JP4709838B2 - 葉酸産生ビフィドバクテリウム菌株、製剤およびこれらの用途 - Google Patents
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Description
ビフィドバクテリウム アドレッセンティス(Bifidobacterium adolescentis)種、コードDSM 16594;
ビフィドバクテリウム アドレッセンティス(Bifidobacterium adolescentis)種、コードDSM 16595;
ビフィドバクテリウム ブレーベ(Bifidobacterium breve)種、コードDSM 16596;
ビフィドバクテリウム シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)種、コードDSM 16597;
ビフィドバクテリウム シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)種、コードDSM 16598。
ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム インファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム アドレッセンティス(Bifidobacterium adolescentis)、ビフィドバクテリウム ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム ブレーベ(Bifidobacterium breve)、ビフィドバクテリウム アンギュレイタム(Bifidobacterium angulatum)、ビフィドバクテリウム カテニュレイタム(Bifidobacterium catenulatum)、ビフィドバクテリウム シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム ガリカム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム デンティウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム デンティコレンス(Bifidobacterium denticolens)、ビフィドバクテリウム イノピナータム(Bifidobacterium inopinatum)、ビフィドバクテリウム アニマリス(Bifidobacterium animalis)、ビフィドバクテリウム ラクチス(Bifidobacterium lactis)。
ラクトバシラス カゼイ サブスピーシーズ パラカゼイ(Lactobacillus casei subsp. paracasei)LMG P-21380(ベルギー微生物保存機関に2002年1月31日に寄託);
ラクトバシラス プランタラム(Lactobacillus plantarum)LMG P-21021(ベルギー微生物保存機関に2002年10月16日に寄託);
ラクトバシラス ペントーサス(Lactobacillus pentosus)LMG P-21019(ベルギー微生物保存機関に2002年10月16日に寄託);
ラクトバシラス プランタラム(Lactobacillus plantarum)LMG P-21020(ベルギー微生物保存機関に2002年10月16日に寄託);
ラクトバシラス プランタラム(Lactobacillus plantarum)LMG P-21022(ベルギー微生物保存機関に2002年10月16日に寄託);
ラクトバシラス プランタラム(Lactobacillus plantarum)LMG P-21023(ベルギー微生物保存機関に2002年10月16日に寄託);
ビフィドバクテリウム ラクチス(Bifidobacterium lactis)LMG P-21384 (ベルギー微生物保存機関に2002年1月31日に寄託);
ストレプトコッカス デルブルウェスキー サブスピーシーズ サーモフィラス(Streptococcus delbrueckii subsp. thermophilus)DSM 16506(DSMZに2004年6月18日に寄託);
ストレプトコッカス デルブルウェスキー サブスピーシーズ サーモフィラス(Streptococcus delbrueckii subsp. thermophilus)DSM 16507(DSMZに2004年6月18日に寄託);
ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)DSM 16603(DSMZに2004年7月20日に寄託);
ビフィドバクテリウム ブレーベ(Bifidobacterium breve)DSM 16604(DSMZに2004年7月20日に寄託);
ラクトバシラス カゼイ サブスピーシーズ ラムノサス(Lactobacillus casei subsp. rhamnosus)DSM 16605(DSMZに2004年7月20日に寄託)。
ラクトバシラス アシドフィラスLMG P-21381;
ラクトバシラス カゼイ サブスピーシーズ パラカゼイLMG P-21380;
ラクトバシラス プランタラムLMG P-21021;
ラクトバシラス ペントーサスLMG P-21019;
ラクトバシラス プランタラムLMG P-21020;
ラクトバシラス プランタラムLMG P-21022;
ラクトバシラス プランタラムLMG P-21023;
ビフィドバクテリウム ラクチスLMG P-21384;
ストレプトコッカス デルブルウェスキー サブスピーシーズ サーモフィラスDSM 16506;
ストレプトコッカス デルブルウェスキー サブスピーシーズ サーモフィラスDSM 16507;
ビフィドバクテリウム ロンガムDSM 16603;
ビフィドバクテリウム ブレーベDSM 16604;
ラクトバシラス カゼイ サブスピーシーズ ラムノサスDSM 16605
を含む群から選ばれる。
ラクトバシラス アシドフィラスLMG P-21381;
ラクトバシラス カゼイ サブスピーシーズ パラカゼイLMG P-21380;
ラクトバシラス プランタラムLMG P-21021;
ラクトバシラス ペントーサスLMG P-21019;
ラクトバシラス プランタラムLMG P-21020;
ラクトバシラス プランタラムLMG P-21022;
ラクトバシラス プランタラムLMG P-21023;
ビフィドバクテリウム ラクチスLMG P-21384;
ストレプトコッカス デルブルウェスキー サブスピーシーズ サーモフィラスDSM 16506;
ストレプトコッカス デルブルウェスキー サブスピーシーズ サーモフィラスDSM 16507;
ビフィドバクテリウム ロンガムDSM 16603;
ビフィドバクテリウム ブレーベDSM 16604;
ラクトバシラス カゼイ サブスピーシーズ ラムノサスDSM 16605
を含む群から選ばれる。
ビフィドバクテリウム アドレッセンティスDMS 16594菌株を、単離に先立ち3ヶ月間、抗生物質およびプロバイオティクス製剤を摂取していない成人被験者の糞便から単離した。
DMS 16594のビフィドバクテリウム属への帰属を目的として、属に特異的な増幅を、16S rDNA標的プライマーであるBif164/Bif662を使用して行い、523bpの修復された単位複製配列を得た。並行して、生化学分析を行い、ビフィドバクテリウム属の糖質代謝の主要酵素である、フルクトース−6−リン酸ホスホケトラーゼを同定した。
由来:ヒト
年齢:39 性別:女
属:ビフィドバクテリウム
種:アドレッセンティス
形態:不規則な棒状、時おり二裂の形をとり、隆起とこぶを有する
葉酸産生:56〜62ng/ml
プラスミド:なし
他の菌株、DSM 16595、DSM 16596、DSM 16597およびDSM 16598を、上述したのと同様の手順で単離した。
由来:ヒト
年齢:37 性別:女
属:ビフィドバクテリウム
種:アドレッセンティス
形態:不規則な棒状、時おり二裂の形をとり、隆起とこぶを有する
葉酸産生:16〜20ng/ml
プラスミド:なし
<DMS 16596菌株の特性>
由来:ヒト
年齢:39 性別:女
属:ビフィドバクテリウム
種:ブレーベ
形態:短く不規則な棒状
葉酸産生:6〜9ng/ml
プラスミド:なし
<DMS 16597菌株の特性>
由来:ヒト
年齢:56 性別:男
属:ビフィドバクテリウム
種:シュードカテニュレイタム
形態:不規則な棒状
葉酸産生:14〜16ng/ml
プラスミド:あり、約9kbのもの1つ
<DMS 16598菌株の特性>
由来:ヒト
年齢:56 性別:男
属:ビフィドバクテリウム
種:シュードカテニュレイタム
形態:不規則な棒状
葉酸産生:14〜19ng/ml
プラスミド:あり、約9kbのもの1つ
<菌株の生育条件>
本発明の好ましい菌株である、DSM 16594、DSM 16595、DSM 16596、DSM 16597およびDSM 16598を、高層培地中、すなわち、寒天高層培地(0.9%寒天培地10mlを含む10mlチューブ)中で、あるいはMRS培養液(Bacto Lactobacilli MRS Broth [0881-17]、Difco Laboratories, Division of Becton Dickinsons and Company, Sparks, Maryland 21152 USA)にシステイン0.05%を加えたものの中で保存した。
グルコース 20 g/L
Vitamin Assay Casaminoacids
(DIFCO Laboratories, USA [0288-17]) 5 g/L
尿素 2 g/L
システイン 0.5 g/L
溶液A 700 ml/L
溶液B 1 ml/L
溶液C 1 ml/L
溶液D 5 ml/L
溶液A、B、CおよびDは以下の組成を有する:
溶液A
(NH4)2SO4 10 g
酢酸ナトリウム 10 g
アスコルビン酸 10 g
KH2PO4 1 g
MgSO4 0.7 g
NaCl 0.2 g
Tween 80 1 ml
Tween 80を沸騰させた蒸留水700mlに溶かし、その後、他のすべての成分を順に加える。
ホウ酸 25 mg
CuSO4 2 mg
KI 5 mg
FeCl3 10 mg
MnSO4 20 mg
モリブデン酸ナトリウム 10 mg
ZnSO4 20 mg
これらの成分を順に、室温で蒸留水50mlに溶かす。
ビオチン 0.2 mg
パントテン酸カルシウム 40 mg
ナイアシン 40 mg
P-アミノ安息香酸 20 mg
ピリドキシン 40 mg
リボフラビン 20 mg
チアミン 40 mg
これらの成分を順に、室温で蒸留水100mlに溶かす。
FeSO4 50 mg
該塩を蒸留水25mlに溶かす。
DSM 16594菌株および本発明の他の菌株による発酵で産生された葉酸量を、微生物学的アッセイにより定量した。
0.01NのNaOH約30mlと水300mlとの中に50mgの葉酸を溶かす。希塩酸(0.1N)を使用して、pHを7.5に合わせ、容積が500mlになるまで水を加える。上述した溶液2mlを水50mlに加え、pHを7.5に合わせ、容積が100mlになるまで水を加える(2μg/mlのs.s.)。
starting powder 11gを水100mlに溶かす。成分を完全に溶かすために、2〜3分間培地を沸騰させる。チューブを蒸留水で数回すすいだ後、チューブ内に5mlを分注する。チューブごとに異なる量の発酵ブロスの上清もしくは葉酸標準溶液(s.s.、2ng/ml)を加え、その後、各チューブの最終容積が10mlになるまで水を加える。121℃で5分間殺菌する。
アッセイの2日前に、エンテロコッカス ヒラエATCC 8043の新鮮な高層培養物を、M17 液体培地(Bacto M17 Broth、Difco Laboratories、USA [1856-17])を含むチューブ内に植菌する。
DSM 16594菌株によって、最少培地No.7中で産生された葉酸は56〜62ng/mlに達する。
混合培養物中、すなわち、腸内マイクロフローラの組成をシミュレートした培養物中のDSM 16594菌株による葉酸の効果的な産生の有無を評価するために、DSM 16594菌株を植菌した/植菌しなかった糞便培養物、すなわち、希釈した糞便サンプルを調製し、該培養物中における、葉酸濃度の増加を測定した。
以下の組成を有し、既述した手順により調製した培地中で、糞便培養物を用意した:
Raftilose P95 (FOS)
(Orafti Group、Tienen、Belgium) 20 g/L
Vitamin Assay Casaminoacids
(DIFCO Laboratories、USA [0288-17]) 5 g/L
システイン 0.5 g/L
葉酸 10 μg/L
溶液A 700 ml/L
溶液B 1 ml/L
溶液C 1 ml/L
溶液D 5 ml/L
溶液E 10 ml/L
溶液A
(NH4)2SO4 10 g
酢酸ナトリウム 10 g
アスコルビン酸 10 g
KH2PO4 1 g
MgSO4 0.7 g
NaCl 0.2 g
Tween 80 1 ml
Tween 80を、沸騰した蒸留水700mlで溶解後、他のすべての成分を順に加える。
ホウ酸 25 mg
CuSO4 2 mg
KI 5 mg
FeCl3 10 mg
MnSO4 20 mg
モリブデン酸ナトリウム 10 mg
ZnSO4 20 mg
これらの成分を、室温で順に蒸留水50mlに溶かす。
ビオチン 0.2 mg
パントテン酸カルシウム 40 mg
ナイアシン 40 mg
P-アミノ安息香酸 20 mg
ピリドキシン 40 mg
リボフラビン 20 mg
チアミン 40 mg
これらの成分を、室温で順に蒸留水100mlに溶かす。
FeSO4 50 mg
該塩を室温で蒸留水25mlに溶かす。
50 mg/Lのヘミン(Sigma-Aldrich SRL、Via Gallarate、Milan、Italy [H5533])を1MのNaOH 5mlに溶かし、容積が1リットルになるまで蒸留水を加える。
培地のアリコート40mlを、穴の開けられるゴム製キャップ付の100ccボトル内に分注する。ゴム製キャップに針で穴を開け、ボトルを沸騰させたウォーターバス内に静置する。100℃で10分間インキュベートした後、キャップに第2の針を刺して穴を開け、そこから窒素を0.15barsの圧力で10分間ボトル内に吹き込む。吹込みが完了したら、両方の針を除去し、ボトルを110℃で30分間殺菌する。
新鮮な糞便サンプルを、嫌気チャンバー内に移す(10% H2、10% CO2、80% N2)。その後、上述した培地で10%懸濁液を調製し、直径3mmの無菌ガラスビーズとともにホモジナイズする。
希釈した糞便サンプルを添加した2つの同一サンプルのうちの1つに、最少培地No.7で24時間生育したDSM 16594菌株の培養物0.4mlを植菌する。DSM 16594菌株を植菌した糞便培養物と植菌していない糞便培養物を37℃で24時間培養する。
DSM 16594菌株を植菌していない糞便培養物中の葉酸濃度の範囲は、約30〜70ng/mlである。
1. フーチス・シー・エス(Fuchs C.S.)他、「葉酸塩およびマルチビタミンの使用による女性の結腸癌の家族性リスクへの影響(The influence of folate and multivitamin use on the familial risk of colon cancer in women.)」、キャンサー・エピデミオロジー・バイオマーカーズ・アンド・プリベンション(Cancer Epidemiol. Biomark. Prev.)2002年、11、P.227〜234
2. マ・ジェイ(Ma J.)他、「メチオニンシンターゼ遺伝子多型:血漿液中の葉酸塩、ビタミンB12、ホモシステインと結腸直腸癌リスクの関連性(A polymorphism of the methionine synthase gene: association with plasma folate, vitamin B12, homocyst(e)ine, and colorectal cancer risk.)」、キャンサー・エピデミオロジー・バイオマーカーズ・アンド・プリベンション(Cancer Epidemiol. Biomark. Prev.)、1999年、8、P.825〜829
3. ハーテミンク・アール、コク ビフィドバクテリウムジェイ・ウィーク・ジー・エイチ、ロンバウツ・エフ・エム(Hartemink R., Kok BIFIDOBACTERIUMJ. Weenk G.H., Rombouts F.M.)、「ビフィドバクテリウム属の新規選択培地、ラフィノース-ビフィドバクテリウム寒天(Raffinose-Bifidobacterium (RB) agar, a new selective medium for bifidobacteria)」、ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジカル・メソッド(J. Microbiol. Methods.)、1996年、27、P.33〜43
4. スカドヴィ・ブイ、クロシアニ・エフ(Scardovi V. Crociani F.)、「ビフィドバクテリウム カテニュレイタム、ビフィドバクテリウム デンティウム、ビフィドバクテリウム アンギュレイタム:三新種およびそれらのデオキシリボ核酸ホモロジー相関(Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium angulatum: three new species and their deoxyribonucleic acid homology relationships.)」、インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Int. J. Syst. Bacteriol.)、1974年、24、P.6〜20
Claims (10)
- 2004年7月21日にDSMZに寄託され、かつ識別コードDSM 16594で特定されるビフィドバクテリウム アドレッセンティス(Bifidobacterium adolescentis)、
2004年7月21日にDSMZに寄託され、かつ識別コードDSM 16595で特定されるビフィドバクテリウム アドレッセンティス(Bifidobacterium adolescentis)、
2004年7月21日にDSMZに寄託され、かつ識別コードDSM 16596で特定されるビフィドバクテリウム ブレーベ (Bifidobacterium breve)、
2004年7月21日にDSMZに寄託され、かつ識別コードDSM 16597で特定されるビフィドバクテリウム シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、
2004年7月21日にDSMZに寄託され、かつ識別コードDSM 16598で特定されるビフィドバクテリウム シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)を含む群から選ばれる、
ビフィドバクテリウム アドレッセンティス(Bifidobacterium adolescentis)、またはビフィドバクテリウム ブレーベ(Bifidobacterium breve)、またはビフィドバクテリウム シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)種に属する、ヒト由来のプロバイオティクス細菌株。 - 請求項1に記載の菌株を1以上含んでなる、医薬品製剤、動物用製剤および/または食物製剤。
- ビフィドバクテリウム アドレッセンティス(Bifidobacterium adolescentis)DSM 16594菌株、ビフィドバクテリウム アドレッセンティス(Bifidobacterium adolescentis)DSM 16595菌株、ビフィドバクテリウム ブレーベ(Bifidobacterium breve)DSM 16596菌株、ビフィドバクテリウム シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)DSM 16597菌株、ビフィドバクテリウム シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)DSM 16598菌株、またはDSM 16594、DSM 16595、DSM 16596、DSM 16597およびDSM 16598を含む群から選ばれる2以上の菌株の混合物、を含んでなる請求項2に記載の製剤。
- さらに、相補的な特性を有する1以上のプロバイオティクス菌株を含んでなり、
該プロバイオティクス菌株が、
ラクトバシラス アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)LMG P-21381、ラクトバシラス カゼイ サブスピーシーズ パラカゼイ(Lactobacillus casei subsp. paracasei)LMG P-21380、ラクトバシラス プランタラム(Lactobacillus plantarum)LMG P-21021、ラクトバシラス ペントーサス(Lactobacillus pentosus)LMG P-21019、ラクトバシラス プランタラム(Lactobacillus plantarum)LMG P-21020、ラクトバシラス プランタラム(Lactobacillus plantarum)LMG P-21022、ラクトバシラス プランタラム(Lactobacillus plantarum)LMG P-21023、ビフィドバクテリウム ラクチス(Bifidobacterium lactis)LMG P-21384、ストレプトコッカス デルブルウェスキー サブスピーシーズ サーモフィラス(Streptococcus delbrueckii subsp. thermophilus)DSM 16506、ストレプトコッカス デルブルウェスキー サブスピーシーズ サーモフィラス(Streptococcus delbrueckii subsp. thermophilus)DSM 16507、ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)DSM 16603、ビフィドバクテリウム ブレーベ(Bifidobacterium breve)DSM 16604、ラクトバシラス カゼイ サブスピーシーズ ラムノサス(Lactobacillus casei subsp. rhamnosus)DSM 16605を含む群から選ばれることを特徴とする、請求項3に記載の製剤。 - さらに、プレバイオティクス特性を有する他の物質を含んでなり、
該プレバイオティクス特性を有する物質が、フラクトオリゴ糖(FOS)、イヌリン、イソマルトオリゴ糖、レジスタントスターチ、ペクチン、ガラクトオリゴ糖、アラビノガラクタン、キシロオリゴ糖、グルコマンナンおよびキトサンオリゴ糖を含む群から選ばれることを特徴とする、請求項3に記載の製剤。 - さらに、プレバイオティクス特性を有する他の物質を含んでなり、
該プレバイオティクス特性を有する物質が、フラクトオリゴ糖(FOS)、イヌリン、イソマルトオリゴ糖、レジスタントスターチ、ペクチン、ガラクトオリゴ糖、アラビノガラクタン、キシロオリゴ糖、グルコマンナンおよびキトサンオリゴ糖を含む群から選ばれることを特徴とする、請求項4に記載の製剤。 - さらに、添加剤、媒体、賦形剤、着香料を含んでなり、
該添加剤が、アミノ酸、ビタミン、酸化防止剤、酵素、グルタミン、アルギニン、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンを含む群から選ばれることを特徴とする、請求項3に記載の製剤。 - DSM 16594菌株、DSM 16595菌株、DSM 16596菌株、DSM 16597菌株、DSM 16598菌株、またはこれらの混合物が、凍結乾燥の形態で含まれていることを特徴とする、請求項3に記載の製剤。
- 一用量あたり105〜1011cellsの各菌株を含んでいる、請求項3に記載の製剤。
- カプセル、経口液剤または懸濁液、袋入り粉体、錠剤、坐薬、膣錠、ペッサリーの形態である、請求項3に記載の製剤。
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