KR20080109585A - 내산성, 내담즙산성, 내염성 및 항균 효과를 가진 신규한식물성 유산균 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내산성, 내담즙산성 및 내염성이 우수하며 항균 효과를 가진 신규한 유산균에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 본 발명은 내산성, 내담즙산성 및 내염성이 우수하여 장내 생존율이 높고, 항균 효과를 가져 유해 미생물의 성장을 억제할 수 있는 신규한 미생물인 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511과 상기 유산균 또는 유산균 배양물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 신규한 유산균 또는 상기 유산균의 배양물은 정장용, 생균용, 항균용 등의 용도로 발효제품, 식품, 의약품, 사료 등에 유용하게 사용될 수 있다.

페디오코커스속 균주, 페디오코커스 펜토사세우스, 내산성, 내담즙산성, 내염성, 항균 효과

Description

내산성, 내담즙산성, 내염성 및 항균 효과를 가진 신규한 식물성 유산균 및 이를 포함하는 조성물{Novel plant origin lactic acid bacteria having acid resistance, bile salt-resistance, salt-resistance and anti-bacterial effect and composition containing the same}

본 발명은 내산성 및 내담즙산성이 우수하여 장내 생존력이 강하고, 내염성이 우수하며 유해 미생물에 대한 항균력을 가진 신규한 유산균, 그 배양액 및 상기 유산균 또는 유산균의 배양액을 이용한 조성물에 관한 것이다.

유산균은 자연계에 널리 존재하며 탄수화물을 혐기적으로 이용하여 유산을 생산한다. 유산균이 발견되는 자연 환경은 다양한데, 사람이나 동물의 장내에 존재할 뿐 아니라, 다양한 채소와 과일에서도 발견되며 요구르트, 우리나라의 김치나 독일의 사우어크라우트(sauerkraut)와 같은 발효식품에서 그 발효과정에 중요한 역할을 담당한다. 이러한 유산균으로는 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp .), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp .), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp .), 스포로락토바실러스 속(Sporolactobacilus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp .) 등이 있다.

이들 유산균은 장내로 유입된 후 장내 상피세포에 착생하게 되어 유해 미생물의 장 정착을 방지하고 항균 물질을 분비함으로써 유해 미생물의 생육을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐 만 아니라, 면역활성 증진, 항암 작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 작용을 수행한다. 또한, 일반적으로 이들 유산균은 직접 혹은 간접적으로 식품에 첨가되어 이들의 대사산물인 유산에 의해 식품의 저장성을 향상시키며 식품의 향미와 조직을 개선한다고 알려져 있다. 따라서 유산균은 동서양을 막론하고 유제품, 육제품, 침채류 및 각종 젓갈류의 가공에 유용한 보조 수단뿐만 아니라 생균제(probiotics)로도 이용되고 있다.

최근 채소나 과일과 같은 식물, 혹은 김치와 같은 과채류를 발효한 식품에서 분리해 낸 식물유래 유산균들의 기능성이 밝혀지면서 새로운 기능성 소재로 떠오르고 있다. 이러한 식물 유래 유산균들에는 류코노스톡 속, 페디오코커스 속, 락토바실러스 속 중 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이나 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 등이 포함된다. 식물 유래 유산균들은 낮은 pH나 높은 염 농도와 같은 척박한 환경에서도 강한 생존력을 보이며, 배양이 용이하다는 장점을 지니고 있다.

한편, 상기 유산균이 상술한 바와 같은 인체에 유용한 효과를 나타내려면 소화기관을 통과하는 과정에서 생존하여 소장에 정착할 수 있어야 한다. 즉, 유산균이 위장에서 분비되는 위산과 소장에서 분비되는 담즙에 대한 내성이 높아야만 이들 소화기관의 가혹한 환경에서 생존하여 소장에 도달하는 생균수가 많아지게 되고 장내 상피 세포나 점막에 흡착하여 정착할 수 있게 된다. 따라서 내산성 및 내담 즙성이 우수한 유산균을 사용해야만 실질적으로 인체에 유용한 기능을 수행할 수 있게 된다.

페디오코커스 속은 김치에서 많이 발견되는 유산균 중 하나로 항균물질을 생성하여 강한 항균력을 보이는 균주로 많이 보고되어 있어, 유해 미생물의 생육을 억제하여 장내 세균총을 정상화시키며 설사와 변비의 개선 효과가 기대된다. 또한 전통적으로 오랫동안 먹어온 식품인 김치에서 분리되어 안전성이 확보됨으로써, 새로운 발효식품이나 건강기능식품으로의 적용이 용이하다는 장점을 가지고 있다.

한국 특허등록 제503570호에는 면역증강, 항암 및 항균 활성을 갖는 신규한 페디오코커스 펜토사세우스 EROM101이 개시되어 있으나, 내산성, 내담즙성 및 내염성이 우수한 균주에 대한 개시는 없다.

이에 본 발명자들은 새롭게 내산성, 내담즙성 및 내염성이 우수한 페디오코커스속 유산균을 분리하였다. 본 발명자들이 새로 분리, 동정한 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CPC0511 균주는 종래 알려진 다른 균주들에 비해 우수한 내산성 및 내담즙성을 가지며, 뛰어난 내염성을 보임으로써 비교적 염분섭취가 많은 한국인의 식습관에 적합한 균주라 할 수 있다. 특히 본 균주가 보여주는 뛰어난 내염성은 본 균주를 이용하여 제품 개발 시 다양한 식품에 적용할 수 있어 산업적으로 이용 가치가 매우 높다. 또한 본 균주는 대장균 및 포도상구균에 대한 항균능력을 보여줌으로써 유해미생물 억제 및 장내 세균총의 정상화, 정장 작용을 기대할 수 있다.

본 발명의 목적은 내산성, 내담즙산성 및 내염성이 뛰어나고, 항균 효과를 갖는 신규한 유산균을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유산균 또는 그 배양물을 포함하는 발효제품을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유산균 또는 그 배양물을 포함하는 정장용, 생균제, 사료첨가용, 항균용 또는 식품첨가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유산균의 배양 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 내산성, 내담즙산성 및 내염성이 우수하며 항균활성을 가진 신규 유산균, 및 상기 유산균 및/또는 유산균 배양물을 함유하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 유산균, 유산균 배양물 또는 조성물은 내산성, 내담즙성 및 내염성이 우수하고, 항균효과가 있어 식품, 의약품, 화장품, 사료 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내산성, 내담즙산성 및 내염성이 우수하며, 항균 효과를 갖는 신규한 유산균인 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CPC0511 (수탁번호: KCCM10867P)을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 유산균 또는 유산균의 배양물을 포함하는 항균용, 정장용, 생균제용, 식품첨가용 또는 사료첨가용 조성물과 발효제품을 제공한다.

본 발명자들은 김치로부터 천연적으로 존재하는 유산균들 중 항균력 및 항바이러스 능력이 우수한 유산균을 새롭게 분리, 동정하였다. 본 발명자들이 새롭게 분리 및 동정한 유산균은 내산성, 내담즙산성 및 내염성이 우수하며, 유해 세균에 대한 항균활성을 보여 유해 미생물의 생육 억제 및 정장 효과를 기대할 수 있다.

이하, 본 발명의 내산성, 내담즙산성 및 내염성이 뛰어난 신규한 유산균 및 이를 포함하는 조성물에 대해 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 내산성, 내담즙산성 및 내염성이 뛰어나며 항균효과가 있어 생균제용, 항균용, 사료용 등의 조성물에 사용되기에 유용한 신규한 유산균인 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CPC0511 (수탁번호: KCCM10867P)을 제공한다.

본 발명에 따른 유산균들은 다음과 같은 방법에 의해 분리 및 동정되었다. 본 발명자들은 먼저, 김치로부터 유산균 선별 배지를 이용하여 유산균만을 분리하고 이 중에서 내산성 및 내담즙산성이 우수한 균주를 분리하였다.

최종 선발된 유산균은 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석을 실시하였다. 그 결과, 본 발명에서 분리한 균주는 페디오코커스 펜토사세우스로 동정되었다. 본 발명자들은 본 발명에서 분리된 균주를 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511이라 명명하고 2007년 4월 30일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 대한민국 서울시 서대문구 홍제1동 361-221 유림빌딩에 소재하는 한국미생물보존센터(KCCM)에 수탁번호 KCCM10867P로 기탁하였다.

본 발명에서 처음으로 분리 및 동정된 유산균 CPC0511은 다음과 같은 특성을 지닌다.

첫째, 본 발명에 따른 유산균은 뛰어난 내산성 및 내담즙산성을 보여 생균제로의 활용가치가 높다.

둘째, 본 발명에 따른 유산균은 뛰어난 내염성을 보여 NaCl 5% 농도에서도 성장이 용이하며, 이러한 특성은 본 균주를 이용하여 실제 제품에 적용시 매우 유용할 것으로 보인다.

셋째, 본 발명에 따른 유산균 및 그 배양액은 유해미생물들의 성장을 억제하는 효능을 가진다. 본 발명에 따른 신규 유산균으로 성장이 억제될 수 있는 유해 미생물로는 대장균(E. coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus) 등이 있으며, 구체적으로는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium), 포도상 구균(Staphylococcus aureus), 장독성 대장균(enterotoxigenic E. coli), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 캠필러박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 유산균 CPC0511은 통상적인 유산균의 배양법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양 배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, MRS(Man-Rogosa-Sharp) 액체 배지 및 우유가 첨가된 액체 배지를 사용할 수 있다. 탄소원으로는 전분, 글루코스, 수크로스, 갈락토스, 프룩토스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 글루코스이다. 질소원으로는 황산암모늄, 질산암모늄, 질산나트륨, 글루탐산, 카사미노산, 효모추출물, 펩톤, 트립톤, 대두박 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 미네랄은 염화나트륨, 인산제이칼륨, 황산마그네슘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있다.

미생물 배양 배지 내 상기 탄소원, 질소원 및 미네랄 각각은 리터당 10 내지 100 g, 5 내지 40 g 및 0.5 내지 4 g 을 이용할 수 있다.

상기의 통상의 배양 배지에 첨가되는 비타민은 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 비타민은 통상의 배양 배지에 상기에서 언급한 탄소원, 질소원, 미네랄 등의 배지와 동시에 첨가하거나, 멸균하여 준비된 배지에 첨가할 수 있다.

배양은 통상의 유산균 배양 조건으로 수행할 수 있으며, 예를 들어 약 15-45℃에서 약 10-72시간 동안 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 냉동건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 미생물은 당업계에 공지된 통상적인 물리화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 가지거나 또는 이보다 우수한 활성을 가지도록 개선 또는 개량될 수 있다.

한편, 본 발명의 CPC0511은 내산성, 내담즙산성 및 내염성이 우수하고, 유해 세균에 대한 항균활성을 가져 발효식품의 종균, 정장용 조성물, 생균제 조성물, 항균용 조성물, 사료첨가용 조성물, 식품첨가용 및 발효제품 등의 형태로 제공될 수 있다.

상기에서 '정장용'이란 사람이나 동물의 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반 증상을 치료 및 개선하는 용도를 말한다. 상기 증상으로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 유해 미생물에 의한 감염성 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증 및 장 급이성 설사 등이 포함된다.

상기에서 '생균제'는 살아 있는 균 즉, 사람이나 동물이 섭취했을 때 위장관 에 머물러 생존할 수 있는 미생물로서 특정 병리 상태를 예방하거나 치료할 수 있는 효과가 있는 미생물 제제를 말한다. 일반적으로 생균제는 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반 증상을 치료하고 개선하는 효과가 있으며 사람 및 동물에 투여되면 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해 미생물이 정착하지 못하게 하는 작용을 하며 유산을 생성하여 장내 pH를 낮추어서 유해 미생물의 증식을 억제한다.

상기에서 '항균용'이란 유해 미생물의 생육을 저해 또는 억제하는 활성을 말한다. 바람직하게는 상기 유해 미생물로는 생체 내 소화기관에 존재하면서 소화기관과 관련된 여러 질환을 유발하는 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium), 포도상 구균(Staphylococcus aureus), 장독성 대장균(enterotoxigenic E. coli), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 캠필러박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상술한 조성물들은 본 발명에 따른 유산균의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균, 건조균 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유할 수 있으며 적합한 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배양물은 본 발명에 따른 유산균을 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 배양액을 초음파 처리하 거나 상기 배양액에 용해효소(lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액 등이 포함된다.

또한, 상기 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유산균 또는 이의 배양물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 정제(tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭시르(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 이에 한정되지는 않으나 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료가 포함된다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성율, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 및 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 생균제용 조성물의 경우에는 조성물 내 생균수가 1x10⁵~1x10¹¹ 세포/g, 바람직하게는 1x10⁷ 세포/g 이상이 되도록 투여할 수 있다.

또한, 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511 또는 이의 배양물은 식품 조성물 또는 식품첨가용 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 본 발명의 유산균 또는 이의 배양물과 적합한 담체, 부형제 또는 보조성분 등을 혼합하여 분말제, 과립제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태로 제조할 수 있다. 나아가, 본 발명의 유산균은 발효제품의 제조를 위한 종균으로 사용될 수 있다. 상기 발효제품으로는 햄 및 소시지와 같은 발효육 제품, 발효 생식 제품, 치즈, 버 터밀크, 요구르크, 유청 등과 같은 발효유 제품 및 김치 등이 포함된다. 상기 발효제품은 본 발명의 유산균을 사용하여 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 발효 생식 제품의 경우 현미와 율무 등의 곡류 분말, 과채류 분말, 버섯류 분말에 본 발명의 유산균 분말을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 곡류 분말에 본 발명의 유산균을 혼합하여 적합한 온도에서 발효한 후 과채류, 버섯류 분말을 영양학적 균형과 기호성을 고려하여 적절히 배합함으로써 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511 또는 이의 배양물은 사료 조성물 또는 사료첨가용 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 상기 사료 조성물은 기존 항생제의 대체용으로 사용되어 장내 유해균의 생육을 억제하며 장내 균총을 안정되게 유지하여 가축의 건강상태를 양호하게 하여 가축의 증체량과 육질을 개선시키고 산유량 및 면역력을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 이에 한정되지는 않으나 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 유산균과 여러 가지 미생물 또는 효소를 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 유산균을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명의 유산균으로 발효시킴으로써 제조할 수 있다.

또한, 상기 본 발명에 따른 조성물들은 본 발명의 유산균과 함께 인간을 포 함하는 동물이 섭취하기에 적합하고 섭취시 유해 미생물의 생육을 억제하며 장내 균총의 균형을 개선시키는 활성을 가지는 다른 종류의 공지된 미생물을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 미생물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisease) 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 유산균의 분리 및 동정

유산균의 분리를 위해 다양한 김치 시료를 수집하여 BCP(Brom Cresol Purple) 평판 배지(Difco, USA)에서 노란색 집락을 형성하는 콜로니를 분리하였다. 분리된 콜로니들은 내산성 평가를 통해 내산성이 우수한 균주를 선별하였으며, 다음 실시예를 통해 선별된 유산균이 페디오코커스 펜토사세우스임을 확인하고 CPC0511이라 명명하였다.

<1-1> 형태학적 분석 및 생화학적 특성

본 발명의 선별된 유산균을 MRS 평판 배지(Difco, USA)에서 배양하고 콜로니의 형태를 관찰하였다. 선발한 유산균의 콜로니 형태는 하기 표 1에 나타내었으며, 생화학적인 특징은 하기 표 2에 나타내었다.

MRS 평판 배지에서의 콜로니의 형태

형태	원형
크기	1.5-3mm
색	노란 빛이 도는 크림색
불투명도	불투명
융기	볼록
표면	매끄러움

CPC0511의 생화학적 특징

그람 염색	양성
호기적 생장	양성
혐기적 생장	양성
카탈라아제	음성
포자 형성	음성
운동성	음성

<1-2> 16S rDNA 분석

선발된 유산균을 동정하기 위해 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였으며 그 결과는 서열번호 1에 나타내었다. 본 발명의 유산균 CPC0511은 페디오코커스 펜토사세우스의 16S rDNA와 99%의 서열 상동성을 보였으므로, 본 발명에서 분리된 균주 CPC0511은 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)임을 확인하였다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명에서 분리된 균주들을 2007년 4월 30일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM10867P로 기탁하였다.

<1-3> 선발된 유산균주의 배양 특성

본 발명의 유산균 CPC0511을 멸균된 MRS 액체 배지(Difco, USA)에 접종하여 30℃에서 진탕배양하면서 균수와 pH의 변화를 확인하였다. 균주의 성장곡선은 도 1에 나타내었다.

실시예 2: 본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511 의 내산성 조사

CPC0511과 다른 유산균주들과의 내산성을 비교하기 위하여 유제품 발효 등에 많이 사용되는 유산균주 5종을 선택하여 표준 균주를 한국미생물보존센터에서 분양받았다. CPC0511 및 분양받은 균주들은 멸균된 MRS 액체 배지에 접종 후 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 그 다음 HCl로 pH 3.0으로 조정한 MRS 액체 배지에 상기 유산균 배양액을 1%를 접종하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 유산균 접종 직후와 1시간 배양 후의 각 시료를 회수하여 멸균 생리 식염수에 희석하고 MRS 평판 배지에 도말한 다음 37℃에서 72시간 동안 배양한 후 평판 배지 위의 집락수를 계수하여 생균 수를 측정하였다. 유산균의 생존율은 접종 직후의 생균 수를 100%로 하고, 접종 직후와 1시간 배양 후의 생균 수를 비교하여 백분율로 나타냈다 (표 3).

pH 3.0에서의 생존율

균 주 명	생존율(%)
CPC0511 (Pediococcus pentosaceus)	94.3
ATCC15707 (Bifidobacterium longum)	0.0
KCTC3635 (Lactobacillus delbrueckii subsp . Bulgaricus)	49.7
KCTC2180 (Lactobacillus casei)	49.4
KCTC3171 (Lactobacillus acidophilus )	66.4
KCTC3658 ( Streptococcus thermophilus)	0.0

그 결과, 본 발명에서 선별된 유산균 CPC0511은 pH 3.0에서 90% 이상의 생존율을 보여 내산성이 우수하였으며, 공지된 다른 유산균종과 비교하였을 때에도 다른 유산균에 비해 더 높은 내산성을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511 의 내담즙산성 조사

본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511과 공지 유산균의 내담즙산성을 다음과 같은 방법으로 비교 조사하였다. 즉, 본 발명에 따른 균주 및 공지 유산균들을 멸균된 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양한 후 이를 희석하여 각각 0.3%의 옥스갈(oxgall)이 함유된 MRS 평판 배지에 도말하고 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 이때 대조군으로 담즙산을 함유하지 않은 MRS 평판 배지에 각 균주를 도말하여 동일한 방법으로 배양하였다. 유산균의 생존율은 대조군의 집락수를 100%로 하고 대조군과 유산균의 집락수를 비교하여 백분율로 나타내었다(표 4).

옥스갈 0.3% 첨가 배지에서의 생존율

균 주 명	생존율(%)
CPC0511 (Pediococcus pentosaceus)	97.5
ATCC15707 (Bifidobacterium longum)	54.7
KCTC3635 (Lactobacillus delbrueckii subsp . Bulgaricus)	0.0
KCTC2180 (Lactobacillus casei)	96.8
KCTC3171 (Lactobacillus acidophilus )	0.0
KCTC3658 ( Streptococcus thermophilus)	0.0

그 결과, 본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511은 공지된 균주에 비해 내담즙산성이 우수하여, 섭취 시 장내생존율이 우수할 것으로 기대된다.

실시예 4: 본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511 의 내염성 조사

비교적 염분의 섭취가 많은 한국인의 식습관 때문에 내염성은 균주 개발에 있어 유용한 기능성이 될 수 있다. 내염성이 높은 유산균주는 염도가 높은 식품들과 함께 섭취해도 장내까지 도달할 수 있는 확률이 높아지며, 발효유와 같은 일반적인 유산균 이용제품 외에도 다양한 식품의 개발에 적용이 가능하다.

따라서 본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511의 내염성을 다음과 같은 방법으로 비교 조사하였다. 즉, 본 발명에 따른 균주를 멸균된 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 1차 배양하였다. NaCl을 3, 4, 5%로 첨가하여 멸균한 MRS 액체 배지를 준비하여 여기에 1차 배양액을 1% 접종하였다. 대조군으로는 NaCl을 첨가하지 않은 MRS 액체 배지를 사용하였다. 37℃에서 16시간 동안 배양한 후, MRS 평판 배지에 희석, 도말하고 37℃에서 72시간 동안 배양하여 각 실험군 별 균수를 측정하였다. 내염성은 대조군의 균수를 100%로 하여 백분율로 나타내었다. 비교 균주들도 동일한 방법으로 실험을 실시하였다.

CPC0511 및 공지 유산균주의 내염성 비교

균 주 명	NaCl 농도 (%)
	3%	4%	5%
CPC0511(Pediococcus pentosaceus)	100.0	69.0	47.3
ATCC15707(Bifidobacterium longum)	0.0	0.0	0.0
KCTC3635(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)	1.0	0.8	0.2
KCTC2180(Lactobacillus casei)	6.4	1.0	0.0
KCTC3171(Lactobacillus acidophilus)	0.4	0.0	0.0
KCTC3658(Streptococcus thermophilus)	1.6	0.3	0.3

그 결과, 본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511은 다른 유산균주들에 비해 월등히 우수한 내염성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511 의 항균력 조사

프로바이오틱스 유산균들은 유산의 생성을 통해 주변의 pH를 낮춤으로써 다른 미생물들이 성장하는 것을 억제할 뿐 아니라 균주에 따라 박테리오신과 같은 항균물질을 생산하는 것으로 알려져 있다. 특히, 페디오코커스 속 유산균들 중 상당수가 항균물질을 생성하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 유산균 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511의 항균력을 조사하였다.

실험에 사용된 지시균들은 대장균(E. coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라균(Salmonella typhimurium), 리스테리아균(Listeria monocytogenes) 4종으로 모두 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다.

실험은 다음의 과정으로 이루어졌다. CPC0511은 멸균된 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양을 하였다. MRS 평판배지를 제조하여 평판배지 중앙에 CPC0511 배양액을 5㎕ 점적한 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 지시균들은 각각 영양 액체 배지에 접종하여 37℃에서 16시간 배양한 후, 멸균하여 45~50℃로 식힌 영양 한천 배지(한천 0.75%)에 1%씩 접종하였다. 지시균이 접종된 한천 배지를 미리 CPC0511을 점적하여 배양한 MRS 평판배지 위에 8ml씩 분주하여 굳힌 후, 37℃에서 24시간 배양하여 저지환의 생성을 관찰하여 그 결과를 표 6 및 도 2 내지 5에 나타내었다.

CPC0511이 생성한 저지환의 크기

지 시 균	저지환의 지름(mm)
KCTC2441 (Escherichia coli)	25
KCTC1621 (Staphylococcus aureus)	24
KCTC3710 (Listeria monocytogenes)	21
KCTC2514 (Salmonella typhimurium)	28

상기 실험결과 CPC0511이 유해미생물의 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. CPC0511이 보이는 항균활성이 유산에 의한 것이 아니라 항균물질의 생성이 의한 것임을 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다.

CPC0511을 멸균된 MRS 액체 배지에 접종하여 30℃에서 16시간 동안 배양을 한 후, 이 배양액을 8000rpm으로 5분간 원심분리하여 균체를 제거하였다. 배양액의 낮은 pH로 인한 항균활성을 배제하기 위해 배양액의 pH를 6.5로 조절한 후, 원심분리 진공 농축기(Centrifugal vacuum concentrator)을 이용하여 10배로 농축하였다. 농축한 배양액은 0.22㎛ 필터로 여과하여 항균력 실험에 사용하였다.

지시균으로는 대장균(E.coli)와 포도상구균(Staphylococcus aureus)를 사용하였다. 지시균은 각각 영양 액체 배지에 접종하여 37℃에서 16시간 배양한 후, 멸균하여 45~50℃로 식힌 영양 한천 배지에 1%씩 접종하였다. 지시균이 접종된 한천 배지를 페트리 디쉬에 15ml씩 분주하여 굳힌 후, 멸균한 페이퍼 디스크를 올려놓고 그 위에 준비한 배양액을 100㎕씩 떨어뜨리고 37℃에서 24시간 배양하여 저지환의 생성을 관찰하였다.

CPC0511이 생성한 저지환의 크기

지 시 균	저지환의 지름(mm)
	농축전 배양액	농축 배양액
KCTC2441(Escherichia coli)	19	24
KCTC1621(Staphylococcus aureus)	-	25

그 결과, 농축한 배양액은 대장균과 포도상구균에 대해 저지환을 생성하는 것을 관찰할 수 있었으며, 대장균의 경우 농축전 pH를 6.5로 조정한 배양액에서도 저지환을 볼 수 있었다. 따라서 CPC0511이 유산 외에도 다른 항균물질을 생성, 항균력을 보임을 알 수 있었다.

도 1은 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CPC0511 (수탁번호: KCCM10867P)의 성장곡선을 나타내는 그래프이다.

도 2는 본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511의 대장균에 대한 항균 활성을 측정한 결과이다.

도 3은 본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511의 포도상구균에 대한 항균 활성을 측정한 결과이다.

도 4는 본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511의 리스테리아균에 대한 항균 활성을 측정한 결과이다.

도 5는 본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511의 살모넬라균에 대한 항균 활성을 측정한 결과이다.

<110> CTCBIO INC. <120> Novel plant origin lactic acid bacteria having acid resistance, bile salt-resistance, salt-resistance and anti-bacterial effect and composition containing the same <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1460 <212> DNA <213> Pediococcus pentosaceus <220> <221> gene <222> (1)..(1460) <223> CPC0511 16S rDNA sequence <400> 1 cagctatact gcagtcgaac gaacttccgt taattgatta tgacgtactt gtactgattg 60 acattttaac acgaagtgag tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcccagaa 120 gtaggggata acacctggaa acagatgcta ataccgtata acagagaaaa ccgcatggtt 180 ttcttttaaa agatggctct gctatcactt ctggatggac ccgcggcgta ttagctagtt 240 ggtgaggtaa aggctcacca aggcagtgat acgtagccga cctgagaggg taatcggcca 300 cattgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca 360 atggacgcaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaag 420 ctctgttgtt aaagaagaac gtgggtaaga gtaactgttt acccagtgac ggtatttaac 480 cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta 540 tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggtcttt taagtctaat gtgaaagcct 600 tcggctcaac cgaagaagtg cattggaaac tgggagactt gagtgcagaa gaggacagtg 660 gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg 720 gctgtctggt ctgcaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat 780 accctggtag tccatgccgt aaacgatgat tactaagtgt tggagggttt ccgcccttca 840 gtgctgcagc taacgcatta agtaatccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc 900 aaaagaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc 960 gaagaacctt accaggtctt gacatcttct gacagtctaa gagattagag gttcccttcg 1020 gggacagaat gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080 agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattact agttgccagc attaagttgg gcactctagt 1140 gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggacgacg tcaaatcatc atgcccctta 1200 tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg agtcgcgaga ccgcgaggtt 1260 aagctaatct cttaaaacca ttctcagttc ggactgtagg ctgcaactcg cctacacgaa 1320 gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1380 acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg taacacccaa agccggtggg gtaacctttt 1440 aggagctagc cgtctaatgg 1460

Claims (8)

1. 내산성, 내담즙산성 및 내염성이 우수하며, 항균 효과를 갖는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CPC0511 (수탁번호: KCCM10867P).
2. 제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511 또는 그 배양물을 포함하는 발효제품.
3. 제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511 또는 그 배양물을 포함하는 정장용 조성물.
4. 제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511 또는 그 배양물을 포함하는 생균제 조성물.
5. 제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511 또는 그 배양물을 포함하는 사료첨가용 조성물.
6. 제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511 또는 그 배양물을 포함하는 항균용 조성물.
7. 제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511 또는 그 배양물을 포함하는 식품첨가용 조성물.
8. 제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511을 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지에서 15-45℃에서 10-72시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 페디오코커스 펜토사세우스 CPC0511의 배양 방법.

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