CN110997897A - 包含罗伊氏乳杆菌cs 132(kctc 11452bp)或其培养物的口腔病原菌抑制组合物 - Google Patents
包含罗伊氏乳杆菌cs 132(kctc 11452bp)或其培养物的口腔病原菌抑制组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种包含罗伊氏乳杆菌CS 132(KCTC 11452BP)或其培养物作为有效成分的口腔病原菌抑制组合物。本发明的罗伊氏乳杆菌CS 132(KCTC 11452BP)对变形链球菌(Streptococcus mutans)、白色念珠菌(Candida albicans)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)具有优秀的抗菌活性，而且具有耐酸性、耐胆汁性及抗生素耐药性优秀的特性。
Description
技术领域
本发明涉及口腔病原菌抑制组合物，更具体而言，涉及一种包含口腔病原菌抑制组合物的抗生用药学组合物，所述口腔病原菌抑制组合物包含罗伊氏乳杆菌CS 132(KCTC11452BP)或其培养物。
背景技术
在人的口腔内，约有400种以上的细菌在繁殖，其菌数约达100亿个。口腔内的细菌混合于人的唾液中，在经过既定时间之后的唾液中，检测到10^6CFU/ml水平的细菌。在这些细菌中，包含诱发牙齿龋齿、牙龈炎和牙周炎或口腔炎的细菌。
据悉，引起蛀牙是由于各种原因共同作用，但最重要的是齿菌斑。齿菌斑中混合有多种细菌，耐酸链球菌和乳酸菌尤其多，其中变形链球菌(Streptococcus mutans)被认为是主要蛀牙菌。这种变形链球菌附着于牙齿表面生长并利用食物内的糖来生成酸，腐蚀牙齿，同时，侵入牙齿骨细胞，导致各种牙槽骨腐蚀和牙龈病。
另一方面，乳酸菌(lactic acid bacteria)作为分解碳水化合物并利用其形成乳酸的细菌，是在缺氧处良好地增殖的兼性厌氧菌或专性厌氧菌。乳酸菌可以分为5个属，分别是链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、双歧杆菌属(Bifidobacteria)及片球菌属(Pediococcus)。据悉，作为链球菌的链球菌属微生物是同型发酵菌，使牛奶发酵而生成乳酸，从而抑制腐败菌或病原菌。据悉，乳杆菌属微生物生产嗜酸菌素(acidophillin)，阻碍痢疾菌、沙门氏菌、葡萄球菌等有害菌的生长，抑制腹泻致病菌的增殖，实现肠道菌群正常化，从而发挥止泻作用。
其中，乳杆菌属微生物作为进行同型或异型发酵的乳酸杆菌，是在乳制品或蔬菜发酵过程中常见的菌，作为双球菌的明串珠菌属微生物进行异型发酵，主要与蔬菜类发酵有关。双歧杆菌属微生物是在有氧气的地方无法生长繁殖的专性厌氧菌，能够对糖进行发酵而生成幼儿能够非常有用地代谢的L(+)型乳酸。片球菌属微生物是具有四联菌形态的同型发酵菌，存在于泡菜或淹渍食品，与香肠等肉类发酵有关。
这种乳酸菌使肠道pH保持酸性，抑制诸如大肠杆菌或梭菌(Clostridium sp.)的有害菌繁殖，不仅改善腹泻或便秘，而且发挥维生素合成、抗癌作用、降低血清胆固醇等作用。
特别是乳酸菌具有能够极强地结合于肠粘膜与上皮细胞的特定蛋白质，给阻止有害细菌生长的肠道调节作用带来巨大帮助。另外据悉，乳酸菌促进巨噬细胞增殖，强化巨噬细胞对肠道有害细菌的认知能力、杀菌能力等，促进免疫相关物质分泌，表现出增强免疫效果(Gabriela perdigon et al.,J.of food Protection 53:404-410,1990；Katsumasasato et al.,Microbiol.Immunol.,32(7):689-698，1988)。
另一方面，乳酸菌作为活菌剂而用作容易摄取的食品添加剂等。当作为活菌剂而摄取乳酸菌时，一般通过口腔摄取，如果能够在这种体内有益乳酸菌中，发掘出蛀牙菌生长抑制活性优秀的乳酸菌并进行利用，则可以在改善肠道微生物环境的同时，营造健康的口腔环境，因而不仅是口腔用医药品，还可以安心地用于食品制造。
发明内容
本发明目的在于提供一种包含对在口腔内存在的变形链球菌(Streptococcusmutans)、白色念珠菌(Candida albicans)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)具有优秀抗菌活性并且耐酸性、耐胆汁性及抗生素耐药性优秀的罗伊氏乳杆菌CS 132(KCTC 11452BP)或其培养物的口腔病原菌抑制组合物。
本发明目的不限于以上提及的内容，未提及的其他目的是本发明所属技术领域的普通技术人员可以从以下记载明确理解的。
根据旨在解决上述技术问题的本发明一种形态，可以提供一种包含罗伊氏乳杆菌CS 132(KCTC 11452BP)或其培养物作为有效成分的口腔病原菌抑制组合物。
另外，所述口腔病原菌可以为变形链球菌(Streptococcus mutans)、白色念珠菌(Candida albicans)或牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)。
另外，所述组合物可以含有罗伊氏乳杆菌CS 132(KCTC 11452BP)菌株103-109cfu/ml，或相对于所述组合物总体积，含有10～30％体积比罗伊氏乳杆菌菌株的培养液。
根据本发明另一形态，本发明可以提供包含CS 132(KCTC 11452BP)或其培养物作为有效成分的用于抑制口腔病原菌的健康功能性食品。
本发明可以提供一种包含对在口腔内存在的变形链球菌(Streptococcusmutans)、白色念珠菌(Candida albicans)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)具有优秀抗菌活性并且耐酸性、耐胆汁性及抗生素耐药性优秀的罗伊氏乳杆菌CS 132(KCTC11452BP)或其培养物的口腔病原菌抑制组合物。
本发明效果不限于以上提及的内容，未提及的其他效果是本发明所属技术领域的技术人员可以从以下记载明确理解的。
附图说明
图1至图4是显示103、105、107及109cfu/ml浓度的罗伊氏乳杆菌CS 132(KCTC11452BP)、罗伊氏乳杆菌Probio-16、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)GG、屎链球菌(Streptococcus faecium)对病原性变形链球菌(Streptococcus mutans)、白色念珠菌(Candida albicans)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的抗菌效果的图。
图5至图7是显示103、105、107及109cfu/ml浓度的罗伊氏乳杆菌CS 132(KCTC11452BP)、罗伊氏乳杆菌Probio-16、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)GG、屎链球菌(Streptococcus faecium)对病原性变形链球菌(Streptococcus mutans)、白色念珠菌(Candida albicans)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的口腔内不溶性葡聚糖生成抑制效果的图。
图8是在MRS培养基中，在0.3％胆汁提取物及多种有无pH条件下比较罗伊氏乳杆菌CS 132及CS 232生长的柱状图(标准偏差显示于各柱的上部，实验是将多个实验重复执行三次-duplicate three times-)。
图9是在MRS-琼脂培养基中，在有无抗生素青霉素G、氨苄青霉素及羟氨苄青霉素条件下比较罗伊氏乳杆菌CS 132、CS 232、Foghat及屎链球菌(S.facium)的生存率(标准偏差显示于各柱的上部，实验是将多个实验重复执行三次-duplicate three times-)。
图10是在MRS-琼脂培养基中，在有无抗生素新霉素、卡那霉素及链霉素条件下比较罗伊氏乳杆菌CS 132、CS 232、Foghat及屎链球菌(S.facium)的生存率(标准偏差显示于各柱的上部，实验是将多个实验重复执行三次-duplicate three times-)。
图11是在MRS-琼脂培养基中，在有无抗生素红霉素及万古霉素条件下比较罗伊氏乳杆菌CS 132、CS 232、Foghat及屎链球菌(S.facium)的生存率(标准偏差显示于各柱的上部，实验是将多个实验重复执行三次-duplicate three times-)。
图12是在MRS-琼脂培养基中，在有无抗生素萘啶酮酸及利福平条件下比较罗伊氏乳杆菌CS 132、CS 232、Foghat及屎链球菌(S.facium)的生存率(标准偏差显示于各柱的上部，实验是将多个实验重复执行三次-duplicate three times-)。
图13是在MRS-琼脂培养基中，在有无抗生素氯霉素及四环素条件下比较罗伊氏乳杆菌CS 132、CS 232、Foghat及屎链球菌(S.facium)的生存率(标准偏差显示于各柱的上部，实验是将多个实验重复执行三次-duplicate three times-)。
图14是确认罗伊氏乳杆菌CS 132、CS 232、Foghat的基因组DNA包含红霉素及万古霉素耐药性基因的照片(标记：100bp大小标记；vanA及vanB：万古霉素耐药性基因；Erm(A)、Erm(B)及Erm(C)：红霉素耐药性基因)。
具体实施方式
如果参照后面与附图一同详细叙述的实施例，本发明的目的及效果以及用于达成其的技术构成将会明确。在说明本发明方面，当判断认为对公知功能或构成的具体说明可能不必要地混淆本发明要旨时，省略其详细说明。而且，后述的术语作为考虑到本发明中的功能而定义的术语，其会因使用者、运用者的意图或惯例等而异。
但是，本发明并非限定于以下公开的实施例，可以以互不相同的多样形态体现。不过，本实施例提供用于使本发明的公开更完整，向本发明所属技术领域的技术人员完整地告知发明的范畴，本发明只由权利要求项的范畴所定义。因此，其定义应以本说明书通篇内容为基础而作出。
在通篇说明书中，当提到某部分“包括”或“具备”某构成要素时，只要没有特别反对的记载，则并非将其他构成要素排除在外，而是意味着可以还包括其他构成要素。
实施例1.本发明中分离的罗伊氏乳杆菌CS 132对蛀牙菌的抗菌活性
1.乳酸菌株的培养
招募健康男性志愿者，收集其粪便。将MRS培养基用作筛选培养基(selectionmedium)，筛选所有过氧化氢酶阴性菌株，用于后续研究。执行形态学(morphology)、革兰氏染色、15℃及45℃下的生长及多样碳源中的发酵试验，根据伯杰氏手册(Bergey's Manual)所示的乳杆菌属特征来执行菌株的鉴定。另外，分离物根据形态学检查及基于API-50CHL试验试剂盒(生物梅里埃公司，美国密苏里州泽尔伍德)的生化特征进行鉴定。
为了分析形态学，实施了革兰氏、孢子染色及荚膜染色，其结果，分离的菌作为革兰氏阳性细菌，在好氧、厌氧条件下同时生长，不形成孢子，无运动性，呈杆菌形态。最终选拔的2个菌株实施基于16S rDNA碱基序列的分子系统分类学分析，结果表现出与罗伊氏乳杆菌标准菌株95％的16s rDNA相同性，鉴定为罗伊氏乳杆菌。所述菌株中的罗伊氏乳杆菌CS 132于2009年1月6日保藏在韩国生物技术研究所基因库中(保藏号KCTC 11452BP)。
2.用作对照组的4种乳酸菌的培养
在本研究中，除罗伊氏乳杆菌CS 132之外，使用了罗伊氏乳杆菌Probio-16、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)GG、屎链球菌(Streptococcusfaecium)等4种乳酸菌株。
罗伊氏乳杆菌Probio-16是经保藏人同意而使用了微生物保存中心保藏的菌株，嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)GG、屎链球菌(Streptococcusfaecium)从韩国细胞库及ATCC购买使用(表1)。各菌株以冻干形态到达，在MRS琼脂培养基培养16-20小时时间后，如果生成菌落，则接种于MRS液体培养基，再培养16-20小时时间。
下表1显示了本发明使用的5种乳酸菌及3种致病性菌株。
[表1]
3.致病性菌株的培养
3种致病性菌株(白色念珠菌、牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌)在ATCC等购买使用，变形链球菌(Streptococcus mutans)涂抹于含有5％马血液的血琼脂平板(哥伦比亚血琼脂基础，阿尔法生物科学公司，美国巴尔的摩)后，培养16-20小时时间，接种于托德·休伊特肉汤(todd-hewittbroth)(奥克希德公司(Oxid)，英格兰汉普郡)，培养16-20小时时间。白色念珠菌(Candida albicans)涂抹于沙氏麦芽糖琼脂(Sabourad Maltose Agar)(贝克顿·迪金森公司，美国斯帕克斯)培养基后，在16-20℃下培养，接种于沙氏麦芽糖肉汤培养基，培养16-20小时时间，在厌氧环境(10％H2、5％CO2及85％N2；37℃)下培养。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)涂抹于布氏琼脂(BBL微生物系统公司，美国马里兰州考基斯维尔)后，在16-20℃下培养，接种于布氏琼脂培养基，在厌氧环境(10％H2、5％CO2及85％N2；37℃)下培养16-20小时时间。
4.琼脂覆盖试验
将5种乳酸菌各1ml的悬浮液(suspension)在MRS肉汤中培养至固定相(stationary phase)后，与包含葡萄糖的融化MRS琼脂混合，倾倒于有盖培养皿，在厌氧性条件下，在37℃下培养20小时时间。变形链球菌在巯基乙酸盐肉汤(TH broth)中培养，白色念珠菌在SAB肉汤中培养，牙龈卟啉单胞菌在胰酶大豆肉汤(TSB broth)中培养后，调整使得光学密度(500nm)达到0.2，移到分离的伯塔尼托盘(Bertani tray)的孔中。利用灭菌的Steers钢销复制器浸于伯塔尼托盘后，将各菌株移到琼脂平板。作为对照组，将各菌株移到无罗伊氏乳杆菌CS 132的琼脂平板。所有平板在厌氧性条件下，在37℃下培养20小时时间后进行评价。
5.不溶性葡聚糖的光学密度(Optical density of insoluble glucan)
在一次性透明小容器(cuvette)中，将变形链球菌、白色念珠菌、牙龈卟啉单胞菌在培养基中培养(存在及不存在罗伊氏乳杆菌CS 132)，24小时后，为了确认不溶性葡聚糖生成量，利用550nm分光光度计进行测量。
6.pH测量
将MRA(支原体)琼脂培养基温度降低至40℃后，添加103cfu/ml的CS 132并制备后，在其上倒入M17、SAB以及TSB琼脂并固化后，培养24小时，测量pH。
在本发明中，从人的粪便中分离培养新型罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)系列的乳酸菌，确认了抗癌活性以及对蛀牙菌的抗菌活性。为了评价分离的乳酸菌对蛀牙菌的抗菌活性，与被认为具有抗菌活性的4个乳酸菌株一同进行评价(表1)。
在无法清洁的口腔内栖息着多样的细菌，这些细菌在口腔内引起多样疾病。据报告，变形链球菌作为主要在蛀牙患者中发现的细菌，牙龈卟啉单胞菌作为主要在牙龈炎和牙周炎患者中发现的细菌，白色念珠菌作为主要在口腔内口腔炎患者中发现的细菌，他们引起口腔疾病。因此，针对从粪便分离的乳酸菌和报告称有抗菌活性的4种菌在内共计5种菌株，评价对引起口腔内疾病的菌株的抗菌活性，确认所分离的乳酸菌是否能够作为抗生素使用。
利用以蒸馏水连续稀释各乳酸菌的方法，稀释成103、105、107、109cfu/ml，与3种细菌同时培养，确认是否抑制细菌增殖。结果在103cfu/ml下，屎链球菌在白色念珠菌中表现出弱抗菌活性，罗伊氏乳杆菌Probio-16在牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌中表现出弱抗菌活性，罗伊氏乳杆菌CS 132在3种菌株中均表现出弱抗菌活性(表2、图1-图4)。在105cfu/ml下，屎链球菌在白色念珠菌中表现出弱抗菌活性，鼠李糖乳杆菌GG在3种菌株中均表现出弱抗菌活性，嗜酸乳杆菌在牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌中表现出弱抗菌活性，罗伊氏乳杆菌Probio-16在牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌中表现出弱抗菌活性，罗伊氏乳杆菌CS 132在3种菌株中均表现出弱抗菌活性(表2、图1-图4)。使用的五种菌株中，在低浓度下也均对病原菌表现出弱抗菌活性(图1-图4)。
下表2显示了本发明分离的罗伊氏乳杆菌菌株不同浓度处理下的对3种致病性菌株的抗菌效果。
[表2]
另据报告，3种病原菌利用口腔内糖份来制造不溶性葡聚糖而生活，在本研究中，也确认了3种病原菌在乳酸菌存在下是否生成不溶性葡聚糖。大致可以确认五种乳酸菌株均抑制不溶性葡聚糖的生成，需要特殊指出的是，罗伊氏乳杆菌CS 132在103cfu/ml的低浓度下，在3种细菌中均表现出有意义的减少现象(图5-图7)。
另据报告，3种致病性菌株均在酸性下表现出活跃的活性，但在pH为5-7左右的中性环境下，不溶性葡聚糖的生成活跃。据报告，乳酸菌株以糖为能量源，分泌乳酸而使周边酸性化。因此，如果pH低于5-7，则认为不溶性葡聚糖的生成受到抑制，为了测量乳酸菌栖息场所的酸度，测量了乳酸菌的pH。结果，测量为最低3.6、最高4.5。这确认了是病原性细菌难以生成不溶性葡聚糖的条件(表3)。
下表3显示了将五种乳酸菌103cfu/ml在M17、SAB及TSB培养基中培养后测量的最终pH结果。
[表3]
根据以上结果，确认了乳酸菌形成能够抑制病原菌活动所需的不溶性葡聚糖生成的环境，不仅实际抑制不溶性葡聚糖的合成，而且，对3种致病性菌株具有抗菌活性，确认了罗伊氏乳杆菌CS 132比对照组四种乳酸菌株表现出更卓越的抗菌活性。
实施例2.耐酸性、耐胆汁性及抗生素耐药性特性
1.使用菌株
罗伊氏乳杆菌CS 132、罗伊氏乳杆菌CS232及Foghat((株)真生物)使用冻干状态者，屎链球菌菌株购买市面上销售的胶囊(韩美药品公司，Medilac-DS肠溶胶囊250mg)使用。各菌株相对于培养基体积按1/1000(v/v)比率稀释，接种于MRS(贝克顿·迪金森公司，美国斯帕克斯)后，在37℃下培养24小时。培养的菌株为了保持冻干之前状态的活性，从接种至培养反复1次。使用的培养基是将MRS介质(贝克顿·迪金森公司)溶解于3次蒸馏水后，在121℃下灭菌20分钟，然后在4℃下保管，使用时预热到37℃使用。
2.耐胆汁性及耐酸性测试
2-1:试验方法
耐胆汁性遵照帕克(Park)等(1996)的方法，简单而言，在MRS液体培养基中添加0.3％胆汁提取物，每次2％，接种罗伊氏乳杆菌CS 132、CS232菌，在37℃下培养24小时时间，培养结束后，在BCP琼脂培养基中测量活菌数。
耐酸性试验遵照克拉克(Clark)等(1996)的方法，简单而言，将1N HCl稀释于蒸馏水，准备MRS中性肉汤(pH 6.4)和MRS酸性肉汤(pH 1、3、4.5)，将在37℃MRS肉汤中培养24小时时间的菌株分别按107cfu/mL水平接种，在37℃中培养3小时时间，利用BCP琼脂培养基测量活菌数。
2-2:试验结果
罗伊氏乳杆菌CS 132、CS232菌株的耐胆汁性及耐酸性测试，分别利用在胆汁提取物0.3％和pH 1、3、4.5及pH 6.4下生长的菌数进行测量。结果，在胆汁提取物0.3％条件的耐胆汁性测试中，在未处理组中，罗伊氏乳杆菌CS 132为1X109cfu/ml，罗伊氏乳杆菌CS232为9.9X108cfu/ml，相反，在处理组中，罗伊氏乳杆菌CS 132为4.7X108cfu/ml，罗伊氏乳杆菌CS 232为4.5X108cfu/ml，分别表现出47％和45％的生存率(图8)。
这与Joo(2003)从开菲尔(在高加索山区饮用的膨化发酵乳，通过发酵乳制得的饮料)分离的乳酸菌在添加了胆汁提取物0.3％的MRS肉汤中表现出44％的存活率为同一水平。
耐酸性测量在与胃酸类似的pH条件下实施。结果，在罗伊氏乳杆菌CS 132和CS232之间未出现较大差异，在pH 6.4下，两种菌株分别表现出1X109cfu/ml和9.9X108cfu/ml的数值，相反，在pH 4.5下，分别表现出9.4X108cfu/ml(94％)和9.0X108cfu/ml(90％)的数值，在pH 3下，表现出5.0X108cfu/ml(50％)和4.7X108cfu/ml(47％)的数值，在pH 1下，表现出1.3X108cfu/ml(13％)和1.2X108cfu/ml(12％)的数值。与克拉克(Clark)等(1993)在市销的酸奶制造中大量使用的长双歧杆菌菌株在pH 3下表现出12％的低生存力的结果相比，上述结果为较高数值，可以评价为耐酸性高。
3.抗生素耐药性测试
3-1：试验方法
使用的抗生素共12种，将5种系列的抗生素分别各选择2-3种使用。各抗生素溶解于指定的溶剂，经0.2um注射器式过滤器(赛多利斯公司，德国哥廷根)过滤使用，在-70℃下保管直至下次使用，使用量显示于表4中。
针对厌氧培养的菌株，在含有0.05％L-半胱氨酸的MRS琼脂培养基中，根据各抗生素浓度来稀释抗生素并添加，在添加后的培养基(表4)中，接种分光光度计595nM下吸光度值为0.5时的菌株200ul后，在厌氧条件下，在37℃下培养24小时时间。形成菌落后，利用菌落计数器(Colony counter)，计数在各培养基中生长的菌株数，将其结果值量化成相对于对照组的实验组生存的细胞数百分比。
使用的抗生素为5个系列12种(表4)，各个的浓度遵照拉比亚(Labia)(2008)等的方法。使用的浓度为固体培养基的浓度。将各个抗生素按表4所示浓度，对4种菌株的罗伊氏乳杆菌CS 132、罗伊氏乳杆菌CS 232、Foghat及屎链球菌(S.facium)进行处理，培养24小时后测量了细胞数(表4为抗生素及使用浓度)。
[表4]
3-2：试验结果
其结果，在b-内醯胺系列抗生素青霉素G中表现出72％、73％、54％、45％的生存率，在羟氨苄青霉素中表现出75％、73％、67％、64％，但在氨苄青霉素中，四种菌均表现出0％的生存率(图9)。
在氨基糖苷类系列中，在新霉素中表现出68％、65％、54％、52％的生存率，在卡那霉素中表现出52％、51％、68％、53％的生存率，在链霉素中表现出65％、67％、57％、48％的生存率(图10)。
在革兰氏阳性谱系列中，在红霉素中表现出52％、51％、52％、38％的生存率，在万古霉素中，表现出45％、43％、47％、35％的生存率(图11)。乳酸菌为革兰氏阳性细菌，万古霉素不仅杀灭革兰氏阳性系列细菌，而且考虑到是现在使用的抗生素中最强力的抗生素，本申请发明的菌株罗伊氏乳杆菌CS 132及CS 232所呈现的上述结果为相当高的水平，暗示本申请发明的菌株的抗生素耐药性特性优秀。
在革兰氏阴性谱系列中，在萘啶酸中表现出68％、55％、58％、52％的生存率，在利福平中表现出51％、50％、43％、42％的生存率(图12)。
另外，在广谱系列中，在氯霉素中表现出64％、64％、62％、60％的生存率，在四环素中表现出68％、67％、0％、0％的生存率(图12)。
根据上述结果，在使用的五种系列抗生素中，在除氨苄青霉素外的b-内醯胺系列中表现出最大耐药性，耐药性表现依次为氨基糖苷类、广谱、革兰氏阴性及革兰氏阳性。
因此，本申请发明的菌株不仅对一般使用频率较高的抗生素具有高耐药性，而且在被认为特异性杀菌与本菌株相同的革兰氏阳性细菌的红霉素、作为现在使用抗生素中最强抗生素的万古霉素中，也表现出相当的抗生素耐药性特性。因此，利用本申请开发的菌株，可以应对抗生素滥用导致的体内抗生素残留问题，不仅是食品或饲料添加剂等用途，通过将对诸如抗生素等有害物质具有耐药性的乳酸菌制成产品，有望恢复肠道细菌群平衡，利用细菌群落的代谢物等，去除对老化、免疫、营养、感染等产生巨大影响的因子，从而改善、维持健康。
4.抗生素耐药性基因的确认
4-1：试验方法
利用PCR方法，确认了是否存在诱导对抗生素耐药性的基因。针对培养的菌株，利用细菌基因组DNA制备试剂盒(索肯特(Solgent)，大田广域市儒城区)收得DNA，利用收得的DNA和PCR(聚合酶链反应)预混料(百奥尼(Bioneer)，大田广域市大德区)以及引物(表5)执行PCR。实验条件根据通常的方法进行，但退火温度遵照表5。
[表5]
4-2：试验结果
利用PCR方法，确认了罗伊氏乳杆菌CS 132、罗伊氏乳杆菌CS 232以及Foghat乳酸菌是否包含对作为革兰氏阳性谱系列抗生素的红霉素和万古霉素的耐药性基因。红霉素确认是否存在Erm(A)、Erm(B)和Erm(C)基因，万古霉素确认是否存在van(A)和van(B)基因，为此，使用了表5的引物。结果显示，在罗伊氏乳杆菌CS 132中，Erm(A)、Erm(B)和Erm(C)基因比较强地表达，在罗伊氏乳杆菌CS 232和foghat中虽然表达，但与罗伊氏乳杆菌CS 132相比，呈现较低的表达形态。van(A)和van(B)基因也在罗伊氏乳杆菌CS 132中呈现强表达，但在罗伊氏乳杆菌CS 232和foghat中呈现较低形态(参照图13)。
在本说明书和附图中，对本发明优选实施例进行了公开，虽然使用了特定用语，但这只是为了更容易说明本发明技术内容和帮助理解发明而从一般意义上使用的，并非要限制本发明的范围。除了在此公开的实施例外，也可以实施立足于本发明技术思想的其他变形例，这是本发明所属技术领域的普通技术人员不言而喻的。
Claims (4)
1.一种包含罗伊氏乳杆菌CS 132(KCTC 11452BP)或其培养物作为有效成分的口腔病原菌抑制组合物。
2.根据权利要求1所述的口腔病原菌抑制组合物，其特征在于，
所述口腔病原菌为变形链球菌(Streptococcus mutans)、白色念珠菌(Candidaalbicans)或牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)。
3.根据权利要求1所述的口腔病原菌抑制组合物，其特征在于，
所述组合物含有罗伊氏乳杆菌CS 132(KCTC 11452BP)菌株103-109cfu/ml，或相对于所述组合物总体积，包含10～30％体积比罗伊氏乳杆菌菌株的培养液。
4.一种包含罗伊氏乳杆菌CS 132(KCTC 11452BP)或其培养物作为有效成分的用于抑制口腔病原菌的健康功能性食品。
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