ES2290762T3 - Cepas bacterianas de bifidobacterium que producen acido folico, sus formulaciones y utilizacion. - Google Patents

Cepas bacterianas de bifidobacterium que producen acido folico, sus formulaciones y utilizacion. Download PDF

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Abstract

Cepas bacterianas pertenecientes al género Bifidobacterium depositadas en DSMZ el 21 de Julio de 2004 e identificadas con los siguientes códigos de identificación: - Bifidobacterium adolescentis código DSM 16594; - Bifidobacterium adolescentis código DSM 16595; - Bifidobacterium breve código DSM 16596; - Bifidobacterium pseudocatenulatum código DSM 16597; - Bifidobacterium pseudocatenulatum código DSM 16598.

Description

Cepas bacterianas de bifidobacterium que producen ácido fólico, sus formulaciones y utilización.
Campo de la invención
El ácido fólico es una importante vitamina del grupo B soluble en agua que acepta una unidad de carbono proveniente de una molécula donadora.
Gracias a esta característica, el ácido fólico es central en una gran cantidad de procesos celulares esenciales, incluida, por ejemplo, la biogénesis de grupos de metilo y síntesis de nucleótidos, de vitaminas y de varios aminoácidos.
En el organismo, la replicación, reparación y metilación de DNA se vuelven más eficientes a medida que aumenta la disponibilidad de ácido fólico.
Por este motivo, los tejidos que presentan una elevada velocidad de proliferación y recambio, tales como leucocitos, eritrocitos y enterocitos, exigen una gran cantidad de ácido fólico, o al menos una buena y constante cantidad del mismo.
En los humanos, la deficiencia de ácido fólico se la ha asociado a un elevado aumento de riesgo de contraer cáncer: por ejemplo, estudios epidemiológicos han demostrado que el riesgo de desarrollar un tumor al seno después de la menopausia es mayor en las mujeres que ingieren una baja cantidad de ácido fólico.
Por el contrario, elevadas cantidades de ácido fólico reducen el riesgo de cáncer colorectal.
El ácido fólico (junto con sus sales, los folatos) juega, entre otras cosas, un papel fundamental para las células que componen la membrana de la mucosa colorectal, la cual sufre un proceso continuo de renovación epitelial.
El papel que juega el ácido fólico en la prevención del cáncer colorectal ha sido descrito en distintos textos (Referencia 1). Ha sido demostrado, en particular, que los polimorfismos de genes responsables del metabolismo del grupo metilo están asociados con el riesgo hereditario del cáncer colorectal y que el efecto de esos genes se ve modificado por la disponibilidad de folatos (Referencia 2).
Por consiguiente, una baja o reducida disponibilidad local de ácido fólico puede provocar una hipometilación de DNA, lo cual favorece, por ejemplo, la aparición de cáncer del colon.
Asimismo, la disponibilidad de grandes cantidades de ácido fólico es recomendado para pacientes afectados por enfermedades inflamatorias del intestino (IBD = Inflammatory Bowel Diseases), puesto que ayuda a regular la proliferación de células del colon y del recto.
Por ende, es de suma importancia hallar un medio a través del cual darle al cuerpo una fuente endógena, natural y no tóxica capaz de suministrar la cantidad necesaria de ácido fólico de manera continua y proporcionar así una alternativa a los métodos sistémicos convencionales de administración de dicha sustancia, o de sus sales.
Lamentablemente, hasta ahora no se ha hallado ningún tipo de solución capaz de satisfacer esta necesidad.
Es bien sabido que el colon humano está colonizado por una compleja y numerosa comunidad microbiana que interactúa activamente con su huésped.
La concentración de bacterias en el colon es de aproximadamente de 10^{11} a 10^{12} bacterias por gramo de contenido intestinal.
De las por lo menos 400 especies de bacterias presentes sólo 30-40 son responsables de aproximadamente el 95-98% de la microflora total.
Entre esas especies principales, las pertenecientes al género Bifidobacterium representan uno de los mayores grupos microbianos intestinales presentes en el cuerpo humano.
El género Bifidobacterium es conocido por su actividad benéfica dentro del cuerpo. Esta actividad se traduce, por ejemplo, en los siguientes efectos: habilidad de reconstituir la flora bacteriana intestinal después de un tratamiento con antibióticos, mantenimiento de un equilibrio entre los varios grupos microbianos intestinales, reducción de los niveles séricos de colesterol, producción de vitaminas, mejora de intolerancia a la lactosa e inmunomodulación.
Las bacterias que pertenecen al género Bifidobacterium, por ende, son consideradas, con razón, probióticas y se usan comúnmente como tales en los sectores farmacéutico, veterinario y/o alimenticio.
Un probiótico es por definición un suplemento microbiano vivo cuya actividad es benéfica para la salud humana o animal.
Hasta hoy, no se conocen cepas probióticas para producir ácido fólico (se han descrito bacterias que producen ácido fólico pertenecientes al género de Lactobacillus y Lactococcus, pero no se las ha propuesto como probióticos).
En particular, no se conoce ninguna bacteria probiótica del género Bifidobacterium capaz de desarrollarse en un medio de cultivo totalmente carente de ácido fólico y producir este último en grandes cantidades.
Descripción de la invención
La parte solicitante imprevistamente ha hallado que cepas de bacterias probióticas de origen humano, pertenecientes al género Bifidobacterium, en particular perteneciente a las especies Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium breve y Bifidobacterium pseudocatenulatum, son productoras de ácido fólico, tal como está descrito en detalles más adelante y en las reivindicaciones anexas.
Más exactamente, tal como está descrito detalladamente abajo y en las reivindicaciones anexas, la parte solicitante aisló y depositó en el DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; Braunsweig-Alemania), el 21 de Julio 2004, cinco nuevas cepas bacterianas de origen humano perteneciente al género Bifidobacterium. De esas cinco nuevas cepas de bacterias, dos pertenecen a la especie Bifidobacterium adolescentis, una a la especie Bifidobacterium breve, y dos a la especie Bifidobacterium pseudocatenulatum. A dichas cepas se le atribuyeron, respectivamente, los siguientes códigos:
DSM 16594;
DSM 16595;
DSM 16596;
DSM 16597;
DSM 16598.
Dichas cepas bacterianas fueron caracterizadas taxonómica y tecnológicamente, como está descrito a continuación, y demostraron ser productoras de grandes cantidades de ácido fólico.
En efecto, dichas cepas son capaces de desarrollarse en medios de cultivo carentes de ácido fólico.
En particular, dichas cepas son capaces de producir, respectivamente, las siguientes cantidades de ácido fólico: 56-62, 16-20, 6-9, 14-16 y 14-19 ng/ml de medio de cultivo.
Asimismo, inesperadamente se ha observado que la biosíntesis del ácido fólico mediante las cepas bacterianas de la presente invención no está sometida a ningún mecanismo de regulación negativa (retroalimentación negativa) por parte del producto resultante o cualquier otro producto ya presente en el medio de cultivo.
En otros términos, en condiciones fisiológicas, la producción de ácido fólico sigue siendo constante independientemente de que este último esté en el ambiente.
Finalmente, también se ha observado que cambios de pH, típicos del ecosistema del colon (valores de pH que varían entre aproximadamente 7 y 5 son considerados verosímiles, en relación a ciertas patologías o tipo de dieta), no impactan negativamente la productividad de las cepas de la presente invención.
Por lo tanto, los microorganismos de este tipo están en condiciones de combinar sus conocidas características probióticas (por ende beneficiosas al organismo) con una capacidad para la producción de ácido fólico in situ (por ejemplo en el colon).
Por consiguiente, esas cepas inesperadamente se presentaron como la solución buscada al problema técnico de la presente invención, como se ha señalado arriba.
De hecho, dichos microorganismos representan una ideal fuente endógena, natural y atóxica de ácido fólico.
El uso de adecuadas formulaciones que contienen las bifidobacterias productoras de ácido fólico de la presente invención puede permitir la producción continua in situ de ácido fólico.
La bacteria probiótica de la presente invención puede ser administrada de varias maneras, en función de las necesidades del paciente o consumidor.
Según un aspecto preferido, la presente invención está orientada a formulaciones farmacéuticas, veterinarias y/o alimenticias que comprenden al menos una de las cepas bacterianas de la presente invención o una mezcla de las mismas.
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Sumamente preferidas son las formulaciones que comprenden al menos una de las cepas DSM 16594, DSM 16595, DSM 16596, DSM 16597 y DSM 16598 o cualquier combinación de ellas.
Según otro aspecto preferido, las cepas de la presente invención también pueden ser formuladas en combinación con otras cepas bacterianas probióticas con características complementarias, es decir propiedades intrínsecas diferentes.
Un ejemplo, que no debería representar ninguna limitación, de tales formulaciones podría estar representado por una mezcla adecuada de al menos una de las cepas bacterianas de la presente invención con una cepa bacteriana probiótica con la característica de adherirse fuertemente a la membrana de la mucosa intestinal.
Las cepas de la presente invención también podrían ser formuladas en combinación con otras cepas que, aparte de las características intrínsecas benéficas asociadas con el género bacteriano al cual pertenecen, presenten otras características peculiares útiles para la salud del huésped.
Dichas formulaciones mezcladas están en condiciones de combinar distintas propiedades probióticas en una única formulación, proporcionándole así al organismo una pluralidad de beneficios, así como las potenciales sinergías que se derivan de las mismas, en una única administración.
En virtud de dichas consideraciones, queda claro que los avezados en la materia pueden imaginar muchas combinaciones de bacterias probióticas sobre la base de sus propias experiencias.
Por lo tanto, también tales combinaciones caen dentro del alcance de la presente invención.
A título puramente ejemplificador, sin restringir el alcance de la presente invención, dichas bacterias probióticas pueden ser seleccionadas a partir, entre otros, del género Lactobacillus, incluidas especies como Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei subesp. rhamnosus, Lactobacillus casei subesp. paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus salivarius subesp. salivarios y Lactobacillus pentosus, o a partir del género Streptococcus, incluidas las especies como Streptococcus delbrueckii subesp. thermophilus.
Entre ellas, las cepas sumamente preferidas han demostrado ser, por ejemplo, las siguientes:
- Lactobacillus acidophilus LMG P-21381 (depositada en el Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - BCCM LMG Collection el 31 de Enero de 2002);
- Lactobacillus casei subesp. Paracasei LMG P-21380(depositada en el Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - BCCM LMG Collection el 31 de Enero de 2002);
- Lactobacillus plantarum LMG P21021(depositada en el Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - BCCM LMG Collection el 16 de Octubre de 2002);
- Lactobacillus pentosus LMG P-21019(depositada en el Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - BCCM LMG Collection el 16 de Octubre de 2002);
- Lactobacillus plantarium LMG P-21020(depositada en el Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - BCCM LMG Collection el 16 de Octubre de 2002);
- Lactobacillus plantarium LMG P-21022(depositada en el Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - BCCM LMG Collection el 16 de Octubre de 2002);
- Lactobacillus plantarum LMG P-21023(depositada en el Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - BCCM LMG Collection el 16 de Octubre de 2002);
- Bifidobacterium lactis LMG P-21384 (depositada en el Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - BCCM LMG Collection el 31 de Enero de 2002);
- Streptococcus delbrueckii subesp. thermophilus DSM 16506(depositada en el DSMZ el 18 de Junio de 2004);
- Streptococcus delbrueckii subesp. thermophilus DSM 16507(depositada en el DSMZ el 18 de Junio de 2004);
- Bifidobacterium longum DSM 16603(depositada en el DSMZ el 20 de Julio de 2004);
- Bifidobacterium breve DSM 16604(depositada en el DSMZ el 20 de Julio de 2004);
- Lactobacillus casei subesp. rhamnosus DSM 16605(depositada en el DSMZ el 20 de Julio de 2004).
Por consiguiente, formulaciones mezcladas sumamente preferidas de la presente invención comprenderán al menos una de las cepas bacterianas de DSM 16594 a DSM 16598, o cualquier mezcla de ellas, adecuadamente formuladas en combinación con por lo menos una de las cepas bacterianas probióticas listadas arriba, o cualquiera mezcla de ellas.
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Preferentemente, dichas cepas bacterianas probióticas son seleccionadas a partir del grupo que comprende:
- Lactobacillus acidophilus LMG P-21381;
- Lactobacillus casei subesp. paracasei LMG P-21380;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21021;
- Lactobacillus pentosus LMG P-21019;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21020;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21022;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21023;
- Bifidobacterium lactis LMG P-21384;
- Streptococcus delbrueckii subesp. thermophilus DSM 16506;
- Streptococcus delbrueckii subesp. thermophilus DSM 16507;
- Bifidobacterium longum DSM 16603;
- Bifidobacterium breve DSM 16604;
- Lactobacillus casei subesp. rhamnosus DSM 16605.
La cantidad y tipo de cepas bacterianas a combinar en dichas formulaciones mezcladas será decidida por los expertos en la materia en función del tipo y de la gravedad de la patología a tratar o prevenir, o el tipo de producto alimenticio probiótico que se desea obtener.
Según otro aspecto preferido, las cepas bacterianas de la presente invención, usadas individualmente o combinadas entre sí y/o con otras cepas bacterianas probióticas, se pueden además formular en combinación con otras sustancias con propiedades prebióticas.
Preferentemente, dichas sustancias con propiedades prebióticas comprenden, en particular, carbohidratos que no son digeridos y absorbidos por el organismo humano y que, por ende, llegan al colon completamente intactos, donde los mismos selectivamente estimulan el desarrollo y la actividad de una cantidad de grupos microbianos beneficiosos, en particular bifidobacterias.
Sumamente preferidos entre dichos carbohidratos prebióticos son los seleccionados a partir del grupo que comprende: fructo-oligosacáridos (FOS), en particular inulina, isomalto-oligosacáridos, almidón resistentes, pectina, galacto-oligosacáridos (GOS), arabinogalactana, xilo-oligosacáridos (XOS), quitosana oligosacáridos (COS) y glucomanana.
A título ejemplificador, sin restringir el alcance de la presente invención, las formulaciones preferidas comprenden al menos una de las cepas bacterianas de DSM 16594 a DSM 16598, o cualquier mezcla de ellas, adecuadamente formuladas en combinación con al menos una sustancia con propiedades prebióticas seleccionada, por ejemplo, entre aquellas listadas arriba, es decir fructo-oligosacáridos (FOS), en particular inulina, isomalto-oligosacáridos, almidón resistentes, pectina, galacto-oligosacáridos (GOS), arabinogalactana, xilo-oligosacáridos (XOS), quitosana oligosacáridos (COS) y glucomanana.
Del mismo modo, las formulaciones preferidas de la presente invención comprenden al menos una de las cepas bacterianas de DSM 16594 a DSM 16598, o cualquier mezcla de ellas, adecuadamente formuladas en combinación con al menos una de las cepas bacterianas probióticas listadas arriba, o cualquier mezcla de ellas, y con al menos una sustancia con propiedades prebióticas seleccionadas, por ejemplo, entre otras aquellas listadas arriba, es decir fructo-oligosacáridos (FOS), en particular inulina, isomalto-oligosacáridos, almidón resistentes, pectina, galacto-oligosacáridos (GOS), arabinogalactana, xilo-oligosacáridos (XOS), quitosana oligosacáridos (COS) y glucomanana
Preferentemente, dichas cepas bacterianas probióticas son seleccionadas a partir del grupo que comprende:
- Lactobacillus acidophilus LMG P-21381;
- Lactobacillus casei subesp. paracasei LMG P-21380;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21021;
- Lactobacillus pentosus LMG P-21019;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21020;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21022;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21023;
- Bifidobacterium lactis LMG P-21384;
- Streptococcus delbrueckii subesp. thermophilus DSM 16506;
- Streptococcus delbrueckii subesp. thermophilus DSM 16507;
- Bifidobacterium longum DSM 16603;
- Bifidobacterium breve DSM 16604;
- Lactobacillus casei subesp. rhamnosus DSM 16605.
Las realizaciones preferidas de la presente invención incluyen las formulaciones en las cuales las cepas de la invención preferentemente se emplean en forma liofilizada.
Las cepas de la presente invención preferentemente son formuladas en combinación con apropiados vehículos, excipientes, aromatizantes, estabilizadores y aditivos, tales como aminoácidos, vitaminas, antioxidantes y enzimas, comúnmente usados en la preparación de formulaciones farmacéuticas y/o alimenticias.
Exclusivamente a título ejemplificador, sin restringir el alcance de la presente invención, entre los aditivos muy preferidos se pueden mencionar glutamina, arginina, dismutasa superóxido y glutationa.
Las formulaciones de la presente invención pueden ser administradas por vía oral, con supositorios, o con comprimidos o cápsulas vaginales, como tales o en combinación con productos alimenticios como, por ejemplo, leche, yogur, derivados de la leche o productos de leche fermentada, para el tratamiento y/o la prevención de problemas gastrointestinales (diarrea, terapia con antibióticos, IBD, prevención del cáncer del colon) donde convendría administrar una adecuada cantidad de ácido fólico.
Como se ha señalado arriba, las formulaciones de la presente invención también pueden ser administradas después o durante terapias con antibióticos para reconstruir y restablecer el equilibrio de la flora intestinal no patógena.
Las formulaciones sumamente preferidas son aquellas a administrar oralmente, por medio de supositorios o cápsulas o comprimidos vaginales.
Algunas formas típicas de formulaciones incluyen, por ejemplo, cápsulas, suspensiones o soluciones orales, polvos contenidos en sobrecitos o formas análogas, comprimidos, supositorios y pesarios.
Por lo que concierne a la dosis, cada formulación normalmente contendrá de 10^{5} a 10^{11} células de cada cepa bacteriana por dosis individual, preferentemente de 10^{7} a 10^{10} bacterias por dosis.
En general, la concentración del principio activo, o de la mezcla de principios activos, puede estar comprendida entre 10^{8} células de cepa(s) bacteriana(s) por gramo de formulación a 10^{11} células por gramo; preferentemente de 10^{9} células por gramo a 10^{10} células por gramo de formulación.
Un ejemplo de las potenciales aplicaciones de la presente invención, que de ninguna manera restringen su alcance, se refiere al caso de administración de las cepas de la presente invención a un paciente adulto bajo terapia con antibióticos.
Durante toda la duración de la terapia con antibióticos y durante los cinco días posteriores a su finalización dicho paciente ha recibido dos sobrecitos por día de una formulación liofilizada de DSM 16594 y DSM 16595 en combinación con las cepas probióticas DSM 16506 y LMG P-21380 y con glutamina.
El contenido de cada sobrecito, administrado en forma oral con suspensión en agua, comprendía aproximadamente 10^{10} células de cada cepa bacteriana y, como excipientes, almidón, tween, dispersantes aromatizantes de mandarina, acesulfama, sacarina, ácido ascórbico y metilparabeno.
Las cepas bacterianas de la presente invención también han demostrado ser sumamente útiles para mejorar el valor nutricional de productos alimenticios.
Productos alimenticios sumamente preferidos son los derivados de la leche y/o sus derivados, por ejemplo yogur y leche fermentada así como también rellenos de bocadillos, helados y así siguiendo.
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Descripción detallada de la invención - Aislamiento de las cepas
La cepa Bifidobacterium adolescentis DSM 16594 fue aislada de los excrementos de un sujeto adulto el cual no había tomado ni antibióticos ni preparaciones probióticas durante los 3 meses precedentes al aislamiento.
En Wilkins-Chalgren Anaerobe Broth (Oxoid Limited, Basingstoke, Hampshire, Inglaterra, Reino Unido) se ha preparado una suspensión al 10% de excrementos frescos con una concentración de 0,5 x, es decir preparando una dilución 1:1 del medio obtenido en conformidad con las instrucciones indicadas en el sobrecito.
A partir del homogenato (diluciones 1:10, obtenidas diluyendo 1 ml de la dilución precedente en 9 ml del mismo medio) se prepararon diluciones seriales de hasta 10^{-9}.
Alícuotas de 0,1 ml de las diluciones entre 10^{-6} y 10^{-9} se pusieron en placas en un medio selectivo para bifidobacterias, RB AGAR (Referencia 3).
Las placas fueron incubadas en anaerobiosis a 37ºC por 48 horas.
Todas las preparaciones fueron realizadas en una cámara anaeróbica (Aparato: Anaerobic System, Modelo 2028, Forma Scientific Co., Marietta, OH) en la siguiente atmósfera: N_{2} 85%, CO_{2} 10%, H_{2} 5%.
La colonia correspondiente a la cepa bacteriana DMS 16594 fue aislada de las productoras de una aureola amarilla, debido a la acidificación del medio y al cambio de color del indicador.
- Atribución al género Bifidobacterium y a la especie Bifidobacterium adolescentis
A los fines de atribuir DMS 16594 al género Bifidobacterium, se ha realizado una amplificación específica del género usando primers orientados a rDNA 16S Bif164/Bif662, a partir de los cuales se ha obtenido amplicone corregido de 523 bp. Simultáneamente, se ha realizado un ensayo bioquímico para identificar la enzima clave del metabolismo de los carbohidratos de las bifidobacterias, es decir fructosa-6-fosfato fosfocetolasa.
La especie adolescentis fue identificada mediante hibridización de DNA-DNA, como está descrito en el documento de Scardovi y otros (Referencia 4).
\vskip1.000000\baselineskip
- Características de la cepa DMS 16594
Origen:
humano
Edad: 39 años Sexo: F
Género:
Bifidobacterium
Especie:
adolescentis
Morfología:
barritas irregulares, a veces de forma bífida, con protuberancias y engrosamientos.
Producción de ácido fólico: 
\hskip0.5cm
entre 56 y 62 ng/ml
Plasmidas:
no
Las otras cepas bacterianas, DSM 16595, DSM 16596, DSM 16597 y DSM 16598, fueron aisladas usando un método similar al descrito arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
- Características de la cepa DMS 16595
Origen:
humano
Edad: 37 años Sexo: F
Género:
Bifidobacterium
Especie:
adolescentis
Morfología:
barritas irregulares, a veces de forma bífida, con protuberancias y engrosamientos.
Producción de ácido fólico: 
\hskip0.5cm
entre 16 y 20 ng/ml
Plasmidas:
no
\global\parskip1.000000\baselineskip
- Características de la cepa DMS 16596
Origen:
humano
Edad: 39 años Sexo: F
Género:
Bifidobacterium
Especie:
breve
Morfología:
barritas irregulares cortas
Producción de ácido fólico: 
\hskip0.5cm
entre 6 y 9 ng/ml
Plasmidas:
no
\vskip1.000000\baselineskip
- Características de la cepa DMS 16597
Origen:
humano
Edad: 56 años Sexo: M
Género:
Bifidobacterium
Especie:
pseudocatenulatum
Morfología:
barritas irregulares
Producción de ácido fólico: 
\hskip0.5cm
entre 14 y 16 ng/ml
Plasmidas:
sí, una de aproximadamente 9 kb
\vskip1.000000\baselineskip
- Características de la cepa DMS 16598
Origen:
humano
Edad: 56 años Sexo: M
Género:
Bifidobacterium
Especie:
pseudocatenulatum
Morfología:
barritas irregulares
Producción de ácido fólico: 
\hskip0.5cm
entre 14 y 16 ng/ml
Plasmidas:
sí, una de aproximadamente 9 kb
\vskip1.000000\baselineskip
- Condiciones de desarrollo de las cepas
Las cepas bacterianas preferidas de la presente invención, DSM 16594, DSM 16595, DSM 16596, DSM 16597 y DSM 16598, fueron conservadas en cultivos introducidos, es decir cultivos introducidos en agar (tubitos de 10 ml con 10 ml de medio agarizado al 9%) o en cultivos líquidos de MRS (Bacto Lactobacilli MRS Broth (0881-17) Laboratorios Difco, División de Becton Dickinsons and Company, Sparks, Maryland 21152 EE.UU.) a los cuales se le agregó cisteina (0,05%).
El medio, preparado siguiendo las instrucciones del sobrecito, fue esterilizado a 110ºC por un lapso de tiempo de 30'.
Cuando las cepas se cultivan en un ambiente carente de ácido fólico, se utiliza un medio sintético denominado minimun; está identificado como Nº 7 y su composición es la descrita a continuación.
Dicho medio se prepara mezclando los componentes y las soluciones siguiendo el orden indicado, bajo agitación, a temperatura ambiente.
El medio se prepara fresco en cada oportunidad.
Medio de cultivo mínimo Nº 7
Glucosa 20 g/L
Vitamin Assay Casaminoacids
(Laboratorios DIFCO, EE.UU. [0288-17] 5 g/L
Urea 2 g/L
Cisteina 0,5 g/L
Solución A 700 ml/L
Solución B 1 ml/L
Solución C 1 ml/L
Solución D 5 ml/L
Las soluciones A, B, C y D tienen las siguientes composiciones:
Solución A
(NH_{4})_{2}SO_{4} 10 g
Acetato de sodio 10 g
Ácido ascórbico 10 g
KH_{2}PO_{4} 1 g
MgSO_{4} 0,7 g
NaCl 0,2 g
Tween 80 1 ml
El Tween 80 se disuelve en 700 ml de agua destilada hirviendo; después de lo cual se agregan los demás componentes en secuencia.
Solución B
Ácido bórico 25 mg
CuSO_{4} 2 mg
KI 5 mg
FeCl_{3} 10 mg
MnSO_{4} 20 mg
Molibdato de sodio 10 mg
ZnSO_{4} 20 mg
Esos componentes se disuelven en secuencia en 50 ml de agua destilada a temperatura ambiente.
Solución C
Biotina 0,2 mg
Pantotenato de calcio 40 mg
Niacina 40 mg
Ácido p-aminobenzoico 20 mg
Piridoxina 40 mg
Riboflavina 20 mg
Tiamina 40 mg
Esos componentes se disuelven en 100 ml de agua destilada a temperatura ambiente.
Solución D
FeSO_{4} 50 mg
La sal se disuelve en 25 ml de agua destilada.
El medio se dispensa dentro de tubitos de 10 ml y se esteriliza a 100ºC por un lapso de tiempo de 30'.
- Ensayo microbiológico del ácido fólico producido por la cepa DSM 16594
La cantidad de ácido fólico producido en fermentación por la cepa DSM 16594, así como también por las otras cepas de la presente invención, fue determinada mediante ensayo microbiológico.
Los cultivos usados para la determinación de la productividad de ácido fólico fueron transplantados al menos 3 veces en el medio mínimo Nº 7, carente de ácido fólico.
El ensayo se basa sobre una determinación turbidimétrica del desarrollo de Enterococcus hirae ATCC 8043, que varía en función de la cantidad de ácido fólico presente en el caldo de cultivo.
La curva de calibración necesaria para la determinación cuantitativa del ácido fólico producido se genera mediante el cultivo de Enterococcus hirae ATCC 8043 en Bacto Folic AOAC Medium (Difco, EE.UU. [0967-15]).
A dicho medio, que contiene todos los nutrilitos necesarios para el desarrollo, con la excepción del ácido fólico, se le agregan cantidades incrementales de ácido fólico (0, 1, 2, 4, 6 y 8 ng por tubito con 10 ml de caldo de cultivo).
Simultáneamente, se inocula Enterococcus hirae ATCC 8043 dentro de tubitos de Bacto Folic AOAC Medium, al cual se le agregan cantidades diferentes del sobrenadante del caldo de cultivo de la cepa DSM 16594.
Después de haber incubado todos los tubos a 37ºC por un lapso de tiempo de 16-18 horas, se toma una lectura turbodimétrica de las muestras a 600 nm y se traza un gráfico lineal sobre una escala semilogarítmica trazando el logaritmo de la concentración de ácido fólico en función de la densidad óptica de la muestra.
Preparación de la solución estándar (s.s.) de ácido fólico con una concentración de 2 \mug/l, o sea 2 ng/ml
Disolver 50 mg de ácido fólico en aproximadamente 30 ml de NaOH 0,01N y 300 ml de H_{2}O. Corregir el pH hasta obtener 7,5 usando HCl diluido (0,1N) y llevando el volumen a 500 ml agregando H_{2}O. Agregar 2 ml de la solución descrita arriba a 50 ml de H_{2}O, corregir el pH llevándolo a 7,5 y llevar el volumen a 100 ml agregando H_{2}O (s.s. de 2 \mug/ml).
Diluir 1 ml de esta solución en 1 litro con H_{2}O de manera de obtener la s.s. de 2 ng/ml (2 \mug/l).
Preparación de tubitos que contienen Bacto Folic Acid Medium
Disolver 11 g del polvo de inicio en 100 ml de H_{2}O. Para disolver los componentes en su totalidad, hervir el medio por un lapso de tiempo de 2-3 minutos. Dispensar alícuotas de 5 ml dentro de tubitos después de enjuagar estos últimos varias veces con agua destilada. Agregar diferentes alícuotas del sobrenadante de caldo de cultivo o la s.s. de ácido fólico (2 ng/ml) y luego agregar H_{2}O para llevar el volumen final de cada tubito a 10 ml. Esterilizar a 121ºC por un lapso de tiempo de 5'.
\vskip1.000000\baselineskip
Ng de ácido fólico por tubito 0 1 2 4 6 8 10
ml de s.s. 2 ng/ml 0 0,5 1 2 3 4 5
ml de H_{2}O 5 4,5 4 3 2 1 0
\mug de ácido fólico por l 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 
\vskip1.000000\baselineskip
A otros 2 tubitos se agregan 4 ml de agua y 1 ml de sobrenadante de caldo de fermentación, obtenidos por centrifugación y filtración con un filtro de 0,22 \mu y seguidas de una apropiada dilución.
Como testigo se preparó un tubito carente de ácido fólico; el mismo no se ha inoculado.
Preparación del inóculo
Dos días antes del ensayo, dentro de un tubito con medio líquido M17 (Bacto M17 Broth, Laboratorios Difco, EE.UU. [1856-17]) se inoculó un cultivo introducido fresco de Enterococcus hirae ATCC 8043. Para preparar el cultivo a usar como inóculo, el cultivo en M17 se centrifuga de manera estéril, se elimina el sobrenadante y se lavan 3 veces las células con 9 ml de solución fisiológica. La píldora de células se vuelve a suspender en 9 ml de solución fisiológica y 1 ml de esta suspensión bacteriana se agrega a 100 ml de solución fisiológica estéril contenida dentro de una probeta Erlenmeyer. A un tubito de Baco Folic AOAC Medium se agrega una gota de esta suspensión, que además se le agrega 10 ng de ácido fólico, y luego se incuba el tubito a 37ºC sin agitarlo.
El día de la prueba, el cultivo preparado según el método descrito arriba se utiliza para preparar el inóculo de la prueba: el cultivo se centrifuga estérilmente, se elimina el sobrenadante y se lavan 3 veces las células con 9 ml de solución fisiológica. Las células se vuelven a suspender en 9 ml de solución fisiológica y se agrega 1 ml de esta solución bacteriana a 100 ml de solución fisiológica estéril contenida dentro de una probeta Erlenmeyer. Para inocular los tubitos de prueba, a todos los tubitos esterilizados a 121ºC por un lapso de tiempo de 5' se agrega una gota de esta suspensión.
Posteriormente, se incuban los tubitos a 37ºC por un lapso de tiempo de 16-18 horas.
- Productividad en cultivo puro
La cantidad de ácido fólico producida por la cepa DSM 16594 en medio mínimo Nº 7 es 56-62 ng/ml.
Las pruebas brindan resultados constantes y reproducibles cuando se llevan a cabo tanto en cultivos carentes de control de pH como en cultivos llevados a cabo en birreactores con un pH constante.
En general, el pH de las sustancias contenidas en el colon puede variar de manera considerable, en relación a ciertas patologías o a factores dietéticos. La producción de ácido fólico mediante DS 16594 se ha demostrado constante (aproximadamente 57-60 ng/ml) independientemente del valor de pH medido, que en este caso estaba comprendido entre 5,5 y 7,0.
También se ha observado que la cepa DSM 16594 produce ácido fólico sin ser afectada por una retroalimentación negativa, por ende hasta un grado que es totalmente independiente de la concentración de ácido fólico presente en el contenido intestinal. En efecto, la cepa DSM 16594 también fue cultivada en el medio mínimo Nº 7 en presencia de crecientes concentraciones de ácido fólico (0, 1, 2, 5, 10 y 20 ng/ml) y se ha observado que la cepa siempre sintetiza y secreta cantidades constantes de ácido fólico (58-61 ng/ml), que de esta manera se agregan a los ya presentes en el medio. Este aspecto es sumamente importante porque sugiere que, después de la ingestión de la cepa DSM 16594 como probiótico, podría haber, dentro del colon, un suministro constante de ácido fólico, una vitamina que es indispensable para el metabolismo de rápido recambio de enterocitos. La desregulación metabólica de la cepa DSM 16594, es decir la carencia de un mecanismo de control que bloquee la biosíntesis de ácido fólico donde ya hay cantidades suficientes de este último, está confirmada por el hecho que la cantidad de ácido fólico producida es al menos 50 veces mayor que la cantidad necesaria para asegurar el desarrollo saludable de bacterias que no sintetizan esta vitamina y, por ende, deben obtenerla de fuentes externas para desarrollarse adecuadamente.
- Evaluación de la contribución de ácido fólico provisto por la cepa DSM 16594 en cultivos fecales
Para evaluar si hubo una producción efectiva de ácido fólico por parte de la cepa DSM 16594 en cultivos mezclados, es decir cultivos que simulan la composición de la microflora intestinal, se prepararon cultivos fecales, es decir cultivos inoculados con muestras fecales diluidas, que pudieron haber sido, o no, inoculados con la cepa DSM 16594; en dichos cultivos se ha determinado el incremento de concentración de ácido fólico.
Los cultivos mezclados que se usaron fueron inoculados con muestras fecales diluidas de manera de simular la normal composición microbiana del contenido intestinal. El medio de cultivo que se usó contenía 10 ng/ml de ácido fólico, una cantidad tal de asegurar el desarrollo de toda la población microbiana inoculada. Además el medio contenía, como fuente de carbono, peptones, vitaminas y fructo-oligosacáridos (FOS).
La elección de FOS se debe al hecho que la administración de un bifidobacterium prebiótico en combinación con este carbohidrato prebiótico, es decir uno que no ha sido digerido ni absorbido y, por ende, puede alcanzar el colon, donde es preponderantemente metabolizado por bifidobacterias, favorece la colonización del intestino tanto por bifidobacterias probióticas como por bifidobacterias endógenas.
- Cultivos fecales
Los cultivos fecales crecieron en un medio preparado según los procedimientos descritos con anterioridad y con la siguiente composición:
Raftilosa P95 (FOS)
(Grupo Orafti, Tienen, Bélgica) 20 g/L
Vitamin Assay Casaminoacids
(Laboratorios DIFCO, EE.UU. [0288-17] 5 g/L
Cisteina 0,5 g/L
Ácido fólico 10 \mug/L
Solución A 700 ml/L
Solución B 1 ml/L
Solución C 1 ml/L
Solución D 5 ml/L
Solución E 10 ml/L
Solución A
(NH_{4})_{2}SO_{4} 10 g
Acetato de sodio 10 g
Ácido ascórbico 10 g
KH_{2}PO_{4} 1 g
MgSO_{4} 0,7 g
NaCl 0,2 g
Tween 80 1 ml
El Tween 80 se disuelve en 700 ml de agua destilada hirviendo; después de lo cual se agregan, en secuencia, los demás componentes.
Solución B
Ácido bórico 25 mg
CuSO_{4} 2 mg
KI 5 mg
FeCl_{3} 10 mg
MnSO_{4} 20 mg
Molibdato de sodio 10 mg
ZnSO_{4} 20 mg
Esos componentes se disuelven en secuencia en 50 ml de agua destilada a temperatura ambiente.
Solución C
Biotina 0,2 mg
Pantotenato de calcio 40 mg
Niacina 40 mg
Ácido p-aminobenzoico 20 mg
Piridoxina 40 mg
Riboflavina 20 mg
Tiamina 40 mg
Esos componentes se disuelven en 100 ml de agua destilada a temperatura ambiente.
Solución D
FeSO_{4} 50 mg
La sal se disuelve en 25 ml de agua destilada a temperatura ambiente.
Solución E
Para lograr un volumen de 1 litro se agrega 50 ml/L de hemina (Sigma-Aldrich SRL, Via Gallarate - Milán - Italia [H5533]) disuelta en 5 ml de NaOH 1M y agua destilada.
Método
En botellas de 100 cc con una cápsula de goma perforable se dispensan alícuotas de 40 ml de medio. Las cápsulas de goma se perforan con una aguja y las botellas se ponen en un baño de agua hirviendo. Después de 10 minutos de incubación a 100ºC la cápsula se perfora con una segunda aguja, a través de la cual se insufla nitrógeno dentro de la botella por un lapso de tiempo de 10 minutos a una presión de 0,15 bares. Una vez terminada la insuflación, se quitan las dos agujas y se esterilizan las botellas a 110ºC por un lapso de tiempo de 30'.
Preparación del inóculo
Dentro de una cámara anaeróbica se transfiere una muestra de materia fecal fresca (10% de H_{2}, 10% de CO_{2} y 80% de N_{2}).
\newpage
Luego en el medio descrito con anterioridad se prepara una suspensión al 10% y se homogeneiza con perlas de vidrio estériles con un diámetro de 3 mm.
A partir de esta suspensión se prepara una dilución 1:100 en el mismo medio contenido en las botellas. Con una jeringa se inocula 0,4 ml de la dilución anterior dentro de dos botellas estériles que contienen 40 ml de medio de cultivo.
Comparación de ácido fólico presente en las muestras fecales inoculadas o no inoculadas con la cepa DSM 16594
Una de las dos muestras idénticas inoculadas con la muestra fecal diluida también se inocula con 0,4 ml de un cultivo de la cepa DSM 16594 hecha desarrollar por un tiempo de 24 horas en un medio mínimo nº 7. Ambos cultivos fecales, uno de los cuales se ha inoculado con la cepa DSM 16594 y el otro no, se incuban a 37ºC por un lapso de tiempo de 24 horas.
Transcurrido este tiempo se centrifuga una alícuota de ambos cultivos a 3.500 g por un lapso de tiempo de 10' y se filtra el sobrenadante con un filtro de 0,4 \mum. Los súpernadantes, diluidos en conformidad, se utilizan para el ensayo microbiológico de ácido fólico.
Productividad de ácido fólico en los cultivos fecales
La concentración de ácido fólico en los cultivos fecales no inoculados con la cepa DSM 16594 está comprendida entre aproximadamente 30 y 70 ng/ml.
Los cultivos correspondientes inoculados con la cepa DSM 16594 demostraron un significativo incremento de concentración de ácido fólico. Dicho incremento estaba comprendido entre 30 y 50 ng/ml, una cantidad que, de esta manera, se agregó a la previamente indicada de 30-70 ng/ml.
Este último hallazgo demuestra, además, que la administración de la cepa bacteriana probiótica de la presente invención, DSM 16594, puede asegurar la presencia de altos niveles de ácido fólico en el colon independientemente de la condición de salud del paciente.
Por consiguiente, es posible asegurar y facilitar el restablecimiento y el mantenimiento de un óptimo equilibrio de flora bacteriana intestinal.
La previa sección experimental describió en detalle el uso de una de las cepas bacterianas sumamente preferidas de la presente invención, es decir la cepa DSM 16594.
Se llevaron a cabo pruebas idénticas, con las mismas condiciones experimentales y usando las mismas cantidades de reactivos, también sobre las otras cuatro cepas bacterianas preferidas de la presente invención, es decir DSM 16595, DSM 16596, DSM 16597 y DSM 16598.
Se ha demostrado que esas cepas bacterianas producen ácido fólico de la misma manera y con las mismas características que la DSM 16594.
La productividad de Bifidobacterium adolescentis DSM 16595, Bifidobacterium breve DSM 16596, Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 16597 y Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 16598 demostró ser menor que la de Bifidobacterium adolescentis DSM 16594.
En particular, DSM 16595 produce aproximadamente el 30,5%, DSM 16596 aproximadamente el 13%, DSM 16597 el 25,5% y DSM 16598 el 28% de la cantidad de ácido fólico que produce DSM 16594.
Sin embargo, también en esos casos, la cantidad de ácido fólico producida (ascendía, respectivamente, a aproximadamente 16-20 ng/ml para DSM 16595; 6-9 ng/ml para DSM 16596; 14-16 ng/ml para DSM 16597 y 14-19 ng/ml para DSM 16598) es significantemente mayor (aproximadamente de 14 a 16 veces mayor para DSM 16595; de 5 a 7 veces mayor para DSM 16596; de 12 a 13 veces mayor para DSM 16597 y de 12 a 15 veces mayor para DSM 16598) que la cantidad necesaria para asegurar el desarrollo saludable de otras bacterias que requieren esta vitamina para su óptimo desarrollo.
Referencias
1. Fucs C.S. et al. (2002) The influence of folate and multivitamin use on the familial risk of colon cancer in women. Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. 11, 227-234.
2. Ma J. et al. (1999) A polymorphism of the methionine synthase gene: association with plasma folate, vitamin B12, homocyst(e)ine, and colorectal cancer risk. Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. 8, 825-829.
3. Hartemink R., Kok BIFIDOBACTERIUMJ. Weenk G.H., Rombouts F.M. (1996) Raffinose-Bifidobacterium (RB) agar, a new selective medium for bifidobacteria J. Microbiol. Methods. 27, 33-43.
4. Scardovi V. Crociani F. (1974) Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium angulatum: three new species and their deoxyribonucleic acid homology relationships. Int. J. Syst. Bacteriol. 24, 6-20.

Claims (10)

1. Cepas bacterianas pertenecientes al género Bifidobacterium depositadas en DSMZ el 21 de Julio de 2004 e identificadas con los siguientes códigos de identificación:
- Bifidobacterium adolescentis código DSM 16594;
- Bifidobacterium adolescentis código DSM 16595;
- Bifidobacterium breve código DSM 16596;
- Bifidobacterium pseudocatenulatum código DSM 16597;
- Bifidobacterium pseudocatenulatum código DSM 16598.
2. Formulaciones farmacéuticas, veterinarias y/o alimenticias que comprenden: la cepa bacteriana Bifidobacterium adolescentis DSM 16594, o la cepa bacteriana Bifidobacterium adolescentis DSM 16595, o la cepa bacteriana Bifidobacterium breve DSM 16596, o la cepa bacteriana Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 16597, o la cepa bacteriana Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 16598, o una mezcla de dos o más cepas seleccionadas a partir del grupo que comprende: DSM 16594, DSM 16595, DSM 16596, DSM 16597 y DSM 16598.
3. Formulaciones según la reivindicación 2, que además comprende una o varias cepas bacterianas probióticas con características complementarias, donde dichas cepas bacterianas probióticas se seleccionan a partir del grupo que comprende:
- Lactobacillus acidophilus LMG P-21381;
- Lactobacillus casei subesp. paracasei LMG P-21380;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21021;
- Lactobacillus pentosus LMG P-21019;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21020;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21022;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21023;
- Bifidobacterium lactis LMG P-21384;
- Streptococcus delbrueckii subesp. thermophilus DSM 16506;
- Streptococcus delbrueckii subesp. thermophilus DSM 16507;
- Bifidobacterium longum DSM 16603;
- Bifidobacterium breve DSM 16604;
- Lactobacillus casei subesp. rhamnosus DSM 16605.
4. Formulaciones según la reivindicación 2 o 3, que además comprende otras sustancias con características prebióticas, donde dichas sustancias con características prebióticas se seleccionan a partir del grupo que comprende: fructo-oligosacáridos (FOS), inulina, isomalto-oligosacáridos, almidón resistentes, pectina, galacto-oligosacáridos, arabinogalactana, xilo-oligosacáridos, glucomanana y quitosana oligosacáridos.
5. Formulaciones según las reivindicaciones de 2 a 4, que además comprenden aditivos, vehículos, excipientes, aromatizantes y estabilizadores, donde dichos aditivos se seleccionan a partir del grupo que comprende: aminoácidos, vitaminas, antioxidantes, enzimas, preferentemente glutamina, arginina, superóxido dismutasa y glutationa.
6. Formulaciones según las reivindicaciones de 2 a 5, donde la cepa DSM 16594, o la cepa DSM 16595, o la cepa DSM 16596, o la cepa DSM 16597, o la cepa DSM 16598, o una mezcla de las mismas están presentes en forma liofilizada.
7. Formulaciones según las reivindicaciones de 2 a 6, con forma de cápsulas, suspensiones o soluciones orales, polvo en sobrecitos, comprimidos, supositorios, comprimidos vaginales, supositorios y pesarios.
8. Formulaciones según las reivindicaciones de 2 a 7, que contienen desde 10^{5} hasta 10^{11} células de cada cepa bacteriana por dosis individual.
9. Uso de las cepas bacterianas según la reivindicación 1, para preparar formulaciones farmacéuticas para el tratamiento o prevención de problemas gastrointestinales donde es deseable la administración de ácido fólico.
10. Uso según la reivindicación 9, para la prevención de cáncer colorectal, o para la prevención y tratamiento de enfermedades inflamatorias del intestino, o para la prevención y tratamiento de infecciones vaginales y condiciones inflamatorias de la vagina, o para reconstituir y restablecer el equilibrio de la flora bacteriana intestinal no patógena, o como probióticos en productos alimenticios, o para la preparación de productos derivados de la leche o sus derivados, o en combinación con sustancias prebióticas, para la preparación de preparaciones alimenticias simbióticas.
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