ITMI20061843A1 - Formulazioni di medium colturali idonei alla applicazione industriale - Google Patents
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Alte Pr
DESCRIZIONE
Annessa a domanda dì brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo
"FORMULAZIONI DI MEDIUM COLTURALI IDONEI ALLA APPLICAZIONE INDUSTRIALE"
A nome: IMMOBILIARE G.M. S.R.L., di nazionalità italiana con sede a NOVARA
Mandatari: Ina. Giuseppe Righetti iscritto all’Albo con il n. 7 BM, Ing. Carlo Raoul Ghioni iscritto all'Albo con il n. 280 BM, Ing. Martino Salvadori iscritto all'Albo con il n. 438 BM, Fabrizio Tansini iscritto all'Albo con il n. 697 BM, Ing. Gianmarco Ponzellini iscritto all'Albo con il n. 901 BM, Dott. Roberto Margutti iscritto all'Albo con il n. 938 B, Ing. Matteo Baroni iscritto all'Albo con il n. 1064 BM, Dott. Marco Benedetto iscritto all'Albo con il n. 1089 B, Ing. Marco Brasca iscritto all'Albo con il n. 1094 B e Ing. Luigi Tarabbia iscritto all'Albo con il n. 1005 BM, della BUGNION S.p.A. domiciliati presso quest ’ultima in MILANO - Viale Lancetti 17. Depositato il: al n.:
La presente invenzione ha per oggetto formulazioni di 21 , 10195.12. XT . i Doti ob< no fsutti Albo 3⁄4 B
medium colturali idonei allo sviluppo industriale di colture liquide starter caratterizzate da un numero di cellule microbiche, per unità di volume di medium di fermentazione, superiore a quello delle colture liquide starter tradizionali e definibile a priori in funzione della formulazione del medium stesso.
Le colture di microrganismi che vengono aggiunte a numerosi alimenti sono denominate "colture starter". Dette colture starter sono innesti selezionati, costituiti da ceppi microbici con proprietà biochimiche ben definite e che perciò consentono di ottenere risultati ripetibili e costanti nel tempo. In tutte le applicazioni biotecnologiche le colture starter hanno il ruolo di avviare i processi fermentativi e di indirizzarli correttamente, contribuendo in maniera determinante all'ottenimento non solo delle peculiarità sensoriali ma spesso anche strutturali e merceologiche dei prodotti finiti.
Dette colture starter microbiche sono ormai universalmente utilizzate nella preparazione delle più svariate sostanze alimentari e la qualità degli alimenti prodotti è correlata, oltre che ad una corretta prassi tecnologica, alla specificità funzionale della coltura utilizzata ed al numero ed allo stato fisiologico dei microrganismi che la 21.10195.12.17.1 Don Ro i eutii Albo
costituisce .
Le colture starter possono essere classificate sulla base di diversi criteri, in funzione della complessità della composizione (colture costituite da un singolo ceppo microbico, ovvero da più ceppi appartenenti ad una o più specie e/o generi}, del campo di applicazione (ad esempio, lattìero-casearìo o altri) e dello stato fisico della coltura (liquido, congelato o disidratato, ad esempio, mediante liofilizzazione o spray-drying) .
Con riferimento alla forma fisica, le colture liquide, se preparate in maniera corretta ed utilizzate entro breve tempo, sono quelle che forniscono i risultati migliori, perché sono caratterizzate da una popolazione microbica in perfetto stato fisiologico e pertanto sono in grado di replicarsi ed estrinsecare il proprio ruolo immediatamente dopo l'inoculo nell'alimento o materia prima da trasformare.
Aspetti negativi delle colture liquide, che costituiscono ad oggi un fattore limitante alla loro diffusione, sono rappresentati dalla ridotta shelflife che, al massimo, può arrivare a 4-5 giorni (ad una temperatura di conservazione di 3-5°C) e dalla limitata concentrazione cellulare massima ottenibile 21. 10195. 12. IT . 1 ?on Rf aulii Albo <β
<(>che obbliga ad utilizzare volumi elevati di dette colture, a parità di quantitativo di materia prima da trasformare) .
Per contro le colture liofilizzate e congelate sono caratterizzate da shelf-life molto più lunghe e da volumi inferiori.
Tuttavia, la colture liofilizzate e congelate presentano il grave inconveniente che le cellule sono in uno stato fisiologico incapace di adattarsi in tempi brevi alle condizioni colturali del substrato alimentare da fermentare. Sono, in altre parole, caratterizzate da una fase di latenza più o meno lunga, definita LAG fase, indispensabile per ripristinare le funzioni vitali.
Inoltre, i prodotti (ad esempio, lattiero-caseari) ottenuti con dette colture possiedono caratteristiche sensoriali, di aroma e di gusto complessivamente inferiori rispetto ai prodotti preparati tramite l'applicazione di colture starter liquide.
Resta, pertanto, viva la necessità di disporre di colture liquide aventi una maggiore concentrazione cellulare, sufficienti, dunque, per la trasformazione di quantitativi maggiori di materie prime e con costi più contenuti, garantendo la produzione industriale di prodotti con superiori peculiarità organolettiche.
21. 10195.12.
Purtroppo, i medium colturali (identificati come convenzionali) comunemente utilizzati per produrre industrialmente le colture starter note (identificate come tradizionali) non sono in grado dì fornire una adeguata risposta alla necessità sopra evidenziata. Detti medium convenzionali commerciali sono comunemente costituiti da proteine, protidi e/o peptoni, da glucidi semplici o complessi, da vitamine, sali minerali e fattori dì crescita specìfici per ogni genere e specie microbica.
Le fonti azotate apportano il materiale necessario alla costruzione delle strutture cellulari, mentre le fonti di carbonio forniscono l'energia necessaria alle varie trasformazioni metaboliche.
Allo stato attuale, il fattore limitante all'ottenimento industriale di colture liquide ad alta concentrazione batterica è costituito dall'abbassamento del pH del medium colturale, durante la produzione della biomassa microbica; detto fenomeno è dovuto alla produzione dì acidi organici per fermentazione delle fonti di carbonio durante la riproduzione batterica.
Gli acidi organici, particolarmente lattico ed acetico, quando in forma dissociata, sono tossici per le cellule batteriche e se la loro concentrazione 21.10195. 12, IT. 1 oli Rofccn SURI Mh 38 B
supera una certa soglia, variabile da specie a specie, essi si accumulano nel citoplasma, inducendo dapprima sofferenza e successivamente blocco delle attività metaboliche. Se la fase di incubazione della coltura nel medium colturale si protrae per tempi eccessivamente lunghi, si assiste ad una elevata mortalità nella popolazione batterica che compromette la funzionalità della stessa.
Le conseguenze di questo fenomeno sono essenzialmente due: da un lato si ha la perdita, più o meno marcata, di vitalità della biomassa, dall'altro lato si manifesta un fenomeno di inibizione dell'ulteriore sviluppo della biomassa stessa, con ovvie ripercussioni negative sulla concentrazione cellulare e sull'attività fermentativa complessiva della coltura starter finale.
La carica microbica (o concentrazione cellulare microbica per unità di volume di coltura starter finale, espressa come CFU, colony-forming units, per mi di coltura starter finale) ottenibile con i medium colturali ad oggi noti ed impiegati industrialmente (convenzionali) arriva, al massimo, a 0,5-1*IO<9>CFU/ml ma, spesso, non supera i 200 milioni (2*10<®>) CFU/ml. Nell'ambito lattiero-caseario la quantità di coltura liquida starter necessaria varia da un prodotto
21. 10195. 12. IT . 1
all'altro, m relazione all'inoculo previsto per ciascun tipo di caseificazione ed alla densità cellulare della coltura.
In generale, con l'inoculo si tende ad ottenere nel latte una concentrazione di cellule vitali di almeno 10-25 milioni di cellule/ml. Dal momento che una coltura starter tradizionale contiene al massimo 0,5-1*10<®>CFU/ml, l'inoculo rappresenta, in volume, da 1 a 5% del volume complessivo del latte; saranno, perciò, necessari 10-50 litri di coltura starter per inoculare 1000 litri di latte ed ottenere poi l'attività fermentativa necessaria, misurabile dall'abbassamento del pH del latte stesso in funzione del tempo.
L'esempio precedente ha confermato come i volumi utilizzati di volta in volta siano considerevoli e, pertanto, un elevato volume di coltura liquida starter è sufficiente per la trasformazione di un volume limitato di materia prima, risulta, perciò, necessaria la frequente produzione, da parte dell'industria, di ulteriore coltura starter, con conseguente ridotta produttività dei propri impianti e costi talvolta insostenibili.
Alla luce dei problemi e della necessità sopra evidenziati, sarebbe, di conseguenza, particolarmente 21.10195.12.IT.1 ottR
utile poter disporre di un medium colturale che consenta la produzione di colture starter liquide caratterizzate da una elevata concentrazione cellulare (quindi, da volumi limitati) e da una elevata attività fermentativa e che mantengano, allo stesso tempo, le caratteristiche favorevoli delle colture liquide starter note (con particolare riferimento alle migliori proprietà organolettiche dei prodotti che derivano dal loro impiego), come pure la maggiore facilità gestionale complessiva che caratterizza le colture congelate o disidratate.
Medium colturali per lo sviluppo industriale del/i microrganismo/i di una coltura lìquida starter aventi le caratteristiche sopra menzionate non sono, a tutt'oggi, noti.
Resta, quindi, particolarmente viva la necessità dì poter disporre di medium colturali che consentano la produzione di colture liquide starter aventi le caratteristiche vantaggiose sopra evidenziate.
Scopo della presente invenzione è quello di dare una adeguata risposta alla necessità sopra evidenziata. Questo scopo ed altri ancora, che risulteranno chiari dalla descrizione dettagliata che segue, sono stati raggiunti dalla Richiedente, la quale ha inaspettatamente trovato che, aggiungendo una 21.10195.12.ιτ.1 uni
opportuna quantità di almeno un agente neutralizzante basico direttamente all'interno del medium colturale di partenza impiegato per la crescita della biomassa microbica, è possibile ottenere una coltura liquida starter caratterizzata da un sensibile arricchimento nel numero di cellule microbiche rispetto alle colture liquide starter ad oggi note (tradizionali). Forma, quindi, un oggetto della presente invenzione il medium colturale di cui sopra, come riportato nella unita rivendicazione indipendente.
Forma un altro oggetto della presente invenzione l'uso di detto medium per la produzione industriale di colture liquide starter, con particolare riferimento al settore caseario, come riportato nella unita rivendicazione indipendente.
Forma poi un ulteriore oggetto della presente invenzione una coltura liquida starter ad elevata concentrazione cellulare e ad elevata attività fermentativa, ottenibile con detto medium colturale, le cui caratteristiche sono riportate nella unita rivendicazione indipendente.
Forme di realizzazione preferite della presente invenzione sono riportate nelle unite rivendicazioni dipendenti .
Con il termine concentrazione cellulare microbica si
io
2α .10195. 12 , IT , 1
intende il numero di cellule microbiche vitali<(>misurato in termini di unità formanti colonia, colony-forming uni ts o CFU) per unità dì volume di coltura o di medium colturale.
La determinazione della concentrazione cellulare viene effettuata mediante una o più conte vitali, generalmente in piastra. Tale metodo consiste nel determinare il numero di cellule, presentì in un medium di fermentazione, capaci dì formare colonie in piastre da laboratorio contenenti un opportuno volume (generalmente 10 mi) di un terreno agarìzzato. L'attività fermentativa di una coltura liquida starter viene determinata misurando la diminuzione, col tempo, del pH di un preciso volume di un liquido opportuno, preferibilmente un latte, in seguito all'inoculo con un determinato quantitativo di detta coltura.
Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione sono evidenziati nella descrizione dettagliata che segue; inoltre, sono ulteriormente illustrate, a titolo di esempio, anche nelle allegate Tavole 1-3 e nelle Tabelle 1-3, a loro correlate, in cui:
- la Tavola 1 riporta, in grafico, l'andamento nel tempo: del pH di un medium colturale convenzionale
I I
21.10195. 12.IT.1 Jotl 3⁄4te«*Margutti Albo ί|θ^/φ38 B
durante la produzione industriale di una coltura liquida starter tradizionale, del pH di un medium colturale contenente carbonato dì calcio come agente neutralizzante interno durante la produzione industriale di una coltura liquida starter secondo la presente invenzione; del pH di un medium colturale contenente carbonato di calcio e monoidrogenofostato di potassio come miscela di agenti neutralizzanti interni, durante la produzione industriale di una coltura liquida starter secondo la presente invenzione; le misurazioni sono state effettuate fino al termine della fase di refrigerazione di dette colture;
- la Tavola 2 riporta i valori delle concentrazioni cellulari, rispettivamente, di: una coltura liquida starter tradizionale sviluppata con un medium colturale convenzionale; una coltura liquida starter secondo l'invenzione, sviluppata utilizzando un medium colturale contenente CaC03come agente neutralizzante interno; di una coltura liquida starter secondo l'invenzione, sviluppata utilizzando un medium colturale contenente CaC03e monoidrogenofosf ato di potassio come miscela di agenti neutralizzanti interni;
detti valori di concentrazione sono espressi in 21.10195.12. IT.1 DotURo BiUtl Alb 938
CEU/ml (il termine nE+p, riportato in ordinata, corrisponde a n*10<p>CFU/ml);
la Tavola 3 riporta in grafico l'attività fermentativa manifestata, in sede di utilizzo biotecnologico, da: una coltura liquida starter tradizionale, sviluppata con un medium colturale convenzionale; una coltura liquida starter ad elevata attività fermentativa secondo l'invenzione, sviluppata utilizzando un medium colturale contenente CaC03e monoidrogenofostato di potassio come agenti neutralizzanti interni; dette attività sono espresse riportando l'andamento nel tempo dell'abbassamento del pH di un latte inoculato con dette colture; la coltura liquida starter tradizionale è stata inoculata al 5% del volume totale del latte (V/V), mentre la coltura liquida starter ad elevata attività fermentativa secondo l'invenzione è stata inoculata allo 0,5% in volume, cioè 10 volte inferiore; il grafico evidenzia chiaramente che la coltura liquida starter secondo l'invenzione mostra la stessa resa industriale di una coltura convenzionale, utilizzando volumi ridotti di 10 volte (quindi, a parità di dose, è caratterizzata da un'attività fermentativa 10 volte superiore);
la Tabella 1 riporta i valori di pH relativi alle 21.10195. 12. ΪΤ . Ι Doti Rolk
Albo Pro 38B
varie fasi di produzione che hanno dato origine ai grafici della Tavola 1;
- la Tabella 2 riporta i valori di concentrazione cellulare, espressi come CFU/ml, che hanno dato origine all'istogramma della Tavola 2;
- la Tabella 3 riporta i valori di pH che hanno dato origine alla Tavola 3.
La presente invenzione è diretta ad un medium colturale, caratterizzato dal fatto di comprendere una quantità efficace di almeno un agente neutralizzante basico.
Preferibilmente, detto medium colturale è utilizzato per la produzione industriale di una coltura liquida starter ad elevata attività fermentativa, comprendente almeno un microrganismo fisiologicamenne compatibile, in cui detta coltura liquida starter è caratterizzata dal possedere una concentrazione cellulare batterica di detto almeno un microorganismo superiore a quella massima riscontrabile nelle colture liquide starter tradizionali (cioè >10<9>CFU/ml di coltura).
Preferibilmente, detta coltura liquida starter di cui sopra è una coltura ad inoculo diretto.
Detto almeno un agente neutralizzanne basico è scelto dal gruppo comprendente: ione carbonato, nelle forme
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2α . 10195. 12. IT . 1 iltt
Alb 938
mono e bi-basiche, ione fosfato, nelle forme mono-, bi- e tri-basiche, ione solfato, nelle forme mono- e bi-basiche, ione idrossido, ione citrato, nelle forme mono-, bi- e tri-basiche, ione tartrato, nelle forme mono- e bi-basiche, altre basi fisiologicamente compatibili con i microrganismi della coltura microbica da sviluppare in detto medium e/o loro miscele .
Dette basi derivano da opportuni sali in cui la parte cationica è preferibilmente rappresentata dallo ione calcio, sodio, potassio, magnesio, manganese e/o ammonio .
In una realizzazione particolarmente preferita, detta base è lo ione carbonato, nelle sue forme mono- e bibasiche; più preferibilmente, nella sua forma bibasica. In detta forma lo ione carbonato è derivato da qualunque opportuna fonte dello stesso, vantaggiosamente, dalla dissoluzione del carbonato di calcio.
In un'altra realizzazione particolarmente preferita, detta base è lo ione carbonato in opportuna miscela con almeno un altro sale scelto tra quelli sopra citati; preferibilmente, uno scelto da: monoidrogenofosfato dì potassio e/o magnesio solfato e/o diìdrogenofosfato di sodio e/o bicarbonato di 21.10195. 12. IT. 1 Do Ro ert imi Albo
sodio e/o tartrato di sodio.
Vantaggiosamente, in detta miscela, il carbonato di calcio e l'altro sale, scelto tra quelli sopra citati, sono in rapporto reciproco (peso/peso) compreso da 1:9 a 9:1, preferibilmente compreso da 1:4 a 4:1; particolarmente preferito, compreso da 1:2 a 2:1.
Detto almeno un agente neutralizzante è utilizzato vantaggiosamente in opportune percentuali (peso/peso), dipendenti essenzialmente dalle caratteristiche del/i ceppo/i microbico/i da sviluppare e dalla concentrazione cellulare finale che si desidera ottenere.
La Richiedente ha, infatti, inaspettatamente trovato che la concentrazione cellulare ottenibile alla fine del processo di preparazione industriale della coltura starter è direttamente proporzionale, entro precisi e ben definiti intervalli, alla quantità dì agente neutralizzante presente nel medium stesso.
E', pertanto, possibile definire, in funzione dei risultati industriali attesi, la formulazione del medium, ottenendo, a parità di composizione, risultati riproducibili, costanti e prevedibili a priori .
La Richiedente ha trovato che l'utilizzo di un agente
neutralizzante interno, o dì una misceladegli stessi, consente il mantenimento del pH del medium colturale entro un preciso intervallo dipendente dalla/e specìfica/che pKbdella/e base/i liberata/e dalla dissoluzione di detto/i agente/i.
Detto mantenimento ha inizio spontaneamente nel momento in cui il pH del medium di crescita della biomassa raggiunge specifici valori, funzione della/e pKbdell'agente neutralizzante o della miscela dì agenti in esso presente, e risulta dipendente, quindi, dal/i microrganismo/i in crescita e dalle condizioni colturali utilizzate.
La durata di detto mantenimento è risultata dipendente sia dalla concentrazione dell'agente neutralizzante o della miscela di agenti che dalla capacità acidificante del/i ceppo/i presente/i nel bioreattore.
La quantità complessiva dell'agente neutralizzante è tale da consentire che, durante la fase di mantenimento del pH, durante la fase di crescita esponenziale della biomassa microbica nel medium colturale, si verifichino da 2 a 5 divisioni (duplicazioni) cellulari della biomassa microbica.
La quantità complessiva di agente neutralizzante (o di miscela di agenti neutralizzanti) è, di norma, ≥2 21.10195.12 .XT. l fi. Ro»erto Albo
g/L dì medium colturale. Preferibilmente, detta quantità è compresa da 2 g/L a 40 g/L; più preferibilmente, è compresa da 8 g/L a 25 g/L.
L'intervallo in cui è mantenuto il pH del medium colturale, durante la fase di crescita esponenziale della biomassa microbica in detto medium, è compreso da 4,4 a 7,0; preferibilmente, detto intervallo dì pH è compreso da 4,7 a 6,4; più preferibilmente, da 5,0 a 5,7.
In una realizzazione preferita, che utilizza CaC03come agente neutralizzante, il pH è compreso, durante la fase di mantenimento, da 5,1 a 5,2.
In un'altra realizzazione preferita, che utilizza CaCCg e K2HPO4come miscela di agenti neutralizzanti interni, l'andamento del pH, durante la fase di mantenimento, si mantiene pressoché costante negli intervalli di 6,1-6,2 e di 5,1-5,2, fino all'esaurimento di detta miscela.
A titolo di esempio, in una prima realizzazione particolarmente preferita dell'invenzione, la quantità di agente neutralizzante, o della miscela di agenti, da inserire nella formulazione del medium colturale, viene calcolata in modo tale che, una volta consumato totalmente detto neutralizzante o miscela, possa residuare una quantità di fonti 21.10195. 12. IT. X DofpRot imo, tti Albo Pi B
energetiche tale da consentire ulteriori 0,5-1 duplicazioni cellulari della biomassa. In tale condizione, il pH del medium colturale scende fino ad un valore specìfico, variabile in funzione del microrganismo coltivato, comunque mai tale da arrecare sofferenza alla biomassa microbica.
In questa situazione l'attività fermentativa della coltura è direttamente correiabile e proporzionale alla concentrazione cellulare, spesso anche lievemente superiore in quanto la biomassa microbica si trova in perfetto stato di vitalità e dì integrità .
In una seconda realizzazione particolarmente preferita dell'invenzione, la quantità di agente/i neutralizzante/i è calcolata in modo tale da far residuare, dopo che detto agente/i è/sono stato/ì completamente consumato/i, una quantità di fonti dì energia tale da permettere ulteriori da 1 a 3 duplicazioni cellulari della biomassa batterica. In tale situazione, detta biomassa possiede una concentrazione cellulare fino a 4 volte superiore a quella ottenibile nella realizzazione precedente, tuttavia l'attività fermentativa estrinsecata da detta biomassa può non risultare direttamente proporzionale a tale fattore, trattandosi di cellule 21.10195. 12. IT. l Don Roqerii Albo PifT·-
non in perfetto stato fisiologico a causadella tossicità causata dall'eccessiva concentrazione idrogenionica nelle fasi finali di produzione industriale della coltura starter.
Il metodo per la preparazione di un medium colturale secondo la presente invenzione comprende aggiungere una opportuna quantità di almeno un agente neutralizzante basico, in accordo con quanto descritto in precedenza, preferibilmente ad un qualsiasi medium colturale tradizionale (ad esempio, commercialmente disponibile), in funzione del/ microrganismo/i che si desidera sviluppare.
Preferibilmente, detta aggiunta viene effettuata per miscelazione tradizionale dei componenti in una opportuna apparecchiatura miscelatrice.
Detta aggiunta/miscelazione può essere effettuata a secco (miscelazione delle polveri dei componenti) oppure in fase liquida, (ad esempio, sotto agitazione) , previa diluizione dei componenti del medium e del/i neutralizzante/i in una opportuna quantità di un mezzo liquido, preferibilmente acquoso.
Il pH della coltura liquida starter concentrata ad elevata attività fermentativa, ottenuta dal medium dell'invenzione è generalmente compreso da 4,7 a 5,6, 21.10195. 12. ΓΤ. Ι Don RM animi i Albo So 38 B
preferibilmente, è compreso da 4 , 9 a 5 , 2.
A questo punto, la coltura finale contenente l'acqua, la biomassa microbica, i metaboliti prodotti da detta biomassa durante la fase di crescita e i residui dei componenti del medium colturale iniziale, viene raffreddata ad una temperatura compresa da 4°C a 10°C e conservata in condizioni refrigerate (preferibilmente, da 3°C a 6°C) fino all'applicazione biotecnologica della coltura stessa.
Risulta, quindi, oggetto della presente invenzione anche la coltura liquida starter realizzata tramite l'impiego del medium colturale dell'invenzione descritto in precedenza.
In una realizzazione dell'invenzione, il microrganismo o la miscela di microrganismi della coltura starter è scelto/a tra opportuni ceppi microbici fisiologicamente compatibili.
In un'altra realizzazione dell'invenzione, detto microrganismo/i è/sono scelto/i tra ceppi microbici aventi valenza probiotica.
La concentrazione cellulare di detta coltura liquida starter, ottenuta utilizzando il medium colturale secondo la presente invenzione è, di norma, >1,5 volte rispetto a quella delle colture liquide starter tradizionali.
2]
21.10195. 12 , IT . 1 ott urti Albo 38 B
Preferibilmente, detta coltura liquida ha una concentrazione cellulare ≥2,5 volte la concentrazione delle colture liquide starter tradizionali; più preferibilmente, detta concentrazione è ≥5 volte quella delle colture liquide starter tradizionali. Ad esempio, la concentrazione cellulare della coltura liquida starter, ottenuta secondo la procedura descrìtta nella prima realizzazione particolarmente preferita dell'invenzione, dì cui sopra è, di norma, >1,5 volte rispetto a quella delle colture liquide starter tradizionali.
Detta coltura liquida ha una concentrazione cellulare preferibilmente compresa da 2,5 a 15 volte la concentrazione delle colture liquide starter tradizionali; più preferibilmente, detta concentrazione è compresa da 4 a 12 volte quella delle colture liquide starter tradizionali.
Ancor più preferibilmente, detta concentrazione è >5 volte quella delle colture liquide starter note.
A sua volta, la concentrazione cellulare della coltura liquida starter, ottenuta secondo la procedura descritta nella seconda realizzazione particolarmente preferita dell'invenzione, di cui sopra è, di norma, compresa da 2,5 a 60 volte la concentrazione delle colture liquide starter note; 21 .I<Q>1S5.12. IT.1 ott R Slitti Albo
preferibilmente, detta concentrazione è compresa da 8 a 32 volte la concentrazione delle colture liquide starter note.
Più preferìbilmente, detta concentrazione è >16 volte quella delle colture liquide starter note.
Quindi, la coltura liquida starter secondo la presente invenzione è caratterizzata da una concentrazione cellulare >10<9>CFU/ml di coltura; preferibilmente, >1,5*IO<9>CFU/ml di coltura.
In una realizzazione preferita dell'invenzione, la coltura liquida starter di cui sopra è caratterizzata da una concentrazione cellulare ≥2,5*10<9>CFU/ml di coltura; preferibilmente, ≥5·IO<9>CFU/ml.
Vantaggiosamente, la coltura liquida starter secondo la presente invenzione possiede un'attività fermentativa superiore a quella delle colture liquide starter tradizionali.
Denta attività fermentativa è mediamente risultata di almeno 2 volte, preferibilmente, di almeno 2,5 volte, superiore rispetto a quella delle colture liquide starter note.
Ad esempio, nella prima realizzazione particolarmente preferita dell'invenzione, di cui sopra, detta coltura liquida starter ha una attività fermentativa compresa da 2,5 a 18 volte l'attività fermentativa 21.10195.12.IT.1 LK R:>be Ili Alb B
delle colture liquide starter tradizionali; preferibilmente, detta attività è compresa da 4 a 15 volte. Più preferibilmente, detta attività fermentativa è ≥6 volte l'attività delle colture liquide starter tradizionali.
A sua volta, nella seconda realizzazione particolarmente preferita dell'invenzione, di cui sopra, detta coltura liquida starter ha una attività fermentativa compresa da 2,5 a 30 volte l'attività fermentativa delle colture liquide starter tradizionali; preferibilmente, detta attività è compresa da 8 a 24 volte l'attività fermentativa delle colture liquide starter tradizionali.
Più preferibilmente, detta attività fermentativa è ≥16 volte l'attività delle colture liquide starter tradizionali .
La coltura liquida starter ad elevata concentrazione ed elevata attività fermentativa, ottenuta con il medium colturale oggetto della presente invenzione è una coltura già pronta per l'impiego industriale desiderato .
Del tutto inaspettatamente, detta coltura liquida starter è anche risultate più stabile delle colture liquide tradizionali. Di norma, la coltura liquida starter di cui sopra ha mostrato di possedere una 21 .10195. 12. IT. 1 obe au
conservabili tà >1,5 volte la conservabìlità delle colture liquide starter tradizionali.
Preferibilmente, detta conservabìlità è >2,5 volte. Più preferibilmente, detta conservabìlità è >4 volte. La coltura liquida starter secondo la presente invenzione è, quindi, caratterizzata da una conservabìlità >6 giorni, ad una temperatura di conservazione mediamente compresa da 3°C a 5°C. Preferibilmente detta conservabìlità è >7,5 giorni; più preferibilmente, >10 giorni; ancor più preferibilmente, è ≥ 13 giorni.
Convenzionalmente, nella presente invenzione la conservabìlità è sempre valutata con riferimento rad una temperatura di conservazione mediamente compresa da 3<^>C a 5<Q>C.
Con l'aggiunta di almeno un agente neutralizzante interno basico, preferibilmente di carbonato di calcio e/o della miscela di detto carbonato con almeno un altro opportuno sale come precedentemente definito, nel medium colturale di partenza è stato possibile ottenere, in modo riproducibile e definibile a priori, un maggiore sviluppo della biomassa, una maggiore vitalità e un'aumentata attività fermentativa della coltura risultante, nonché un'inaspettata incrementata stabilità di detta 21 , 10195. 12. IT. 1 Don uni 93S
coltura .
Il metodo per la preparazione di una coltura liquida starter secondo l'invenzione, comprende almeno una fase in cui un medium colturale, preferibilmente, convenzionale, viene addizionato/miscelato con una opportuna quantità di almeno un agente neutralizzante basico in accordo con quanto descritto in precedenza. Come esempio, assolutamente non limitante, di realizzazione, viene dì seguito illustrato un metodo avente valenza generale per la preparazione di una coltura liquida starter ad elevata concentrazione ed elevata attività fermentativa, in cui detta coltura è ottenuta tramite l'utilizzo di un medium colturale secondo la presente invenzione descritto in precedenza. Detto metodo comprende sostanzialmente le seguenti fasi:
a) aggiungere ad un medium colturale una opportuna quantità di almeno un agente neutralizzante basico; b) dissolvere il medium derivarne da a) in un opportuno volume di un mezzo liquido, solitamente acqua;
c) bonificare il bioreattore mediante vapore fluente; preferibilmente, per 30 minuti;
d) sottoporre a trattamento termico il medium colturale diluito derivante da b) all'interno del
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bioreattore; preferibilmente, a 85-90°C per 20-30 minuti ;
e<}>raffreddare il medium colturale derivante da d) fino alla temperatura di inoculo desiderata;
f) inoculare il medium derivante da e) con una quantità efficace di coltura madre (liquida, liofilizzata o congelata) dì almeno un microrganismo batterico microbico, o di una miscela di microrganismi ;
g) far sviluppare la biomassa per un tempo sufficiente al verificarsi complessivamente di circa 9 (ad esempio, da 8 a 10) duplicazioni cellulari del/i microrganismo/i da coltivare, fino a quando, terminato l'effetto tampone dell'agente o degli agenti neutralizzanti, il pH del medium colturale scende spontaneamente fino ad un valore compreso da 4,9 a 5,2; vantaggiosamente, durante tutto il periodo di sviluppo della biomassa, il medium di fermentazione è mantenuto in leggera e costante agitazione;
b) raffreddare la coltura derivante da g), fino ad una temperatura compresa da 4°C a 8°C.
In un esempio di realizzazione preferita dell'invenzione, riportato a titolo assolutamente non limitativo, il medium colturale derivante da b), 21.10195.12.IT.1 Don Re
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contenente carbonato di calcio quale agente neutralizzante interno, comprende (quantità relative ad un litro di medium colturale): siero, 5g; peptone di caseina, lOg; estratto di lievito, 5g; glucosio, lOg; MnS04, 200mg; CaCO3, 12g; acqua, quanto basta a raggiungere IL dì medium colturale finale.
La quantità di calcio carbonato presente nel suddetto medium colturale è, generalmente, ≥2 g/L di medium colturale. Preferibilmente, detta concentrazione è compresa da 2 a 20 g/L, più preferibilmente, è compresa da 5 a 15 g/L; ancor più preferibilmente, compresa da 8 a 12 g/L,
In un'altra realizzazione particolarmente preferita, il medium colturale derivante da b) , contenente carbonato di calcio e monoìdrogenof ostato dì potassio, quale miscela di agenti neutralizzanti interni, comprende (quantità relative ad un litro di medium colturale): siero, 5g; peptone di caseina, lOg; estratto di lievito, 5g; glucosio, lOg; MnS04, 200mg; CaC03, 4,8g; K2HP04, 12,lg; acqua, quanto basta a raggiungere IL di medium colturale finale.
La quantità totale del carbonato di calcio e di monoidrogenofosfato di potassio è generalmente maggiore dì 2 g/litro di medium colturale. Preferibilmente, detta concentrazione è compresa da 2 ;
Albo fluì
a 40 g/litro, preferibilmente da 5 a 30 g/litro; piu preferibilmente, da 8 a 20 g/litro.
Vantaggiosamente, la presenza del calcio carbonato, singolarmente o in miscela con almeno un altro sale, porta allo sviluppo di anidride carbonica, nel medium di fermentazione, nel momento in cui il pH di detto medium scende al di sotto di ben definite soglie, dettate dalle pKbdello ione carbonato.
La Richiedente ha inaspettatamente trovato che lo sviluppo di COj da parte dello ione carbonato funziona come bioattivatore nei confronti dei microrganismi in crescita, inoltre contribuisce all'anaerobiosi del medium di sviluppo della biomassa, portando a notevoli vantaggi nel momento in cui detta biomassa è costituita da microrganismi anaerobi stretti o microaerofìli .
La temperatura di inoculo del medium colturale derivante da e) è mediamente compresa da 18 a 47°C, a seconda delle caratteristiche del/i microrganismo/i impiegato/i , delle relative condizioni di crescita richieste dal/i medesimo/ί e della percentuale di inoculo del/ì microrganismo/i . Ad esempio, per i microrganismi mesofilì la temperatura è preferibilmente compresa da circa 18°C a circa 32°C, mentre per microrganismi termofili la temperatura è 21,10195.22. ΓΤ . 1 CjDoti tfgutti Albo Ό1 »3S B
preferibilmente compresa da circa 37°C a circa 45°C.
La quantità di coltura madre, di cui ai punto f) , addizionata al medium colturale derivante da b), se liquida o congelata, può mediamente variare da 0,5% a 10% (V/V), a seconda del/i microrganismo/i da coltivare, delle caratteristiche del medium colturale e delle condizioni di sviluppo della biomassa microbica .
Nel caso di colture madri disidratate, la quantità è funzione della concentrazione batterica, e comunque tale da fornire mediamente 10-25 milioni dì CFU/mi di medium colturale.
Preferibilmente, a livello del bioreattore si adottano accorgimenti atti ad evitare il piu possibile i rischi di contaminazione: l'aria in ingresso nella camera di fermentazione viene filtrata attraverso filtri sterili; la camera stessa è sterilizzata con vapore ad alta temperatura tra una produzione e l'altra; gli elettrodi utilizzati per il controllo del pH ed i sensori di temperatura vengono anch'essi sterilizzati; la produzione della biomassa avviene in condizioni dì sovrapressione di aria o azoto sterili.
La coltura liquida starter ottenibile utilizzando il medium colturale secondo la presente invenzione, come 21.10195.12.IT.1 H>o
AÌb 938
descritto in precedenza, può comprendere qualsiasi tipo di ceppo batterico microbico fisiologicamente compatibile e/o avente interesse applicativo industriale .
Preferibilmente, detta coltura comprende almeno un ceppo microbico (o una miscela di più ceppi microbici) scelto dal gruppo comprendente i generi: Lactohacillus, Bifidobacterium, Lactococcus, Leuconostoc , Pediococcus, Streptococcus , Bacillus, Propionibacterium, Saccharomyces , Enterococcus , Staphylococcus .
Ad esempio, del genere Lactohacillus hanno trovato impiego le specie: L. pentosus, L. plantarum, L. casei , L. casei ssp. paracasei , L. casei ssp. rhamnosus, L. acidophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. fermentum, L. gasseri .
Ad esempio, del genere Bifidobacterium hanno trovato impiego le specie: B. longum, B. breve, B. lactis, B. adolescentis, B. pseudocatenulatum, B. ca tenulatum . Ad esempio, del genere Lactococcus hanno trovato impiego le specie: L. lactis e L . lactis ssp. lactis . Ad esempio, del genere Streptococcus ha trovato impiego la specie S. thermophilus .
Ad esempio, del genere Staphylococcus ha trovato impiego la specie S. xylosus.
Con le realizzazioni della presente invenzione è possibile definire a priori, in funzione della quantità di agente neutralizzante o della miscela degli stessi presente nel terreno, sia la concentrazione cellulare sia l'attività fermentativa della popolazione batterica della coltura starter ottenuta .
Tale possibilità rappresenta un ulteriore vantaggio nei casi in cui si desideri anticipare la maturazione dell'alimento .
La Richiedente ha, infatti, inaspettatamente trovato che una opportuna ridotta attività fermentativa della biomassa batterica, a parità di concentrazione cellulare ottenibile con un medium colturale secondo la seconda realizzazione preferita dell'invenzione, consente di apportare alla materia prima da trasformare, qualora rappresenti un vantaggio tecnologico e industriale, una quantità di enzimi intracellulari (che mediano l'attività proteo/lipolitica a carico delle materie prime, quindi il conseguente sviluppo dell'aroma) in numero superiore a quello che sarebbe apportato da una coltura caratterizzata da un'attività fermentativa maggiore.
Le colture liquide starter secondo le realizzazioni 21. 10195. 12. IT . 1 Don Rn bei 3⁄4lbo
dell'invenzione sono utilizzate come innesti per la preparazione di prodotti dell'industria alimentare (ad esempio, prodotti lattiero-caseari, quali formaggi, yogurt, latti fermentati; pane, prodotti da forno, salumi e insaccati in genere, bevande alcoliche) .
Preferibilmente, dette colture liquide starter sono utilizzate per la preparazione di prodotti dell'industria lattiere-casearia.
Il processo di caseificazione da seguire con le colture starter ad elevata attività fermentativa dell'invenzione è uguale a quello che viene osservato con le colture liquide starter tradizionali; ì prodotti lattiero-caseari che ne derivano possiedono almeno tutte le desiderabili caratteristiche organolettiche ottenibili con dette colture liquide starter tradizionali.
L'inoculo del latte in caldaia con una coltura liquida starter ad elevata attività fermentativa è mediamente inferiore all'1% in volume (V/V), rispetto al volume totale del latte da trattare; preferibilmente, detto inoculo è compreso da 0,2% a 0,8% (V/V) rispetto al latte; più preferibilmente, è compreso da 0,3% a 0,6% (V/V); vantaggiosamente, è <0,5% (V/V).
21.J0195.12.IT.1 Qoti surti Albo 938
Pertanto, a parità di volume di latte da inoculare, è sufficiente l'utilizzo di un volume più ridotto di coltura liquida starter ad elevata attività fermentativa. Per l'inoculo di 1000 litri di latte, ad esempio, saranno sufficienti da 3 a 6 litri di coltura starter secondo la presente invenzione, invece dei 10-50 litri richiesti per gli inoculi dello stesso quantitativo di latte con una coltura lìquida starter nota. Tale volume di coltura liquida starter ad elevata attività fermentativa corrisponde, in termini di resa industriale, misurabile dall'abbassamento dei valori di pH del latte in funzione del tempo, a 10-50 litri di una coltura liquida starter commerciale nota.
A titolo di esempio, assolutamente non limitativo, viene qui di seguito riportata la composizione del medium colturale, oggetto della presente invenzione, con cui sono state sviluppate due colture liquide starter ad elevata attività fermentativa.
Esempio 1 - Medium colturale per la produzione di una coltura liquida starter comprendente il ceppo batterico Streptococcus thermophilus DSM 16506 (depositato da ANIDRAL S.r.l. al DSMZ, in data 18.06.2004) .
Detto medium presenta la seguente composizione ZI . 10195. 12. IT. 1 arsimi Afb 38 B
<(>quantità relative ad un litro di medium colturale): permeato di siero, 8g; peptone di caseina, 12g; estratto di lievito, 5g; CaCC>3, 9g; acqua, quanto basta a raggiungere IL di medium colturale finale.
Seguendo la procedura del metodo di preparazione generale descritto in precedenza, è stata ottenuta, mediante il medium di cui sopra, una coltura liquida starter, per uso lattiero-caseario, avente una concentrazione cellulare finale di Streptococcus thermophilus DSM 16506 equivalente a 3,8·IO<5>CFU/ml di coltura starter.
Esempio 2 - Medium colturale per la produzione di una coltura liquida starter comprendente il ceppo batterico Streptococcus thermophilus DSM 16506.
Detto medium presenta la seguente composizione {quantità relative ad un litro di medium colturale): permeato di siero, 8g; peptone di caseina, 12g; estratto di lievito, 5g; CaC03, 3,6g; K2HPO3⁄4, 9,lg; acqua, quanto basta a raggiungere IL di medium colturale finale.
Seguendo la procedura del metodo di preparazione generale descritto in precedenza, è stata ottenuta, mediante il medium di cui sopra, una coltura liquida starter, per uso lattiero-caseario, avente una concentrazione cellulare finale di Streptococcus 21.10195.12.IT.l R J Butti Albo 8 B
thermophilus DSM 16506 equivalente a 7,1-IO<9>CFU/ml di coltura.
Claims (25)
- 21,10195.12.IT,1 ioti.Rotici gutil18 B RIVENDICAZIONI 1 . Un medium colturale caratterizzato dal fatto di comprendere almeno un agente neutralizzante basico.
- 2. Il medium secondo la rivendicazione 1, in cui detto agente neutralizzante basico è scelto dal gruppo comprendente: ione carbonato, nelle forme mono- e bi-basiche, ione fosfato, nelle forme mono-, bi- e tri-basiche, ione solfato, nelle forme mono- e bì-basiche, ione idrossido, ione citrato, nelle forme mono-, bi- e tri-basiche, ione tartrato, nelle forme mono- e bi-basiche, basi fisiologicamente compatibili con i microrganismi della coltura microbica da sviluppare in detto medium e/o loro miscele.
- 3. Il medium secondo la rivendicazione 2, in cui 1 ' agente neutralizzante è scelto tra: ione carbonato, nelle sue forme mono- e/o bi-basiche, e/o una miscela di ione carbonato e di un altro sale scelto da: monoidrogenofostato di potassio e/o magnesio solfato e/o diidrogenofostato di sodio e/o bicarbonato di sodio e/o tartrato di sodio.
- 4. Il medium secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 , in cui detto agente neutralizzante è presente in una quantità tale da consentire il mantenimento del pH di detto medium 21 .10195,, 12. ϊΐ. 1 Dòti uni A b entro un determinato intervallo, durante la fase di crescita esponenziale della biomassa microbica in detto medium.
- 5. Il medium secondo la rivendicazione 4, in cui la quantità complessiva dì detto agente neutralizzante è ≥2 g/L dì medium colturale; preferibilmente, detta quantità è compresa da 2 g/L a 40 g/L; più preferibilmente, è compresa da 8 g/L a 25 g/L.
- 6. Il medium secondo la rivendicazione 4, in cui detto mantenimento del pH del medium colturale è prolungato per il tempo necessario a che si verifichino da 2 a 5 duplicazioni cellulari di detta biomassa microbica.
- 7. Il medium secondo la rivendicazione 4, in cui detto intervallo entro cui il pH viene mantenuto è compreso da 4,4 a 7,0; preferibilmente, da 4,7 a 6,4; piu preferibilmente, da 5,0 a 5,7.
- 8. Il medium secondo la rivendicazione 7, in cui ì'intervallo entro cui il pH viene mantenuto è compreso da 5,1 a 5,2, nel caso In cui l'agente neutralizzante è carbonato di calcio.
- 9. Un metodo per la preparazione di un medium colturale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, comprendente aggiungere/miscelare una quantità efficace di almeno un agente neutralizzante Zi .10195.12. IT , 1 DotÌRo, Albo PrSS basico in accordo con quanto descritto nella rivendicazione 4 o 5, ad un medium colturale.
- 10. Uso di un medium colturale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 per la preparazione di una coltura liquida starter comprendente almeno un microrganismo fisiologicamente compatibile, in cui detta coltura è caratterizzata da una concentrazione cellulare microbica di detto almeno un microrganismo >10<9>CFU/ml di coltura.
- 11. La coltura liquida starter in accordo con quanto descritto nella rivendicazione 10.
- 12. La coltura secondo la rivendicazione 11, caratterizzata dal fatto che la sua concentrazione cellulare microbica è >1,5*10<9>CFU/ml di coltura.
- 13. La coltura secondo la rivendicazione 12, caratterizzata dal fatto che la sua concentrazione cellulare microbica è >2,5*IO<9>CFU/ml di coltura; preferibilmente, è ≥5·10<9>CFU/ml dì coltura.
- 14. La coltura secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 13, ulteriormente caratterizzata dal fatto che la sua conservabilità è ≥6 giorni, ad una temperatura di conservazione mediamente compresa da 3°C a 5°C.
- 15. La coltura secondo la rivendicazione 14, caratterizzata dal fatto che la sua conservabilità è 21.10195.12.IT,1 D oti R ≥7,5 giorni; preferibilmente, detta conservabilità è ≥10 giorni; più preferibilmente, è ≥13 giorni.
- 16. La coltura secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 15, ulteriormente caratterizzata dal fatto che la sua attività fermentativa è almeno 2 volte superiore a quella delle colture liquide starter note; preferibilmente, è almeno 2,5 volte superiore,
- 17. La coltura secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 16, in cui detta coltura è una coltura ad inoculo diretto.
- 18. La coltura secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 17, in cui detto almeno un microrganismo è scelto dal gruppo di ceppi microbici comprendente i generi; Lactobacillus, Leuconostoc, Bit idobacterium, Lactococcus , Pediococcus, Streptococcus , Bacillus, PropionibacteriumfSaccharoinyces, Enterococcus , Staphylococcus .
- 19. Xa coltura liquida secondo la rivendicazione 18, in cui: - detti ceppi del genere Lactobacillus sono scelti dal gruppo comprendente le specie: L. pentosus, L. plantarum , L . casei/L. casei ssp. paracasei, L. casei ssp. rhamnosus, L, acidophilus , L. delbrueckii ssp. bui cari cus, L. fermentum, L. gasseri; 21 , 10195. 12. ir, 1- detti ceppi del genere Bifìdobacterì um sono scelti dal gruppo comprendente le specie: B. longum, B, breve, B . lactis, B. adolescenti* , B. pseudocatenula tum, B. catenula tum; - detti ceppi del genere Lactococcus sono scelti dal gruppo comprendente le specie: L . lactis e L. lactis ssp. lactis; - detti ceppi del genere Streptococcus sono scelti dai gruppo comprendente la specie S . thermophìlus ; - detti ceppi del genere Staphylococcus sono scelti dal gruppo comprendente la specie S, xylosus.
- 20. Un metodo per la preparazione di una coltura liquida starter secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 19, in cui detto metodo comprende almeno una fase in cui un medium colturale viene addizionato con una quantità efficace di almeno un agente neutralizzante basico in accordo con quanto descrìtto nella rivendicazione 4 o 5.
- 21. Il metodo secondo la rivendicazione 20 , comprendente le seguenti fasi: a) aggiungere ad un medium colturale una quantità di almeno un agente neutralizzante basico; b) dissolvere il medium derivante da a) in un mezzo liquido; preferibilmente, acqua; c) bonificare il bioreattore mediante vapore fluente; 4! 21.preferibilmente, per 30 minuti; d) sottoporre a trattamento termico il medium colturale diluito derivante da b) all'interno del bioreattore; preferibilmente, a 85-90°C per 20-30 minuti; e) raffreddare il medium colturale derivante da d) fino alla temperatura di inoculo; f) inoculare il medium derivante da e) con una quantità efficace di coltura madre di almeno un microrganismo batterico microbico, o di una miscela di microrganismi; q) far sviluppare la biomassa per un tempo sufficiente al verificarsi complessivamente di circa 9 duplicazioni cellulari complessive del/i microrganismo/i , fino a quando il pH del medium colturale scende spontaneamente fino ad un valore compreso da 4,9 a 5,2; h) raffreddare la coltura derivante da g), fino ad una temperatura compresa da 4°C a 8°C.
- 22. Uso di una coltura liquida secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 19 come starter per la preparazione di prodotti dell'industria alimentare.
- 23. L'uso secondo la rivendicazione 22, in cui detti prodotti dell'industria alimentare sono scelti dal gruppo comprendente: prodotti lattiero-caseari, 21. 10195. 12. IT . 1Albo Pi<*> formaggi, yogurt, latti fermentati, pane, prodotti da forno, salumi, insaccati fermentati, bevande alcoliche .
- 24. L'uso secondo la rivendicazione 23, in cui detti prodotti sono scelti tra i prodotti lattiero-caseari.
- 25. Uso di una coltura liquida secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 19 come inoculo diretto del latte. IL MANDATARIO Dotto—Roberto Ma raut ti
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