CN101039687A - 产生叶酸的双岐杆菌菌株，及其制剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及产生叶酸的属于双岐杆菌属(Bifidobacterim)的菌株，含有它们的药物、兽医或食品制剂及其应用。特别是，本发明涉及新的人源菌株，属于青春双岐杆菌(Bifidobacterim adolescentis)(2)，短双岐杆菌(Bifidobacterim breve)(1)和假小链双岐杆菌(Bifidobacterim pseudocatenulatum)(2)，根据布达佩斯条约，于2004年7月21日保藏于DSMZ保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH；Braunsweig－德国)。

Description

产生叶酸的双岐杆菌菌株，及其制剂和应用

发明概述

本发明涉及属于双岐杆菌属(Bifidobacterim)的产生叶酸的菌株，含有它们的药物、兽医或食品制剂及其应用。

特别是，本发明涉及新的人源菌株，属于青春双岐杆菌(Bifidobacterim adolescentis)(2)，短双岐杆菌(Bifidobacterimbreve)(1)和假小链双岐杆菌(Bifidobacterimpseudocatenulatum)(2)，根据布达佩斯条约，于2004年7月21日保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ)(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH；Braunsweig-德国)。

上述菌株分别用以下标识码指代：

青春双岐杆菌，代码DSM 16594；

青春双岐杆菌，代码DSM 16595；

短双岐杆菌，代码DSM 16596；

假小链双岐杆菌，代码DSM 16597；

假小链双岐杆菌，代码DSM 16598。

技术领域

叶酸是一种从供体分子接受一个碳单位的重要水溶性维生素B。

由于该特性，在大量的基本细胞过程中叶酸起重要作用，包括，例如，甲基的生物合成以及核苷酸、维生素和几种氨基酸的合成。

在机体中，当叶酸的可用性增加时，DNA复制、修复和甲基化作用更为有效。

由于这一原因，增殖和周转率高的组织，如白细胞、红细胞和肠上皮细胞，需要大量叶酸，或者至少需要其良好、持续的可用性。

在人中，叶酸缺乏与癌症的危险增加相关：例如，流行病学研究显示了在低叶酸摄入的妇女中，绝经后发生乳腺肿瘤的危险较高。

相反，大量的叶酸可降低结肠直肠癌的危险。

尤其，叶酸(与它的盐，叶酸盐构成一起)对于构成经历持续的上皮更新过程的结肠直肠粘膜的细胞起着十分重要的作用。叶酸在预防结肠直肠癌中所起的作用见文献(参考文献1)。已经证实，特别是，负责甲基代谢的基因的多态性与结肠直肠癌的家族危险相关，这些基因的作用通过获得叶酸盐的可用性得到调节(参考文献2)。

因此，叶酸的局部可用性低或减少可以造成DNA低甲基化，从而有利于，例如，结肠癌的发生。

进而，由于叶酸有助于调整结肠和直肠的细胞增殖，大量叶酸的可用性被推荐于炎性肠病(IBD)患者。

因此，寻找一种使机体具有能够持续提供必需数量叶酸的天然、无毒的内生性来源的手段，并从而提供给予所述物质或其盐的常规系统性方法的替代方法非常重要。

遗憾的是，迄今没有找到满足该需要的解决方法。

众所周知，人结肠定居着多种与宿主活跃地相互作用的复杂而众多的微生物群落。

结肠中细菌的浓度大约为每克肠内容物10¹¹-10¹²个细菌。

存在至少400种细菌，但30-40种独自占总微生物区系的大约95-98％。

在这些主要的菌种中，属于双岐杆菌属的那些代表了存在于人体中的主要肠内微生物类群之一。

双岐杆菌属以其在体内的有益活性而著称。该活性转变为以下作用，例如：能够在抗生素治疗后补充肠内菌群，保持各种肠内微生物类群的平衡，降低血清胆固醇水平，产生维生素，减轻乳糖不耐受和免疫调节。

因而，属于双岐杆菌属的细菌被确认为益生菌，通常用于药物、兽医和/或食品领域。

根据定义，益生菌是活的微生物补充物，其活性有益于人或动物健康。

迄今，还不知道产生叶酸的益生菌株(已经记载了属于乳酸菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)的产生叶酸的细菌，但它们尚未被推荐为益生菌)。

特别是，还不知道可在完全缺乏叶酸的培养基中生长并大量产生叶酸的双岐杆菌属的益生菌。

发明内容

本申请人意想不到地发现了属于双岐杆菌属的人源益生菌株是叶酸的产生者。

例如，鉴定了属于以下种类的产生叶酸的菌株：长双岐杆菌(Bifidobacterium logum)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、青春双岐杆菌、双岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双岐杆菌、角双岐杆菌(Bifidobacterium angulatum)、链状双岐杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、假小链双岐杆菌、高卢双岐杆菌(Bifidobacterium gallicum)、齿双岐杆菌(Bifidobacteriumdentium)、寓齿双歧杆菌(Bifidobacterium denticolens)、奇异双歧杆菌(Bifidobacterium inopinatum)、动物双岐杆菌(Bifidobacterium animalis)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)。

在这些菌株中，青春双岐杆菌、短双岐杆菌和假小链双岐杆菌已经受到特别的关注，如下文和所附权利要求中的详细描述。

更具体地，在本发明的一个优选方面，如下文和所附权利要求中所描述，申请人分离出并于2004年7月21日在德意志微生物保藏中心(DSMZ)(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH；Braunsweig-德国)保藏了属于双岐杆菌属的五种新的人源菌株，这五种新菌株中的两种属于青春双岐杆菌，一种属于短双岐杆菌，两种属于假小链双岐杆菌。所述的菌株分别以下列标识码指代：

DSM 16594；

DSM 16595；

DSM 16596；

DSM 16597；

DSM 16598。

所述的菌株如下所述在分类上和工艺上进行了表征，并显示出产生大量的叶酸。事实上，所述的菌株能够在缺乏叶酸的培养基中生长。

特别地，所述的菌株能分别产生下列数量的叶酸：56-62、16-20、6-9、14-16和14-19ng/ml培养基。

此外，意想不到地观察到通过本发明的菌株生物合成叶酸不受对所得产物部分或任何其它已存在于培养基中的产物的负调节机制(负反馈)的影响。

换言之，在生理条件下，叶酸的产生保持恒定，不论它是否存在于环境中。

最后，还观察到结肠生态系统典型的pH的改变(pH值在大约7-5间的变化被认为可能与某些病理或饮食类型相关)不负面影响本发明菌株的生产力。

因而这类微生物能够将其已知的益生特性(对身体有益)与原位产生叶酸(例如在结肠中)的能力相结合。

因此，这些菌株意想不到地成为本发明的技术问题的所期望的解决方案，如上文所述。

事实上，所述的微生物代表了叶酸的理想、天然、无毒的内生性来源。

因而使用含有本发明的产生叶酸的双岐杆菌的合适制剂可以持续原位产生叶酸。

根据患者或使用者的需要，本发明的益生菌可以多种方式给予。

在优选的方面中，本发明的目的在于提供含有至少一种本发明的菌株或其混合物的药物、兽医和/或食品制剂。

特别优选的是含有菌株DSM 16594、DSM 16595、DSM 16596、DSM 16597和DSM 16598中的至少一种或其任意组合的制剂。

在另一个优选方面，本发明的菌株还能与其它具有互补特性，即不同的内在特性的益生菌株相组合制成制剂。

这种制剂的例子，不应当被视为限制性的，可以用至少一种本发明的菌株与具有强力粘附于肠粘膜性质的益生菌株的适当混合来代表。

本发明的菌株也可以与其它菌株相组合制成制剂，所述的其它菌株除了具有与它们所属的菌属相关的内在有益特性之外，还显示出其它的益于宿主健康的特殊性质。

所述的混合制剂能够在单一制剂中结合许多益生性质，从而，在单独给予时，给机体提供众多益处，以及由此产生的潜在的协同作用。

鉴于上述原因，本领域技术人员根据其自身经验，显然能够设计许多益生菌的组合。

因而，这些组合也落入本发明的范围之内。

作为例子，而非对本发明的范围进行限制，其中，所述的益生菌可选自乳杆菌属(Lactobacillus)，包括如保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillu caseisubsp.rhamnosus)、干酪乳杆菌类干酪亚种(Lactobacillus caseisubsp.Paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵性乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salivarius)和戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)这样的种，或者选自链球菌属(Streptococcus)，包括如嗜热链球菌(Streptococcus delbrueckiisubsp.Thermophilus)这样的种。

在这些细菌中，特别优选的菌株包括，例如以下：

-嗜酸乳杆菌LMG P-21381(于2002年1月31日保藏于比利时微生物协调保藏中心BCCM LMG Collection)；

-干酪乳杆菌类干酪亚种LMG P-21380(于2002年1月31日保藏于比利时微生物协调保藏中心BCCM LMG Collection)；

-植物乳杆菌LMG P-21021(于2002年10月16日保藏于比利时微生物协调保藏中心BCCM LMG Collection)；

-戊糖乳杆菌LMG P-21019(于2002年10月16日保藏于比利时微生物协调保藏中心BCCM LMG Collection)；

-植物乳杆菌LMG P-21020(于2002年10月16日保藏于比利时微生物协调保藏中心BCCM LMG Collection)；

-植物乳杆菌LMG P-21022(于2002年10月16日保藏于比利时微生物协调保藏中心BCCM LMG Collection)；

-植物乳杆菌LMG P-21023(于2002年10月16日保藏于比利时微生物协调保藏中心BCCM LMG Collection)；

-乳双歧杆菌LMG P-21384(于2002年1月31日保藏于比利时微生物协调保藏中心BCCM LMG Collection)；

-嗜热链球菌DSM 16506(于2004年6月18日保藏于DSMZ)；

-嗜热链球菌DSM 16507(于2004年6月18日保藏于DSMZ)；

-长双岐杆菌(Bifidobacterium longum)DSM 16603(于2004年7月20日保藏于DSMZ)；

-短双岐杆菌DSM 16604(于2004年7月20日保藏于DSMZ)；

-干酪乳杆菌鼠李糖亚种DSM 16605(于2004年7月20日保藏于DSMZ)。

因此，本发明特别优选的混合制剂将包括至少一种从DSM 16594到DSM 16598中的菌株或其混合物，与以上所列的益生菌株中的至少一种或其任意混合物相结合适当地组配。

优选地，所述的益生菌株选自：

-嗜酸乳杆菌LMG P-21381；

-干酪乳杆菌类干酪亚种LMG P-21380；

-植物乳杆菌LMG P-21021；

-戊糖乳杆菌LMG P-21019；

-植物乳杆菌LMG P-21020；

-植物乳杆菌LMG P-21022；

-植物乳杆菌LMG P-21023；

-乳双歧杆菌LMG P-21384；

-嗜热链球菌DSM 16506；

-嗜热链球菌DSM 16507；

-长双岐杆菌DSM 16603；

-短双岐杆菌DSM 16604；

-干酪乳杆菌鼠李糖亚种DSM 16605。

所述的混合制剂中待组合的菌株的数量和类型将由本领域技术人员根据所要治疗或预防的病变的种类和严重性、或希望得到的益生食品的类型而决定。

在另一个优选的方面，本发明的菌株，单独或与另外一种和/或与其它益生菌株组合，可以与具有益生元性质的其它物质相结合进一步进行组配。

优选地，所述的具有益生元性质的物质包括，特别是，不被人消化和吸收，从而能完整地到达结肠的碳水化合物，在结肠中它们选择性刺激大量有益微生物类群，特别是双岐杆菌的生长和活性。

在所述的益生碳水化合物中特别优选的是选自下列的那些：果糖低聚糖(FOS)、特别是菊粉、异麦芽低聚糖、抗性淀粉、果胶、低聚半乳糖(GOS)、阿拉伯半乳聚糖、低聚木糖(XOS)、低聚脱乙酰壳多糖(COS)和葡甘露聚糖。

作为例子，而非对本发明的范围进行限制，优选的制剂包括至少一种从DSM 16594到DSM 16598中的菌株或其任意混合物，与至少一种具有益生元性质的物质结合进行适当的组配，所述的物质选自，例如，上文所列举的那些，即，果糖低聚糖(FOS)、特别是菊粉、异麦芽低聚糖、抗性淀粉、果胶、低聚半乳糖(GOS)、阿拉伯半乳聚糖、低聚木糖(XOS)、低聚脱乙酰壳多糖(COS)和葡甘露聚糖。

同样本发明优选的制剂包括至少一种从DSM 16594到DSM 16598中的菌株或其任意混合物，与以上所列的益生菌株中的至少一种或其任意混合物，并且与至少一种具有益生元性质的物质相结合进行适当的组配，所述的物质选自，例如，上文所列的那些，即，果糖低聚糖(FOS)、特别是菊粉、异麦芽低聚糖、抗性淀粉、果胶、低聚半乳糖(GOS)、阿拉伯半乳聚糖、低聚木糖(XOS)、低聚脱乙酰壳多糖(COS)和葡甘露聚糖。

优选地，所述的菌株选自：

-嗜酸乳杆菌LMG P-21381；

-干酪乳杆菌类干酪亚种LMG P-21380；

-植物乳杆菌LMG P-21021；

-戊糖乳杆菌LMG P-21019；

-植物乳杆菌LMG P-21020；

-植物乳杆菌LMG P-21022；

-植物乳杆菌LMG P-21023；

-乳双歧杆菌LMG P-21384；

-嗜热链球菌DSM 16506；

-嗜热链球菌DSM 16507；

-长双岐杆菌DSM 16603；

-短双岐杆菌DSM 16604；

-干酪乳杆菌鼠李糖亚种DSM 16605。

本发明优选的实施方案包括那些其中本发明的菌株优选以冷冻干燥的形式使用的制剂。

优选将本发明的菌株与适当的载体、赋形剂、调味剂、稳定剂和添加剂，如通常用于药物和/或食品制剂的制备的氨基酸、维生素、抗氧化剂和酶相组合制成制剂。

仅仅作为例子，而非对本发明的范围进行限制，在特别优选的添加剂中可以提及的有谷氨酰胺、精氨酸、过氧化物歧化酶和谷胱甘肽。

本发明的制剂可以口服给予、以栓剂、或以阴道片剂或胶囊形式，按照原样或与食品，例如，乳、酸乳酪、乳衍生物或发酵乳制品一起给予，来治疗和/或预防需要给予足量叶酸的胃肠道疾病(腹泻、抗菌素治疗、IBD、预防结肠癌)。

如以上所指明的，本发明的制剂也可在抗生素治疗之后或期间给予，以补充和恢复非病原肠内菌群的平衡。

特别优选的制剂为口服给予，通过栓剂或阴道胶囊或阴道片剂的方式给予的制剂。

典型的剂型包括，例如，胶囊、口服液或混悬液、袋装粉或类似形式、片剂、栓剂和阴道栓剂。

关于剂量，每种制剂通常为每单次剂量含有10⁵-10¹¹个每种菌株的细胞，优选每剂含10⁶-10¹¹个细菌，最优选每剂含10⁷-10¹⁰个细菌。

通常，活性成分或活性成分的混合物的浓度范围为10⁸个菌株细胞每克制剂-10¹¹个细胞每g；优选10⁹个细胞每g-10¹⁰个细胞每g制剂。

本发明的潜在应用的一个实例，不以任何方式限制本发明的范围，是关于一个向正接受抗生素治疗的成人患者给予本发明的菌株的病例。

抗生素治疗的整个过程及其结束后5天，所述患者每天接受两袋与益生菌株DSM 16506和LMG P-21380以及与谷氨酰胺组合的DSM 16594和DSM 16595的冷冻干燥制剂。

每袋的内容物，以口服水混悬液的形式给予，含有大约10¹⁰个每种菌株的细胞和，如赋形剂、淀粉、吐温、分散剂桔调味剂(mandarinflavouring)、乙酰舒泛、糖精、抗坏血酸和对羟基苯甲酸甲酯。

本发明的菌株也表明了对增强食品的营养价值特别有用。

特别优选的食品是获自乳和/或其衍生物的食品，例如酸乳酪和发酵乳以及点心的馅、冰激凌等。

发明详述

-菌株的分离

菌株青春双岐杆菌DMS 16594分离自在隔离前3个月内未摄食抗生素或益生制剂的成年受试者的粪便。

10％新鲜粪便的混悬液在Wilkins-Chalgren厌氧肉汤培养基(Oxoid Limited，Basingstoke，Hampshire，England，UK)中，以0.5x的浓度制备，即，通过制备根据包装上的说明所获得的培养基的1∶1稀释液。

将匀浆(1∶10稀释液，通过在9ml相同培养基中稀释1ml先前的稀释液获得)连续稀释至10^-9。将介于10^-6-10^-9之间的稀释液的0.1ml等分部分在用于双岐杆菌的选择性培养基，RB琼脂中(参考文献3)铺板。

在37℃厌氧生活中温育平板48小时。

所有制剂的制备均在以下气体环境：N₂ 85％、CO₂ 10％、H₂ 5％的厌氧室中进行(设备：厌氧系统(Anaerobic System)，Mod.2028，FormaScientific Co.，Mariet ta，OH)。

由于培养基的酸化和指示剂的颜色变化，将相应于菌株DMS 16594的菌落从产生黄色晕圈的菌落中分离出来。

-归属于双岐杆菌属和青春双岐杆菌种

为将DMS 16594归属于双岐杆菌属，使用16S rDNA-定向引物Bif164/Bif662进行属特异性扩增，从中获得了523bp的校正的扩增子。同时进行生化分析来鉴别双岐杆菌碳水化合物代谢的关键酶，即果糖-6-磷酸磷酸转酮酶。

通过DNA-DNA杂交鉴别了青春种，见Scardovi等人的论文(参考文献4)。

-菌株DMS 16594的特征

来源：人

年龄：39  性别：女

属：双岐杆菌属

种：青春双岐杆菌

形态学：不规则杆菌，有时形态上分叉，有突起和隆突

产生叶酸：56-62ng/ml之间

质粒：无

其它菌株，DSM 16595、DSM 16596、DSM 16597和DSM 16598，采用与以上描述相似的方法分离。

-菌株DSM 16595的特征

来源：人

年龄：37  性别：女

属：双岐杆菌属

种：青春双岐杆菌

形态学：不规则杆菌，有时形态上分叉，有突起和隆突

产生叶酸：16-20ng/ml

质粒：无

-菌株DMS 16596的特征

来源：人

年龄：39  性别：女

属：双岐杆菌属

种：短双岐杆菌

形态学：短不规则杆菌。

产生叶酸：6-9ng/ml

质粒：无

-菌株DMS 16597的特征

来源：人

年龄：56  性别：男

属：双岐杆菌属

种：假小链双岐杆菌

形态学：不规则杆菌

产生叶酸：14-16ng/ml

质粒：有，大约9kb一个

-菌株DMS 16598的特征

来源：人

年龄：56  性别：男

属：双岐杆菌属

种：假小链双岐杆菌

形态学：不规则杆菌

产生叶酸：14-19ng/ml

质粒：有，大约9kb一个

-菌株生长条件

本发明优选的菌株，DSM 16594、DSM 16595、DSM 16596、DSM 16597和DSM 16598，保存在穿刺培养物，即琼脂穿刺培养物(含10ml 0.9％琼脂化培养基的10ml试管)中或保存在向其中加入了半胱氨酸(0.05％)的MRS液体培养物(细菌乳杆菌MRS肉汤培养基[0881-17]DifcoLaboratories，Division of Becton Dickinsons and Company，Sparks，Maryland 21152 USA)中。

根据包装上的说明制备培养基，在110℃灭菌30分钟。

当在没有叶酸的环境中培养该菌株时，使用所谓的基本合成培养基；它被标识为7号，具有下文所描述的组成。

在室温，搅动下按所示的顺序混合成分和溶液，制备所述的培养基。

每次制备新鲜的培养基。

7号基本培养基

葡萄糖                                   20g/L

维生素测定酪蛋白氨基酸

(DIFCO Laboratories，USA[0288-17]        5g/L

尿素                                     2g/L

半胱氨酸                                 0.5g/L

溶液A                                    700ml/L

溶液B                                    1ml/L

溶液C                                    1ml/L

溶液D                                    5ml/L

溶液A、B、C和D具有以下组成：

溶液A

(NH₄)₂SO₄                            10g

醋酸钠                                   10g

抗坏血酸                                 10g

KH₂PO₄                                1g

MgSO₄                                   0.7g

NaCl                                     0.2g

吐温80                                   1ml

将吐温80溶解于700ml煮沸的蒸馏水中，然后依次加入所有其它成分。

溶液B

硼酸                            25mg

CuSO₄                          2mg

KI                              5mg

FeCl₃                          10mg

MnSO₄                          20mg

钼酸钠                          10mg

ZnSO₄                          20mg

室温下将这些成分依次溶解于50ml蒸馏水中。

溶液C

生物素                          0.2mg

泛酸钙                          40mg

烟酸                            40mg

对氨苯甲酸                      20mg

维生素B6                        40mg

维生素B2                        20mg

维生素B1                        40mg

室温下将这些成分依次溶解于100ml蒸馏水中。

溶液D

FeSO₄                          50mg

将该盐溶解于25ml蒸馏水中。

将培养基分装于10ml试管并在100℃灭菌30分钟。

-菌株DSM 16594产生的叶酸的微生物学测定

由菌株DSM 16594以及由本发明的其它菌株发酵产生的叶酸的量通过微生物学测定来确定。

将用于测定叶酸产量的培养物至少3次移入不含叶酸的7号基本培养基中。

所述测定基于海氏肠球菌(Enterococcus hirae)ATCC 8043的生长的比浊测定，它根据存在于培养肉汤中的叶酸的量而变化。

定量测定所产生的叶酸所必需的校准曲线通过在细菌叶酸AOAC培养基(Difco，USA[0967-15])中培养海氏肠球菌ATCC 8043而建立。

向所述的含有除叶酸以外生长所必需的全部营养素的培养基中，加入递增量的叶酸(0、1、2、4、6和8ng每只含10ml培养肉汤的试管)。

同时，将海氏肠球菌ATCC 8043接种于含细菌叶酸AOAC培养基的试管中，向其中加入不同量的菌株DSM 16594的发酵肉汤上清夜。

将所有试管在37℃下温育16-18小时后，在600nm处对样品进行比浊读数，并通过根据样品的光密度对叶酸浓度的对数作图，以半对数标度绘制线图。

制备叶酸标准溶液(s.s.)浓度为2μg/l，即2ng/ml。

在大约30ml NaOH 0.01N和300ml H₂O中溶解50mg叶酸。用稀HCl(0.1N)校正pH至7.5，并通过加H₂O使体积达到500ml。将2ml上述溶液加入到50ml的H₂O中，校正pH至7.5并通过加H₂O使体积达到100ml(2μg/ml的s.s.)。

用H₂O将1ml该溶液稀释成1升，以获得2ng/ml(2μg/l)的s.s.。

准备含细菌叶酸培养基的试管

在100ml H₂O中溶解11g初始粉末。为使成分完全溶解，将培养基煮沸2-3分钟。用蒸馏水冲洗试管数次后，将5ml等分部分分装入试管中。加入发酵肉汤上清夜的不同等分部分或叶酸的s.s.(2ng/ml)，然后加入H₂O使每支试管的最终体积达到10ml。在121℃灭菌5分钟。

每支试管中叶酸的ng数	0	1	2	4	6	8	10
								s.s.(2ng/ml)的ml数	0	0.5	1	2	3	4	5
H2O的ml数	5	4.5	4	3	2	1	0
								每支试管中叶酸的μg数	0	0.1	0.2	0.4	0.6	0.8	1

经离心并用0.22μ滤器过滤，随后进行适当稀释，获得发酵肉汤上清夜，将4ml水和1ml所获得的发酵肉汤上清夜加入到另外两支试管中。

准备不含叶酸的试管作为空白样品，它不进行接种。

制备接种物

鉴定前两天，将海氏肠球菌ATCC 8043的新鲜穿刺培养物接种到含M17液体培养基(细菌M17肉汤，Difco Laboratories，USA[1856-17])的试管中。为制备将用作接种物的培养物，将M17中的培养物无菌离心，除去上清夜，用9ml生理溶液洗涤细胞3次。将细胞团块再次混悬于9ml生理溶液中，将1ml该细菌混悬液加入到含100ml灭菌生理溶液的锥形瓶中。将一滴该混悬液加入到含细菌叶酸AOAC培养基的试管中，并也将10ng叶酸加入其中，不摇动37℃下温育试管。

在试验当天，将根据上述方法制备的培养物用于制备试验接种物：将培养物无菌离心，除去上清夜，用9ml生理溶液洗涤细胞3次。将细胞再次混悬于9ml生理溶液中，将1ml该细菌混悬液加入到含100ml无菌生理溶液的锥形瓶中。为接种试验试管，向121℃下灭菌5分钟的所有试管中加入一滴该混悬液。

随后在37℃温育试管16-18小时。

-纯培养物中的生产力

菌株DSM 16594在7号基本培养基中所产生的叶酸量达56-62ng/ml。

当在缺乏pH控制的培养物上以及在具有恒定pH的生物反应器中的培养物上进行试验时，均产生稳定、可再现的结果。

通常，结肠中所含物质的pH值的变化可以很大，这与某些病理或饮食因素相关。不论所测得的pH值如何，在本案中变化范围为5.5-7.0，由DSM16594产生的叶酸都是恒定的(大约57-60ng/ml)。

还观察到菌株DSM 16594产生叶酸不受负反馈的影响，因此达到完全不依赖于肠内容物中存在的叶酸的浓度的程度。事实上，菌株DSM16594也在含有浓度递增的叶酸(0、1、2、5、10和20ng/ml)的7号基本培养基中进行了培养并且观察到该菌株总是合成和分泌恒量的叶酸(58-61ng/ml)，它们增添到培养基中已经存在的叶酸中。这方面非常重要，因为它提示，菌株DSM 16594在作为益生菌摄入后，可能在结肠内，持续供应叶酸，叶酸是肠细胞的快速更新代谢所必需的维生素。所产生的叶酸的量比保证不合成该维生素，因此必须从外部来源获得它以便充分生长的细菌健康生长所需的量大至少50倍，这一事实进一步证实了菌株DSM 16594的代谢失调，即缺乏在已经存在足量叶酸的情况下阻断叶酸的生物合成的控制机制。

-评价菌株DSM 16594在粪便培养物中提供叶酸的贡献

为评价菌株DSM 16594在混合培养物，即模拟肠内微生物群的组成的培养物中是否能有效产生叶酸，制备了粪便培养物，即用稀释的粪便样品接种的培养物，其可以接种了或未接种菌株DSM 16594；在所述的培养物中叶酸浓度的增加得到确定。

所采用的混合培养物用稀释的粪便样品接种，以便模拟肠内容物的正常微生物组成。所使用的培养基含10ng/ml叶酸，该量能确保整个接种的微生物群的生长。培养基还含有蛋白胨、维生素和作为碳源的果糖低聚糖(FOS)。

选择FOS是由于下列事实：益生双岐杆菌与该益生碳水化合物的组合摄入有利于该益生双岐杆菌和内源性双岐杆菌二者在肠内定居，所述益生碳水化合物既不被消化也不被吸收从而能够到达结肠，在那里它被双岐杆菌所代谢。

-粪便培养物

粪便培养物在根据先前所描述的方法而制备的培养基中培养，其具有以下成成：

Raftilose P95(FOS)

(Orafti Group，Tienen，比利时)                20g/L

维生素测定酪蛋白氨基酸

(DIFCO Laboratories，USA[0288-17]             5g/L

半胱氨酸                                      0.5g/L

叶酸                                          10μg/L

溶液A                                         700ml/L

溶液B                                         1ml/L

溶液C                                1ml/L

溶液D                                5ml/L

溶液E                                10ml/L

溶液A

(NH₄)₂SO₄                        10g

醋酸钠                               10g

抗坏血酸                             10g

KH₂PO₄                            1g

MgSO₄                               0.7g

NaCl                                 0.2g

吐温80                               1ml

将吐温80溶解于700ml煮沸的蒸馏水中，然后依次加入所有其它成分。

溶液B

硼酸                                 25mg

CuSO₄                               2mg

KI                                   5mg

FeCl₃                               10mg

MnSO₄                               20mg

钼酸钠                               10mg

ZnSO₄                               20mg

室温下将这些成分依次溶解于50ml蒸馏水中。

溶液C

生物素                               0.2mg

泛酸钙                               40mg

烟酸                                 40mg

对氨基苯甲酸                         20mg

维生素B6                             40mg

维生素B2                             20mg

维生素B1                        40mg

室温下将这些成分依次溶解于100ml蒸馏水中。

溶液D

FeSO₄                          50mg

室温下将该盐溶解于25ml蒸馏水中。

溶液E

将50mg/L氯高铁血红素( Sigma-Aldrich SRL，Via Gallarate， Milan，意大利[H5533])溶解于5ml NaOH 1M中，并加入蒸馏水使体积达1升。

方法

将40ml培养基的等分部分分装到有可穿孔橡皮盖的100cc瓶中。用针刺穿橡皮盖并将瓶置于沸水浴中。在100℃温育10分钟后，用第二根针刺穿盖，通过它在0.15巴的压力下将氮吹入瓶中10分钟。一旦完成吹气，就将两根针移除，将瓶在110℃灭菌30分钟。

制备接种物

将新鲜粪便样品转移到厌氧培养室(10％H₂、10％CO₂、80％N₂)中。

然后在上述培养基中制备10％混悬液，用直径为3mm的无菌玻璃珠进行匀化。

由该混悬液，在这些瓶中所含的相同培养基中制备1∶100稀释液。用注射器将0.4ml稀释液接种到两个含40ml培养基的无菌瓶中。

存在于用或未用菌株DSM 16594接种的粪便样品中的叶酸的比较

用稀释的粪便样品接种的两个相同样品中的一个用0.4ml在7号基本培养基中生长24小时而制得的菌株DSM 16594的培养物进行接种。将两个粪便培养物，一个用菌株DSM 16594接种而另一个没有接种，在37℃温育24小时。

这段时间过后，两个培养物的等分部分均以3500g离心10分钟，用0.4μm滤器过滤上清夜。相应稀释的上清液被用于叶酸的微生物学测定。

粪便培养物中的叶酸产量

未用菌株DSM 16594接种的粪便培养物中的叶酸浓度范围大约为30-70ng/ml。

用菌株DSM 16594接种的匹配培养物显示出叶酸浓度的显著增加。所述的增加范围为30-50ng/ml，是增加到上文所示的30-70ng/ml中的量。

后者的这一发现进一步证明了给予本发明的益生菌株DSM 16594，不论患者的健康情况如何，都能确保结肠内存在高水平的叶酸。

因此，可以有利于并且确保肠内菌群最佳平衡的重建和维持。

以上实验部分详细描述了本发明的特别优选的菌株之一，即菌株DSM 16594的使用。

在相同的实验条件下并使用相同量的试剂，也对另外四种本发明的优选菌株，即DSM 16595、DSM 16596、DSM 16597和DSM 16598中进行了相同的试验。

证明了这些菌株以与菌株DSM 16594相同的方式和相同的特性产生叶酸。

青春双岐杆菌DSM 16595、短双岐杆菌DSM 16596、假小链双岐杆菌DSM 16597和假小链双岐杆菌DSM 16598的生产力显示低于青春双岐杆菌DSM 16594。

特别是，DSM 16595产生大约30.5％、DSM 16596产生大约13％、DSM16597产生25.5％以及DSM 16598产生28％的由DSM 16594所产生的叶酸的量。

虽然如此，在这些情况下，所产生的叶酸量(分别为，DSM 16595产生大约16-20ng/ml；DSM 16596产生6-9ng/ml；DSM 16597产生14-16ng/ml；DSM 16598产生14-19ng/ml)也显著高于确保其它需要该维生素达到最佳生长的细菌的健康生长所需要的量(大约DSM 16595高出14-16倍；DSM 16596高出5-7倍；DSM 16597高出12-13倍；DSM 16598高出12-15倍)。

参考文献

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3.Hartemink R.，Kok BIFIDOBACTERIUMJ.Weenk G.H.，RomboutsF.M.(1996)Raffinose-Bifidobacterium(RB)agar，a new selectivemedium for bifidobacteria J.Microbiol.Methods. 27，33-43。

4.Scardovi V.Crociani F.(1974)Bifidobacteriumcatenulatum，Bifidobacterium dentium，Bifidobacteriumangulatum：three new species and their deoxyribonucleic acidhomology relationships.Int.J.Syst.Bacteriol. 24，6-20。

Claims (80)

1.作为叶酸产生者的属于双岐杆菌(Bifidobacterium)属的人源益生菌株。

2.根据权利要求1的菌株，属于以下种：长双岐杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、双岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双岐杆菌(Bifidobacteriumbreve)、角双岐杆菌(Bifidobacterium angulatum)、链状双岐杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)、假小链双岐杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、高卢双岐杆菌(Bifidobacterium gallicum)、齿双岐杆菌(Bifidobacterium dentium)、寓齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdenticolens)、奇异双歧杆菌(Bifidobacterium inopinatum)和动物双岐杆菌(Bifidobacterium animalis)。

3.根据权利要求1的菌株，属于青春双岐杆菌。

4.根据权利要求1的菌株，属于短双岐杆菌。

5.根据权利要求1的菌株，属于假小链双岐杆菌。

6.根据权利要求3的菌株，于2004年7月21日保藏于DSMZ，以标识码DSM 16594标识。

7.根据权利要求3的菌株，于2004年7月21日保藏于DSMZ，以标识码DSM 16595标识。

8.根据权利要求4的菌株，于2004年7月21日保藏于DSMZ，以标识码DSM 16596标识。

9.根据权利要求5的菌株，于2004年7月21日保藏于DSMZ，以标识码DSM 16597标识。

10.根据权利要求5的菌株，于2004年7月21日保藏于DSMZ，以标识码DSM 16598标识。

11.含有至少一种根据权利要求1所述的菌株的药物、兽医和/或食品制剂。

12.含有至少一种根据权利要求2所述的菌株的药物、兽医和/或食品制剂。

13.含有至少一种根据权利要求3所述的菌株的药物、兽医和/或食品制剂。

14.含有至少一种根据权利要求4所述的菌株的药物、兽医和/或食品制剂。

15.含有至少一种根据权利要求5所述的菌株的药物、兽医和/或食品制剂。

16.根据权利要求13所述的制剂，含有菌株青春双岐杆菌DSM16594。

17.根据权利要求13所述的制剂，含有菌株青春双岐杆菌DSM16595。

18.根据权利要求14所述的制剂，含有菌株短双岐杆菌DSM 16596。

19.根据权利要求15所述的制剂，含有菌株假小链双岐杆菌DSM16597。

20.根据权利要求15所述的制剂，含有菌株假小链双岐杆菌DSM16598。

21.根据权利要求11所述的制剂，含有两种或多种菌株的混合物，所述菌株选自：DSM 16594、DSM 16595、DSM 16596、DSM 16597和DSM 16598。

22.根据权利要求16所述的制剂，进一步包含一种或多种具有互补特性的益生菌株。

23.根据权利要求17所述的制剂，进一步包含具有互补特性的其它益生菌株。

24根据权利要求18所述的制剂，进一步包含具有互补特性的其它益生菌株。

25.根据权利要求19所述的制剂，进一步包含具有互补特性的其它益生菌株。

26.根据权利要求20所述的制剂，进一步包含具有互补特性的其它益生菌株。

27.根据权利要求21所述的制剂，进一步包含具有互补特性的其它益生菌株。

28.根据权利要求16所述的制剂，进一步包含具有益生元性质的其它物质。

29.根据权利要求17所述的制剂，进一步包含具有益生元性质的其它物质。

30.根据权利要求18所述的制剂，进一步包含具有益生元性质的其它物质。

31.根据权利要求19所述的制剂，进一步包含具有益生元性质的其它物质。

32.根据权利要求20所述的制剂，进一步包含具有益生元性质的其它物质。

33.根据权利要求21所述的制剂，进一步包含具有益生元性质的其它物质。

34.根据权利要求16所述的制剂，进一步包含一种或多种具有互补特性的益生菌株和具有益生元性质的其它物质。

35.根据权利要求17所述的制剂，进一步包含一种或多种具有互补特性的益生菌株和具有益生元性质的其它物质。

36.根据权利要求18所述的制剂，进一步包含一种或多种具有互补特性的益生菌株和具有益生元性质的其它物质。

37.根据权利要求19所述的制剂，进一步包含一种或多种具有互补特性的益生菌株和具有益生元性质的其它物质。

38.根据权利要求20所述的制剂，进一步包含一种或多种具有互补特性的益生菌株和具有益生元性质的其它物质。

39.根据权利要求21所述的制剂，进一步包含一种或多种具有互补特性的益生菌株和具有益生元性质的其它物质。

40.根据权利要求22-27任何一项所述的制剂，其中所述的益生菌菌株选自：

-嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus LMG P-21381)LMGP-21381；

-干酪乳杆菌类干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.paracaseiLMG P-21380)LMG P-21380；

-植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum LMG P-21021)LMG P-21021；

-戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus LMG P-21019)LMG P-21019；

-植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum LMG P-21020)LMG P-21020；

-植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum LMG P-21022)LMG P-21022；

-植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum LMG P-21023)LMG P-21023；

-乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis LMG P-21384)LMG P-21384；

-嗜热链球菌(Streptococcus delbrueckii subsp.thermophilusDSM 16506)DSM 16506；

-嗜热链球菌(Streptococcus delbrueckii subsp.thermophilusDSM 16507)DSM 16507；

-长双岐杆菌(Bifidobacterium longum DSM 16603)DSM 16603；

-短双岐杆菌(Bifidobacterium breve DSM 16604)DSM 16604；

-干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp.rhamnosusDSM 16605)DSM 16605。

41.根据权利要求28-33的任何一项所述的制剂，其中所述的具有益生元性质的物质选自：

果糖低聚糖(FOS)、菊粉、异麦芽低聚糖、抗性淀粉、果胶、低聚半乳糖、阿拉伯半乳聚糖、低聚木糖、葡甘露聚糖和低聚脱乙酰壳多糖。

42.根据权利要求16所述的制剂，进一步包括添加剂、载体、赋形剂、调味剂和稳定剂。

43.根据权利要求42所述的制剂，其中所述的添加剂选自：氨基酸、维生素、抗氧化剂、酶，优选谷氨酰胺、精氨酸、过氧化物歧化酶和谷胱甘肽。

44.根据权利要求17所述的制剂，进一步包括添加剂、载体、赋形剂、调味剂和稳定剂。

45.根据权利要求44所述的制剂，其中所述的添加剂选自：氨基酸、维生素、抗氧化剂、酶，优选谷氨酰胺、精氨酸、过氧化物歧化酶和谷胱甘肽。

46.根据权利要求18所述的制剂，进一步包括添加剂、载体、赋形剂、调味剂和稳定剂。

47.根据权利要求46所述的制剂，其中所述的添加剂选自：氨基酸、维生素、抗氧化剂、酶，优选谷氨酰胺、精氨酸、过氧化物歧化酶和谷胱甘肽。

48.根据权利要求19所述的制剂，进一步包括添加剂、载体、赋形剂、调味剂和稳定剂。

49.根据权利要求48所述的制剂，其中所述的添加剂选自：氨基酸、维生素、抗氧化剂、酶，优选谷氨酰胺、精氨酸、过氧化物歧化酶和谷胱甘肽。

50.根据权利要求20所述的制剂，进一步包括添加剂、载体、赋形剂、调味剂和稳定剂。

51.根据权利要求50所述的制剂，其中所述的添加剂选自：氨基酸、维生素、抗氧化剂、酶，优选谷氨酰胺、精氨酸、过氧化物歧化酶和谷胱甘肽。

52.根据权利要求21所述的制剂，进一步包括添加剂、载体、赋形剂、调味剂和稳定剂。

53.根据权利要求52所述的制剂，其中所述的添加剂选自：氨基酸、维生素、抗氧化剂、酶，优选谷氨酰胺、精氨酸、过氧化物歧化酶和谷胱甘肽。

54.根据权利要求16所述的制剂，其中菌株DSM 16594以冷冻干燥形式存在。

55.根据权利要求17所述的制剂，其中菌株DSM 16595以冷冻干燥形式存在。

56.根据权利要求18所述的制剂，其中菌株DSM 16596以冷冻干燥形式存在。

57.根据权利要求19所述的制剂，其中菌株DSM 16597以冷冻干燥形式存在。

58.根据权利要求20所述的制剂，其中菌株DSM 16598以冷冻干燥形式存在。

59.根据权利要求21所述的制剂，其中所述的菌株的混合物以冷冻干燥形式存在。

60.根据权利要求16所述的制剂，其形式为胶囊、口服溶液或混悬液、袋装粉、片剂、栓剂、阴道片剂和阴道栓剂。

61.根据权利要求17所述的制剂，其形式为胶囊、口服溶液或混悬液、袋装粉、片剂、栓剂、阴道片剂和阴道栓剂。

62.根据权利要求18所述的制剂，其形式为胶囊、口服溶液或混悬液、袋装粉、片剂、栓剂、阴道片剂和阴道栓剂。

63.根据权利要求19所述的制剂，其形式为胶囊、口服溶液或混悬液、袋装粉、片剂、栓剂、阴道片剂和阴道栓剂。

64.根据权利要求20所述的制剂，其形式为胶囊、口服溶液或混悬液、袋装粉、片剂、栓剂、阴道片剂和阴道栓剂。

65.根据权利要求21所述的制剂，其形式为胶囊、口服溶液或混悬液、袋装粉、片剂、栓剂、阴道片剂和阴道栓剂。

66.根据权利要求16所述的制剂，每单次剂量含有10⁵-10¹¹个每种菌株的细胞。

67.根据权利要求17所述的制剂，每单次剂量含有10⁵-10¹¹个每种菌株的细胞。

68.根据权利要求18所述的制剂，每单次剂量含有10⁵-10¹¹个每种菌株的细胞。

69.根据权利要求19所述的制剂，每单次剂量含有10⁵-10¹¹个每种菌株的细胞。

70.根据权利要求20所述的制剂，每单次剂量含有10⁵-10¹¹个每种菌株的细胞。

71.根据权利要求21所述的制剂，每单次剂量含有10⁵-10¹¹个每种菌株的细胞。

72.根据权利要求1所述的菌株在制备用于治疗或预防需要给予叶酸的胃肠道疾病的药物中的应用。

73.根据权利要求72所述的应用，用于预防结肠直肠癌。

74.根据权利要求72所述的应用，用于预防和治疗IBD。

75.根据权利要求72所述的应用，用于预防和治疗阴道感染和阴道内炎症。

76.根据权利要求72所述的应用，用于补充和恢复非病原肠内菌群的平衡。

77.根据权利要求1所述的菌株作为益生菌在食品中的应用。

78.根据权利要求77所述的应用，用于制备获自乳或其衍生物的产品的制备。

79.根据权利要求78所述的应用，与益生物质相组合。

80.根据权利要求1所述菌株的应用，与益生物质相组合，用于制备共生食品制剂。