ES2262418B1 - Extractos proteicos con amplio espectro de actividad antibacteriana y cepas del genero bifidobacterium que los producen. - Google Patents
Extractos proteicos con amplio espectro de actividad antibacteriana y cepas del genero bifidobacterium que los producen. Download PDFInfo
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Abstract
Extractos proteicos con amplio espectro de actividad antibacteriana y cepas del género Bifidobacterium que los producen. La presente invención aporta seis cepas del género Bifidobacterium y los extractos resultantes de su metabolismo que contienen proteínas antibacterianas. Estas proteínas presentan un amplio espectro de actividad que incluye bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Las cepas de la presente invención son estables en las condiciones de estrés gastrointestinal (pH ácido, alta concentración de sales) y en las condiciones de los procesos tecnológicos de conservación y elaboración de alimentos. Además, presentan un perfil de sensibilidad a antibióticos que garantiza su seguridad. Estas cepas y sus extractos pueden ser empleados como probióticos con propiedades protectoras frente a patógenos gastrointestinales y como bioprotectores o conservantes de alimentos frente a bacterias patógenas y alterantes.
Description
Extractos proteicos con amplio espectro de
actividad antibacteriana y cepas del género Bifidobacterium
que los producen.
Esta patente pertenece al sector de la técnica
de la Industria Alimentaria y Farmacéutica. Más concretamente, esta
invención se enmarca dentro del campo de la alimentación funcional
(probióticos) y de las tecnologías de conservación de alimentos por
métodos biológicos, a través del uso de microorganismos con
actividad antimicrobiana y de sus metabolitos. La patente incluye
seis cepas del género Bifidobacterium, de origen intestinal
humano, los metabolitos proteicos con actividad antibacteriana de
amplio espectro que producen, y su uso frente a bacterias patógenas
gastrointestinales y bacterias patógenas y alterantes de
alimentos.
Los probióticos constituyen uno de los subgrupos
de alimentos funcionales más destacados por su versatilidad
funcional y gran aceptación por los consumidores, lo que ha
despertando un creciente interés comercial, tanto en la industria
farmacéutica como en la alimentaria.
Un probiótico es un suplemento dietético
constituido por microorganismos viables que, administrado en
cantidades adecuadas, es capaz de modificar la microflora de un
compartimento del huésped, ejerciendo así un efecto beneficioso
sobre la salud de éste (Schrezenmeir, et al., 2001.
Probiotics, prebiotics, and symbiotics-approaching
a definition. Am. J. Clin. Nutr. 73: 361S-364S). Los
principales probióticos son las bacterias integrantes de los géneros
Lactobacillus y Bifidobacterium, comensales del
tracto gastrointestinal y tradicionalmente utilizadas en diversas
fermentaciones alimentarias. Las cepas del género
Bifidobacterium son particularmente importantes ya que
colonizan selectivamente el tracto intestinal de los recién
nacidos, representando hasta el 91% de su flora, y en adultos entre
el 3 y el 7% (Harmsen, et al. 2000. Analysis of intestinal
flora development in breast-feed and
formula-feed infants by using molecular
identification and detection methods. J. Pediatr. Gastroenterol.
Nutr. 30: 61-67; Biavati, et al. 2001. The
family Bifidobacteriaceae. In: Dworkin, et al. (eds.),
The Prokaryotes. pp. 1-70. Springer, Nueva York).
Los microorganismos del género Bifidobacterium se incluyen
habitualmente dentro del grupo de bacterias lácticas, definido
fisiológicamente por su capacidad para producir ácido láctico como
uno de los principales metabolitos resultantes de la fermentación
de carbohidratos. No obstante, su ADN posee un contenido en G + C
más alto (55-64%) por lo que filogenéticamente se
incluyen dentro de la clase Actinobacteria (O'Riordan, et
al. 1997. Determination of genetic diversity within the genus
Bifidobacterium and estimation of chromosomal size. FEMS
Microbiol. Lett. 156: 259-264).
Los probióticos se han comercializado en una
gran variedad de formas: (i) alimentos fermentados convencionales a
los que se les adicionan probióticos y que se consumen
principalmente con fines nutritivos (leche, quesos, etc.); (ii) las
leches cultivadas y fermentadas, utilizadas básicamente como
vehículos de bacterias probióticas (leche acidófila, leche bífidus,
etc.), y (iii) los suplementos dietéticos o preparaciones
farmacéuticas liofilizadas. En la actualidad, las bifidobacterias
se consumen mayoritariamente incorporadas a alimentos y,
principalmente, a derivados lácteos; aunque se está ampliando el
número de productos (zumos, papillas, productos cárnicos, cereales,
mayonesas, etc.) que constituyen un posible vehículo para su
aporte.
Entre los efectos beneficiosos que se atribuyen
a los probióticos se incluyen la mejora de la intolerancia a la
lactosa; la prevención y tratamiento de infecciones
gastrointestinales y urogenitales, el restablecimiento del
ecosistema intestinal tras los tratamientos con antibióticos y
quimioterapia, la prevención del cáncer coleorrectal y la
estimulación del sistema inmune (Salminen, et al. 1998.
Functional food science and gastrointestinal physiology and
function. Br J Nutr; 80: 147S-171S; Tannock, 1999.
A fresh look at the intestinal microflora. In G.W. Tannock
(ed.), Probiotics. A critical review, pp. 5-14.
Horizon Scientific Press, Wymondham, Norfolk, England).
Concretamente, se considera que el género Bifidobacterium es
esencial en el mantenimiento del equilibrio del ecosistema
intestinal y el desplazamiento de microorganismos potencialmente
perjudiciales, por lo que se le atribuye una importante función
protectora. Se considera que cepas de este género ejercen efectos
beneficiosos en el tratamiento de la diarrea del viajero, las
infecciones por rotavirus y la diarrea asociada al uso de
antibióticos (McNaught, et al. 2001. Probiotics in clinical
practice: a critical review of the evidence. Nutr. Res. 21:
343-353). También se han descrito sus efectos
antagónicos frente a patógenos de los géneros Listeria,
Clostridium, Salmonella, Campylobacter, Shigella, Proteus, y
Escherichia (Gibson, et al. 1994. Regulatory effects
of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria. J. Appl.
Bacteriol. 77: 412-420; Lee, et al. 2003.
Identification and screening for antimicrobial activity against
Clostridium difficile of Bifidobacterium and
Lactobacillus species isolated from healthy infant faeces.
Int. J. Antimicrob. Agents 21: 340-346; Touré et
al. 2003. Production of antibacterial substances by
bifidobacterial isolates from infant stool active against
Listeria monocytogenes. J. Appl. Microbiol. 95:
1058-1069; Gagnon, et al. 2004. In
vitro inhibition of Escherichia coli 0157:H7 by
bifidobacterial strains of human origin. Int. J. Food Microbiol. 92:
69-78).
No obstante, no siempre existen evidencias
claras sobre los efectos beneficiosos ejercidos por las cepas
probióticas y por los productos cultivados con ellas y, en muchos
casos, los resultados son contradictorios. En parte esto es debido
a la aplicación de deficientes criterios de evaluación en el proceso
de selección de nuevas cepas probióticas y a la falta de estudios
científicos sobre sus mecanismos de acción.
Concretamente, el origen de las cepas
probióticas, su resistencia a las condiciones de estrés
gastrointestinal y tecnológico y su susceptibilidad a los
antibióticos son criterios de selección claves para el desarrollo de
nuevos probióticos previo a su introducción en el mercado.
Se considera que la función e implantación de
los probióticos puede ser dependiente de la especie y se ha
recomendado el uso de cepas de origen humano (Lee, et al.
1995. The coming age of probiotics. Trends Food Sci. Technol. 6:
241-245); pese a ello, actualmente el número de
cepas de bifidobacterias de origen humano existente en el mercado
es escaso.
Entre los factores que condicionan la
supervivencia de las cepas probióticas durante el tránsito
gastrointestinal, el pH ácido del estómago y la elevada
concentración de sales biliares en el intestino son las barreras
fisiológicas más importantes. Durante la digestión, el tiempo medio
de permanencia de los alimentos en el estómago es de 90 minutos a
un pH próximo a 2,0 (Hill. 1990. Factors controlling the microflora
of the health upper gastrointestinal tract. In Hill M.J. y Marsh,
P.D. (eds), Human Microbial Ecology pp. 57-85. CRC
Press, Boca Ratón, Florida; Berrada, et al. 1991.
Bifidobacterium from fermented milk: survival during acid
transit. J. Dairy Sci. 74:409-414). La
concentración de bilis en el intestino oscila entre 1,5 y 2,0% en
la primera hora de la digestión, disminuyendo posteriormente hasta
el 0,3% (Sjovall, 1959. On the concentration of bile acids in the
human intestine during absorption of bile acids and steroids 74.
Acta Physiol. Scand. 46: 339-345). Por ello, las
tolerancias al pH ácido y a altas concentraciones de sales biliares
son dos de las propiedades deseables en un microorganismo
probiótico. Además, para su incorporación a alimentos y utilización
como suplementos, es aconsejable que estas cepas resistan otras
condiciones de estrés a las que son sometidas durante los procesos
industriales (congelación, secado, liofilización, salado,
temperaturas de fermentación y de refrigeración, etc.). Hasta ahora
el proceso de selección de las cepas probióticas no siempre ha
asegurado su resistencia a los tratamientos tecnológicos y a su
paso por el tracto gastrointestinal por lo que su viabilidad y
estabilidad en los productos comercializados a menudo no cumple los
criterios deseables para garantizar su efectividad (Fasoli, et
al. 2003. Bacterial composition of commercial probiotic
products as evaluated by PCR-DGGE analysis. Int. J.
Food Microbiol. 82: 59-70; Temmerman, et al.
2003. Identification and antibiotic susceptibility of bacterial
isolates from probiotic products. Int. J. Food Microbiol. 81:
1-10; Temmerman, et al. 2003.
Culture-independent analysis of probiotic products
by denaturing gradient gel electrophoresis. Appl. Environ.
Microbiol. 69: 220-226).
Microbiol. 69: 220-226).
El conocimiento de la susceptibilidad de las
cepas probióticas a los antibióticos es también esencial, tanto
para asegurar la ausencia de elementos de resistencia
transferibles, como para establecer la compatibilidad de los
probióticos con antibióticos para su uso en terapias combinadas y en
diarreas debidas a tratamientos con antibióticos.
Por otro lado, los mecanismos de acción de los
probióticos frente a patógenos gastrointestinales se desconocen, en
gran medida, lo que dificulta la definición de la especificidad de
su acción frente a patologías concretas. Entre los posibles
mecanismos, se pueden citar: la competición por nutrientes y sitios
de adhesión, la degradación de toxinas, la estimulación del sistema
inmune y la síntesis de compuestos antimicrobianos (Fooks, et
al. 1999. Prebiotics, probiotics and human gut microecology.
Int. Dairy J. 19: 53-61).
Los compuestos antimicrobianos producidos por
las bacterias lácticas se dividen en dos grandes grupos: (i) los
compuestos de bajo peso molecular (menores de 1000 Da) que incluyen
los ácidos orgánicos y que poseen un amplio espectro de acción y
(ii) los proteínas antimicrobianas o bacteriocinas (mayores de 1000
Da) cuyo espectro de acción se restringe a microorganismos
próximamente relacionados y otras bacterias
Gram-positivas. En los últimos años, en
Lactobacillus spp. también se ha detectado la producción de
otros compuestos de naturaleza proteica, denominados
"bacteriocin-like compounds", que no encajan
con los criterios que definen las bacteriocinas y que tienen un
espectro de acción más amplio (Bruno, et al. 2002. Inhibition
of pathogenic and putrefactive microorganisms by
Bifidobacterium sp. Milchwissenschaft 57:
617-621).
La capacidad de las bacterias lácticas para
competir e inhibir el desarrollo de otros microorganismos se debe
fundamentalmente a la producción de ácidos orgánicos,
principalmente láctico y acético; aunque, en las últimas décadas,
se ha demostrado que la producción de bacteriocinas también
desempeña una función importante (Niku-Paavola,
et al. 1999. New types of antimicrobial compounds produced
by Lactobacillus plantarum. J. Appl. Microbiol. 86:
29-35). Esto ha permitido el uso de cepas de
bacterias lácticas como cultivos protectores y sus metabolitos como
conservantes en un gran número de fermentaciones alimentarias. La
producción de bacteriocinas se ha estudiado en cepas de diversos
géneros del grupo de bacterias lácticas y, muy especialmente, en
Lactobacillus, Pediococcus y Enterococcus por su
diversidad en especies y hábitats y sus aplicaciones industriales
(Riley et al. 2002. Bacteriocins: Evolution, Ecology, and
Application. Ann. Rev. Microbiol. 56: 117-137).
Concretamente, las cepas del género Lactobacillus se
consideran las principales productoras de bacteriocinas y, en el
caso de cepas probióticas, se suponen implicadas en la colonización
del tracto intestinal y en el desplazamiento de patógenos
(Majhenic, et al. 2004. DNA analysis of the genes encoding
acidocin LF221A and acidocin LF221B, two bacteriocins produced by
Lactobacillus gasseri LF221. Appl. Microbiol. Biotechnol.
63: 705-714). Por el contrario, los efectos
inhibitorios de las bifidobacterias frente a la flora competitiva se
han atribuído básicamente a la producción de ácidos orgánicos y
sideróforos (Bruno, et al. 2002. Inhibition of pathogenic and
putrefactive microorganisms by Bifidobacterium sp.
Milchwissenschaft 57: 617-62; Asahara, et
al. 2001. Increased resistance of mince to Salmonella enterica
serovar Thyphimurium infection by synbiotic administration of
Bifidobacteria and transgalactosylated oligosaccharides. J. Appl.
Microbiol. 91: 985-996; O'Sullivan, et al.
2001. Isolated bifidobacteria that produce siderophores which
inhibit growth of Lactococcus lactis. US Patent Number
884894; Levchenko, et al. 2001. Strain bifidobacterium breve
79-88 used for preparing
curative-prophylactic
fermented-milk, nonfermented-milk
food-stuffs, biologically active supplements and
bacteria) preparations. Número de patente: RU2176270; Neeser, et
al. 2001. New bifidobacteria preventing diarrhea caused by
pathogenic bacteria. International Patent Number WO 01/11015 Al) y
no existen evidencias claras de su capacidad para sintetizar
compuestos antimicrobianos de naturaleza proteica y de amplio
espectro. Tan sólo se ha demostrado que algunas bifidobacterias
aisladas de heces de niños producen péptidos antimicrobianos
activos frente a Listeria monocytogenes y sólo se ha
purificado una bacteriocina (Bifidocina B) de B. bifidum NCFB
1454, que posee un espectro de inhibición restringido a bacterias
Gram-positivas (Yildirim, et al. 1998.
Characterization and antimicrobial spectrum of Bifidocin B, a
bacteriocin produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454.
J. Food Prot. 61: 47-51; Yildirim, et al.
1999. Purification, amino acid sequence and mode of action of
Bifidocin B produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454. J.
Appl. Microbiol. 86: 45-54. Touré, et al.
2003. Production of antibacterial substances by bifidobacterial
isolates from infant stool active against Listeria
monocytogenes.
J. Appl. Microbiol. 95: 1058-1069).
J. Appl. Microbiol. 95: 1058-1069).
La presente invención aporta un grupo de cepas
del género Bifidobacterium de origen humano y, por
consiguiente, amplía el escaso número de cepas de bifidobacterias
de dicho origen (cuyo uso ha sido recomendado) existente en el
mercado de los probióticos. Estas bacterias son productoras de
metabolitos proteicos con actividad antibacteriana de amplio
espectro (activos frente a Gram-positivas y
Gram-negativas). Otra ventaja de la presente
invención es la resistencia a las condiciones de estrés
grastrointestinal y tecnológico. Otra ventaja añadida es el perfil
de sensibilidad a antibióticos que garantiza su seguridad.
En la presente invención han sido seleccionadas
seis cepas del género Bifidobacterium:
Bifidobacterium BIR-0304,
Bifidobacterium BIR-0307,
Bifidobacterium BIR-0312,
Bifidobacterium BIR-0324,
Bifidobacterium BIR-0326 y
Bifidobacterium BIR-0349.
Las cepas han sido aisladas a partir de heces de
individuos sanos (adultos y niños), y son productoras de compuestos
de naturaleza proteica con características similares a las
bacteriocinas pero con un espectro de acción más amplio que
comprende bacterias, tanto Gram-positivas, como
Gram-negativas. Este espectro de inhibición tan
amplio no es una característica común a todas las bifidobacterias
humanas de origen fecal ya que sólo seis del total de aislados
presentan esta propiedad.
Estas cepas son altamente resistentes al pH
ácido. La selección y aislamiento de las cepas mediante incubación
previa de las muestras fecales en un medio ácido ha permitido la
selección directa de aislados resistentes al pH propio de los jugos
gástricos, que constituye la principal barrera biológica que puede
limitar la supervivencia de los probióticos a su paso por el tracto
gastrointestinal y durante los procesos de fermentación de alimentos
y su período de almacenamiento.
Las cepas del género Bifidobacterium
seleccionadas son también resistentes a altas concentraciones de
sales biliares y cloruro sódico y a altas temperaturas, el método
de aislamiento selectivo utilizado mediante
pre-incubación de las muestras fecales a pH ácido,
permitió la selección directa de cepas resistentes al pH ácido y
pudo favorecer el desarrollo de otras resistencias cruzadas,
obteniéndose cepas tolerantes a las condiciones de estrés
gastrointestinal y tecnológico. Por lo tanto, estas cepas cuentan
con mayores posibilidades de sobrevivir y ser funcionales que las
cepas probióticas actualmente comercializadas.
Las cepas seleccionadas del género
Bifidobacterium presentan un perfil de
resistencia-sensibilidad a antibióticos común a este
género que garantiza su seguridad. La realización de pruebas
sistemáticas de sensibilidad a antibióticos es esencial como
criterio de selección de nuevos probióticos y cultivos protectores
para su uso en alimentación a fin de garantizar la ausencia de
resistencias a antibióticos transmisibles.
La presente invención proporciona además
compuestos antibacterianos derivados del metabolismo de las
bifidobacterias, en forma de extractos. Estos compuestos
antibacterianos derivados del metabolismo de las bifidobacterias
constituyen un objeto adicional de la presente invención y son
reivindicados en la presente invención.
Los metabolitos son secretados al medio de
cultivo durante el crecimiento de las bifidobacterias y los
extractos que los contienen se obtienen a partir de los
sobrenadantes libres de células de estos cultivos mediante
liofilización, centrifugación, precipitación, extracción o
filtración. El espectro de actividad incluye a bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas
responsables de alteraciones en alimentos y potencialmente
patógenas pertenecientes a los géneros (Lactobacillus,
Lactococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Brochothrix, Listeria,
Clostridium, Staphylococcus Escherichia, Salmonella, Aeromonas,
Vibrio, Helicobacter, Campylobacter, Arcobacter, etc.). Los
compuestos responsables de la actividad antibacteriana secretados a
los medios de cultivo por las seis bifidobacterias y presentes en
los extractos neutralizados ensayados son sustancias de naturaleza
proteica y poseen características bioquímicas similares a las de
las bacteriocinas de bacterias lácticas, pero no cumplen los
criterios de su definición ya que poseen un espectro de inhibición
excepcionalmente amplio incluyendo, no sólo a bacterias
Gram-positivas, sino también a un amplio número de
bacterias Gram-negativas.
Los compuestos antibacterianos derivados del
metabolismo de estas bacterias, así como el uso de estos compuestos
como agentes antibacterianos frente a patógenos gastrointestinales
o frente a bacterias patógenas y alterantes de alimentos, están
también reivindicados en la presente invención.
El procedimiento de obtención de los extractos
que contienen los compuestos arriba mencionados también se
reivindica en la presente invención.
Puesto que las cepas seleccionadas del género
Bifidobacterium sintetizaron compuestos con actividad
antibacteriana de amplio espectro, frente a bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas, en
las condiciones a las que están expuestas en el tracto intestinal,
pueden actuar como probióticos con función protectora a este nivel
y ser utilizados con fines médicos. El uso de las cepas de la
presente invención como probióticos es otro objeto de la presente
invención.
Las bifidobacterias seleccionadas crecen y se
mantienen viables en diversos alimentos y bebidas constituyendo,
por tanto, vehículos idóneos para su aporte. Por ejemplo, en las
leches fermentadas y no fermentadas se comprobó su capacidad para
secretar compuestos antimicrobianos al medio de cultivo durante su
crecimiento. Las cepas del género Bifidobacterium
seleccionadas, así como sus metabolitos adicionados en forma de
extractos, actúan como inhibidores del desarrollo de bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas en
alimentos y bebidas. Es decir, actúan como cultivos bioprotectores
en alimentos como la leche. El uso de estas cepas y de sus
extractos como agentes bioprotectores de alimentos constituye otro
objeto de la presente invención.
Puesto que pueden fermentar y coagular la leche,
podrían ser utilizadas para la elaboración de leches fermentadas y
otros derivados lácteos. Este uso también ha sido reivindicado en
la presente invención.
Figura 1.- Representación de la tolerancia de
las cepas del género Bifidobacterium a condiciones de estrés
intestinales y tecnológicas. Se muestra un ejemplo de la capacidad
de crecimiento de una de las cepas seleccionadas
(Bifidobacterium BIR-0312) en presencia de
altas concentraciones de bilis (Ox-gall; Fig. 1A) y
sal (NaCl; Fig. 1B), en caldo MRS-C, a 37ºC. El
crecimiento se monitorizó mediante medidas de absorbancia a 655 nm
en un espectrofotómetro de placas de multipocillo.
Figura 2.- Representación del efecto inhibidor
de las cepas del género Bifidobacterium frente a
Helicobacter pylori mediante la técnica de difusión en agar.
Las flechas señalan los halos de inhibición causados por los
compuestos antibacterianos presentes en los extractos obtenidos a
partir de los cultivos de las bifidobacterias seleccionadas. El
control negativo (C) muestra la ausencia de inhibición del extracto
obtenido a partir del medio de cultivo que no fue fermentado por
las bifidobacterias.
Figura 3.- A. Representación del efecto
inhibidor de las cepas del género Bifidobacterium crecidas
en distintos medios de cultivo sobre Salmonella typhimurium
por la técnica de la doble capa. Los medios utilizados para crecer
las bifidobacterias fueron:
MRSC-OX-P, MRSC con un 0,5% de sales
biliares (Ox-gall) y 0,1 g/l de pancreatina; L,
leche; L-EL-G, leche con un 0,5% de
extracto de levadura y un 1% de glucosa; PCL, Plate Count leche. El
efecto inhibidor se determinó midiendo los halos de inhibición y
está expresado en milímetros (mm)*. B. Representación del efecto
inhibidor de los extractos de las cepas del género
Bifidobacterium crecidas en distintos medios de cultivo sobre
Salmonella typhimurium por la técnica de difusión en agar.
A= MRSC-OX-P, neutralizado; B=
MRSC-OX-P, sin neutralizar; C=MRSC,
sin neutralizar; D=MRSC, neutralizado; E=MRSC sin inocular, control
negativo; F= L-EL-G sin
neutralizar; G= L-EL-G neutralizado;
H= L-EL-G sin inocular, control
negativo.
Un objeto de la presente invención lo constituye
una cepa bacteriana aislada útil como producto probiótico, en
adelante cepa bacteriana aislada de la presente invención,
caracterizada porque es una cepa aislada de heces de humanos sanos
perteneciente al género Bifidobacterium, porque produce
compuestos antibacterianos de naturaleza peptídica con
características similares a las bacteriocinas de amplio espectro de
acción que comprende bacterias Gram-positivas y
Gram-negativas, y porque es resistente a
condiciones de estrés gastrointestinal y tecnológico, pertenecientes
al siguiente grupo: a condiciones del jugo gástrico, altas
concentraciones de sales biliares y cloruro sódico y altas
temperaturas.
Hay que destacar que esta cepa ha sido aislada a
partir de heces de individuos sanos (adultos y niños), y es
productora de compuestos de naturaleza proteica con características
similares a las bacteriocinas pero con un espectro de acción más
amplio que comprende bacterias, tanto
Gram-positivas, como Gram-negativas.
Este espectro de inhibición tan amplio no es una característica
común a todas las bifidobacterias humanas de origen fecal ya que
sólo seis del total de aislados presentan esta propiedad.
Debido a que experiencias previas demostraron
que mediante aislamientos convencionales tan sólo un 40% de las
cepas de bifidobacterias de origen fecal eran resistentes a pH
ácido, se utilizó un procedimiento de aislamiento más selectivo que
permitiera mejorar este porcentaje y aislar directamente sólo las
cepas ácido-resistentes. Tras
pre-incubación de las muestras fecales a pH ácido
durante 16 h, 60 aislados fueron asignados al género
Bifidobacterium. De acuerdo con los resultados del análisis
por RAPDs, 24 del total de aislados fueron cepas distintas. La
identificación a nivel de especie de las cepas de mayor interés por
su amplio espectro de actividad antibacteriana se realizó
utilizando PCRs específicas de especie. La cepas del género
Bifidobacterium BIR-0304,
BIR-0307, BIR-0312 y
BIR-0349 se asignaron a la especie B. longum
infantis; la cepa BIR-0324 a la especie B.
catenulatum y la cepa BIR-0326 a B.
bifidum.
Por tanto, las cepas del género
Bifidobacterium seleccionadas son altamente resistentes al
pH ácido. El procedimiento de selección de las cepas, mediante
incubación previa de las muestras fecales en un medio ácido, permite
la selección directa de aislados resistentes al pH propio de los
jugos gástricos, que constituye la principal barrera biológica que
puede limitar la supervivencia de los probióticos a su paso por el
tracto gastrointestinal y durante los procesos de fermentación de
alimentos y su período de almacenamiento (Ejemplo 1). Todas las
cepas fueron resistentes a las condiciones propias de los jugos
gástricos manteniendo su viabilidad en torno a
10^{6}-10^{8} UFC/ml tras incubación
prolongada.
Además, las cepas del género
Bifidobacterium seleccionadas son resistentes a altas
concentraciones de sales biliares y cloruro sódico. Todas las cepas
estudiadas mostraron capacidad para crecer a concentraciones de
bilis de entre 0,5 y 3% (Figura 1A) y de NaCl de entre 2 y 8%
(Figura 1B). Además, estas cepas presentan muy buena capacidad de
crecimiento a temperaturas superiores a la óptima (hasta 60ºC)
incluyendo las habitualmente utilizadas en los procesos de
elaboración de leches fermentadas (Por ejemplo
42-45ºC). Por tanto, el método de aislamiento
selectivo utilizado mediante pre-incubación de las
muestras fecales a pH ácido, permitió la selección directa de cepas
resistentes al pH ácido y pudo favorecer el desarrollo de otras
resistencias cruzadas, obteniéndose cepas tolerantes a las
condiciones de estrés gastrointestinal y tecnológico (altas
concentraciones de cloruro sódico, altas temperaturas incluidas en
los procesos tecnológicos de elaboración de diversos alimentos como
los productos lácteos y procesos de liofilización). Globalmente, la
invención proporciona cepas resistentes y estables en las
condiciones propias del tracto gastrointestinal y de los procesos
tecnológicos con mayores posibilidades de sobrevivir y ser
funcionales que las cepas probióticas actualmente comercializadas
(Ejemplo 1).
Así, un objeto particular de la presente
invención lo constituye una cepa del género Bifidobacterium
perteneciente al siguiente grupo: Bifidobacterium
BIR-0304 (CECT 7039), Bifidobacterium
BIR-0307 (CECT 7040), Bifidobacterium
BIR-0312 (CECT 7041), Bifidobacterium
BIR-0324 (CECT 7042), Bifidobacterium
BIR-0326 (CECT 7043) y Bifidobacterium
BIR-0349 (CECT 7044).
La determinación de la sensibilidad a
antibióticos es un criterio esencial para la selección de nuevos
probióticos y, en general, de cepas bacterianas que vayan a ser
utilizadas para alimentación (humana y animal) a fin de garantizar
su uso seguro y, en el caso de probióticos, su compatibilidad con la
administración de antibióticos en terapias combinadas y en el
tratamiento de trastornos originados por el consumo de éstos. Las
cepas seleccionadas del género Bifidobacterium presentan un
perfil de resistencia-sensibilidad a antibióticos
común a este género que garantiza su seguridad. Las cepas
estudiadas fueron resistentes al metronidazol, gentamicina, ácido
nalidíxico, trimethoprim, kanamicina, vancomicina y polimixina. Las
resistencias intrínsecas a ciertos antibióticos que presentan las
cepas de la presente invención, como el metronidazol y la
vancomicina, son útiles para terapias combinadas que incluyan estos
probióticos y antibióticos, por ejemplo en el tratamiento de las
infecciones por Helícobacter pylori y Clostridium
difficile. Sólo la cepa Bifidobacterium
BIR-0349 fue sensible a la gentamicina y la cepa
Bifidobacterium BIR-0324 al trimethoprim. Sin
embargo, todas fueron sensibles a la rifampicina, amoxicilina,
penicilina G, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina y
claritromicina. (Ejemplo 1).
Otro objeto de la presente invención lo
constituyen compuestos antibacterianos, en forma de extracto,
derivados del metabolismo de las bifidobacterias de la presente
invención. Los metabolitos son secretados al medio de cultivo
durante el crecimiento de las mencionadas bifidobacterias y los
extractos que los contienen se obtienen a partir de los
sobrenadantes libres de células de estos cultivos por ejemplo
mediante liofilización. El procedimiento de obtención de los
extractos también se reivindica en la presente invención. Este
procedimiento de obtención es el siguiente: (i) inoculación de un
medio de cultivo al 1% (entre el 0.01 y el 50%) con cada
bifidobacteria e incubación del mismo, (ii) recuperación del
sobrenadante del cultivo por centrifugación al final de la fase
exponencial del crecimiento (o bien durante la fase exponencial o
estacionaria de crecimiento) (iii) concentración del sobrenadante
por liofilización (o bien por precipitación con sulfato amónico o
solventes orgánicos y posterior diálisis o evaporación, por
extracción con solventes orgánicos o por filtración) y (iv)
suspensión del liófilo en un volumen de tampón que represente el
10% (entre el 90 y el 0.5%) del volumen inicial del medio de cultivo
y neutralización o no del extracto obtenido y esterilización por
filtración. La actividad antimicrobiana se detecta en los
extractos, neutralizados (en los que se elimina el efecto de los
ácidos orgánicos) y sin neutralizar (en los que el efecto de los
ácidos orgánicos se suma al de compuestos de otra naturaleza; ver
Ejemplo 2 y 3). El espectro de actividad incluye a bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas
responsables de alteraciones en alimentos y potencialmente patógenas
pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Lactococcus,
Leuconostoc, Carnobacterium, Brochothrix, Listeria, Clostridium,
Staphylococcus, Escherichia, Salmonella, Aeromonas, Vibrio,
Helicobacter, Campylobacter, Arcobacter, etc.
La actividad antimicrobiana de estos compuestos
fue determinada por la técnica de la doble capa y la de difusión en
agar frente a dos microorganismos indicadores
Gram-positivos, L. innocua y L.
lactis, esto permitió la selección de ocho cepas del género
Bifidobacterium de entre las 24 aisladas de heces.
Posteriormente, el estudio se orientó hacia la detección de la
actividad antibacteriana debida exclusivamente a la secreción de
compuestos de naturaleza proteica, por lo que se utilizó sólo la
técnica de difusión en agar y extractos neutralizados, y se amplió
el número de microorganismos indicadores, incluyendo bacterias
tanto Gram-positivas como
Gram-negativas. Se seleccionaron, finalmente, las
seis cepas que mostraron el espectro de inhibición más amplio (ver
Tabla I). Entre ellas, la cepa Bifidobacterium
BIR-0312 fue la que inhibió un número mayor de
microoganismos indicadores. Los perfiles de inhibición de las cepas
Bifidobacterium BIR-0304,
BIR-0307, BIR-0312,
BIR-0324 y BIR-0326 fueron similares
mientras que la cepa BIR-0349 mostró un espectro
más restringido. La mayoría de las bacterias potencialmente
patógenas Gram-positivas (Clostridium difficile,
L. monocytogenes y Staphylococcus aureus) y
Gram-negativas (Salmonella typhimurium,
Helicobacter pylori, Campylobacter coli y Arcobacter
butzleri) fueron inhibidas por, al menos, cuatro de las
bifidobacterias seleccionadas.
Los compuestos responsables de la actividad
antibacteriana secretados a los medios de cultivo por las seis
bifidobacterias y presentes en los extractos neutralizados
ensayados son sustancias de naturaleza proteica cuya producción o
liberación al medio es máxima al final de la fase de crecimiento
exponencial y fase estacionaria, cuando se utiliza como medio de
cultivo caldo MRS, conteniendo cisteína y agentes como el Tween
(0,1-10,0%). La naturaleza proteica se confirma por
la destrucción de su actividad tras su tratamiento con todas las
proteinasas ensayadas. Tan sólo la incubación con proteinasa K
incrementó el efecto inhibidor sobre Helicobacter pylori,
debido a que la propia proteinasa actuaba como inhibidor del
crecimiento de este iv microorganismo y, dependiendo de la
concentración, de forma sinérgica junto a otros compuestos de los
extractos de las bifidobacterias.
Los compuestos responsables de la inhibición son
termoestables manteniendo su actividad tras su incubación a 80ºC
durante al menos 3 min y a 100ºC durante al menos 1 min. También
son estables y activos en un amplio intervalo de pH
(2-11) (Ejemplo 2). Por tanto, su actividad es
compatible con las condiciones propias del tracto gastrointestinal
y con las de un amplio número de procesos tecnológicos
(fermentación y maduración de productos lácteos, cárnicos,
etc.).
La masa molecular aparente de los compuestos
antibacterianos es menor de 100 kDa, determinada por
ultrafiltración (Ejemplo 2).
Por tanto, los compuestos responsables de la
actividad antibacteriana poseen características bioquímicas
similares a las de las bacteriocinas de bacterias lácticas, pero no
cumplen los criterios de su definición ya que poseen un espectro de
inhibición excepcionalmente amplio incluyendo, no sólo a bacterias
Gram-positivas, sino también a un amplio número de
bacterias Gram-negativas. Así, la actividad
antimicrobiana de los extractos frente a bacterias
Gram-positivas (por ejemplo Listeria innocua)
y Gram-negativas (por ejemplo Salmonella
typhimurium y Helicobacter pylori) se destruye tras su
tratamiento con diversas proteasas (tripsina, proteasa A, pepsina y
catepsina B), pero no con amilasas y lipasas (Ejemplo 2). El hecho
de que el espectro de inhibición se amplíe a patógenos
Gram-negativos es una característica inusual en las
bacteriocinas convencionales de bacterias
Gram-positivas y confiere a la cepa aislada de la
presente invención y a sus metabolitos grandes ventajas como
probióticos y bioprotectores frente a microorganismos que no estén
próximamente relacionados.
Los compuestos antibacterianos de naturaleza
proteica producidos por las cepas seleccionadas del género
Bifidobacterium son capaces de inhibir cepas de
Helicobacter pylori (multi)-resistentes a
antibióticos habitualmente utilizados para su tratamiento (por
ejemplo metronidazol y claritromicina), pudiendo constituir una
terapia alternativa a dicho tratamiento farmacéutico.
Las cepas seleccionadas del género
Bifidobacterium de la presente invención sintetizaron
compuestos con actividad antibacteriana de amplio espectro, frente a
bacterias Gram-positivas y
Gram-negativas, en las condiciones a las que están
expuestas en el tracto intestinal, presencia de sales biliares y
pancreatina, por lo que pueden actuar como probióticos con función
protectora a este nivel y ser utilizados con fines médicos. Dicha
actividad antibacteriana fue debida a compuestos secretados al medio
de cultivo y, en gran parte, a compuestos de naturaleza proteica ya
que los halos de inhibición debidos al efecto de los extractos
neutralizados fueron sólo ligeramente inferiores (entre 1 y 3 mm) a
los de los extractos sin neutralizar (ver Figura
3-B, pocillos A y B) (Ejemplo 3).
Se determinó el posible uso de leche y medios
basados en leche como sustrato para el crecimiento de las
bifidobacterias y vehículos para su aporte en forma de células
viables. En leche, todas las bifidobacterias seleccionadas e
inoculadas al 1% fueron capaces de crecer, alcanzando niveles de
10^{6}-10^{9} UFC/ml, tras períodos de
incubación de entre 24 y 48 h. El pH de la leche se redujo de
valores iniciales de 6,4 a valores entre 4,0 y 5,2 y se observó
cierto grado de coagulación, especialmente importante en las
muestras inoculadas con la cepa Bifidobacterium
BIR-0324 y su aroma fue el típico del yogur. En
L-EL-G, todas las bifidobacterias
seleccionadas fueron capaces de crecer, y el aumento en el número
de viables fue ligeramente superior (entre 1 y 0,5 unidades
logarítmicas) al obtenido en L. El grado de acidificación alcanzado
también fue mayor, obteniéndose valores finales de pH entre 3,0 y
4,6. Se observó también un mayor grado de coagulación y, este fue
especialmente importante, en las muestras inoculadas con las cepas
Bifidobacterium BIR-0312,
BIR-0324 y BIR-0326 y su aroma fue
el típico de leches fermentadas azucaradas.
Las bifidobacterias seleccionadas fueron capaces
de sintetizar compuestos con actividad antibacteriana frente a
microorganismos Gram-positivos y
Gram-negativos en leche y medios basados en leche,
como se demuestra por la técnica de la doble capa. Se obtuvieron
halos de inhibición de 3 a 12 mm, excepto en el caso de la cepa
Bifidobacterium BIR-0349 (ver Figura
3-A). La capacidad para secretar compuestos
antimicrobianos al medio de cultivo durante su crecimiento en estos
medios se verificó mediante el análisis de la actividad de sus
extractos. Concretamente, en la Figura 3-B se
observa el efecto inhibidor de los extractos neutralizados y sin
neutralizar de la cepa Bifidobacterium
BIR-0324 crecida en
L-EL-G frente a S.
typhimurium, detectándose halos muy similares, sólo 3 mm mayor
en el extracto no neutralizado. Estos resultados confirman, por
tanto, que dicha actividad es debida a compuestos de naturaleza
proteica y que son secretados in situ durante su crecimiento
en medios basados en leche.
Por lo tanto, las cepas del género
Bifidobacterium de la presente invención seleccionadas
crecen y se mantienen viables en diversos alimentos constituyendo
vehículos idóneos para su aporte. Las leches fermentadas y no
fermentadas, constituyen ejemplos de alimentos que sirven de soporte
para el mantenimiento de su viabilidad (Ejemplo 4); además, se
encuentran entre los productos más adecuados para la administración
de cepas probióticas, debido a que la leche y sus derivados son
integrantes habituales de la dieta en países desarrollados, tienen
alto valor nutritivo, son fáciles de digerir y gozan de gran
aceptación en los diversos grupos de población.
Las cepas del género Bifidobacterium
seleccionadas pueden fermentar la leche y coagular sus proteínas;
por tanto, pueden ser utilizadas para la elaboración de leches
fermentadas, leches bífidus y otros derivados lácteos como por
ejemplo, el yogur (Ejemplo 4).
Las cepas del género Bifidobacterium de
la presente invención seleccionadas, así como sus metabolitos
adicionados en forma de extractos, actúan como inhibidores del
desarrollo de bacterias Gram-positivas y
Gram-negativas en alimentos y bebidas. Las
bifidobacterias seleccionadas actuaron como cultivos bioprotectores
en leche, reduciendo la viabilidad de Salmonella en, al
menos, dos unidades logarítmicas y de Listeria en, al menos,
seis (ver Tabla II). Los efectos protectores consecuencia directa
de los metabolitos secretados por las bifidobacterias, se
confirmaron por adición exclusiva a la leche contaminada de sus
extractos. La adición de extractos no neutralizados, en los que se
sumarían los efectos de los ácidos orgánicos y los de compuestos de
naturaleza proteica, produjeron una reducción de los niveles de
Listeria a valores inferiores a 100 UFC/ml y la adición de
extractos neutralizados, con los que se evaluaría inicialmente el
efecto de compuestos de naturaleza proteica, provocó reducciones de
la bacteria contaminante de, al menos, dos unidades logarítmicas.
Por tanto, los compuestos de naturaleza proteica en forma de
extractos así como los cultivos de las cepas del género
Bifidobacterium que los producen pueden actuar, en alimentos
como la leche, como bioprotectores o conservantes naturales
inhibiendo el desarrollo de microorganismos contaminantes (Ejemplo
5).
Por lo tanto, otro objeto de la presente
invención lo constituye el uso de la cepa bacteriana aislada en la
presente invención en la elaboración de un alimento o bebida
probiótica, y que de una forma concreta cumpla funciones
profilácticas o terapéuticas frente a patógenos
gastro-intestinales. De forma preferente dicho uso
de la cepa bacteriana en la elaboración de un alimento probiótico
consiste en la elaboración de una leche fermentada, una leche
bífidus y otros derivados lácteos.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso de la cepa bacteriana aislada en la presente
invención como fermento o cultivo iniciador y cultivo bioprotector
de alimentos o bebidas frente a bacterias de alteración y de
interés sanitario y de forma preferente en alimentos como leches
fermentadas una leche bífidus y otros derivados lácteos.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso de la cepa bacteriana aislada en la presente
invención como cultivo bioprotector de alimentos o bebidas frente a
bacterias alterantes de alimentos y de interés sanitario.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso de los extractos proteicos de la presente
invención como compuestos terapéuticos frente a patógenos
gastrointestinales u otro tipo de bacteria patógena, preferentemente
el patógeno gastrointestinal es una cepa de la especie
Helicobacter pylori multi-resistente.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso de los extractos proteicos de la presente
invención como conservantes biológicos frente a bacterias
alterantes y de interés sanitario en alimentos o bebidas y de forma
preferente en una leche fermentada, una leche bífidus y otros
derivados lácteos.
Un cultivo de Bifidobacterium
BIR-0304 ha sido depositado en la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjasot (Valencia),
el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de
depósito CECT 7039.
Otro cultivo de Bifidobacterium
BIR-0307 ha sido depositado en la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjasot (Valencia),
el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de
depósito CECT 7040.
Otro cultivo de Bifidobacterium
BIR-0312 ha sido depositado en la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjasot (Valencia),
el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de
depósito CECT 7041.
Otro cultivo de Bifidobacterium
BIR-0324 ha sido depositado en la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjasot (Valencia),
el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de
depósito CECT 7042.
Otro cultivo de Bifidobacterium
BIR-0326 ha sido depositado en la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjasot (Valencia),
el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de
depósito CECT 7043.
Por último, otro cultivo de
Bifidobacterium BIR-0349 ha sido depositado
en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en
Burjasot (Valencia), el día 21 de Diciembre de 2004,
correspondiéndole el número de depósito CECT 7044.
Se procedió al aislamiento de cepas del género
Bifidobacterium a partir de heces de individuos sanos
(adultos de entre 25-35 años de edad y niños de
entre 6 y 12 meses) que no hubieran ingerido alimentos que
contuvieran bifidobacterias durante al menos el mes anterior al
análisis y que no hubieran sido sometidos a tratamientos con
antibióticos durante los últimos seis meses. Las muestras se
mantuvieron a 4ºC y se analizaron sin que transcurrieran más de dos
horas desde su recogida. Dos gramos de cada una de ellas se
diluyeron en tampón fosfato 10 mM conteniendo una concentración de
NaCl 130 mM (PBS) y se homogeneizaron en un stomacher
Lab-Blender 400 (Seward Medical, Londres, UK),
durante 3 min. A fin de aislar directamente sólo cepas resistentes
a las condiciones ácidas de los jugos gástricos, de cada uno de los
homogeneizados se tomaron muestras de 1 ml y se inocularon en caldo
MRS (de Man Rogosa and Sharpe; Scharlau, Barcelona) conteniendo un
0.05% de cisteína (Sigma, St. Louis, MO; MRS-C),
ajustado a pH 2 con HCl. Estas muestras se incubaron a 37ºC durante
16 h en condiciones de anaerobiosis (AnaeroGen, Oxoid, UK).
Posteriormente, se hicieron diluciones decimales y alícuotas de 100
\mul se sembraron en placas de agar de dos medios selectivos para
el aislamiento de bifidobacterias: BSM (Fluka, Buchs, Suiza) y BFM
(Nebra y Balnch, 1999). Después de tres días de incubación, se
seleccionaron entre 8 y 10 colonias características de las
diluciones más altas de cada medio y se analizó su morfología bajo
tinción de Gram.
La identidad de los aislados se confirmo
mediante PCR específica de género, de acuerdo con la metodología
descrita por Kaufman et al. (1997. Identification and
quantification of Bifidobacterium species isolated from food
with genus-specific 16S
rRNA-targeted probes by colony hybridization and
PCR. Appl. Environ. Microbiol. 63: 1268-1273). Se
utilizaron cebadores (LM26 y LM3) que amplifican un fragmento de
1.35 kb del gen del ARN ribosómico 16S. La diferenciación de los
aislados a nivel de cepa se realizó por la técnica de RAPD
(Randomly amplified polymorphic DNA)-PCR, utilizando
el cebador Bif y la metodología descrita por Tynkynen et al.
(1999. Comparison of ribotyping, randomly amplified polymorphic DNA
analysis, and pulsed-field gel electrophoresis in
typing of Lactobacillus rhamnosus and L. casei
strains. Appl. Environ. Microbiol. 65: 3908-3914).
De los 60 aislados, 24 fueron cepas distintas. La identificación a
nivel de especie de las cepas de mayor interés por su amplio
espectro de actividad antibacteriana (ver ejemplo 2) se realizó
mediante el uso de PCRs múltiples y simples utilizando cebadores
específicos de especie basados en secuencias del gen del ARN
ribosómico 16S (Matsuki et al. 2003. Genus- and
species-specific PCR primers for the detection and
identification of Bifidobacteria Curr. Issues Intest. Microbiol. 4:
61-69).
La cepas del género Bifidobacterium
BIR-0304, BIR-0307,
BIR-0312 y BIR-0349 se asignaron a
la especie B. longum infantis; la cepa
BIR-0324 a la especie B. catenulatum y la
cepa BIR-0326 a B. bifidum.
La resistencia de las bifidobacterias aisladas a
las condiciones ácidas de los jugos gástricos, que constituyen la
primera barrera biológica que limita la viabilidad de los
probióticos tras su ingestión, se confirmó para cada una de las
cepas recuperadas. Para ello, se prepararon suspensiones de células
(10^{8} células/ml) de cada cepa en PBS, conteniendo 3 g/l de
pepsina (Sigma, St. Louis, MO) y ajustada a pH 2 con HCl y se
incubaron a 37ºC durante un total de 120 min. A distintos tiempos
(0, 90 y 120 min), incluyendo el tiempo medio de vaciado gástrico
(90 min), se tomaron alícuotas para determinar la viabilidad
mediante recuentos en placas de agar MRS-C.
Posteriormente, se estudió la tolerancia de las cepas resistentes
al pH ácido a otras condiciones de estrés, como la bilis, el NaCl y
las altas temperaturas. Para conocer la tolerancia de las cepas
objeto de estudio a la bilis, se evaluó su capacidad para crecer en
MRS-C, al que se adicionaron diversas
concentraciones (0,5-3%) de Ox-gall
(Sigma, St. Louis, MO). Alícuotas de 200 \mul de cada medio,
inoculadas al 1% con cultivos de 24 h, se cargaron en placas
multipocillo y se incubaron a 37ºC. El crecimiento se monitorizó
mediante medidas de absorbancia a 655 nm en un espectrofotómetro
550 Microplate Reader (Bio-Rad, Hércules, CA). Del
mismo modo, se determinó la tolerancia de las cepas a altas
concentraciones de NaCl (0-8%) y a altas
temperaturas (42-60ºC).
La sensibilidad de las cepas objeto de estudio
se determinó mediante el uso de discos de antibióticos (Oxoid,
Basingstoke, UK) y el método de difusión en agar y, en el caso del
metronidazol y la claritromicina mediante el uso de
E-test (AB Biodisk, Solna, Suecia). 100 \mul de un
cultivo de 24 h se inocularon en 9 ml de MRS-C
conteniendo un 0.7% de agar fundido y se vertió sobre una capa de
agar sólido. Una vez solidificada la capa superior, se colocaron los
discos o tiras de antibiótico en su superficie y, tras incubar a
37ºC durante 24 h, se midieron los halos de inhibición.
La actividad antibacteriana de las cepas del
género Bifidobacterium aisladas selectivamente por el
procedimiento descrito en el Ejemplo 1, se determinó mediante dos
métodos: (i) por la técnica de la doble capa y (ii) por la técnica
de difusión en agar.
La actividad antibacteriana de cada cepa se
evaluó globalmente mediante la técnica de la doble capa utilizando
como microorganismos indicadores dos bacterias
Gram-positivas (Listeria innocua y
Lactococcus lactis). Las bifidobacterias potencialmente
activas se sembraron en placas de MRS-C en líneas de
unos 2 cm y se incubaron en condiciones óptimas durante 16 h y su
desarrollo posterior se inhibió con cloroformo. El microorganismo
indicador se inoculó a una concentración de
10^{4}-10^{5} CFU/ml en 10 ml de agar
semisólido adecuado, se vertió sobre la capa de agar del
microorganismo protector y se incubó en condiciones óptimas para el
primero. Listeria innocua se cultivó en Brain Herat (BH) y
L. lactis en M17 y ambos se incubaron en aerobiosis a 30ºC.
Tras 24 h se midieron los posibles halos de inhibición alrededor de
las líneas del cultivo protector.
A fin de evaluar la actividad antibacteriana
debida a la secreción de compuestos de naturaleza proteica se
utilizó la técnica de difusión en agar. 10 ml de caldo
MRS-C se inocularon al 1% con un cultivo de 24 h de
cada bifidobacteria y se incubaron durante 16 h a 37ºC. Los
sobrenadantes se obtuvieron por centrifugación (12.000 g, 15 min,
4ºC) y se concentraron por liofilización. Los liófilos se
resuspendieron en 1 ml de tampón fosfato 50 mM a pH 6.5, se
neutralizaron con NaOH hasta alcanzar un pH de 6,5 para eliminar
los efectos de los ácido orgánicos generados por fermentación, y se
esterilizaron por filtración. Estas muestras constituyeron los
extractos crudos en los que se determinó la posible actividad de
proteínas antibacterianas producidas por las bifidobacterias. El
microorganismo indicador se inoculó a una concentración de
10^{4}-10^{5} células/ml en 10 ml de agar
semisólido adecuado y se vertió sobre una capa sólida de agar del
mismo medio. Tras solidificar, se perforaron pocillos de 5 mm, a
los que se añadieron 40 \mul del extracto libre de células y
neutralizado de cada bifidobacteria. Se dejó difundir 1 h a 4ºC y,
posteriormente, se incubó en las condiciones óptimas para cada
microorganismo indicador. Como microorganismos indicadores,
inicialmente, se utilizaron dos bacterias
Gram-positivas (Listeria innocua y
Lactococcus lactis) y, posteriormente, se amplio el espectro
incluyendo un amplio número de bacterias alterantes y patógenos
Gram-positivos y Gram-negativos.
Entre estos se estudiaron los siguientes indicadores: (i) cepas
alterantes de los géneros Lactobacillus y Leuconostoc
que se cultivaron en MRS, y del género Carnobacterium que se
cultivaron en agar APT y se incubaron a 30ºC y en microaerofilia;
(ii) cepas alterantes del género Brochothrix que se
cultivaron en agar STAA y se incubaron a 30ºC y en aerobiosis;
(iii) cepas del género Enterococcus que se cultivaron en BH
y se incubaron a 37ºC, en aerobiosis; (iv) cepas del género
Clostridium que se cultivaron en RCM a 37ºC, en
anaerobiosis; (v) cepas del género Listeria y
Enterobacter que se cultivaron en BH e incubaron a 30ºC, en
aerobiosis; (vi) cepas de los géneros Staphylococcus,
Escherichia, Salmonella y Vibrio, que se cultivaron en BH y se
incubaron a 37ºC, en aerobiosis; (vii) cepas del género
Aeromonas que se cultivaron en BH y se incubaron a 20ºC, en
aerobiosis; (viii) cepas de los géneros Helicobacter y
Campylobacter, que se cultivaron en agar sangre de caballo
(ASC) y de oveja (ASO), respectivamente, y se incubaron a 37ºC en
microaerofilia; y (ix) cepas del género Arcobacter que se
cultivaron en agar ASO y se incubaron a 30ºC, en aerobiosis.
También se incluyó como indicador una cepa del mismo género y de la
especie B. bifidum, que se cultivó en agar TPY y se incubó a
37ºC, en anaerobiosis. Todos los medios de cultivo fueron de Oxoid
(Basingstoke, UK) excepto el agar MRS y STAA que fue de Scharlau
(Barcelona,
España).
España).
Posteriormente, el estudio se orientó hacia la
detección de la actividad antibacteriana debida exclusivamente a la
secreción de compuestos de naturaleza proteica, por lo que se
utilizó sólo la técnica de difusión en agar y extractos
neutralizados, y se amplió el número de microorganismos
indicadores, incluyendo bacterias tanto
Gram-positivas como Gram-negativas.
Se seleccionaron, finalmente, las seis cepas que mostraron el
espectro de inhibición más amplio (ver Tabla I). Entre ellas, la
cepa Bifidobacterium BIR-0312 fue la que
inhibió un número mayor de microoganismos indicadores. Los perfiles
de inhibición de las cepas Bifidobacterium
BIR-0304, BIR-0307,
BIR-0312, BIR-0324 y
BIR-0326 fueron similares mientras que la cepa
BIR-0349 mostró un espectro más restringido. La
mayoría de las bacterias potencialmente patógenas
Gram-positivas (Clostridium difficile, L.
monocytogenes y Staphylococcus aureus) y
Gram-negativas (Salmonella typhimurium,
Helicobacter pylori, Campylobacter coli y Arcobacter butzleri)
fueron inhibidas por, al menos, cuatro de las bifidobacterias
seleccionadas.
| Bacteria | Espectro de inhibición (mm)* de las cepas Bifidobacterium | |||||
| Indicadora | BIR-0304 | BIR-0307 | BIR-0312 | BIR-0324 | BIR-0326 | BIR-0349 |
| Lactobacillus fermentum | 9,2 | - | 9,1 | - | 11,1 | 14,4 |
| Lactococcus lactis | 10,1 | 9,2 | 14,3 | 10,1 | 10,5 | 19,2 |
| Leuconostoc spp. | - | - | - | - | - | 10.3 |
| Enterococcus faecium | - | - | - | - | - | - |
| Carnobacterium piscicola | 10,1 | - | 9,0 | 9,2 | - | - |
| Bifidobacterium bifidum | - | - | 9,0 | - | - | - |
| Brochothrix thermosphacta | 16,3 | 15,1 | 14,3 | 12,1 | - | - |
| Listeria innocua | 17,1 | 18,2 | 16,6 | 15,5 | 10,3 | 10,1 |
| Listeria monocytogenes | 15,3 | - | 11,2 | 10,3 | 11,2 | - |
| Clostridium difficile | 9,3 | 13,3 | 12,3 | 9,2 | 10,0 | - |
| Staphylococcus aureus | 10,2 | 9,1 | 15,2 | - | 19,4 | - |
| Escherichia coli | 13,5 | 18,0 | 14,0 | 15,2 | 15,3 | 10,4 |
| E. col/ O157:H7 | - | - | - | - | - | 10,2 |
| Salmonella | 14,0 | 15,2 | 12,0 | 14,2 | 9,0 | - |
| Enterobacter | - | - | - | - | - | 9,2 |
| Aeromonas | - | - | 9,0 | - | 9,0 | 10,0 |
| Vibrio | - | - | - | - | 9,3 | 9,0 |
| Helicobacter pylori | 10,0 | 9,1 | 9,3 | 12,3 | 9,0 | - |
| Campylobacter coli | 9,1 | 9,2 | 13,2 | 10,1 | 15,3 | - |
| Arcobacter butzleri | 13,3 | 9,0 | 10,2 | 11,5 | 12,4 | - |
| *, \begin{minipage}[t]{155mm} El efecto inhibidor de los extractos, libres de células y neutralizados, obtenidos a partir de los cultivos de las bifidobacterias seleccionadas frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas se determinó mediante medidas de los halos de inhibición y está expresado en milímetros (mm)*. El signo (-) indica ausencia de inhibición. \end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
La caracterización de los compuestos
responsables de la actividad antibacteriana de los extractos
neutralizados, obtenidos por el procedimiento descrito en el
apartado anterior, se realizó mediante los siguientes ensayos:
- (i)
- Sensibilidad a diversos enzimas proteolíticos (tripsina, proteinasa K, proteasa A, pepsina y catepsina B) lipolíticos (lipasa A) y amilolíticos (\alpha-amilasa) suministrados por Sigma (St. Louis, MO). Los extractos se incubaron en presencia de 2 mg/ml de cada enzima y fueron incubados en condiciones óptimas de actuación para cada una de ellas, durante 2 h. Tras cada tratamiento se determinó la actividad residual utilizando como control los extractos no incubados con ningún enzima.
- (ii)
- Estabilidad a la temperatura y pH. Los extractos se incubaron a distintas temperaturas (80 y 100ºC) durante 10-30 min y a distintos pH (3-10), durante 1 h. Tras cada tratamiento se determinó la actividad residual utilizando controles no tratados.
- (iii)
- Masa molecular aparente. Se determinó mediante el uso de sistemas de filtración-centrifugación (Millipore, Bedford, Mass) con membranas de límites de exclusión entre 3 y 100 kDa. Los extractos se fraccionaron de forma progresiva con filtros de distinto límite de exclusión y se determinó en que fracciones (retenido y filtrado) se concentraba la actividad.
Como microorganismos indicadores se utilizaron
bacterias Gram-positivas (L. innocua y L.
lactis) y Gram-negativas (H. pylori).
La capacidad de las cepas seleccionadas del
género Bifidobacterium para producir compuestos
antibacterianos en las condiciones propias del tracto intestinal se
determinó por la técnica de la doble capa y la de difusión en agar.
En el primer caso las cepas seleccionadas se inocularon en líneas en
agar MRS-C conteniendo 0.5% de bilis
(Ox-gall, sigma, St. Louis, MO) y 0,1 g/l de
pancreatina (Sigma, St. Louis, MO), y se incubaron a 37ºC, durante
16 h. Sobre estas placas de agar se vertieron los cultivos del
microorganismo indicador (Listeria innocua y Salmonella
typhimurium) y se incubaron durante 24 h a temperatura óptima
para el indicador. En el segundo ensayo, se estudió el efecto
inhibidor de los extractos obtenidos a partir de cultivos de las
seis bifidobacterias crecidas en caldo MRS-C,
conteniendo 0.5% de bilis y 0,1 g/l de pancreatina. Alícuotas (40
\mul) de estos extractos se adicionaron a los pocillos perforados
en placas de agar semisólido en las que estaba inoculado el
microorganismo indicador (Listeria innocua y Salmonella
typhimurium), se dejaron difundir a 4ºC, durante 1 h y,
posteriormente, se incubaron en condiciones óptimas para cada
indicador durante 24 h. Tras el período de incubación se midieron
los halos de inhibición alrededor de las líneas o los pocillos.
La capacidad de las bifidobacterias para crecer,
fermentar y coagular la leche se determinó inoculando al 1%
cultivos de 24 h de cada una de ellas en leche desnatada al 10% (L)
y leche desnatada al 10%, conteniendo un 0.5% de extracto de
levadura y un 1% de glucosa
(L-EL-G). Los cultivos se incubaron
a 37ºC y a distintos tiempos se determinó la viabilidad de las
bifidobacterias mediante recuentos en placas de agar
MRS-C, el pH, la consistencia y el aroma de las
leches cultivadas.
La capacidad de las cepas seleccionadas para
producir compuestos antibacterianos in situ en los medios
basados en leche (L, L-EL-G y PCL)
se determinó por la técnica de la doble capa y por la de difusión
en agar. En el primer caso, las cepas seleccionadas se inocularon
en líneas en los medios basados en leche descritos y se incubaron a
37ºC, durante 16 h. Sobre estas placas de agar se vertieron los
cultivos del microorganismo indicador (Listeria innocua y
Salmonella typhimurium) y se incubaron, durante 24 h, a
temperatura óptima para el indicador. En el segundo ensayo, se
estudió el efecto inhibidor de los extractos obtenidos a partir de
cultivos de las bifidobacterias en L y
L-EL-L tras su incubación durante 16
h a 37ºC, en anaerobiosis. Alícuotas (40 \mul) de los extractos,
neutralizados y sin neutralizar, se adicionaron a los pocillos
perforados en placas de agar semisólido en las que estaba inoculado
el microorganismo indicador (Listeria innocua y
Salmonella typhimurium), se dejaron difundir a 4ºC, durante
1 h y, posteriormente, se incubaron en condiciones óptimas para
cada indicador durante 24 h. Tras el período de incubación se
midieron los halos de inhibición alrededor de las líneas de siembra
y de los pocillos, en cada caso.
Se utilizó leche descremada al 10% como modelo
de un alimento en el que las cepas seleccionadas podrían desempeñar
una función bioprotectora frente a bacterias alterantes y
patógenas. La leche, previamente esterilizada, se inoculó con las
bifidobacterias bioprotectoras, de modo que alcanzaran niveles de
10^{7} UFC/ml, y se contaminaron con cultivos de Listeria
innocua y Salmonella typhimurium, de modo que alcanzaran
niveles finales de 10^{4}-10^{5} UFC/ml, y se
incubaron a 37ºC, durante 48 h. Paralelamente, se analizaron
controles en los que sólo se inoculó la bacteria contaminante. A
distintos tiempos se tomaron alícuotas y se evaluó comparativamente
la viabilidad de los microorganismos contaminantes en presencia o
ausencia de la bifidobacteria bioprotectora. Los recuentos de
Listeria se hicieron en agar Palcam (Merck, Darmstadt,
Alemania) y los de Salmonella en agar Hektoen (Scharlau,
Barcelona, España) incubando en aerobiosis a 30 y 37ºC,
respectivamente, durante 48 h.
A fin de estudiar el efecto bioprotector de los
compuestos antimicrobianos secretados al medio por las
bifidobacterias y adicionados, en forma de extractos a la leche,
previamente inoculada con el microorganismo contaminante
(Listeria innocua; 10^{5} UFC/ml), se le añadieron 0.2
volúmenes del extracto obtenido en MRS-C,
neutralizado y sin neutralizar. Se incubó a 37ºC durante 48 h.
Paralelamente, se analizaron controles en los que se inoculó la
bacteria contaminante y un volumen equivalente de medio no
fermentado. Como en el caso anterior se evaluó la viabilidad del
microorganismo contaminante a distintos tiempos mediante recuentos
en placa.
Las cepas del género Bifidobacterium de
la presente invención seleccionadas, así como sus metabolitos
adicionados en forma de extractos, actúan como inhibidores del
desarrollo de bacterias Gram-positivas y
Gram-negativas en alimentos. Las bifidobacterias
seleccionadas actuaron como cultivos bioprotectores en leche,
reduciendo la viabilidad de Salmonella en, al menos, dos
unidades logarítmicas y de Listeria en, al menos, seis (ver
Tabla II). Los efectos protectores consecuencia directa de los
metabolitos secretados por las bifidobacterias, se confirmaron por
adición exclusiva a la leche contaminada de sus extractos. La
adición de extractos no neutralizados, en los que se sumaría los
efectos de los ácidos orgánicos y los de compuestos de naturaleza
proteica, produjeron una reducción de los niveles de Listeria
a valores inferiores a 100 UFC/ml y la adición de extractos
neutralizados, con los que se evaluaría inicialmente el efecto de
compuestos de naturaleza proteica, provocó reducciones de la
bacteria contaminante de, al menos, dos unidades logarítmicas. Por
tanto, los compuestos de naturaleza proteica en forma de extractos
así como los cultivos de las cepas del género Bifidobacterium
que los producen pueden actuar, en alimentos como la leche, como
bioprotectores inhibiendo el desarrollo de microorganismos
contaminantes (Ejemplo 5).
\vskip1.000000\baselineskip
| Inóculo en leche | Viabilidad del microorganismo | |
| contaminante (UFC/ml) | ||
| Tiempo de Incubación (h) | ||
| 0 h | 48 h | |
| L. innocua | 1,3x10^{5} | 5,5x10^{7} |
| L. innocua + Bifidobacterium BIR-0326 | 1,3x10^{5} | <10^{2} |
| L. innocua + medio no inoculado | 6,0x10^{5} | 4,4x10^{8} |
| L. innocua + extracto neutralizado de Bifidobacterium BIR-0326 | 6,0x10^{5} | 2,0x10^{6} |
| L. innocua + extracto sin neutralizar de Bifidobacterium BIR-0326 | 6,0x10^{5} | <10^{2} |
| S. typhimurium | 4,5x10^{4} | 1,5x10^{5} |
| S. typhimurium + Bifidobacterium BIR-0324 | 4,5x10^{4} | <10^{2} |
Claims (17)
1. Cepa bacteriana aislada caracterizada
porque:
- a)
- es una cepa de origen humano aislada de heces de humanos sanos perteneciente al siguiente grupo del género Bifidobacterium: Bifidobacterium BIR-0304 (CECT 7039), Bifidobacterium BIR-0307 (CECT 7040), Bifidobacterium BIR-0312 (CECT 7041), Bifidobacterium BIR-0324 (CECT 7042), Bifidobacterium BIR-0326 (CECT 7043) y Bifidobacterium BIR-0349 (CECT 7044),
- b)
- produce compuestos con actividad antibacterianas de naturaleza proteica, con características similares a las bacteriocinas, de amplio espectro de acción que comprende bacterias Gram-positivas y Gram-negativas,
- c)
- es susceptible de ser utilizada como probiótico al resistir las condiciones de estrés gastrointestinal y tecnológico pertenecientes al siguiente grupo: a condiciones de pH del jugo gástrico, concentraciones de sales biliares comprendidas entre 0.5-3% de bilis, concentraciones de cloruro sódico comprendidas entre 2-8% y ser tolerante a temperaturas entre 42-60ºC propias de los procesos tecnológicos de elaboración de alimentos,
- d)
- son resistentes a metroniazol, ácido malidíxico, kanamiciana, vancomina y poliximina,
- e)
- son sensibles a la rifampicina, amoxicilina, penicilina G, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina y claritromicina,
2. Extracto derivado del metabolismo de la cepa
bacteriana según la reivindicación 1 caracterizado
porque:
- a)
- Se produce por inoculación de los microorganismos en un medio y recuperación del sobrenadante en la fase exponencial o la fase estacionaria,
- b)
- presenta actividad antibacteriana de amplio espectro (frente a Gram-positivas como por ejemplo Listeria inocua y Gram-negativas como por ejemplo Escherichia coli),
- c)
- es termoestable a 80ºC durante 3 minutos o a 100ºC durante 1 minuto,
- d)
- presentan estabilidad y actividad en un intervalo de pH de 2-11,
- e)
- es sensibles a enzimas proteolíticas y resistentes a enzimas lipolíticas y amilolíticas lo que revela su naturaleza proteica,
- f)
- y los compuestos activos tienen una masa molecular aparente menor de 100 kDa.
3. Extracto derivado del metabolismo de la cepa
bacteriana BIR-0304 (CECT 7039),
Bifidobacterium BIR-0307 (CECT 7040),
Bifidobacterium BIR-0312 (CECT 7041),
Bifidobacterium BIR-0324 (CECT 7042) o
Bifidobacterium BIR-0326 (CECT 7043) según la
reivindicación 1 caracterizado porque:
- g)
- Se produce por inoculación de los microorganismos en un medio y recuperación del sobrenadante en la fase exponencial o la fase estacionaria,
- h)
- presenta actividad antibacteriana de amplio espectro (frente a Gram-positivas patógenas como por ejemplo Clostridium difficile y Gram-negativas como por ejemplo Salmonella typhimurum o Helicobacter pilori,
- i)
- es termoestable a 80ºC durante 3 minutos o a 100ºC durante 1 minuto,
- j)
- presentan estabilidad y actividad en un intervalo de pH de 2-11,
- k)
- es sensibles a enzimas proteolíticas y resistentes a enzimas lipolíticas y amilolíticas lo que revela su naturaleza proteica,
- l)
- y los compuestos activos tienen una masa molecular aparente menor de 100 kDa.
4. Procedimiento de obtención de extracto
proteico según la reivindicaciones 2 y 3 caracterizado
porque se obtiene a partir de los sobrenadantes libres de células
de cultivos de las cepas bacterianas según la reivindicación 1 en la
fase exponencial o la fase estacionaria.
5. Procedimiento de obtención de extracto
proteico según la reivindicación 4 caracterizado porque la
producción o liberación al medio es máxima al final de la fase de
crecimiento exponencial y fase estacionaria, cuando se utiliza como
medio de cultivo caldo MRS, conteniendo 0.5% cisteína y agentes como
el Tween (0,1-10,0%).
\newpage
6. Procedimiento de obtención de extracto
proteico según la reivindicación 5 caracterizado porque se
obtiene mediante liofilización, centrifugación, precipitación,
extracción o filtración y de forma opcional neutralización.
7. Uso de la cepa bacteriana según la
reivindicación 1 en la elaboración de un alimento, ingrediente o
bebida probiótica.
8. Uso de la cepa bacteriana según la
reivindicación 6 caracterizado porque el alimento o bebida
probiótica presenta acción antimicrobiana activa frente a patógenos
gastro-intestinales u otro tipo de bacteria
patógena.
9. Uso de la cepa bacteriana según la
reivindicación 8 caracterizado porque el alimento,
ingrediente o bebida probiótica es activa frente a Helicobacter
pilori.
10. Uso de la cepa bacteriana según la
reivindicación 8 caracterizado porque el alimento,
ingrediente o bebida probiótica es activa frente a Clostridium
difficile.
11. Uso de la cepa bacteriana según las
reivindicaciones 7 a 10 caracterizado porque el alimento,
ingrediente o bebida probiótica consiste, entre otros, en una leche
fermentada, leche bífidus y otros derivados lácteos.
12. Uso de la cepa bacteriana según la
reivindicaciones 1 como fermento o cultivo iniciador y cultivo
bioprotector de alimentos, ingredientes o bebidas frente a
bacterias de alteración y de interés sanitario.
13. Uso de la cepa bacteriana según la
reivindicación 12 caracterizado porque el fermento se
utiliza para la elaboración de, entre otros, leches fermentadas,
leches bífidus y otros derivados lácteos.
14. Uso del extracto proteico según la
reivindicaciones 2 y 3 como antimicrobiano o conservante biológico
de alimentos, ingredientes o bebidas frente a bacterias alterantes
de alimentos y de interés sanitario.
15. Uso del extracto proteico según la
reivindicaciones 2 y 3 como antimicrobiano frente a patógenos
gastrointestinales u otro tipo de bacteria patógena.
16. Uso del extracto proteico según la
reivindicación 15 caracterizado porque el patógeno
gastrointestinal es una cepa de la especie Helicobacter
pylori (multi)-resistente.
17. Uso del extracto proteico según la
reivindicación 15 caracterizado porque el patógeno
gastrointestinal es una cepa de la especie Clostridium
difficile.
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| YILDIRIM, Z. y JOHNSON M.G. Characterization and antimicrobial spectrum of bifidocin B, a bacteriocin produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454. 1998, Vol. 61 (1), páginas 47-51. * |
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