JP6885727B2

JP6885727B2 - 組成物

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Publication number: JP6885727B2
Application number: JP2016551079A
Authority: JP
Inventors: オハラ，スティーブン，パトリック
Original assignee: オプティバイオティクスリミテッド
Priority date: 2013-11-05
Filing date: 2014-11-05
Publication date: 2021-06-16
Anticipated expiration: 2034-11-05
Also published as: CA2929681C; JP2016537409A; WO2015067948A1; AU2014345343B2; JP2019189620A; US20160271191A1; ES2760256T3; AU2018241190A1; CA2929681A1; AU2014345343A1; EP3065571B1; EP3065571A1; GB201319538D0

Description

本発明は、コレステロールレベルの管理に有用な、プロバイオティクスおよびプレバイオティクス組成物に関する。

プロバイオティクスは、宿主に健康上の利益を付与する細菌である。典型的に、腸内に天然に存在する細菌集団を補給するために、プロバイオティクス細菌株の培養物が個体によって消費され、または個体に投与される。数例を挙げると、がん、下痢症および過敏性腸症候群の発生の低減を含むいくつかの健康上の利益が、プロバイオティクスに関連するとされている。プロバイオティクスは、いくつかの生理的状態を管理する一助になる潜在可能性があり、摂取された脂質などのある特定の物質の吸収を低減するように作用する。また予備研究では、プロバイオティクスが、コレステロールの血清レベルおよび血圧の低下に有用であり、糖尿病をモジュレートし、体重を低減する一助になり得ることが示されている。

乳酸桿菌（Lactobacilli）は、乳製品に共通のプロバイオティクスであり、現在販売されているプロバイオティクスのおよそ７５％を構成している。しかし、腸内で有用となるのに、乳酸桿菌用量の２％しか生存しないと推定されている。

プレバイオティクスは、乳酸桿菌またはビフィドバクテリウム属などの有益な常在性腸内微生物叢を選択的に増強することができる食事性成分であり、食品部門への適用がかなり増大することが見出されている。プレバイオティクスは、非消化性食品成分であり、大腸細菌によって選択的に代謝され、それによって健康の改善に寄与する。したがってプレバイオティクスを使用すると、常在性腸微生物の環境内の有益な変化を促進することができ、したがってプロバイオティクスの生存を助けることができる。プレバイオティクスは、腸内で選択的に代謝されないペクチン、セルロース、キシランなどのほとんどの食物繊維とは明確に異なる。プレバイオティクスとしての分類基準は、胃酸性度、哺乳動物の酵素による加水分解および胃腸管による吸収に抵抗しなければならないこと、腸管ミクロフローラによって発酵されること、ならびに健康および良好な状態と関連する腸管細菌の増殖および／または活性を選択的に刺激することである。

フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ、イヌリンおよびオリゴフルクトース）およびガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、プレバイオティクス分類基準を満たすことがヒト介入研究で繰り返し実証されている。現在、乳酸桿菌のためのプレバイオティクスは、存在していない。

本発明の一目的は、個体のコレステロール吸収の改変に使用するのに適していると思われる、乳酸桿菌プロバイオティクスと、乳酸桿菌のための特定のプレバイオティクスの組合せを提供することである。またプロバイオティクス組成物が、心疾患、糖尿病または肥満などの他の生理的状態を処置するために使用できることは、やはり有益となるはずである。

本開示は、以下の［１］から［２５］を含む。
［１］高い胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を有する乳酸桿菌の１つまたは複数の株、およびコレステロール改変剤を含む、組成物。
［２］高い胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を有する乳酸桿菌の１つまたは複数の株、およびコレステロール改変剤を含む、個体のコレステロール吸収の改変に使用するための、組成物。
［３］高い胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を有する乳酸桿菌の１つまたは複数の株、およびコレステロール改変剤を含む、高コレステロール、心疾患、糖尿病または肥満の処置に使用するための、組成物。
［４］上記１つまたは複数の株が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、およびラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）（ＡＴＣＣ４３１２１）またはそれらの変異株から選択される少なくとも１つの株を含む、上記［１］から［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］上記コレステロール改変剤が、オリゴ糖を含む、上記［１］から［４］のいずれかに記載の組成物。
［６］上記オリゴ糖が、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−およびβ−グルコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、またはβ−キシロシダーゼの１つまたは複数から選択される、上記［５］に記載の組成物。
［７］上記細菌株が、逆酵素反応によって上記オリゴ糖を生成することができる、上記［５］または［６］に記載の組成物。
［８］上記コレステロール改変剤が、乳酸桿菌の上記１つまたは複数の株のための選択的増殖培地を含む、上記［１］から［７］のいずれかに記載の組成物。
［９］上記１つまたは複数の株が、１０ ^５ｃｆｕ／ｇ〜１０ ^１２ｃｆｕ／ｇの範囲の量で存在する、上記［１］から［８］のいずれかに記載の組成物。
［１０］被包されている、上記［１］から［９］のいずれかに記載の組成物。
［１１］食料品の形態である、上記［１］から［１０］のいずれかに記載の組成物。
［１２］栄養補助食品として使用するための、上記［１］から［１１］のいずれかに記載の組成物。
［１３］ビタミン、ミネラル、植物性化学物質、抗酸化剤、およびそれらの組合せから選択される１つまたは複数の活性成分をさらに含む、上記［１］から［１２］のいずれかに記載の組成物。
［１４］上記コレステロール改変剤がプレバイオティクスを含む場合、プレバイオティクスまたは二次プレバイオティクスをさらに含む、上記［１］から［１３］のいずれかに記載の組成物。
［１５］高い胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を有する乳酸桿菌の１つまたは複数の株を、生物学的に有効な量のコレステロール改変剤と混合するステップを含む、上記［１］から［１４の組成物を生産する方法。
［１６］有効量のラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）およびラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも１つ、ならびにコレステロール改変剤を投与することによって、高コレステロール血清レベル、心疾患、糖尿病または肥満を有する個体を処置する、方法。
［１７］上記１つまたは複数の株が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）およびラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１またはそれらの変異株から選択される２つまたはそれを超える株を含む、上記［１５］に記載の方法。
［１８］上記コレステロール改変剤が、オリゴ糖を含む、上記［１６］または［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］上記オリゴ糖が、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−およびβ−グルコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、またはβ−キシロシダーゼの１つまたは複数から選択される、上記［１８］に記載の方法。
［２０］上記細菌株が、逆酵素反応によって上記オリゴ糖を生成することができる、上記［１８］または［１９］に記載の方法。
［２１］上記コレステロール改変剤が、乳酸桿菌の上記１つまたは複数の株のための選択的増殖培地を含む、上記［１８］から［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］上記株が、１０ ^５ｃｆｕ／ｇ〜１０ ^１２ｃｆｕ／ｇの範囲の量で存在する、上記［１８］から［２１］のいずれか一項に記載の方法。
［２３］組成物が被包されている、上記［１８］から［２２］のいずれか一項に記載の方法。
［２４］ビタミン、ミネラル、植物性化学物質、抗酸化剤、およびそれらの組合せから選択される１つまたは複数の活性成分をさらに含む、上記［１８］から［２３］のいずれか一項に記載の方法。
［２５］上記コレステロール改変剤がプレバイオティクスを含む場合、プレバイオティクスまたは二次プレバイオティクスをさらに含む、上記［１８］から［２４］のいずれか一項に記載の方法。
本発明の第１の態様によれば、高い胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を有する乳酸桿菌の１つまたは複数の株、およびコレステロール改変剤を含む組成物が提供される。

本発明のさらなる一態様によれば、高い胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を有する乳酸桿菌の１つまたは複数の株、およびコレステロール改変剤を含む、個体のコレステロール吸収の改変に使用するための組成物が提供される。

本発明のさらに別の態様によれば、高い胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を有する乳酸桿菌の１つまたは複数の株、およびコレステロール改変剤を含む、高コレステロール、心疾患、糖尿病または肥満の処置に使用するための組成物が提供される。

本発明のまたさらなる一態様によれば、高コレステロール、心疾患、糖尿病または肥満を処置するための薬品の製造における、高い胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を有する乳酸桿菌の１つまたは複数の株、およびコレステロール改変剤を含む組成物の使用が提供される。

任意の態様では、組成物の１つまたは複数の株は、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、およびラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１またはそれらの変異株から選択される少なくとも１つの株を含むことができる。

本願の文脈における用語「変異株」は、開示されている株から直接導出されているが、１つまたは複数の遺伝子変異の導入によって（遺伝子操作または選択によって）、表現型的に異なっている任意の株を意味することを企図する。

コレステロール改変剤は、オリゴ糖を含む。好ましくは、オリゴ糖は、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−およびβ−グルコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、またはβ−キシロシダーゼの１つまたは複数から選択される。より好ましくは、細菌株は、逆酵素反応によってオリゴ糖を生成することができる。

コレステロール改変剤は、乳酸桿菌の１つまたは複数の株のための選択的増殖培地を含むことができる。

組成物は、コレステロール改変剤がプレバイオティクスを含む場合、プレバイオティクスまたは二次プレバイオティクスをさらに含むことができる。

プロバイオティクス組成物は、好ましくは、小腸内のコレステロールの吸収プロファイルの変化を誘発するために、組成物中に有効量で存在する。好ましくは、培養物は、個体に１０^５ｃｆｕ／ｇ〜１０^１２ｃｆｕ／ｇの範囲の量で投与される。より好ましくは、プロバイオティクス細菌株は、１０^８ｃｆｕ／ｇ〜１０^９ｃｆｕ／ｇの範囲の量で存在する。ただし、個体の状態に応じて異なる投与量が投与され得ることを理解されよう。

株は、被包されていてもよい。多くの被包技術が、当業者には明らかであり、用いられる被包技術は、消化通過中にプロバイオティクス培養物に必要な安定性に合わせて調整される。被包は、プロバイオティクスに合わせて具体的に調整されたプレバイオティクスを含むことができる。

プロバイオティクス組成物は、コレステロール吸収を低下するのに最も適した時間に放出されるようにするための賦形剤または担体化合物をさらに含むことができる。典型的に、培養物は、小腸の腸管腸細胞に到達するまでに、相対的に無傷で生存していなければならない。

組成物は、いくつかの食料品型式、例えば飲むことのできる液体、スプレッド、および／または固体もしくは液体食料品と混合できる粉末であってもよい。

組成物は、１つまたは複数の活性成分、例えばビタミン、ミネラル、植物性化学物質、抗酸化剤、およびそれらの組合せと組み合わせることができる。

ビタミンには、脂溶性ビタミン、例えばビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびビタミン、ならびにそれらの組合せが含まれ得る。一部の実施形態では、ビタミンには、水溶性ビタミン、例えばビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＢ（チアミンまたはＢ１、リボフラビン（riboflavoin）またはＢ２５ナイアシンまたはＢ３、ピリドキシンまたはＢ６、葉酸またはＢ９、シアノコバラミン（cyanocobalimin）またはＢ１２、パントテン酸、ビオチン）、およびそれらの組合せが含まれ得る。

ミネラルには、ナトリウム、マグネシウム、クロム、ヨウ素、鉄、マンガン、カルシウム、銅、フッ化物、カリウム、亜リン酸、モリブデン、セレン、亜鉛、およびそれらの組合せが含まれ得るが、それらに限定されない。

抗酸化剤には、アスコルビン酸、クエン酸、ローズマリー油、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＥリン酸塩、トコフェロール、ジ−アルファ−トコフェリルリン酸塩、トコトリエノール、アルファリポ酸、ジヒドロリポ酸、キサントフィル、ベータクリプトキサンチン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、ベータ−カロテン、カロテン、混合カロテノイド、ポリフェノール、フラボノイド（fiavonoid）、およびそれらの組合せが含まれ得るが、それらに限定されない。

植物性化学物質には、カロテノイド（cartotenoid）、葉緑素、クロロフィリン、繊維、フラバノイド、アントシアニン（anthocyamn）、シアニジン（cyaniding）、デルフィニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジン、フラバノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン（epigailocatechingallate）、テアフラビン、テラルビシン（thearubigin）、プロアントシアニジン（proanthocyanin）、フラボノール、ケルセチン、ケンフェロール、ミリセチン、イソラムネチン、フラバノンスヘスペレチン、ナリンゲニン、エリオジクチオール、タンゲレチン、フラボン、アピゲニン、ルテオリン、リグナン、フィトエストロゲン、レスベラトロール、イソフラボン、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、ダイズイソフラボン、およびそれらの組合せが含まれ得るが、それらに限定されない。

組成物は、医薬品または薬品の代わりに（またはそれに加えて）、栄養補助食品、健康補助食品または機能性食品として使用することができる。さらに組成物は、既存の食料品、例えばヨーグルト、食品スプレッドに組み込むことができ、または食料品と容易にブレンドすることができ、もしくは液体飲料に製造することができる粉末として組み込むことができる。組成物はまた、栄養補助食品に配合することができる。

本発明のさらなる一態様によれば、本明細書で先に記載した組成物を生成する方法が提供され、該方法は、高い胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を有する乳酸桿菌の１つまたは複数の株を、生物学的に有効な量のコレステロール改変剤と混合するステップを含む。

当業者には、組成物を生成する方法に、さらなるステップを組み込むこともでき、組成物に前述の追加の構成成分を組み込み、または組成物を前述の追加の構成成分と混合すること組み込み得ることが明らかとなろう。

本発明のさらに別の態様によれば、有効量のラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）およびラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも１つ、ならびにコレステロール改変剤を投与することによって、高コレステロール血清レベル、心疾患、糖尿病または肥満を有する個体を処置する方法が提供される。

一方法は、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）およびラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１またはそれらの変異株から選択される２つまたはそれを超える株を投与するステップを含むことができる。

当業者には、本発明の初期の態様に関して列挙した組成物のいくつかの特徴が、当然のことながら、該方法と交換可能であり、個体に投与される組成物を形成し得ることが明らかとなろう。

本発明の詳細な説明
ここで、本発明の実施形態を、以下の図面の詳細な説明を単なる例として用いて説明する。

［図１Ａ］実験１でＬ．プランタルム（plantarum）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図１Ｂ］実験１でＬ．カゼイ（casei）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである［図１Ｃ］実験１でＬ．サリバリウス（salivarius）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図１Ｄ］実験１でＬ．ファーメンタム（fermentum）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図１Ｅ］実験１でＬ．ラムノサス（rhanmosus）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図１Ｆ］実験１でＬ．デルブリュッキ（delbrueckii）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図２Ａ］実験１でＬ．プランタルム（plantarum）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図２Ｂ］実験１でＬ．カゼイ（casei）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図２Ｃ］実験１でＬ．サリバリウス（salivarius）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図２Ｄ］実験１でＬ．デルブリュッキ（delbrueckii）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図２Ｅ］実験１でＬ．ラムノサス（rhanmosus）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図２Ｆ］実験１でＬ．アシドフィルス（acidophilus）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図２Ｇ］実験１でＬ．ヘルベティカス（helveticus）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。実験１のＭＲＳ培地中、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロール濃度における、１４時間にわたる異なる細菌株の結果を示すグラフである（ＯＤ_６００を毎時間測定した）。実験１のＭＲＳ培地中、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロール濃度における、試験前２日間にわたる異なる細菌株の結果を示すグラフである（ＯＤ_６００を毎時間測定した）。実験２において９６ウェルプレートで、ＭＲＳＡ中、好気条件下で増殖させた乳酸桿菌株の写真である。実験２において９６ウェルプレートで、ＭＲＳＡだけ（対照）、ＭＲＳＡ＋０．５％ＧＤＣＡ、ＭＲＳＡ＋０．５％ＴＤＣＡ、ＭＲＳＡ＋０．５％Ｏｘｇａｌ、およびＭＲＳＡ＋２％Ｏｘｇａｌ中、嫌気条件下で増殖させた乳酸桿菌株の写真である。実験２において９６ウェルプレートで、ＭＲＳＡだけ（対照）、ＭＲＳＡ＋０．５％ＧＤＣＡ、ＭＲＳＡ＋０．５％ＴＤＣＡ、ＭＲＳＡ＋０．５％Ｏｘｇａｌ、およびＭＲＳＡ＋２％Ｏｘｇａｌ中、好気条件下で増殖させた乳酸桿菌株の写真である。ハイスループットスクリーニングに付した多様な乳酸桿菌株を示す円グラフである。コレステロール低下能のさらなる分析のために識別された２４種類の株の結果を示す棒グラフである。光学密度に対してコレステロール同化を正規化した後の、図５に示されている２４種類の株の結果を示す棒グラフである。フリーズドライ実験中のいくつかの株の粉末計数を示す棒グラフである。フリーズドライ実験中のいくつかの株のフリーズドライでの生存率を示す棒グラフである。フリーズドライ状態にされたいくつかの株の胃内でのインビトロ生存率を示す棒グラフである。株Ｂ４３２１、Ｂ２８２８およびＢ２８３０に関する２００μＭのＧＤＣにおける胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を示す棒グラフである。株Ｂ４３２１、Ｂ２８２８およびＢ２８３０に関する胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性（Ｏｘｇａｌ）を示す棒グラフである。

実験１
これらの実験の基礎は、新規なＧＯＳを生成するために、微生物においてβ−ガラクトシダーゼを可逆的に使用することであった。β−ガラクトシダーゼは、普通はラクトースを消化するはずである。しかし、基質および温度に関して反応条件を変化させることによって、酵素は可逆的に作用し、ラクトース（ＧＯＳ）のオリゴ糖版を産生する。

乳酸桿菌は、ビフィドバクテリウム属であるプロバイオティクスとしてより頻繁に使用されているが、乳酸桿菌に選択的なプレバイオティクスは存在していない。またこれらのプロバイオティクスは、β−ガラクトシダーゼ活性を備えているので、実験によって、これらのプロバイオティクスに特異的なＧＯＳの生成を誘発した。ＧＯＳなどのプレバイオティクスの代謝作用は、種に特異的であり（バイ−イムノ（Bi-Immuno）細菌およびビフィド（Bifido）細菌によって証明される通り）、したがって乳酸桿菌のＧＯＳは、乳酸桿菌の増殖、生存性、および健康上の利益を潜在的に増強する。

実施した実験は、以下の通りであった。
１．様々なプロバイオティクスの乳酸桿菌を集め、ＧＯＳを産生するそれらの能力について試験し、β−ガラクトシダーゼ活性を測定すること、
２．逆酵素手順を使用してプレバイオティクスＧＯＳを産生すること、
３．新規な分子をスケールアップして、インビトロ試験を行うこと、
４．プロバイオティクスおよびシンバイオティクスを試験する一連の「腸モデル」実験において、プレバイオティクスが存在しない状態および存在する状態で、乳酸桿菌の生存および増殖を比較すること、
５．乳酸桿菌のための被包材料としてＧＯＳを使用できる可能性を評価すること、ならびに
６．被包材料の送達特性を試験すること。

実験の第１段階中に最初に調査した細菌株を、以下の表１に示す。

細菌増殖曲線の決定を、ＰＢＳ９００μＬ中、培養物の希釈系列１００μＬを使用して、０時間、３時間、５時間、８時間および２４時間間隔で培養物をサンプリングすることによって行った。各系列２０μＬを、陰性対照と共に瓶上に広げ、増殖を評価した。

株のいくつかの細菌計数を、０．１％ラクトースを増殖培地として使用することによって評価した。図１Ａ〜１Ｆは、Ｌ．プランタルム（plantarum）、Ｌ．カゼイ（casei）、Ｌ．サリバリウス（salivarius）、Ｌ．ファーメンタム（fermentum）、Ｌ．ラムノサス（rhanmosus）、およびＬ．デルブリュッキ（delbrueckii）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した経時的な細菌計数が、すべておよそ６．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌから、約１３時間目には９．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌをわずかに超える定常増殖曲線をもたらし、増殖が、２５時間目までには増大しなくなった通り漸減したことを示している。

株のいくつかの細菌計数を、５％ラクトースを増殖培地として使用することによって評価した。図２Ａ〜２Ｇは、Ｌ．プランタルム（plantarum）、Ｌ．カゼイ（casei）、Ｌ．サリバリウス（salivarius）、Ｌ．デルブリュッキ（delbrueckii）、Ｌ．ラムノサス（rhanmosus）、Ｌ．アシドフィルス（acidophilus）およびＬ．ヘルベティカス（helveticus）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数を示している。ここでもすべてが、およそ６．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌから、約１３時間目には９．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌをわずかに超える定常増殖曲線をもたらし、次に、増殖は、２５時間目までには増大しなくなった通り平坦になった。

次に、コレステロールを細菌株の培養培地に含め、各株をインキュベーション後にコレステロールの量について試験した。

使用したコレステロールアッセイは、次式によるものである。
コレステロール％×乾燥重量（ｇ）^−１＝（Ｂ−Ｔ／Ｂ×１００）／Ｗ
式中、Ｂ＝接種されなかった対照中のコレステロール含量（ｍｇ／ｌ^−１）、Ｔ＝培養培地中のコレステロール（ｍｇ／ｌ^−１）およびＷ＝細胞（１２時間のインキュベーション後の乾燥重量（ｇ））。

培養物のペレット重量を、上清（supernanent）とは独立に測定し、消費されたブロス（蒸発した残留物）も測定した。コレステロールアッセイを数回実施して、三連で実施した。

図３は、ＭＲＳ培地中、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロール濃度における、１４時間にわたる異なる細菌株の増殖を示しており（ＯＤ_６００を毎時間測定した）、いくつかの細胞株が、この培地において増殖するのにはるかにより有効であったことを示している。Ｌ．プランタルム（Planatarum）は、最良の増殖プロファイルを示し、その後にＬ．デルブリュッキ（delbrueckii）、Ｌ．カゼイ（casei）およびＬ．ファーメンタム（fermentum）が続いた。

図３は、ＭＲＳ培地中、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロール濃度における、１２時間にわたる異なる細菌株の増殖を示しており（ＯＤ_６００を毎時間測定した）、いくつかの細胞株が、この培地において増殖するのにはるかにより有効であったことを示している。Ｌ．プランタルム（planatarum）は、最良の増殖プロファイルを示し、その後にＬ．デルブリュッキ（delbrueckii）、Ｌ．カゼイ（casei）およびＬ．ファーメンタム（fermentum）が続いた。

図４は、ＭＲＳ培地中、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロール濃度における、試験前２日間にわたる異なる細菌株の結果を示すグラフである（ＯＤ_６００を毎時間測定した）。Ｌ．ファーメンタム（fermentum）は、最良の増殖プロファイルを示し、その後にＬ．ラムノサス（rhanmosus）、Ｌ．ヘルベティカス（halveticus）、Ｌ．ヘルベティカス（halveticus）およびＬ．サリバリウス（salivarius）が続いた。

次に、コレステロール活性をさらに測定するために、直接的なプレートアッセイ試験を株に対して実施した。静止細胞の胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）活性を測定して、コンジュゲートした胆汁酸の加水分解からのアミノ酸の放出を評価した。胆汁酸塩の脱コンジュゲーション（遊離コール酸の放出に基づく）を測定し、最後に、脱コンジュゲーションした胆汁とコレステロールの共沈殿を評価した。以下の表２は、直接的なプレートアッセイの結果を示す。

Ｌ．カゼイ（casei）、Ｌ．デルブリュッキ（delbrueckii）およびＬ．アシドフィルス（acidophilus）は、すべて信頼できるＢＳＨ活性を有していたことが分かった。しかし、Ｌ．ファーメンタム（fermentum）およびＬ．プランタルム（plantarum）も増殖に成功しており（３回の実施のうち２回）、Ｌ．プランタルム（plantarum）は、図３および４に示されている通り、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロールで増殖するのに特に有効であることが既に証明された。

コレステロールを含有する培地で増殖できる株およびＢＳＨ活性を有する株の結果を比較することによって、Ｌ．カゼイ（casei）、Ｌ．デルブリュッキ（delbrueckii）、Ｌ．ファーメンタム（fermentum）およびＬ．プランタルム（plantarum）は、特定のプレバイオティクスＧＯＳを生成し、識別するのに適した候補であると思われた。

特定の株によって産生されたＧＯＳプレバイオティクスは、ＧＯＳを生成するだけでなく代謝する、最適化された代謝作用を有する（逆酵素手順から産生される通り）。したがってＧＯＳは、プロバイオティクスにとって非常に選択的な環境を作り出すことができるシンバイオティクスに、プロバイオティクスと共に組み込むことができる。プロバイオティクスは、健康上の特定の利益を有することができるので、健康上の特定の利益に合わせて調整されるシンバイオティクス配合物を産生することができる。

実験２
実験１と並列して、乳酸桿菌の７１８の株の初期ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）試験を実施して、異なるタイプの胆汁酸塩に対する耐性を評価した。次に、胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を確立するために、さらなる実験を実施して、２８６の耐性株における胆汁の沈殿を調査した。

試験した株は、乳酸桿菌アシドフィルス（acidophilus）、乳酸桿菌ヘルベティカス（helveticus）、乳酸桿菌アリメンタリス（alimentarius）、乳酸桿菌ブレビス（brevis）、乳酸桿菌ブチネリ（buchneri）、乳酸桿菌カゼイ（casei）（亜種：ラムノサス（rhamnosus）、カゼイ（casei）、トレランス（tolerans）、シュードプランタルム（pseudoplantarum）、パラカゼイ（paracasei）、アラクトスス（alactotsus）およびラムノサス（rhamnosus）を含む）、乳酸桿菌クリスパタス（crispatus）、乳酸桿菌クルバトゥス（curvatus）（亜種：クルバトゥス（curvatus）を含む）、乳酸桿菌デルブリュッキ（delbrueckii）（亜種：ブルガリクス（bulgaricus）およびラクチス（lactis）を含む）、乳酸桿菌ファーメンタム（fermentum）、乳酸桿菌パニス（panis）、乳酸桿菌パラカゼイ（paracasei）（亜種：パラカゼイ（paracasei）を含む）、乳酸桿菌ペントスス（pentosus）、乳酸桿菌プランタルム（planatarum）、乳酸桿菌ラムノサス（rhamnosus）、乳酸桿菌サケイ（sakei）、乳酸桿菌サリバリウス（salivarius）（亜種：サリバリウス（salivarius）を含む）であった。

株を、ＭＲＳ中３７℃で終夜増殖させた。これらの培養物の中からグリセロール原液を生成し、−８０℃で保存した。マイクロタイタープレートに接種し、すべての株を、マスタプレートに四連で入れた。

これらの実験で使用した胆汁酸塩は、Ｓｉｇｍａ（登録商標）から購入し、以下の通りであった。グリコデオキシコール酸ナトリウム（ＧＤＣＡ）（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｇ３２５８、ＣＡＳ：１６４０９−３４−０）、タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物（ＴＤＣＡ）（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｔ０８７５、ＣＡＳ：２０７７３７−９７−１）およびウシ胆汁（Ｏｘｇａｌ）（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｂ３８８３、ＣＡＳ：８００８−６３−７）。実験で使用した胆汁酸塩の濃度は、以下の通りであった。０．５％ＧＤＣＡ、０．５％ＴＤＣＡ、０．５％ｏｘｇａｌ、および２．０％ｏｘｇａｌ。グリコデオキシコール酸を使用するインビトロデータは、ヒトのインビボ環境をより厳密に模倣するので、生成物の有効性の可能性を反映する可能性がより高いと思われる。

培養物を、９６ウェルプレートで、ＭＲＳＡ中３７℃で終夜増殖させた。次に、９６ウェルプレート中ＭＲＳＡ寒天１５０μｌを含有し、添加した胆汁酸塩を含むウェルに、培養物５μｌをスポッティングし、好気／嫌気条件下で４８時間インキュベートした。株の適切な増殖を確実にするために、ｐＨ条件をモニタした。

結果は、ある特定の株が、嫌気条件下および好気条件下の両方で、ＭＲＳＡプレート上で実際に増殖したことを示した。以下の表３は、初期ＨＴＳから得られた陽性結果のすべてを示しており、特定の株は、嫌気条件下で、様々な胆汁酸塩上で増殖することができる（ＯＤ_６００の測定によって評価した）。

図５は、多くの株が、ＭＲＳＡ中、好気条件下で十分に増殖したことを示している。図７に示されている通り、ＧＤＣＡは、好気条件下であらゆる場合において株の増殖を阻害するが、図６に示されている通り、嫌気条件下では、いくつかの株がＧＤＣＡ中で実際に増殖する。２．０％Ｏｘｇａｌは、好気条件および嫌気条件の両方においていくつかの株の増殖を阻害することが見出された。図６および７のプレートは、以下の株（ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＮＣＩＭＢ８０２６、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＮＣＩＭＢ８８２６、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＡｂＢｉｏ、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）ＬＢＫ−１６Ｈ、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦ５１（１８３６）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＮＣＩＭＢ３０１８７、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２９９（１８３７）について良好な増殖を示している。これらの結果を、実験１の（ならびに図３および４に示されている）１００ｍｇ／Ｌのコレステロールを含有する培地で増殖させた比較用の株の増殖データと比較すると、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）およびラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）が、コレステロールが存在する状態で優れた増殖を示し、胆汁酸塩に抵抗性を示し、胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を有するように見える。

以下の表４は、増殖の結果の簡単な概要を示す。

合計４１の株は、３種類すべての胆汁酸塩が０．５％で存在する状態で増殖することが見出された。

次に、耐性株における胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を、５μｌを「ＰＣＲチューブプレート」（薄肉微量遠心管中寒天１５０μｌ）にスポッティングすることによって評価した。これらのチューブプレートを、９６ウェルプレートと同じ条件下で増殖させた（ＭＲＳ＋０．５％ＴＤＣＡ、ＭＲＳ＋０．５％ＧＤＣＡ、ＭＲＳ＋０．５％ｏｘｇａｌ、ＭＲＳ＋２．０％ｏｘｇａｌ、胆汁なしのＭＲＳ（対照））。

プレートを、３７℃で嫌気的にインキュベートし、胆汁の沈殿（胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性に関する）を、以下の採点系を使用して、２４時間および４８時間後に評価した。ＢＳＨ活性については、＋または−として増殖を記録する。次に、０．５％ｏｘｇａｌを含有するＭＲＳプレート上へのその後の画線培養のために、陽性を選択した。

７２時間後、陽性株を識別した。陽性培養物だけが、ＧＤＣＡおよびＴＤＣＡにおける沈殿を示した。

図８は、初期ハイスループットスクリーニングアッセイに使用した株の範囲を示す。

初期（earler）ＢＳＨ活性に基づいて株数を２４まで絞った後、０．４％を補充したＭＲＳ培地におけるコレステロール同化のさらなるスクリーニングを実施した。

以下の表３は、選択された株およびそれらのコレステロール低下の平均（％）の結果を示す。

図９は、表の結果を棒グラフで示しており、最初の８つの株の間には、株の残りと比較して大きな差異があることを示している。

以下の表４および図１０は、光学密度に対して正規化されたコレステロール同化を示している。

次に、コレステロール低下（％）（以下の表５）および腸内の株の潜在的な増殖有効性の文脈においてＯＤに正規化したコレステロール低下（以下の表６）に基づいて、株の結果を比較して評価を行った。

株２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）およびＡＴＣＣ４３１２１は、先の表５および６の両方の分析において、高コレステロールの低下および良好なＢＳＨ活性を示している。実施したインビトロ試験は、これらの株が、互いに組み合わせられようと、または個々であろうと、個体のコレステロール吸収の改変、または心疾患、糖尿病もしくは肥満の処置に使用するのに適し得ることを強力に示唆している。これらの株を、増殖に特異的なプレバイオティクスと併用すると、増殖を促進し、支持することができる。

次に、いくつかの株が、フリーズドライに上手く対処する方法、および選択された３種類の株の特定の胆汁酸塩に対するその後のＢＳＨ活性を調査するための実験を実施した。

第１のステップは、いくつかの株を発酵させることであった。株は、選択されたすべての担体および抗凍結剤を酸性にすることが見出された。配合物は、生成中に冷間加工されるべきであると評価された。担体の選択およびそれらの最終濃度は、以下の通りであった。８２％ＭＤ＋１４％ソルビトール（ＭＤ＝マルトデキストリン）（残りの培地、および細菌）および８２％ＭＤ＋１４％スクロース。すべての株は、酵母エキスおよび大豆ペプトンのミックスを用いて、選択された窒素供給源上で十分に増殖した。動物成分は、この検証については提案されなかったが、大豆ペプトンは、不溶性沈殿物を生じる場合があり、これは将来的に下流処理を妨害するおそれがあると評価された。生成に使用される培地は、１００％ＹＥに基づくものと評価され、他の窒素供給源を含まないことが理想的であった。以下の表７は、選択された３種類の株（Ｂ４３２１、Ｂ２８２８およびＢ２８３０）に関する、培地中の発酵の結果および生存率の概要を示す。以下のデータでは、Ｂ４３２１は、過去に言及したＢ２６９１と同じ株に関する。

図１１は、いくつかの株の粉末計数を示し、図１２は、同じ株のフリーズドライでの生存率を示す。

図１３は、胃内の株の生存率を示す。株Ｂ４３２１（Ｂ２６９１）は、明らかに試験条件下でより良好に生存している。約１０９ＣＦＵ／ｍＬの定常細胞を、ペプシンおよびリパーゼを含むＮａ／Ｋ／ＨＣｌ溶液中、ｐＨ２．４５で６０分間インキュベートした。

図１４および１５は、選択された株に対する胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を示している。Ｂ２８２８およびＢ２８３０は、３時間でほぼ１００％の基質に変換された。したがって、これらの株を区別することは不可能であると思われた。

前述の実施形態は、特許請求の範囲によって与えられる保護範囲を制限するものではなく、本発明を実施することができる方法を例示する。

生物学的材料の寄託
生物学的材料の寄託は、英国ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅｓ（ＮＣＴＣ）の英国特許出願の目的で行われた。ＮＣＴＣは、ブダペスト条約の下で認知されている国際寄託当局（ＩＤＡ）である。

英国のＮＣＴＣに寄託された株のそれぞれには、接頭辞ＥＣＧＣを有する番号が割り当てられている。ＥＣＧＣは、ＥｕｒｏｐｅａｎＣｕｌｔｕｒｅＧｅｎｅｒａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎを表す。

Ｂ２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）は、元々、ＮＣＴＣに寄託されたとき、Ｌ．ロイテリ（reteri）として表現型的に分類されていたことに留意されたい。その後、Ｂ２６９１は、遺伝子分析に基づいてＬ．プランタルム（plantarum）であることが見出され、この株は、本願ではＢ２６９１と呼ばれており、後の実験ではＢ４３２１と改名された。

Claims

高い胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を有する乳酸桿菌の株およびオリゴ糖を含む組成物であって、前記株が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）を含む、組成物。
高い胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を有する乳酸桿菌の株およびオリゴ糖を含む、個体のコレステロール吸収の改変に使用するための組成物であって、前記株が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）を含む、組成物。
高い胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を有する乳酸桿菌の株およびオリゴ糖を含む、高コレステロールの処置に使用するための組成物であって、前記株が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）を含む、組成物。
前記株が、１０^５ｃｆｕ／ｇ〜１０^１２ｃｆｕ／ｇの範囲の量で存在する、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
被包されている、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
食料品の形態である、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
栄養補助食品として使用するための、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
ビタミン、ミネラル、植物性化学物質、抗酸化剤、およびそれらの組合せから選択される１つまたは複数の活性成分をさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
プレバイオティクスをさらに含み、またはプレバイオティクスを含む場合、二次プレバイオティクスをさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載の組成物。
高い胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を有する乳酸桿菌の株を、生物学的に有効な量のオリゴ糖と混合するステップを含む、請求項１から９の組成物を生産する方法であって、前記株が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）を含む、方法。
前記組成物が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）から選択される１つまたはそれを超える株をさらに含む、請求項１０に記載の方法。