KR100973977B1 - 신규한 락토바실러스 속 미생물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 락토바실러스 속 미생물 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 내산성, 내담즙성 및 항생제 내성 특성이 우수하여 정장용, 식품첨가용 또는 사료첨가용으로 유용한 락토바실러스 루테리 CS 132가 제공된다.
유산균, 항생제 내성, 정장, 생균제
Description
본 발명은 신규한 락토바실러스 속 미생물 및 이의 용도에 관한 것이다.
사람의 장 내에는 100조에 달하는 균체가 존재하며 고형 분변의 약 30%를 차지한다. 이들 중에는 클로스트리디움과 같은 부패세균이 존재하기도 하고, 비피도박테리움, 락토바실러스와 같은 유익한 유산균 또한 존재하여 상호 균형을 유지하고 있다.
락토바실러스는 그람 양성의 편성 혐기성 세균으로 장내 서식하며 비타민, 아미노산, 단백질 등의 장내합성뿐만 아니라 면역강화, 소화촉진 등의 작용을 하며 장내세균을 안정화시킨다. 또한, 정상인의 장내에서 초산과 젖산 등 유기산을 생성하여 장내 부패세균의 성장을 억제할 뿐 아니라 대장내 병원성 세균의 생육 억제와 암 발생을 줄이는 효과가 있고, 설사, 변비 등의 장 질환에 많은 유익한 효과를 보이고 있으며, 돌연변이 원성물질의 흡착에 의한 항돌연변이 활성을 가지는 것으로 보고되어 있다.
지금까지 락토바실러스는 발효유나 분유 등 생균 형태로 이용되었으나 최근에는 대사산물 중 유용한 기능성을 가진 물질을 분리, 정제하려는 연구가 시도되고 있으며, 락토바실러스가 생산하는 다당류에 의한 항암활성이 보고되면서 고기능성 식품, 의약품 소재로서의 가능성이 매우 높은 물질로 인식되고 있다.
한편, 항생제의 오·남용과 이에 따른 항생제 내성 균주의 증가는 질병 예방 및 치료에 가장 큰 문제점으로 지적되고 있다. 축산물의 경우 항생제 잔류 문제에 의해 이를 섭취하는 사람의 건강까지 위협하는 상황이 초래되어 최근 가축사료 내 항생제의 사용을 엄격히 규제하고 있는 실정이다.
따라서, 새로운 프로바이오틱스 제제로 이용하기 위해서는 유산균이 가지는 정장이나 항균 활성 등의 유익한 효과와 더불어 인체 내로의 침투성 및 항생제 내성 특성 등이 고려되어야 한다. 본 발명에서는 신규한 락토바실러스 루테리균의 내산성, 내담즙성 및 항생제 내성의 특성을 확인하여 프로바이오틱스 제제 개발을 위한 새로운 미생물을 제공하고자 한다.
본 발명의 과제는 내산성, 내담즙성 및 항생제 내성을 가지는 신규한 락토바실러스 속 미생물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여
본 발명의 일 측면에 따르면,
신규한 미생물 락토바실러스 루테리 CS 132(기탁번호 KCTC 11452BP)를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 측면에 따르면,
상기 락토바실러스 루테리 CS 132 또는 그 배양물을 포함하는 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 내산성, 내담즙성 및 항생제 내성이 뛰어나 정장용, 식품용 또는 사료용 조성물에 유용한 신규한 유산균인 락토바실러스 루테리 CS 132(기탁번호 KCTC 11452BP)을 제공한다.
본 발명에 따른 유산균은 다음과 같은 방법에 의해 분리 및 동정되었다. 본 발명자는 사람의 분변으로부터 유산균 선별 배지를 이용하여 유산균만을 분리하고 이 중에서 내산성 및 내담즙산성이 우수한 균주를 분리하였다.
최종 선발된 유산균은 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석을 실시하였다. 그 결과, 본 발명에서 분리한 균주는 락토바실러스 루테리로 동정되었다. 본 발명자들은 분리된 균주를 락토바실러스 루테리 CS 132라 명명하고 2009년 1월 6일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 KCTC 11452BP로 기탁하였다.
본 발명에서 처음으로 분리 및 동정된 유산균 락토바실러스 루테리 CS 132는 다음과 같은 특성을 지닌다.
첫째, 본 발명에 따른 유산균은 우수한 내산성 및 내담즙성을 보인다.
둘째, 본 발명에 따른 유산균은 항생제 내성이 뛰어나다.
유산균은 구강투여시 장으로 이동하는 과정에서 위에 존재하는 위액과 담즙에 의해 사멸될 수 있다. 이에, 본 발명에서는 위액 및 담즙과 유사한 조건 하에서 유산균의 생존률을 평가하였다. 그 결과 체내와 동일한 담즙의 농도에서 락토바실러스 루테리 CS 132(L. reuteri CS 132)와 락토바실러스 루테리(L. reuteri CS 232) 모두 40% 이상의 생존률을 보였으며 강산의 경우 pH 3에서는 47% 이상, PH 1에서는 1.2% 이상의 생존률을 보여 위를 거쳐 장까지 충분히 도달가능한 것으로 확인되었다. 위의 결과는 본 발명의 미생물을 생균제 형태로 충분히 이용할 수 있음을 시사한다.
다음으로, 널리 사용되고 있는 항생제에 내성 특성을 확인하였다. 그 결과 사용된 모든 항생제에서 40% 이상의 높은 생존률을 보였다. 특히 그람 양성균인 유산균이 그람 양성 계열 항생제에서 43% 이상의 높은 생존률을 보인 것은 주목할 만하다. 이에, 그람 양성 계열 항생제인 에리트로마이신과 반코마이신에 내성을 가질 수 있는 유전자의 존재 유무를 PCR 기법을 이용하여 확인한 결과 두 항생제에서 내성을 가지는 유전자를 보유하고 있음을 확인하였다.
상기 본 발명에 따른 유산균 락토바실러스 루테리 CS 132은 통상적인 유산균의 배양법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양 배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, MRS(Man-Rogosa-Sharp) 액체 배지 및 우유가 첨가된 액체 배지를 사용할 수 있다.
배양은 통상의 유산균 배양 조건으로 수행할 수 있으며, 예를 들어 약 15-45℃에서 약 10-72시간 동안 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 냉동건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 미생물은 당업계에 공지된 통상적인 물리화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 가지거나 또는 이보다 우수한 활성을 가지도록 개선 또는 개량될 수 있다.
한편, 본 발명의 락토바실러스 루테리 CS 132은 내산성 및 내담즙성, 항생제 내성이 우수하여 발효식품의 종균, 정장용 조성물, 사료첨가용 또는 항균용 조성물 로 유용하다. 상기 조성물은 생균제 형태로 제공될 수 있다.
상기에서 '정장용'이란 사람이나 동물의 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반증상을 치료 및 개선하는 용도를 말한다. 상기 증상으로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 유해 미생물에 의한 감염성 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증 및 장 급이성 설사 등이 포함된다.
상기에서 '생균제'는 살아 있는 균 즉, 사람이나 동물이 섭취했을 때 위장관 에 머물러 생존할 수 있는 미생물로서 특정 병리 상태를 예방하거나 치료할 수 있는 효과가 있는 미생물 제제를 말한다. 일반적으로 생균제는 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반 증상을 치료하고 개선하는 효과가 있으며 사람 및 동물에 투여되면 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해 미생물이 정착하지 못하게 하는 작용을 하며 유산을 생성하여 장내 pH를 낮추어서 유해 미생물의 증식을 억제한다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 루테리 CS 132 또는 이의 배양물은 식품 또는 식품첨가용 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 본 발명의 유산균 또는 이의 배양물과 적합한 담체, 부형제 또는 보조성분 등을 혼합하여 분말제, 과립제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태로 제조할 수 있다. 나아가, 본 발명의 유산균은 발효제품의 제조를 위한 종균으로 사용될 수 있다. 상기 발효제품으로는 과채류 발효 음료, 햄 및 소시지와 같은 발효육 제품, 발효 생식 제품, 치즈, 버터밀크, 요구르크, 유청 등과 같은 발효유 제품 및 김치 등이 포함된다. 상기 발효제품은 본 발명의 유산균을 사용하여 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 루테리 CS 132 또는 이의 배양물은 사료 조성물 또는 사료첨가용 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 상기 사료 조성물은 기존 항생제의 대체용으로 사용되어 장내 유해균의 생육을 억제하며 장내 균총을 안정되게 유지하여 가축의 건강상태를 양호하게 하여 가축의 증체량과 육질을 개선시키고 산유량 및 면역력을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 이에 한정되 지는 않으나 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 유산균과 여러 가지 미생물 또는 효소를 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 유산균을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명의 유산균으로 발효시킴으로써 제조할 수 있다.
또한, 상기 본 발명에 따른 조성물들은 본 발명의 유산균과 함께 인간을 포함하는 동물이 섭취하기에 적합하고 섭취시 유해 미생물의 생육을 억제하며 장내 균총의 균형을 개선시키는 활성을 가지는 다른 종류의 공지된 미생물을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 미생물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisease) 등을 들 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 루테리 CS 132는 내산성, 내담즙성 및 항생제 내성 특성이 우수하여 정장용, 식품첨가용 또는 사료첨가용 조성물에 사용될 수 있다.
이하, 본 발명은 하기 실시예에 의해 상세하게 설명하나 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 균주의 분리 및 동정
건강한 남성 지원자를 모집하여 그 분변을 수집하였다. MRS 배지를 선택 배지(selection medium)로 사용하여 모든 카탈라아제 음성 균주를 선별하여 이후의 연구에 사용하였다.
균주의 동정은 박테리오스코피(morphology), 그람 염색, 15℃ 및 45℃에서의 성장 및 다양한 탄소원에서의 발효 시험을 수행하여 Bergey's Manual에 제시된 바와 같은 락토바실러스의 특징에 근거하여 행해졌다. 또한, 분리물은 형태학적 검시 및 API-50 CHL 테스트 키트(bioMerieux Vitek Inc., Hazel Wood, MO, USA)에 의한 생화학적 프로파일에 근거하여 동정되었다. morphology를 분석하기 위하여, 그람, 스포어 및 캡슐 염색을 실시하였다.
그 결과, 분리된 균은 그람 양성의 세균으로 호기, 혐기적인 조건에서 동시에 성장하며 포자를 형성하지 않고, 운동성이 없으며, 간균의 형태를 띠었다.
최종 선발된 2 균주는 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석을 실시한 결과 락토바실러스 루테리 표준 균주와 95%의 16s rDNA 상동성을 보여주어 락토바실러스 루테리로 동정하였다.
상기 균주를 락토바실러스 루테리 CS 132(Lactobacillus reuteri CS 132) 및 락토바실러스 루테리 CS 232로 명명하였고, 이중 락토바실러스 루테리 CS 132는 2009년 1월 6일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호 KCTC 11452BP).
실시예
2: 균주의 특성 테스트
1. 사용 균주
L. reuteri CS 132, L. reuteri 232 및 퍼거트(Foghat, (주)참바이오)는 동결건조된 상태의 것을 사용하였고, Streptococcus faecium 균주는 시중에 시판되고 있는 캡슐(한미약품, 메디락-디에스 장용 캡슐 250mg)을 구입하여 사용하였다. 각 균주는 배지 부피 대비 1/1000 (v/v) 비율로 희석하여 MRS media(Becton Dickinson, Cockeysville, MD)에 접종한 후 37℃, 24시간 배양하였다. 배양된 균주는 동결건조 이전상태의 활성을 유지하기 위하여 접종부터 배양까지 1회 반복하였다. 사용된 배지는 MRS media(Becton Dickinson)를 3차 증류수에 용해하고 121℃, 20분간 멸균한 후 4℃에 보관하고 사용시 37℃로 예열하여 사용하였다.
2. 내담즙성 및 내산성 테스트
2-1: 시험방법
내담즙성은 Park 등(1996)의 방법을 따랐으며 간략히 기술하면, MRS 액체 배지에 0.3% bile extract을 첨가하고, lactobacillus reuteri CS132, 232균을 2%씩 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양 하였으며, 배양종료 후 BCP 한천배지에서 생균수를 측정하였다.
내산성 시험은 Clark 등(1996)의 방법을 따랐으며, 간략히 기술하면, 1 N HCl을 증류수에 희석하여 MRS 중성 broth(pH 6.4)와 MRS 산성 broth(pH 1, 3, 4.5)를 준비하고, 37℃ MRS broth에서 24시간 동안 배양된 균주를 각각 107 cfu/mL 수준으로 접종하여 37℃ 에서 3시간 동안 배양하고, BCP 한천배지로 생균수를 측정하였다.
2-2: 시험결과
락토바실러스 루테리 CS 132, 232 균주의 내담즙성 및 내산성 테스트는 각각 bile extract 0.3%와 pH 1, 3, 4.5 및 pH 6.4에서 성장한 균의 수로 측정하여 실시하였다. 그 결과, bile extract 0.3%의 조건의 내담즙성 테스트에서는 무처리군에서 Lactobacillus reuteri CS 132는 1X109 cfu/ml, Lactobacillus reuteri CS 232는 9.9X108 cfu/ml인 반면 처리군에서는 Lactobacillus reuteri CS 132는 4.7X108 cfu/ml을, Lactobacillus reuteri CS 232는 4.5X108 cfu/ml로 각각 47% 와 45%의 생존률을 보였다(도 1).
이는 Joo(2003)의 bile extract 0.3%를 첨가한 MRS broth에서 kefir(카프카스의 산악지대에서 음용되는 발포성 발효유. 우유를 발효시켜 만든 음료)로부터 분리한 유산균이 44%의 생존율을 보인 것과 같은 수준이다.
내산성 측정은 위산과 유사한 pH 조건에서 실시하였다. 그 결과 Lactobacillus reuteri CS 132와 232 사이에는 큰 차이를 보이지 않았고, pH 6.4의 경우 두 균주에서 1X109 cfu/ml 와 9.9X108 cfu/ml였던 반면, pH 4.5에서는 9.4 X108 cfu/ml (94%)과 9.0 X108 cfu/ml (90%)을, pH 3에서는 5.0 X108 cfu/ml (50%)과 4.7 X108 cfu/ml (47%)을, pH 1에서는 1.3 X108 cfu/ml (13%)과 1.2 X108 cfu/ml(12%)의 수치를 나타내었다. 상기 결과는 시판되는 요구르트 제조에 많이 사용되고 있는 Bifidobacterium longum 균주가 pH 3에서는 12%의 낮은 생존력을 보였다는 Clark 등(1993)의 결과에 비해 다소 높은 수치로서, 내산성이 높다고 평가할 수 있다.
3.
항생제 내성 테스트
3-1 : 시험방법
사용된 항생제는 총 12종으로 5가지 계열의 항생제를 각각 2-3종씩 선택하여 사용하였다. 각 항생제는 지정된 용매에 용해하여 0.2 um 시린지 필터 (Sartorius, Goettingen, Germany)에 여과하여 사용하였고 다음 사용시까지 -70℃에 보관하였으며 사용량은 표 1에 나타내었다.
혐기적으로 배양된 균주를 0.05% L-시스테인이 함유된 MRS 한천 배지에 각 항생제의 농도에 따라 항생제를 희석하여 첨가한 배지(표 1)에 Spectrophotometer로 595 nM에서 흡광도 값이 0.5일때의 균주 200ul를 접종한 후 혐기적 조건에서 37℃, 24시간 동안 배양하였다. 콜로니가 형성되면 콜로니 계수기(Colony counter)를 이용하여 각 배지에서 자란 균주수를 계수하고 그 결과값을 대조군 대비 실험군에서 생존한 세포수를 퍼센트 값으로 수치화 하였다.
사용된 항생제는 5개 계열 12종(표 1)이며, 각각의 농도는 Labia(2008) 등의 방법을 따랐다. 사용된 농도는 고체배지상의 농도이다. 각각의 항생제를 4종의 균주 L. reuteri CS 132, L. reuteri CS 232, Foghat 및 S. facium에 표 1에서와 같은 농도를 처리하고 24시간 배양한 후 세포수를 측정하였다.
[표 1] 항생제 및 사용된 농도
| 항생제 | 항생제 농도 범위(㎍/ml) | 사용된 농도 (㎍/ml) |
| b-Lactam | ||
| penicillin G | 2-64 | 4(2)a |
| ampicillin | 1-32 | 0.5(2) |
| amoxicillin | 2/1-32/16 | 2(2) |
| Aminoglycoside | ||
| neomycin | 2-32 | 16(1) |
| kanamycin | 128-2048 | 256(2) |
| streptomycin | 4-2048 | 256(2) |
| Gram-positive spectrum | ||
| erythromycin | 0.5-64 | 8(1) |
| vancomycin | 2-32 | 4(2) |
| Gram-negative spectrum | ||
| nalidixic acid | 4-46 | 32(1) |
| rifampicin | 1-45 | 5(3) |
| Broad spectrum | ||
| chloramphenicol | 2-64 | 16(2) |
| tetracycline | 2-32 | 4(2) |
| a (1): (Ouoba et al, 2008), (2) : (Danielsen and Wind, 2003), (3) : (Zhou et al, 2003). |
||
3-2 : 시험결과
그 결과 b-Lactam 계열 항생제 페닐실린 G에서는 72%, 73%, 54%, 45%의 생존률을, 아목시실린에서는 75%, 73%, 67%, 64%를 보였으나 앰피실린에서는 네 종류 균 모두 0%의 생존률을 보였다(도 2a).
아미노글리코시드 계열에서는 네오마이신은 68%, 65%, 54%, 52%의 생존률을, 가나마이신에서는 52%, 51%, 68%, 53% 그리고 스트렙토마이신에서는 65%, 67%, 57%, 48%의 생존률을 보였다 (도 2b).
그람 양성 스펙트럼 계열에서는 에리트로마이신은 52%, 51%, 52%, 38%를 반코마이신에서는 45%, 43%, 47%, 35%의 생존률을 보였다 (도 2c). 유산균이 그람 양성 세균이며, 반코마이신은 그람 양성계열 세균을 살균할 뿐 아니라 현재 사용되고 있는 항생제 중 가장 강력한 항생제임을 고려할 때, 본원발명의 균주 락토바실러스 루테리 CS 132 및 CS 232가 보여주는 위의 결과는 상당히 높은 수준으로서, 본원발명의 균주가 항생제 내성 특성이 우수함을 시사한다.
그람 음성 스펙트럼 계열에서는 날리디식 산은 68%, 55%, 58%, 52%를, 리팜피신에서 51%, 50%, 43%, 42%의 생존률을 보였다 (도 2d).
또한, 브로드 스펙트럼 계열은 클로람페니콜에서 64%, 64%, 62%, 60%의 생존률을, 테트라사이클린에서는 68%, 67%, 0%, 0%의 생존률을 각각 보였다(도 2d).
위의 결과에 의하면 사용된 5가지 계열의 항생제에서 앰피실린을 제외한 b-Lactam 계열에서 가장 큰 내성을 보였고, 아미노글리코시드, 브로드 스펙트럼, 그람 음성 및 그람 양성 순으로 내성을 보였다.
따라서, 본원발명의 균주는 일반적으로 많은 사용빈도를 보이고 있는 항생제에 높은 내성을 가질 뿐 아니라 본 균주와 같은 그람 양성세균에 특이적으로 살균하는 것으로 보고된 에리트로마이신과, 사용되고 있는 항생제 중 가장 강한 항생제인 반코마이신에서도 상당한 항생제 내성 특성을 보였다. 이에 본원에서 개발된 균 주를 이용하여 무분별한 항생제 사용으로 인하여 야기되는 체내 항생제 잔류 문제에 대처할 수 있고, 식품이나 사료첨가제 등의 용도뿐만 아니라, 항생제와 같은 유해물질에 내성을 갖는 유산균을 제품화함으로써 장내 세균군집의 균형을 회복시키고 세균군집의 대사산물 등을 이용하여 노화, 면역, 영양, 감염 등에 지대한 영향을 미치는 인자들을 제거함으로써 건강을 개선, 유지하고자 한다.
4. 항생제 내성유전자 확인
4-1 : 시험방법
항생제에 내성을 유도하는 유전자의 유무를 PCR 기법을 이용하여 확인하였다. 배양된 균주를 Genomic DNA Prep Kit for Bacteria (Solgent, 대전광역시 유성구)를 이용하여 DNA를 수확하고, 수확된 DNA와 PCR premix(Bioneer, 대전광역시 대덕구) 그리고 프라이머(표 2)를 이용하여 PCR을 수행한다. 실험 조건은 통상적인 방법에 의해 진행하였으나 어닐링 온도는 표 2를 따랐다.
[표 2]
| 항생제 | 내성 유전자 | 프라이머 | 어닐링 온도(℃) |
| Vancomycin | VanA | 5′-AAC AAC TTA CGC GGC ACT-3′ | 55 |
| 5′-AAA GTG CGA AAA ACC TTG C-3′ | |||
| VanB | 5′-GAT ATT CAA AGC TCC GCA GC-3′ | 55 | |
| 5′-TGA TGG ATG CGG AAG ATA CC-3′ | |||
| Erythromycin | erm (A) | 5′-AAG CGG TAA AAC CCC TCT GAG-3′ | 55 |
| 5′-TCA AAG CCT GTC GGA ATT GG-3′ | |||
| erm (B) | 5′-CAT TTA ACG ACG AAA CTG GC-3′ | 52 | |
| 5′-GGA ACA TCT GTG GTA TGG CG-3′ | |||
| erm (C) | 5′-CAA ACC CGT ATT CCA CGA TT-3′ | 48 | |
| 5′-ATC TTT GAA ATC GGC TCA GG-3′ |
4-2 : 시험결과
L. reuteri CS 132, L. reuteri CS 232 그리고 Foghat 유산균이 그람 양성 스펙트럼 계열의 항생제인 에리트로마이신과 반코마이신에 대한 내성유전자 포함 여부를 PCR 기법을 이용하여 확인하였다. 에리트로마이신은 Erm(A), Erm(B)와 Erm(C) 유전자를, 반코마이신은 van(A)와 van(B) 유전자의 존재 여부를 확인하였으며 이를 위해 표 2의 프라이머를 사용하였다. 그 결과 L. reuteri CS 132에서는 Erm(A), Erm(B)와 Erm(C) 유전자가 비교적 강하게 발현되었으며 L. reuteri CS 232와 foghat에서는 발현은 되었지만 L. reuteri CS 132와 비교하여 다소 낮은 발현 양상을 보였다. van(A) 와 van(B) 유전자도 L. reuteri CS 132에서는 강한 발현 양상을 보였으나 L. reuteri CS 232와 foghat에서는 다소 낮은 양상을 보였다 (도 3 참조).
이상 첨부된 표를 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
도 1은 MRS 배지에서 0.3% bile extract 및 여러 pH 조건 유무 하에서 락토바실러스 루테리 CS 132 및 CS 232의 성장을 비교한 막대그래프이고(표준편차는 각 막대의 상부에 나타나 있고, 실험은 세 번 반복 수행되었다),
도 2a는 MRS-한천 배지에서 항생제 Penicillin G, Ampicillin 및 Amoxicillin 유무 하에서 락토바실러스 루테리 CS 132, CS 232, 퍼거트 및 S.facium의 생존율을 비교한 것이고(표준편차는 각 막대의 상부에 나타나 있고, 실험은 세 번 반복 수행되었다),
도 2b는 MRS-한천 배지에서 항생제 Neomycin, Kanamycin 및 Streptomycin 유무 하에서 락토바실러스 루테리 CS 132, CS 232, 퍼거트 및 S.facium의 생존율을 비교한 것이고(표준편차는 각 막대의 상부에 나타나 있고, 실험은 세 번 반복 수행되었다),
도 2c는 MRS-한천 배지에서 항생제 Erythromycin 및 Vancomycin 유무 하에서 락토바실러스 루테리 CS 132, CS 232, 퍼거트 및 S.facium의 생존율을 비교한 것이고(표준편차는 각 막대의 상부에 나타나 있고, 실험은 세 번 반복 수행되었다),
도 2d는 MRS-한천 배지에서 항생제 Nalidixic acid 및 Rifampicin 유무 하에서 락토바실러스 루테리 CS 132, CS 232, 퍼거트 및 S.facium의 생존율을 비교한 것이고(표준편차는 각 막대의 상부에 나타나 있고, 실험은 세 번 반복 수행되었다),
도 2e는 MRS-한천 배지에서 항생제 Chloramphenicol 및 Tetracycline 유무 하에서 락토바실러스 루테리 CS 132, CS 232, 퍼거트 및 S.facium의 생존율을 비교한 것이고(표준편차는 각 막대의 상부에 나타나 있고, 실험은 세 번 반복 수행되었다),
도 3은 락토바실러스 루테리 CS 132, CS 232, 퍼거트의 게놈 DNA가 에리트로마이신 및 반코마이신 내성 유전자를 포함함을 확인한 사진이다(Marker: 100bp size marker; vanA 및 vanB: Vancomycin 내성 유전자; Erm(A), Erm(B) 및 Erm(C): Erythromycin 내성 유전자).
Claims (5)
- 신규한 미생물 락토바실러스 루테리 CS 132(기탁번호 KCTC 11452BP).
- 제1항의 락토바실러스 루테리 CS 132 또는 그 배양물을 포함하는 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 정장용 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 식품 또는 식품첨가용 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 사료첨가용 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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