包埋された菌を単離するため、サンプル３５６，１７６とＡもブラウンブレンダーでホモゲナイズした（−ホモジネート‘Ｈ’と命名）。前記溶液を順次希釈し、下記の寒天培地上に塗布接種（１００μｌ）した。ＲＣＭ（強化クロストリジア培地）および酢酸を用いてｐＨ５．５に調整したＲＣＭ；ＴＲＹ（トリプチカーゼ、ペプトンおよび酵母抽出物）；ＭＲＳ（ｄｅＭａｎｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅ）；ＲＯＧ（Ｒｏｇｏｓａのアセテート培地（ＳＬ））；ＬＬＡ（Ｌａｐｉｅｒｅの肝ラクトース寒天）；ＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン寒天）；ＬＢＳ（ビフィドバクテリウム選択的寒天）；およびＴＳＡＹＥ（０．６％酵母抽出物添加トリプトンソヤシュガー）。プロピオン酸添加ＴＰＹおよびＭＲＳ寒天は、ビフィドバクテリウム菌の単離のために特異的に用いた。ＴＰＹ寒天を除いた全寒天培地は、オキソイドケミカル社（Ｏｘｏｉｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が供給した。プレート類は、嫌気的ジャー（ＢＢＬ、Ｏｘｏｉｄ）中ＣＯ_２産生キット（Ａｎａｅｒｏｃｕｌｔ Ａ，Ｍｅｒｃｋ）を用いて２〜５日間、３７℃でインキュベーションした。

グラム陽性、カタラーゼ陰性棹菌形状または分岐／多形菌単離物を純粋なまま、非選択的複合培地（ＭＲＳおよびＴＰＹ）に画線した。単離物は他に断りがなければ通常どおり、ＭＲＳまたはＴＰＹ培地中３７℃で嫌気条件下において培養した。推定ビフィドバクテリウムを４０％グリセロール中に蓄え、−２０℃と−８０℃で保存した。

Ｇ．Ｉ．Ｔ．から採取した７個の組織切片について、ビフィドバクテリウム属に属する菌株の存在をスクリーニングした。下記の表１に示したように組織サンプルによっていくらかばらつきがあった。サンプルＡ（回腸）と３１６（虫垂）の細胞数は最も小さく、組織１ｇ当たり約１０^２細胞が単離された。比較し、１０^３ｃｆｕ／ｇ組織を超えるものが他のサンプルから得た。‘洗浄’および‘サンプル’段階中類似数の細菌が単離されたが、４３３（回腸−虫垂）‘サンプル’の溶液ではわずかに高いカウントが得られた。強固に接着する菌についてスクリーニングしたもの（均質化）のうち、３５６（回腸−虫垂）は、有意なカウントを示す唯一の組織切片であった。

表１は、組織試料の菌数を組織１ｇ当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍｌ）として示したものである。

発酵最終産物分析
炭水化物グルコースの代謝とその後の有機酸終点産物の代謝をＬＫＢ Ｂｒｏｍｍａ，Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ 高速液体クロマトグラフィーカラムを用いて調べた。カラムは、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ（一定圧力）により６０℃に保持した。用いたＨＰＬＣ緩衝液は、０．０１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４であった。分析前に、カラムを１０ｍＭサイトレート、１０ｍＭグルコース、２０ｍＭラクテートおよび１０ｍＭアセテートをスタンダードとして用いて校正した。培養物は、改変ＴＰＹ培養液中で嫌気的に１〜２日間、３７℃で増殖させた。１４，０００ｇで１０分間遠心分離後、上清をＨＰＬＣ緩衝液で１：５に希釈し、ＨＰＬＣ中で２００μｌを分析した。全上清は、二重に分析した。

細菌単離物の生化学的および生理学的特性を決定し同定に役立てた。ナイトレート還元、インドール形成およびβガラクトシダーゼ活性の発現をアッセイした。１５℃および４５℃両者における増殖、ＮａＣｌ濃度を５．０％まで増加させて存在させた場合の増殖、およびゼラチン上におけるプロテアーゼ活性を求めた。リトマスミルク中における前記株類の増殖特徴も評価した。ビフィドバクテリウム菌の同定は、フラクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ酵素活性をアッセイすることによって確認した（２０）。

異なるサンプルからカタラーゼ陰性の細菌単離物約１５００が選択され、それらのグラム反応、細胞大きさおよび形態、１５℃および４５℃における増殖、およびグルコースからの発酵最終産物の観点から特性解析した（データ示さず）。試験した単離物の６０％を越えるものがグラム陽性の均質発酵性の球菌（ＨＯＭＯ−）でテトラド類、鎖状または束状のいずれかに並んでいた。単離物の１８％はグラム陰性棹菌および不均質発酵性の球棹菌（ＨＥＴＥＲＯ−）であった。残りの単離物（２２％）は、主に、均質発酵性の球棹菌であった。ビフィド様培養物を、３種の組織切片３５６、１７６およびＡから単離した。３８株はより詳細に特性解析した−４３３から１３単離物；４２３から４単離物；３１２から８単離物；３５６から９単離物；１７６から３単離物；および３１６から１単離物であった。３８単離物全てを試験したところ、ナイトレート還元およびトリプトファンからのインドール産生の両者に対して陰性であった。異なる温度、ＮａＣｌ濃度における増殖とゼラチン加水分解を下記の表２に記録した。

種同定＆酵素活性プロフィール
ＡＰＩ Ｒａｐｉｄ ３２Ａキット（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＳＡ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、ビフィドバクテリウム単離物の初期同定を行った。これは、標準化しかつ小型化した酵素試験を用いる嫌気性菌類のための同定システムである。ビフィドバクテリウム単離物をＴＰＹ寒天上で上記のように増殖させた。細胞を、提供された培地に再度懸濁させ、ストリップ中に接種し、４時間後、このストリップを製造業者の指示に従い読み取った。

３５６および１７６からの単離物のうち１０個を、フラクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ酵素アッセイとＲａｐｉｄ３２Ａキットを用いてビフィドバクテリウム菌として同定した。ランダム増殖多形ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）に基づき、４株類ＡＨ２１０、ＡＨ２１１，ＡＨ２１２、ＡＨ２１４がインファンティス種として分類された。

最後に、１６ｓ ＲＮＡ分析とリボタイピングを用いて、より詳細に株のアイデンティティを調べた。リボタイピングにより、前記6種の株類ＡＨ２０８、ＡＨ２０９、ＡＨ２１０、ＡＨ２１１，ＡＨ２１２およびＡＨ２１４のそれぞれがビフィドバクテリウムロンガム群に属していることが確認され、一方、１６ｓ ＤＮＡ分析によってさらに、前記株類のそれぞれがビフィドバクテリウムロンガムインファンティスであるとして同定された。

抗生物質感受性特性
前記単離物の抗生物質感受性を、‘ディスク感受性’アッセイを用いて決定した。培養物を適切な培養液中で２４〜４８時間増殖させ、寒天培地に塗布接種し（１００μｌ）、公知濃度の抗生物質を含むディスクをこの寒天上に置いた。嫌気性条件下３７℃で１〜２日間、インキュベーションし、抗生物質感受性について株類を調べた。株類は、１ｍｍ以上の阻止円が観察されるならば、感受性と見なした。

ヒトの臨床上重要な抗生物質類を用いて、前記ビフィドバクテリウムロンガムインファンティス株類のうちの３種、ＡＨ２０９、ＡＨ２１０およびＡＨ２１２のそれぞれの感受性特性を確認した。これらのビフィドバクテリウム菌は、アンピシリン、アモキシシリン、セフタキシム、セフトリアキソン、シプロフロキサシン、セファラジン、リファンピシンおよびクロラムフェニコールに対して感受性であった。前記株類は、ネチルミシン、トリメソプリンおよびナリジクス酸に対して耐性であった。

低ｐＨにおけるビフィドバクテリウム菌の増殖
ヒト胃液を健常対象から経鼻胃管（Ｍｅｒｃｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｃｏｒｋ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を介し吸入によって得た。それをすぐに１３，０００ｇで３０分間遠心分離し固体粒子を全て除去し、０．４５μｍと０．２μｍのフィルターによって殺菌し、アリコット４０ｍｌに分割し、４℃と−２０℃で保存した。

サンプルのｐＨとペプシン活性は、実験使用に先立ち測定した。ペプシン活性は、定量的ヘモグロビンアッセイによって測定した。簡単に述べると、胃液アリコット（１ｍｌ）を基質（０．７Ｍ尿素、０．４％（ｗ／ｖ）ウシヘモグロビン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，０．２５Ｍ ＫＣｌ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ２．０））に添加し、２５℃でインキュベーションした。サンプルを、０，２，４，６，８，１０，２０および３０分間隔で取り出した。反応は、５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）添加により終結させ、攪拌せずに３０分間放置した。アッセイ混合物をその後ろ過（Ｗｈａｔｍａｎ、ｎｏ．１１３）し、１４，０００ｇで１５分間遠心分離し、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。ペプシン酵素活性１単位は、ヘモグロビンを基質として用いてＴＣＡ−可溶性生成物類として測定し、ｐＨ２．０において１分あたりＡ_２８０ｎｍにおいて０．００１ユニット増加を起こすために必要な酵素量として定義した。

ビフィドバクテリウムロンガムインファンティス株類の増殖が胃で見られるものと等しい低ｐＨ値で起こるかどうかを調べるため、一晩培養したものを新鮮一晩培養物から採取し、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で二回洗浄し、ｐＨ３．５、３．０、２．５および２．０に（１Ｎ ＨＣｌによって）調整したＴＰＹ培養液中に再懸濁させた。細胞は３７℃でインキュベーションし、プレート計数法を用いて５，３０，６０および１２０分間隔で生存を測定した。

ビフィドバクテリウム菌の胃を介した継代に耐えて生き延びる能力を調べるため、ヒト胃液を用いてエクスビボ研究を行った。一晩培養した新鮮培養物から細胞を採取し、緩衝液（ｐＨ６．５）で２回洗浄し、最終濃度１０^６〜１０^８ｃｆｕ／ｍｌとなるようにヒト胃液中に再懸濁させた。３７℃における３０〜６０分のインキュベーション時間にわたって生存をモニターした。この実験は、ｐＨ約１．２（非調整）およびｐＨ２．０および２．５（１Ｎ ＮａＯＨによって調整）の胃液を用いて実施した。

試験したビフィドバクテリウムロンガムインファンティス４株類（ＡＨ２１０、ＡＨ２１１，ＡＨ２１２およびＡＨ２１４）のそれぞれは生き延び、ｐＨ３．５において全く生存力を失うことがなかった（データを示さず）。

ヒト胃中で遭遇する条件で前記ビフィドバクテリウムロンガムインファンティス株類が生存できるかその能力を調べるため、生存能力を、ｐＨ約１．２とｐＨ２．５のヒト胃液中で試験した。下記表３は、ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／ｍｌで表した生存を示している。ｐＨ１．２の胃液に比較して、ｐＨ２．５の胃液中で生存が増加した。

胆汁存在下における培養物の増殖
新鮮培養物をウシ胆汁（Ｂ−８３８１、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｐｏｏｌｅ）を濃度０．３、１．０、１．５，５．０および７．５％（ｗ／ｖ）で添加しかつブタ胆汁（Ｂ−８６３１、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｐｏｏｌｅ）を濃度０．３、０．５、１．０、１．５、５．０および７．５％（ｗ／ｖ）で添加したＴＰＹ寒天プレートに画線した。プレートは嫌気条件下３７℃でインキュベーションし、増殖を２４〜４８時間後に記録した。

ヒト数名の胆嚢から単離した胆汁サンプルは、使用前−８０℃で保存した。実験作業のため、胆汁サンプルを融解させ、プールし、８０℃で１０分間殺菌した。ヒト胆汁の胆汁酸組成は、Ｄｅｋｋｅｒらの方法に従って（２１）逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）をパルスアンペアメータ法による検出器と併用して決定した（２１）。ヒト胆汁を濃度０．３％（ｖ／ｖ）でＴＰＹ寒天培地に添加した。画線したばかりの培養物を、２４および４８時間後に増殖について調べた。

ヒト胆嚢胆汁は、５０〜１００ｍＭの胆汁酸濃度を有しており、小腸での希釈によってこの濃度が５〜１０ｍＭまで低下する。さらに、生理的条件下では、胆汁酸はナトリウム塩として見られる。したがって、下記胆汁酸類それぞれのナトリウム塩を含むＴＰＹ寒天プレート上における増殖について培養物をスクリーニングした（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｐｏｏｌｅ）。

（ａ）結合形態：タウロコール酸（ＴＣＡ）；グリココール酸（ＧＣＡ）；タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）；グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）；タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）およびグリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）；
（ｂ）脱結合形態：リソコール酸（ＬＣＡ）；ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）；デオキシコール酸（ＤＣＡ）およびコール酸（ＣＡ）。各胆汁酸について、１，３および５ｍＭの濃度を用いた。増殖は、２４時間および４８時間の嫌気的インキュベーション後に記録した。

定性的（寒天プレート）および定量的（ＨＰＬＣ）アッセイを用いて脱結合活性を決定した。

プレートアッセイ：全培養物は、（ａ）０．３％（ｗ／ｖ）ブタ胆汁、（ｂ）３ｍＭ ＴＤＣＡまたは（ｃ）３ｍＭ ＧＤＣＡを添加したＴＰＹ寒天プレート上に画線した。脱結合は、コロニーを取り囲む乳白色の沈殿として観察された。

高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）：ヒト胆汁のインビトロ脱結合の分析を、ＨＰＬＣを用いて実施した。簡単に述べると、一晩培養した培養物を０．３％（ｖ／ｖ）ヒト胆汁を添加したＴＰＹ培養液に接種し（５％）、嫌気的に３７℃でインキュベーションした。２４時間にわたりさまざまな時間間隔で、サンプル（１ｍｌ）を取りだし、１４，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。未希釈細胞非含有上清（３０μｌ）をその後、ＨＰＬＣによって分析した。

試験したビフィドバクテリウム菌のいくつかは、使用した３つの胆汁源で増殖可能であった（胆汁酸耐性）。ウシ胆汁に対する耐性がブタ胆汁に対するよりもはるかに高いことが観察された。試験したビフィドバクテリウム株類は、１．５％を含む最大１．５％までのウシ胆汁濃度に対して耐性であった（データは示さず）。

ブタ胆汁は、下記の表４に示したようにより阻害性であった。

ウシおよびブタ両者の胆汁存在下における胆汁耐性プロフィールにかかわらず、ビフィドバクテリウム菌は、０．３％（ｖ／ｖ）ヒト胆汁の生理的濃度においてコンフルエンスになるまで増殖した（データを示さず）。

各胆汁酸類に対するその耐性について特異的に分析すると、ビフィドバクテリウム菌はタウリン結合胆汁酸類の存在下でよく増殖し、単離物類は、タウリン結合物ＴＣＡ，ＴＤＣＡおよびＴＣＤＣＡ５ｍＭを含む最大５ｍＭまでの寒天培地上でコンフルエンスになるまで増殖した。下記の表５から明らかにわかるようにグリシン結合物類のいずれも、試験したビフィドバクテリウムロンガムインファンティス４種（ＡＨ２１０、ＡＨ２１１，ＡＨ２１２およびＡＨ２１４）の増殖を阻害しなかった。

脱結合胆汁酸類存在下における増殖も試験した。ビフィドバクテリウムＡＨ２１０、ＡＨ２１１，ＡＨ２１２およびＡＨ２１４は、濃度５ｍＭのＬＣＡに対して耐性であった。ＣＡ存在下における増殖も試験した。下記の表６は、その結果を示している。１ｍＭ ＣＤＣＡ存在下で全く増殖が観察されなかった（結果を示さず）。

抗菌活性の検出
本研究で使用した指標微生物類の多くはＭｅｒｃｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｃｏｒｋ，Ｉｒｅｌａｎｄで単離された野生型株であり、下記の増殖条件下で下記の培地中で増殖させた：０．６％酵母抽出物添加トリプトンソヤ培養液／寒天（ＴＳＡＹＥ、Ｏｘｏｉｄ）中スタフィロコッカス（３７℃、嫌気的）、バシラス（３７℃、嫌気性）、シュードモナス（３０℃、好気的）、大腸菌（３７℃、嫌気性）、サルモネラ（３７℃、嫌気性）およびリステリア（３０℃、好気性）、血液寒天培地上におけるカンフィロバクター（３７℃、嫌気性）、バクテリオデス（３７℃、嫌気性）、ヘリコバクター（３７℃、嫌気性）、プロテウス（３７℃、嫌気性）ヘモフィラス（３７℃、嫌気性）およびニューモコッカス（３７℃、嫌気性）、ＹＰＤ（酵母（１％）、ペプトン（２％）およびデキストロース（２％））培地中カンジダ（３７℃、嫌気性）、強化クロストリジアル培地（ＲＣＭ、Ｏｘｏｉｄ）中クロストリジウム（３７℃、嫌気性）、Ｍ１７培地（Ｏｘｏｉｄ）中ラクトコッカス（３０℃、好気性）、トッドヘウィット培地（Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｏｘｏｉｄ）中ストレプトコッカス（３７℃、嫌気性）、およびブレインハートインフージョン培地（ＢＨＩ、Ｍｅｒｃｋ）中エンテロコッカス（３７℃、嫌気性）。全菌株類は、新鮮増殖培地に接種し一晩増殖させてから、実験に使用した。寒天スロッピー（積層）およびプレートは、前記培養液にそれぞれ０．７％（ｗ／ｖ）および１．５％（ｗ／ｖ）寒天を添加することによって、調製した。

抗菌活性は、言及した方法（２２）を用いて検出した。当初のスクリーニングに用いた指標は、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）、Ｌ．ファーメンツムＫＬＤ（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＫＬＤ）、Ｐ．フロウレセンス（Ｐ．ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｓ）および大腸菌Ｖ１５７（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｖ１５７）であった。簡単に述べると、ビフィドバクテリウム菌（ＴＰＹ）を、３６〜４８時間インキュベーションした。順次１０倍希釈したものをＴＰＹ寒天培地に塗布接種（１００μｌ）した。一晩インキュベーションした後、明確なコロニーを有するプレートに指標となる細菌を積層した。指標のローンは、モルテンオーバレイに一晩培養した指標培養物の２％（ｖ／ｖ）を接種して調製し、接種ＴＰＹプレート表面に注いだ。このプレートを指標細菌の増殖に適した条件下で一晩、再度インキュベーションした。半径１ｍｍを超える阻止円を有する指標培養物は、試験細菌に対して感受性であると考えた。

バクテリオファージ活性による阻害は、接種ＴＰＹ寒天プレートを上下にさかさまにし指標に重なることによって、除外した。バクテリオファージは、寒天中を拡散できない。

ビフィドバクテリウムロンガムインファンティス各株は、指標微生物類としてＬｓ．イノキュア、Ｌ．ファーメンツムＫＬＤ、Ｐ．フルオレセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）および大腸菌を用い阻害活性をスクリーニングした。試験株類を非緩衝化ＭＲＳ上に接種すると、４種の指標類の阻害が観察された。大きさが１ｍｍ乃至５ｍｍの範囲の円が測定された。

スクリーニング中ＴＰＹプレートにカタラーゼを取り込ませたが抗菌活性に影響を及ぼさなかったので、阻害は、過酸化水素によるのではなかった。同様に、バクテリオファージ活性は、方法のところで述べたように除外した。

ビフィドバクテリウムロンガムインファンティス全６株（ＡＨ２０８、ＡＨ２０９、ＡＨ２１０、ＡＨ２１１，ＡＨ２１２およびＡＨ２１４）は、ＴＰＹ培地上で試験したとき広範囲のスタフィロコッカス、シュードモナス、コリフォルムおよびバシラス種に対して阻害性であった。シュードモナスおよびスタフィロコッカスに対して最大５ｍｍまで、バシラス種を取り囲む７ｍｍまでの阻止円（コロニーエッジより阻止円エッジまで）が記録された。下記の表７は、スタフィロコッカス株類の阻害を示している。

下記の表８は、シュードモナスおよびバシラス株類の阻害を示している。

消化管上皮細胞へのプロバイオティック菌の接着
接着アッセイ
プロバイオティック株類の接着は、先に述べた方法を改良したものを用いて実施した（２３）。ＨＴ−２９およびＣａｃｏ−２細胞の単層を無菌の２２ｍｍ^２のガラスカバースリップ上に調製し、それを濃度４×１０^４細胞／ｍｌでコーニング組織培養皿に入れた。細胞には２日毎に新鮮培地を供給した。約１０日後かつ単層の分化が起こった後、この単層を２回、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。抗生物質を含まないＤＭＥＭ（２ｍｌ）および約１０^８ｃｆｕ／ｍｌを含む約１８ｈ ビフィドバクテリウム懸濁液２ｍｌを各皿に添加し、細胞を３７℃で２時間、５％ＣＯ_２含有湿潤雰囲気中でインキュベーションした。インキュベーション後単層を５回ＰＢＳで洗浄し、３分間メタノール（ＢＤＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）固定しグラム染色（Ｇｒａｍ Ｓｔａｉｎ Ｓｅｔ、Ｍｅｒｃｋ）し、油浸下顕微鏡で調べた。各ガラスカバースリップ単層について、上皮細胞２０個当たりの接着細菌数を顕微鏡視野１０種で計数した。上皮細胞２０個当たりの接着細胞数の平均と標準誤差を計算した。各接着アッセイは、二重に実施した。

第２の方法では、ＰＢＳ中で５回洗浄した後、単層を冷たい無菌Ｈ_２Ｏ中で強くボルテックスすることによって接着細菌を除去した。１／４強度のリンゲル液（Ｏｘｏｉｄ）で順次希釈しＴＰＹでインキュベーションすることによって菌体を数えた。

ビフィドバクテリウムロンガムインファンティス各株は、消化管上皮細胞に接着した（図１）。これらのプロバイオティック株類は、それらが消化管上皮に接着しそれゆえに関連宿主細胞と相互作用するので、ワクチン／薬物運搬担体として適している。

ＰＢＭＣサイトカイン産生に及ぼすプロバイオティック株類の効果の決定
末梢血単核球細胞を健常ドナー（ｎ＝１９）から密度勾配遠心分離によって単離した。ＰＢＭＣ類は、前記プロバイオティック菌株類によって３７℃で７２時間刺激した。この時点で培養上清を採取し、遠心分離し、アリコットに分け、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−８およびＩＦＮ□レベルをＥＬＩＳＡ類（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて評価するまで、−７０℃で保存した。

ＡＨ２０８，ＡＨ２１０、ＡＨ２１１、ＡＨ２１２およびＡＨ２１４は、ＰＢＭＣ類によるＩＦＮγ産生をさまざまなレベルで刺激した（図２）。対照的に、ＡＨ２０９は、ＰＢＭＣ類によるＩＦＮγ産生を刺激しなかった。

ＡＨ２０８，ＡＨ２１１およびＡＨ２１２はＰＢＭＣ類と混合培養すると、ＩＬ−１０産生を有意に誘発した（図３）。ＡＨ２０９およびＡＨ２１０は、対照に比較して、ＩＬ−１０レベルを有意に変化させなかった。

ＡＨ２０８、ＡＨ２１０およびＡＨ２１２をＰＢＭＣ類と混合培養すると、結果としてＩＬ−１２レベルをアップレギュレーションした（図４）。ＡＨ２０９およびＡＨ２１１は、ＩＬ−１２レベルを有意に変化させなかった。

ＡＨ２０８，ＡＨ２０９、ＡＨ２１０、ＡＨ２１１、ＡＨ２１２およびＡＨ２１４は、健常ドナーから単離したＰＢＭＣ類からのインビトロにおけるＩＬ−８産生を刺激しなかった（図５）。

ＡＨ２１２とのインキュベーション後における上皮／ＰＢＭＣ混合培養モデルにおけるサイトカインレベルの決定
小腸に生理学的関連性を有する適切なインビトロモデルは、上皮細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球および菌株類を取り込んだ培養系である。この目的のため、ヒトＣａｃｏ−２上皮細胞を、孔径３□ｍの２５ｍｍトランスウェルインサート類（Ｃｏｓｔａｒ）の先端表面に５×１０^５細胞／ｍｌで種接種した。これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ１６４０中で、５％ＣＯ_２環境中３７℃で４週間培養した。培地は、３日毎に交換した。上皮細胞が完全に分化した時点で、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ類）を密度勾配遠心分離によって単離した。洗浄したＰＢＭＣ類１×１０^６個を上皮細胞に対して基底外側でインキュベーションし、プロバイオティック菌１×１０^７個と培養した。対照は培地のみを含んでいた。ＰＢＭＣ類と上皮細胞では直接の細胞−細胞接触はこのモデル系では起こり得なく、細胞間コミュニケーションは、可溶性因子類のみによって媒介されていた。

ＡＨ２１２と７２時間インキュベーションした後、細胞培養物上清を取り出し、アリコットに分け、−７０℃で保存した。ＴＮＦα細胞外サイトカインレベルを、標準的ＥＬＩＳＡキット類（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。ＴＮＦαレベルは、健常志願者３名のＰＢＭＣｓを用いて二重測定した。

プロバイオティック菌類と上皮細胞−ＰＢＭＣの混合培養物をインキュベーション後、ＥＬＩＳＡ類によってＴＮＦαサイトカインレベルを測定した（図６）。ＡＨ２１２は、これらの細胞によって放出されるＴＮＦαレベルを低下させた。

免疫調節
ヒト免疫系は、非常に広範囲のヒト疾患の病因および病理に重要な役割を果たしている。低および高免疫応答性は、疾病状態の一部であるかまたは大部分である。サイトカインと称される生物体の一族は、免疫プロセスのコントロールに特に重要である。これらの繊細なサイトカインネットワークが混乱すると、多くの疾患にますます関連するようになってくる。これらの疾患には、炎症性障害、免疫不全、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、腫瘍（特に、消化管および免疫系のそれら）、下痢疾患、抗生物質関連下痢、小児下痢、虫垂炎、自己免疫疾患、多発性硬化症、アルツハイマー病、リウマチ性関節炎、腹腔疾患、糖尿病、臓器移植、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、歯周病、泌尿器疾患、性感染症、ＨＩＶ感染、ＨＩＶ複製、ＨＩＶ関連下痢、外科手術関連外傷、外科手術誘発転移性疾患、敗血症、体重減少、食欲不振、発熱コントロール、悪液質、創傷治癒、潰瘍類、腸バリア機能、アレルギー、喘息、呼吸器障害、循環系障害、冠心疾患、貧血、血液凝固系障害、腎疾患、中枢神経系障害、肝疾患、虚血、栄養障害、骨粗しょう症、内分泌障害、表皮障害、乾癬およびにきびが含まれるが、これらに限定されない。サイトカイン産生に及ぼす効果は、調べたプロバイオティック株類のそれぞれに特異的である。したがって、特に特定疾患種類について独自のサイトカインインバランスを正常化するために、特定のプロバイオティック株類を選択することもできる。疾患特異的療法を患者に合わせることは、上記に述べたプロバイオティック株類を選択し用いることによって、達成できる。

免疫教育
腸内菌叢は、小腸免疫系の発達と適切な機能のために重要である。腸内菌叢がないと、小腸免疫系は菌を全く含まない動物モデルにおいて実証されているように未発達であり、マクロファージ貪食能力や免疫グロブリン産生のようなある機能的パラメータが消失する（２４）。非傷害免疫応答の刺激において腸内菌叢が重要であることが、より明確になってきている。西欧諸国におけるアレルギー疾患の頻度と重篤度の増大は、宿主が遭遇する感染暴露回数と範囲が低下していることとあいまって、保健衛生の向上と関連している。免疫刺激がこのように欠けていることにより、宿主は、非病原性であるが抗原性物質類に反応するようになり、アレルギーまたは自己免疫が起こることになる。一連の非病原性免疫調節性細菌を意識的に消費させることによって、宿主に対して必要かつ適切な教育的刺激を与え、免疫機能を適切に発達させコントロールできる。

炎症
炎症とは、身体的損傷、感染を受けた部位または免疫応答が進行中の場所に体液、血漿タンパク質類および白血球が局所的に集積することを述べる用語である。炎症応答のコントロールは、いくつかのレベルで発揮される（２５）。コントロール因子には、サイトカイン類、ホルモン類（例 ハイドロコーチゾン）、プロスタグランジン類、反応性中間体類およびロイコトリエン類が含まれる。サイトカイン類は低分子量の生物活性蛋白質類で、発達、組織修復および造血を制御する一方免疫および炎症応答の産生と制御に関わっている。それらは、白血球それ自体間および他の細胞タイプとのコミュニケーション手段を提供する。ほとんどのサイトカイン類は多面的で、生物学的に重複する複数の活性を発現する。サイトカインカスケード類およびネットワークは、特定細胞タイプに特定サイトカインが及ぼす作用というよりはむしろ、炎症性応答をコントロールする（２６）。炎症応答が衰退すると結果として該当活性化シグナルおよび他の炎症性メディエータ類の濃度低下が起こり、炎症応答の停止が導かれる。ＴＮＦαは、それがサイトカイン類カスケードおよび炎症状態を起こすことになる生物効果を開始させるので、中枢的前炎症性サイトカインである。したがって、例えばインフリキシマブのようなＴＮＦαを阻害する物質類が現在、炎症性疾患類の治療に使用されている。

前炎症性サイトカイン類は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む多くの炎症性疾患類の病理に主要な役割を果たしていると考えられている。ＩＢＤ治療用現行療法は、ＩＬ−８およびＴＮＦαを含むこれらの前炎症性サイトカイン類のレベルを低下させることを目標としている。このような療法はまた、リウマチ性関節炎のような全身炎症性疾患類の治療にも重要な役割を果たすことができる。

過敏性腸症候群（ＩＢＳ）はよくある消化管障害であり、１５〜２０％にも上る公衆にその人生のある段階で影響を及ぼす。最もよく見られる症状は、腹痛、下痢または便秘によって表される排便障害、鼓腸、および腹部膨満が挙げられる。診断を確定するための簡易試験は全くなく、もしこれらの症状に対して他の器質的障害が全く見出せなければ、その診断は通常ＩＢＳである。ＩＢＳ罹患患者類は、胃腸科医が診る患者の２５〜５０％にも上っている。

例えば胃腸炎発作、腹部または骨盤部手術、おそらく抗生物質服用および感情的ストレスによる小腸菌叢の障害を含む症状の発症に関与していると考えられている。ＩＢＳ罹患患者は、一般公衆に比較して、有意に低下した生活の質を有するようになるであろうし、仕事を離れる可能性も高く、より多くのヘルスケア用品類を使用する。有効な医療法は全くなく、今日推奨される療法には、抗痙攣薬、抗下痢薬、食物繊維サプリメント類、結腸の内臓認識閾値を変える薬物類、鎮痛薬類および抗うつ剤類が含まれている。

本発明の株類のそれぞれはサイトカイン調節および微生物拮抗作用プロフィールに関して独自の性質を有しているが、特定株類をこれらの性質に基づき特定の疾病状態に使用するために選択できることが当然予測される。また、適切なサイトカイン調節性質と抗菌性を有するこのパネル由来の株類を組み合わせて治療効果を高められるであろうということも当然予想される。

本発明の株類は、特にもし非ステロイド抗炎症薬物類（ＮＳＡＩＤｓ）またはインフリキシマブのような他の抗炎症療法と併用して使用すれば、ある範囲の炎症性疾患の治療において潜在的適用を有することもできる。

サイトカイン類および腫瘍
広範囲の腫瘍タイプに対して多機能性サイトカイン類が産生されることは、有意な炎症応答が腫瘍患者において進行中であることを示唆している。この応答がインビボにおける腫瘍細胞の増殖と進展にいかなる防御効果を有しているかは今のところ明確ではない。しかし、これらの炎症応答は、担癌宿主に悪影響を及ぼすことができた。複雑なサイトカイン相互作用が、腫瘍内部および正常組織内部におけるサイトカイン産生と細胞増殖の制御に関与している（２７、２８）。体重減少（悪液質）が腫瘍患者の最もありふれた単一死亡原因であり、当初の栄養不良状態が予後不良を示唆する。腫瘍が増殖しかつ拡がるためには、新しい血管の形成を誘発し、細胞外マトリックスを崩壊させなければならない。炎症応答は、上記メカニズムに重要な役割を果たし、従って、宿主の体力減退と腫瘍の進展に寄与しているのかも知れない。ビフィドバクテリウムロンガムインファンティスの抗炎症性質により、これらの菌株類それらは、悪性細胞転換速度を遅くするのかも知れない。さらに、小腸細菌は食物化合物から遺伝子毒性、発癌性および腫瘍促進活性を有する物質類を産生でき、腸内細菌は、前発ガン物質類をＤＮＡ反応性物質類に活性化できる（２９）。一般的に、ビフィドバクテリウム種は、バクテロイド類、ユーバクテリアおよびクロストリジアのような他の腸内菌群に比較して、低い生体異物代謝酵素活性を有している。したがって、腸内ビフィドバクテリウム菌類の数を増やすことは、これらの酵素類レベルを有益な方に修飾できた。

ワクチン／ドラッグデリバリ
病原性生物の大半は、粘膜表面を介した入口を獲得する。これらの部位類を効率的にワクチンすることで、特定の感染性物質による侵入に対して防御する。経口ワクチン法は、今日まで、弱毒生病原性生物または精製カプセル化抗原類の使用に集約されていた（３０）。感染性物質に対してインビボで抗原類を産生するように工学的に作成されたプロバイオティック菌類は、これらの菌類がヒト消費に対して安全であると考えられているので、魅力的な代替品を提供できるであろう（ＧＲＡＳステータス）。

マウス研究では、外来抗原類を発現するプロバイオティック菌類の消費が、防御性免疫応答を惹起できることを実証してきた。破傷風毒素断片Ｃ（ＴＴＦＣ）をコードする遺伝子はラクトコッカスラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）で発現され、マウスを経口経路で免疫した。この系は、マウスを致死的毒素襲撃から防御するだけの有意に十分に高い抗体力価を誘発できた。抗原提示に加えて、生菌ベクター類は、免疫刺激サイトカイン類のような生体活性化合物類をインビボで産生できる。生体活性ヒトＩＬ−２またはＩＬ−６を分泌するＬ．ラクティスおよびＴＴＦＣは、鼻内免疫マウスにおいて１０〜１５倍高い血清ＩｇＧ力価を誘発した（３１）。しかし、この特定の菌株をもってしても、総ＩｇＡレベルは、これらのサイトカイン類による混合発現によって増加しなかった。ストレプトコッカスゴルドニ（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ）のような他の菌株類も、それらの粘膜ワクチンとしての有用性が調べられている。マウス口腔および膣腔にコロニーを作る組み換えＳ．ゴルドニは、この菌が発現する抗原類に対して粘膜および全身両者の抗体応答を誘発した（３２）。したがって、ベクター類としてプロバイオティック菌類を用いた経口免疫は、宿主を感染から防御するだけでなく、通常病原体が惹起するであろう免疫刺激に取って代わり、従って、宿主の免疫教育に寄与するであろう。

プレバイオティックス
プロバイオティック生物類の導入は、適切な担体中に微生物を摂取させることによって行われる。これらのプロバイオティック株類の大腸における増殖を促進するような媒体を提供することは有益であろう。１種以上のオリゴ糖類、多糖類、または他のプレバイオティックスを添加することは、消化管中における乳酸菌の増殖を増強する。プレバイオティックスとは、プラスの価値があると見なされているビフィドバクテリア菌、ラクトバチラス菌のような生来備わっている細菌によつて結腸中で特異的に発酵される生命を有していないあらゆる食物成分を称する。プレバイオティックス類の種類には、フラクトース、キシロース、ソーヤ、ガラクトース、グルコースおよびマンノースを含むそれらが挙げられる。プロバイオティック株と１種以上のプレバイオティック化合物類を併用投与することは、投与プロバイオティックスのインビボにおける増殖を高め、より顕著な健康への恩恵が得られることになり、シンビオテックと称されている。

他の活性成分類
プロバイオティック株類がそれ自体としてまたは上記で述べた他のプロバイオティックおよび／またはプレバイオティック物質類とともに予防的にまたは治療方法として投与できることがわかるであろう。さらに、前記菌類は、炎症または他の障害類、特に免疫が関与するそれらの治療に用いられるもののような他の活性物質類を用いて予防または治療方針の一部として使用できる。このような組み合わせは、単一製剤として投与するかまたは別々の製剤として、同一または異なる投与経路を用いて、同時にまたは異なる時点で投与できる。

本発明はこれまで記載してきた態様に限定されず、それらは、細部において変更できる。

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ヒト消化管上皮細胞であるＣａＣｏ−２およびＨＴ−２９に対するビフィドバクテリウムロンガムインファンティスの接着性を示した棒グラフである。 ＰＢＭＣ類によって誘発されたＩＦＮγ（ｐｇ／ｍｌ）産生に及ぼすビフィドバクテリウムロンガムインファンティス各株の効果を示した棒グラフである。 ビフィドバクテリウムロンガムインファンティスと同時インキュベーション後、ＰＢＭＣ類によるＩＬ−１０（ｐｇ／ｍｌ）産生に及ぼす効果を示した棒グラフである。 ビフィドバクテリウムロンガムインファンティスと同時インキュベーション後、ＰＢＭＣ類のＩＬ−１２（ｐｇ／ｍｌ）応答を示した棒グラフである。 ＩＬ−８産生に及ぼすビフィドバクテリウムロンガムインファンティスの非刺激効果を例示した棒グラフである。 ＴＮＦα産生に及ぼすビフィドバクテリウムロンガムインファンティスＡＨ２１２の阻害効果を示した棒グラフである。

Claims (57)

1. ＡＨ２０８，ＡＨ２０９，ＡＨ２１０，ＡＨ２１１、ＡＨ２１２またはＡＨ２１４のいずれかから選択されたビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株またはその変異体類またはバリアント類。
2. ビフィドバクテリウム株ＡＨ２０８またはその変異体またはバリアント。
3. ビフィドバクテリウム株ＡＨ２０９またはその変異体またはバリアント。
4. ビフィドバクテリウム株ＡＨ２１０またはその変異体またはバリアント。
5. ビフィドバクテリウム株ＡＨ２１１またはその変異体またはバリアント。
6. ビフィドバクテリウム株ＡＨ２１２またはその変異体またはバリアント。
7. ビフィドバクテリウム株ＡＨ２１４またはその変異体またはバリアント。
8. 前記変異体が遺伝的に修飾された変異体である請求項１乃至８のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株。
9. 前記バリアントがビフィドバクテリウムの天然のバリアントである請求項１乃至８のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株。
10. 株類ＡＨ２０８，ＡＨ２０９，ＡＨ２１０，ＡＨ２１１、ＡＨ２１２またはＡＨ２１４のいずれかから選択されたビフィドバクテリウム株の生物学的に純粋な培養物。
11. 生細胞の形状である請求項１乃至１０のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株。
12. 非生細胞の形状である請求項１乃至１０のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株。
13. 前記ビフィドバクテリウムが切除し洗浄したヒト消化管から単離される請求項１乃至１２のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株。
14. 前記株がヒトにおける経口的消費後において有意に免疫調節性である請求項１乃至１３のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株。
15. 前記株がＰＢＭＣ類によって産生されたＩＬ−１０を刺激可能である請求項１乃至１４のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株。
16. 前記株がＡＨ２０８、ＡＨ２１１またはＡＨ２１２のいずれかひとつから選択される請求項１５に記載のビフィドバクテリウム株。
17. 請求項１乃至１６のいずれかに記載の少なくとも１種のビフィドバクテリウム株を含む製剤。
18. 別のプロバイオティック物質を含む請求項１７に記載の製剤。
19. プレバイオティック物質を含む請求項１７または１８のいずれかに記載の製剤。
20. 摂取可能な担体を含む請求項１７乃至１９のいずれかに記載の製剤。
21. 前記摂取可能な担体は、カプセル、錠剤または散剤のような薬学的に許容できる担体である請求項２０に記載の製剤。
22. 前記摂取可能な担体が、酸性化させたミルク、ヨーグルト、冷凍ヨーグルト、粉ミルク、ミルク濃縮物、チーズスプレッド類、ドレッシング類または飲料類のような食品である請求項２０または２１に記載の製剤。
23. さらに、蛋白質および／またはペプチド、特にグルタミン／グルタメートを多量に含む蛋白質類および／またはペプチド類、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラルおよび／または微量元素を含む請求項１７乃至２２のいずれかに記載の製剤。
24. 前記ビフィドバクテリウム株が、前記製剤１ｇ当たり１０^６ｃｆｕを超えた量で存在する請求項１７乃至２３に記載の製剤。
25. アジュバントを含む請求項１７乃至２４に記載の製剤。
26. 細菌性成分を含む請求項１７乃至２５に記載の製剤。
27. 薬物体を含む請求項１７乃至２６に記載の製剤。
28. 生体化合物を含む請求項１７乃至２７に記載の製剤。
29. 免疫化およびワクチン化プロトコール類に使用するための請求項１７乃至２８に記載の製剤。
30. 食品中で使用するための請求項１乃至１６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１７乃至２９のいずれかに記載の製剤。
31. 医薬品として使用するための請求項１乃至１６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１７乃至２９のいずれかに記載の製剤。
32. 望ましくない炎症活性の予防および／または治療に使用するための請求項１乃至１６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１７乃至２９のいずれかに記載の製剤。
33. クローン病または潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患；過敏性腸症候群；嚢炎；または感染後大腸炎のような望ましくない消化管炎症活性の予防および／または治療に使用するための請求項１乃至１６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１７乃至２９のいずれかに記載の製剤。
34. 前記炎症活性が過敏性腸症候群である請求項３３に記載の製剤。
35. 消化管腫瘍（類）の予防および／または治療に使用するための請求項１乃至１６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１７乃至２９のいずれかに記載の製剤。
36. リウマチ性関節炎のような全身疾患の予防および／または治療に使用するための請求項１乃至１６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１７乃至２９のいずれかに記載の製剤。
37. 望ましくない炎症活性による自己免疫疾患類の予防および／または治療に使用するための請求項１乃至１６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１７乃至２９のいずれかに記載の製剤。
38. 望ましくない炎症活性による腫瘍の予防および／または治療に使用するための請求項１乃至１６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１７乃至２９のいずれかに記載の製剤。
39. 腫瘍の予防に使用するための請求項１乃至１６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１７乃至２９のいずれかに記載の製剤。
40. クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）関連下痢、または感染後下痢、または大腸菌のような感染性物質による下痢性疾患のような望ましくない炎症活性による下痢疾患の予防および／または治療に使用するための請求項１乃至１６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１７乃至２９のいずれかに記載の製剤。
41. 望ましくない炎症活性の予防および／または治療用抗炎症バイオセラピー剤の調製に使用するための請求項１乃至１６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１７乃至２９のいずれかに記載の製剤。
42. ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−８，ＩＬ−１０および／またはＩＬ−１２のレベル修飾用一群のバイオセラピー剤類の調製に使用するための請求項１乃至１６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１７乃至２９のいずれかに記載の製剤。
43. 炎症性障害、免疫不全、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、腫瘍（特に、消化管および免疫系の）、下痢疾患、抗生物質関連下痢、小児下痢、虫垂炎、自己免疫疾患、多発性硬化症、アルツハイマー病、リウマチ性関節炎、腹腔疾患、糖尿病、臓器移植、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、歯周病、泌尿器疾患、性感染症、ＨＩＶ感染、ＨＩＶ複製、ＨＩＶ関連下痢、外科手術関連外傷、外科手術誘発転移性疾患、敗血症、体重減少、食欲不振、発熱コントロール、悪液質、創傷治癒、潰瘍類、腸バリア機能、アレルギー、喘息、呼吸器障害、循環系障害、冠心疾患、貧血、血液凝固系障害、腎疾患、中枢神経系障害、肝疾患、虚血、栄養障害、骨粗しょう症、内分泌障害、表皮障害、乾癬および／またはにきびの予防および／または治療における請求項１乃至１６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１７乃至２９のいずれかに記載の製剤またはその活性誘導体断片または変異体の用途。
44. 前記株が前炎症性微生物類に拮抗し消化管から排除することによって作用する請求項１乃至１６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株。
45. 前炎症性サイトカイン類のレベル低下用抗炎症バイオセラピー剤の調製に使用するための請求項１乃至１６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１７乃至２９のいずれかに記載の製剤。
46. ＡＨ２０８、ＡＨ２０９、ＡＨ２１０、ＡＨ２１１、ＡＨ２１２またはＡＨ２１４のいずれかから選択されたビフィドバクテリウム株の抗感染性プロバイオティック株としての用途。
47. 対象において望ましくない炎症活性または炎症性疾患を治療または予防する方法で、前記対象に対して請求項１乃至１４のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１５乃至２７のいずれかに記載の製剤を投与することを含む。
48. 前記望ましくない炎症活性が消化管炎症活性である請求項４７に記載の方法。
49. 前記望ましくない炎症活性が、クローン病または潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患；過敏性腸症候群；嚢炎；または感染後大腸炎である請求項４７に記載の方法。
50. 前記望ましくない炎症活性が過敏性腸症候群である請求項４７に記載の方法。
51. 対象における腫瘍を治療または予防する方法で、前記対象に対して請求項１乃至１４のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１５乃至２７のいずれかに記載の製剤を投与することを含む。
52. 前記腫瘍が消化管腫瘍または炎症による腫瘍である請求項５１に記載の方法。
53. 対象における炎症関連全身疾患を治療または予防する方法で、前記対象に対して請求項１乃至１４のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１５乃至２７のいずれかに記載の製剤を投与することを含む。
54. 前記全身疾患がリウマチ性関節炎である請求項５３に記載の方法。
55. 対象において炎症によって起こった自己免疫疾患を治療または予防する方法で、前記対象に対して請求項１乃至１４のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１５乃至２７のいずれかに記載の製剤を投与することを含む。
56. 対象において下痢疾患を治療または予防する方法で、前記対象に対して請求項１乃至１４のいずれかに記載のビフィドバクテリウム株または請求項１５乃至２７のいずれかに記載の製剤を投与することを含む。
57. 前記下痢疾患が、クロストリジウムディフィシレ関連下痢、ロタウイルス関連下痢、感染後下痢、または大腸菌のような感染性物質による下痢疾患である請求項５６に記載の方法。

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