KR101345248B1

KR101345248B1 - 병원성 세균을 저해하는 유산균 및 이를 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR101345248B1
Application number: KR1020110096226A
Authority: KR
Inventors: 신점호; 김매진; 조현주
Original assignee: 김매진; 안성시농업기술센터
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2011-09-23
Publication date: 2014-01-22
Also published as: KR20130032558A

Abstract

본 발명은 우수한 내산성, 내담즙산성 및 내열성 등을 가지면서 가축의 장에 존재하는 다양한 장내 병원성 세균에 대한 우수한 효과를 나타내는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AS11-1(기탁번호:KACC 91659P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하여 항균용 조성물, 정장용 조성물, 생균제 조성물, 사료첨가용 조성물 등 여러 가지 용도로 유용하게 사용하는 것을 특징으로 한다.

Description

병원성 세균을 저해하는 유산균 및 이를 함유하는 조성물{Lactic acid bacteria for inhibiting the pathogenic bacteria and composition containing the same}

본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AS11-1(기탁번호:KACC 91659P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하여 내산성, 내담즙성, 내열성, 항산화능력 등이 우수하여 가축의 장에 존재하는 다양한 장내 병원성 세균을 저해하는 유산균 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

유산균은 대사를 통해 각종 생고분자물질, 효소, 유기산, 알코올 등을 생성할 뿐 아니라 동물산업, 식품산업, 의약품생산산업 등에 널리 사용되고 있어 경제적으로 매우 중요한 미생물이다(Fuller,1989). 특히 유산균 중 약 56개의 종으로 구성되어있는 Lactobacillus속 균주들은 각종 생균제(Probiotic)제품으로 개발되고 있는데, 이는 장관내 주요 균주들로써, 사람과 동물의 건강과 기능향상에 사용되고 있으며, 특히 면역증진작용, 장관내 미생물총의 균형, 항암작용, 설사방지들의 효과가 인정되고 다양한 생화학적 및 물리적 특성과 더불어 그 안전성이 입증되어 대량생산 및 보존관련기술이 구축되어 왔음을 시사한다(Klaeuhanmm and Kullen,1999).

가축에 있어서도 생균제(Probiotic)의 급여가 미치는 영향은 지속적으로 연구되어 지고 있다. 어미와 외부자연환경으로부터 장내 정상균총을 빠르고 즉각적으로 구성하는 야생동물과는 달리, 인위적인 환경에서 사육되는 가축은 외부환경(사료변화, 수송스트레스, 유해미생물감염, 항생제투여)의 영향으로 정상적인 균총형성이 어렵고, 이는 증체율 저하 및 사료이용률 감소 등으로 이어져 폐사율에 직접적인 영향을 끼치고 있다.

이에 대한 방안으로 그간 항생제나 화학적인 치료법으로 대처하였으나, 이 방법 역시 잔류문제가 남아있어 국내에서는 2005년도에 항생제에 대하여 25개 품목으로 대폭 그 범위를 감소시켜 왔고, EU(유럽연합)는 이보다 더 강도 높은 조치를 취하였으며, 2006년부터 가축의 치료목적 외에 성장촉진용 항생물질의 사료 첨가를 전면 금지시키고 있는 등 항생제의 엄격한 사용규제가 이루어지고 있으며, 이로 인해 항생제를 대체하여 가축내 병원성 세균을 저해할 수 있는 사료첨가용 생균제의 사용이 요구되고 있다.

한편, 생균제와 항생제의 급여효과를 비교 실험한 결과, 유산균 생균제 급여 시에 항생제 투여 시보다 증체량 개선, 장내 호기성균 및 대장균의 감소가 더 크게 나타났다고 보고되었으며(Francis,1978), 토끼와 쥐에 대한 in vivo 실험에서도 설사를 일으키는 enterotoxigenic E. coli 및 Salmonella typhimurium 균주에 대해 probiotic효과를 보여주었다(Heyman and Menard,2002).

또한 Chang et al .,의 연구에 의하면 항생제를 혼합한 투여구보다 사료요구율은 감소하였으며, 증체율은 대조구보다 증가하였다고 보고된바 있다.

이와 같이 생균제의 급여는 가축의 증체량, 사료효율, 장내 세균총개선 등에 효과적이며 이는 생산성의 증대와 항생제를 대체할 수 있는 경제적인 사육효과를 기대할 수 있다.

그러므로 생균제로 사용할 수 있는 유산균은 소화 관내 생존능이 높아야하고, 적정량의 생균이 존재하여야 하며, 균주동정을 통한 안전성있는 균주를 사용하여야 한다.

따라서, 본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus)속 균주를 동정하고, 동정된 유산균의 생리활성 및 내산성, 내담즙성, 열안정성, 항산화능력 등 균주특성을 조사하여 살모넬라균(Salmonella ), 대장균(E. coli ), 포도상구균( Staphylococcus ) 등 병원성세균에 대한 억제효능이 뛰어난 유산균 및 이러한 유산균 또는 유산균 배양물을 포함하는 여러 용도의 유용한 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 이미 발효식품 중에 존재하여 안정성이 확인된 유산균을 1차 및 2차 동정하여 분석한 후 내산성, 내담즙성, 내열성 및 병원균 등에 대한 항균능을 조사하고, 이의 균주를 이용하여 정장제나 생균제 등으로 사용하는 것을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내산성, 내담즙성, 내열성 및 항균활성이 있는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AS11-1(기탁번호:KACC 91659P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 사용하여 대장균 또는 살모넬라 속 병원균 등에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

그리고 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 AS11-1(기탁번호:KACC 91659P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 사용하여 동물의 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 나타나는 제반증상을 치료하거나 개선하는 정장용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 AS11-1(기탁번호:KACC 91659P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 사용하여 동물이 섭취했을 때 위장관에 머물러 생존할 수 있는 균의 정착 및 증식을 예방하고, 치료할 수 있는 생균제 조성물을 제공한다.

본 발명은 우수한 내산성, 내담즙성, 내열성 및 항산화능력 등을 가지면서 가축의 장에 존재하는 다양한 장내 병원성 세균에 대한 우수한 효과를 나타내는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AS11-1(기탁번호:KACC 91659P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 사용함으로써, 항균용 조성물, 정장용 조성물, 생균제 조성물, 사료첨가용 조성물 등 여러 가지 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 16S rRNA의 염기서열을 분석하여 나타낸 것이다.
도 2는 MRS broth에서 3회 계대 배양한 유산균 배양액을 1% (v/v) 접종하여 각 온도별로 열처리하여 생균수를 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 3은 락토바실러스 플란타륨의 내산성을 분석하여 나타낸 결과이다.
도 4는 락토바실러스 플란타륨의 내담즙성을 분석하여 나타낸 결과이다.
도 5는 DPPH 라디칼을 50% 소거하는 시료의 농도인 IC50값으로 측정한 결과 를 나타낸 것이다.
도 6은 DPPH 라디칼 소거 활성을 이용한 유산균 배양액의 항산화 활성을 측정하여 나타낸 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 우수한 내산성, 내담즙성, 내열성 및 항균활성 등을 갖는 신규 유산균인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AS11-1(기탁번호:KACC 91659P)을 제공한다.

그리고 본 발명은 상기 신규 유산균 또는 이의 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물, 정장용 조성물, 생균제 조성물, 사료첨가용 조성물 등을 제공한다.

상기에서 항균용이란 생체 내 소화기관에 존재하면서 소화기관과 관련된 여러 질환을 유발하는 유해 세균의 생육을 저해 또는 억제하는 활성을 말한다.

상기에서 정장용이란 동물의 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 나타나는 제반증상을 치료하거나 개선하는 것을 말한다.

상기에서 생균제란 동물이 섭취했을 때 위장관에 머물러 생존할 수 있는 균의 정착 및 증식을 예방하고, 치료할 수 있는 것을 말한다.

이하, 본 발명의 신규 유산균인 락토바실러스 플란타룸 AS11-1(기탁번호:KACC 91659P) 및 이러한 유산균 또는 이의 배양물을 포함하는 여러 가지 용도의 유익한 조성물에 대해 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 살모넬라균(Salmonella ), 대장균(E. coli ), 포도상구균( Staphylococcus ) 등 유해한 병원균의 증식을 억제하며, 시중에서 시판되는 시유를 탄소원으로 하여 다량의 유산을 생성하는 신규 유산균인 락토바실러스 플란타룸 AS11-1(기탁번호:KACC 91659P)에 관한 것이다.

락토바실러스 플란타룸 AS11-1은 시판 시유를 이용하여 카톤팩에서 실온으로 배양한 케퍼 발효유에서 분리된 유산균으로, 내산성, 내담즙성, 내열성 및 항산화능력 등을 가지면서 살모넬라균, 대장균, 포도상구균 등의 증식을 억제하는 것에 특징이 있다.

본 발명의 신규 유산균은 16S rDNA 염기서열에 기초하여 99% 상동성을 보이는 락토바실러스 플란타룸으로 최종 동정되었다. 그리고 본 균주의 정확한 분류를 위하였으며, 그 후 일반적인 특성 분석, 당 이용성 분석, 유전자 염기서열 분석 및 락토바실러스 플란타룸 스트레인(Lactobacillus plantarum strain ) NM65-2(Accession No: HM218291) 유전자와 내산성, 내담즙성, 황산화 능력 등을 비교하여 신균주임을 확인하였다.

따라서 상기 균주를 락토바실러스 플란타룸인(Lactobacillus plantarum ) AS11-1라 명명하고, 2011 8월 1일자로 대한민국 경기도 수원시 권선구 서둔동 88-20에 소재하는 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁번호 KACC91659P로 기탁하였다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 AS11-1을 이용한 살모넬라속 균, 장내 기회성 세균 등에 대한 in vitro 실험을 통한 생육 억제 방법의 바람직한 예는 다음과 같다. 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 AS11-1이 위의 세균에 대한 항균능을 보이기 위한 최적온도는 37℃가 가장 바람직하다.

본 발명의 신규 미생물은 in vitro 실험에서 병원성 세균인 황색포도상균(Staphylococcus aureus KCTC1927), 포도상 무탄스균(Staphylococcus mutans KCTC3065), 대장균(Escherichia coli KCTC2593), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium KCTC2054), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KCTC1014), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes KCTC 3569), 칸디다알비칸스(Candida albicans KCTC7270), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus KCTC6145) 등에 대한 항균 효과를 나타내었다.

한편, 본 발명에 따른 신규 유산균은 일반적인 락토바실러스 플란타룸 배양법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양방법은 시판 시유를 카톤팩에서 실온으로 배양한 케퍼 발효유에서 분리한 케퍼 발효액을 PCA(Plate Count Agar)평판 배지에 도말하여 30~40℃에서 20~30시간 동안 충분히 배양하였다. 그리고 배양액에서 농축된 균체의 회수를 위해 22,000~25,000rpm/min으로 25~35분 동안 원심분리한 후 동결건조시켜 사용할 수 있지만 적합하게는 -75 ~ -85℃를 유지하는 급속 동결기(deep freezer)에 보관하여 그 활성을 잃지 않도록 보존하는 것이 바람직하다.

따라서, 상기와 같이 급속 동결시킨 본 발명의 유산균은 유해 세균에 대한 저해효능이 우수하고, 내산성, 내담즙성 등이 존재함으로써, 항균용 조성물, 정장용 조성물, 생균제 조성물, 사료첨가용 조성물 등의 용도로 제공될 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여 하기 실시예 등을 들어 설명한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예 들에 한정되는 것으로 해석돼서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명의 구체적 이해를 돕기 위해 예시적으로 제공되는 것이다.

(실시예 1) 락토바실러스 플란타룸 AS11-1의 분석

1-1 락토바실러스 플란타룸 AS11-1의 동정

1) API 50 CHL Kit에 의해 당 이용성 조사

1차 동정은 탄수화물 발효실험인 API 50 CHL medium kit(BioMerieux, France)를 사용하였다. 균주를 MRS 평판배지에 도말하여 37℃에서 24시간 증식시킨 후 집락을 생리식염수 2ml로 현탁시켜, 서스펜션 배지(suspension medium) 5ml에 위 균액을 떨어뜨려 분산시킨 후 탁도를 2 맥팔랜드(McFarland)로 맞춘다. 분산시킨 균액을 API 50 CHL medium 10㎖에 접종하여 섞고 API 50 CH strip에 150㎕씩 접종시킨 후 37℃에서 배양하면서 24시간, 48시간 후 결과를 판독하였다. 실험결과 얻어지는 생화학적 결과는 API동정용 프로그램(apiwebTM)에 접속하여 분석하였다.

2) 16S rRNA 염기서열분석

최종적인 균 동정을 위해 균주의 16S rRNA의 염기서열을 분석하였다. 분석은 ㈜솔젠트에 의뢰하여 진행하였으며, 결과는 BLASTN(Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램을 이용하여 젠뱅크(Genbank)의 리보솜RNA유전자수열(ribosomal RNA gene sequence)와 비교 분석하였다.

1-2 일반적인 특성측정

과산화수소분해효소(Catalase)시험은 MRS 평판배지에 도말하여 37℃에서 24시간 혐기적으로 배양한 콜로니(colony)에 3.0% 과산화수소 용액을 가하여 기포의 발생유무로 확인하였다. pH 및 산도측정은 유산균배양액에 페놀프탈레인(phenolphthalein) 지시약을 2~3방울 떨어뜨린 후 0.1N NaOH로 적정함에 근거하였고, 전체 생성된 유기산은 락트산(lactic acid)으로 환산하여 표기하였다.

1-3 내열성 측정

열에 대한 내성을 측정하기 위해 3대 계대배양한 균주를 MRS 액체 배지에 1%(v/v) 접종하여 37℃에서 24시간 배양 후, 배양액 1㎖씩 취하여 60℃, 70℃, 80℃에서 10분, 20분, 30분간 정치한 뒤, 10배씩 연속적으로 희석하여 10^-4, 10^-5, 10^-6 희석한 배양액 100㎕를 각각 MRS 한천 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양 후 나타나는 젖산균 군락을 계수하였다.

1-4 내산성 및 내답즙성 측정

내산성 측정은 MRS 액체 배지를 1N HCl로 pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0으로 조정한 후 유산균 배양액 1%(v/v)를 접종하여 37℃에서 3시간 정치 배양하였다. 배양액을 10배씩 연속적으로 희석하여 10^-3, 10^-4, 10^-5 희석한 배양액 100㎕를 각각 MRS 한천 배지에 도말하여 37℃, 48시간 배양 후 나타나는 젖산균 군락을 계수하여 아래의 식에 따라 생존률(%)을 조사하였다.

[생존율(%) = (cell number in MRS containing HCl / cell number of initial inoculated cell)x 100]

내담즙성 측정은 MRS 액체 배지에 oxgall(Sigma)을 0(대조구), 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1%(w/v)가 되게 첨가하고, 유산균 배양액 1%를 접종하여 37℃에서 6시간 정치 배양하였다. 배양액을 10배씩 연속적으로 희석하여 10^-5, 10^-6, 10^-7 희석한 배양액 100㎕를 각각 MRS 한천 배지에 도말하여 37℃, 48시간 배양 후 나타나는 젖산균 군락을 계수하여 아래의 식에 따라 생존률(%)을 조사하였다.

[생존율(%) = (cell number in MRS containing oxgall / cell number of initial inoculated cell) x 100]

1-5 항산화 활성 라디칼을 이용한 황산화능력 측정

항산화 활성 (DPPH) 측정에 사용된 시료는 동결건조되어있던 37℃, 24시간, 3차 계대배양한 시료 0.2 ㎛를 제균필터로 정제한 후 시험에 사용하였으며, 200㎛ DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)와 시료를 30분 동안 반응시킨 후 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay, 517nm)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 시료 무첨가군의 흡광도를 100%로 하여 DPPH 라디칼에 대한 시료의 라디칼 소거 능은 아래의 식에 따라 산출하였고, DPPH 라디칼을 50% 소거하는 시료의 농도인 IC50값을 구하였다.

[Inhibition (%) = (1 - 시료 첨가구의 O.D/시료 무첨가구의 O.D)×100]

1-6 유산균의 병원성 세균에 대한 저해능력평가

1) 유산균배양액 시료의 전처리

분리유산균은 4.6 x 10⁸ CFU/ml, O.D. 0.76의 배양액으로 항균시험을 시행 하였고, 시료의 전처리는 원심분리(600rpm, 15min, sigma)후 0.2㎛ 실린지필터(Sartorius stedium bioteck, hydrophilic type)로 제균 과정 후 시험에 사용하였다.

2) 항균, 항 곰팡이, 항 효모의 배양조건 및 방법

S. aureus , S. typhimurium는 영양액(Nutrient Broth, Difco Co.)배지를 제조하여 37℃ 진탕배양기(shaking incubator, Vision Scientific Co., LTD.)에서 16시간 동안 배양하였으며, E. coli는 영양액(NB, Difco Co.)배지를 제조하여 37℃ 진탕배양기(shaking incubator, Vision Scientific Co.,LTD.)에서 8시간 동안 배양하였다. L. monocytogenes는 뇌심장침출액(Brain Heart Infusion, Difco Co.)배지를 제조하여 37℃ 진탕배양기(shaking incubator, Vision Scientific Co., LTD.)에서 8시간 동안 배양하였다. B. cereus는 영양액(NB, Difco Co.)배지를 제조하여 30℃ 진탕배양기(shaking incubator, Vision Scientific Co., LTD.)에서 16시간 동안 배양하였다. S. mutans는 뇌심장침출액(Brain Heart Infusion, Difco Co.)배지를 제조하여 37℃ 진탕배양기(shaking incubator, Vision Scientific Co., LTD.)에서 16시간 동안 배양하였다. C. albicans는 효모사상균용배지(Yeast Mould Broth)를 제조하여 24℃ 진탕배양기( shaking incubator, Vision Scientific Co., LTD.)에서 16시간 동안 배양하였고, A. fumigatus는 한천(Potato dextrose agar, MBcell)배지를 제조하여 30 ℃ 인큐베이트(incubator, JSR JSGI-250T)에서 48시간 동안 배양하였다. 배양시킨 각각의 세균은 멸균된 배지 150㎖에 S. aureus , S. typhimurium , E. coli , B. cereus , S. mutans는 0.5㎖ 접종시키고, L. monocytogenes , C. albicans , A. fumigatus는 0.3 ㎖ 접종시킨 다음 접종시킨 배지를 사각접시(SPL 245 x 245 x 20 mm)에서 굳혔다. 굳은 배지에 8.6mm의 벽을 만들어 100㎕의 샘플을 넣고 인큐배이트(JSR JSGI-250T)에서 24시간 배양 후 clear zone을 측정한 결과 배양된 병원성미생물의 성장 정도 측정(Optical Density at 600 nm)은 [표 1]과 같고, 배양된 유산균의 성장 정도 측정(Optical Density at 600 nm)은 [표 2]와 같다.

한편, 양성조절(Positive control)은 대표적인 항생제로 알려진 클로람페니콜(Chloramphenicol)을 사용하였고, 음성제어(Negative control)은 MRS Broth와 100% Me-OH을 사용하였다.

(실시예 2) 락토바실러스 플란타룸 AS11-1의 분석결과

2-1 일반적인 특성

Gram양성 간균인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 catalase 음성을 나타냈고, 37℃에서 24시간 혐기적 배양 후 pH와 산도를 측정한 결과는 표 3과 같다. 균주의 성장에 따른 배양액의 pH는 배양시간의 경과에 따라 낮아진다. Lactobacillus plantarum 의 최적 pH 5.5~6.5, 최저 pH 3.5인 것을 감안하면 24시간 배양시 3.75 x 10⁸ 수준의 성장과 pH의 하강은 기존 연구결과(You et al., 2005)와 비교해 상대적으로 성장속도가 빠른 것으로 판단된다.

2-2 락토바실러스 플란타룸 AS11-1의 동정

1) API 50 CHL Kit에 의한 당 이용성 조사

49개 탄수화물에 대한 당 이용성을 조사한 결과 분리유산균은 단당인 L-arabinose, ribose, galactose, glucose, fructose, mannose와 당알콜인 mannitol, sorbitol, 다당류인 α-Methyl-D-mannoside, 배당체인 N-acetylglucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, bitol, 당산화물인 gluconate를 이용하여 산을 생성하는 특성은 표 4에 나타내었다.

그리고 순수 분리가 확인된 락토바실러스 플란타룸 AS11-1을 판독프로그램인 API LAB Plus software(API 50 CHL version 5.1)으로 해석한 결과 ID 값과 99.4% 일치하여 락토바실러스 플란타늄(Lactobacillus plantarum)인 것으로 동정되었다.

2) 16S rRNA 염기서열분석

2차 동정은 균주의 16S rRNA의 염기서열을 분석하였다. 같은 미생물종이라도 DNA 염기서열에서는 조금씩 차이를 보이며, 이러한 차이는 생육에도 영향을 미칠 수 있다. 16S rRNA 서열은 생물체들의 분류와 진화를 연구하는데 많이 이용되고 있는데, 이는 모든 생물체는 16S rRNA 유전자를 필수적으로 가지고 있으며 진화 속도와 관계가 있기 때문이다. 16S rRNA 유전자의 크기는 대개 1550 base pair(bp) 정도로 이루어져 있으며, 여러 종들 간에 잘 보존된 부분과 변화가 심한 영역으로 구성되어 있어 현재는 미생물동정에 많이 이용되고 있다(Clarridge, 2004).

따라서 상동관계(homology)를 비교한 결과 도 1과 같이 1,406 잔기의 염기배열을 나타냈고, Lactobacillus plantarum strain NM65-2(Accession No: HM218291) 유전자와 100%(1406/1406) 상동성을 보이므로 균주는 Lactobacillus plantarum 으로 동정되었으며, L. plantarum NH65-2로 판명되었다.

2-3 내열성 측정결과

MRS broth에서 3회 계대 배양한 유산균 배양액을 1% (v/v) 접종하여 37℃(대조구), 60℃, 70℃, 80℃에서 10분, 20분, 30분씩 열처리하여 생균수를 측정한 결과 60℃에서 10분 1.4 x 10⁶(cfu/ml), 20분 2.9 x 10⁵(cfu/ml), 30분 6.7 x 10⁴(cfu/ml)이고, 70℃에서 10분 4.1 x 10⁵(cfu/ml), 20분 2.3 x 10⁴(cfu/ml), 30분 6.7 x 10³(cfu/ml)이며, 80℃에서는 10분 6.3 x 10⁴(cfu/ml), 20분 1.0 x 10⁴(cfu/ml)으로 계수되었고, 30분에서는 생존한 세포수가 [표 5] 및 [도 2]와 같이 하나도 없었다. 따라서, 균주는 열처리온도와 시간이 증가함에 따라 사멸되는 세포수도 급격히 증가하였다.

2-4 내산성 및 내답즙성 측정결과

L. plantarum의 내산성은 시험을 위해 pH 2, pH 3, pH 4, pH 5 조건에서 3시간 처리한 결과 pH 5에서 9.93 x 10⁷ CFU/ml, pH 3에서 3.67 x 10⁷ CFU/ml로 약 37% 감소하였고, 위액조건과 가장 유사한 pH 3에서는 대조구 대비 약 28% 감소하였다[표 6] 및 [도 3]. 한편, 공복시 위액의 pH는 대략 1.4~2.0으로 대부분의 유해균은 사멸되지만, 음식물 섭취시 위장 내 pH는 상승하게 되어 유해균의 사멸을 감소시키게 되는 것이다.

L. plantarum의 내담즙성은 시험을 위해 담즙산염(bile-salt)으로 처리한 0.1%, 0.3%, 0.5%, 0.7%, 1%의 유산균배양액을 6시간 정치 후 생균수를 측정한 결과, 0.1%에서 1.5 x 10⁷ CFU/ml, 0.3%에서는 4.3 x 10⁶ CFU/ml, 0.5%에서는 3.3 x 10⁶ CFU/ml 이상 생존하였다. 반면 0.7% 이상의 처리조건에서는 생존한 세포수가 한 개도 나타나지 않았다[표 7] 및 [도 4].

한편, 가축사료용 생균제로 개발되는 균주들은 내산성 및 내담즙성이 반드시 요구되는데, 이는 강산성 조건(pH 3.0 이하)의 위장을 통과하여, 소장으로 이동 후 생존해야 하기 때문이다. 내산성을 보인 균주는 십이지장에서 분비되는 비교적 산성이 강한 담즙에도 역시 내성을 나타내는 특성을 지니며, 인체 유래 균주가 비(非) 인체 유래 균주보다 위산과 담즙산에 대한 강한 내성을 가진다고 보고되고 있다(Bezkorovainy, 2001).

따라서, 본 발명에 사용된 균주는 비(非) 장내 유래 균주로서 산성과 담즙산에 미미한 내성을 나타내는 것으로 볼 때, 균주 모두 가축의 장내 조건에서 충분히 증식할 수 있는 특성을 지니고 있는 것이다.

2-5 항산화 활성 라디칼을 이용한 황산화능력 측정결과

DPPH 라디칼 소거 활성을 이용한 유산균 배양액의 항산화 활성을 측정하여 [도 6]에 나타내었다. 그리고 유산균 배양 원액을 6.25, 12.5, 25.0, 50.0%의 농도로 희석하여 분석한 결과 농도 의존적으로 항산화 활성은 11.62±0.34, 19.49±1.67, 35.08±4.44, 55.59±9.42% 증가하는 것을 알 수 있었다. 그리고 이와 같은 결과로 DPPH 라디칼을 50% 소거하는 시료의 농도인 IC50값을 측정해본 결과 희석농도는 43.1%로 나타났다[도 5].

2-6 유산균의 병원성 세균에 대한 저해능력평가

1) 그람양성세균(Gram-Positive bacteria)에 대한 항균 활성

① 포도상균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성

본 실험에 사용된 S. aureus는 5.00 x 10⁸ CFU/ml, O.D.; 0.937 (1:1 = 멸균수:S. aureus)로 시험하였으며, 유산균 배양액의 S. aureus에 대한 항균활성은 [표 8]과 같다.

측정은 대표적인 항균제로 알려진 클로람페니콜(Chloramphenicol 100 ppm; 15.45±0.24 mm, 500 ppm; 29.44±0.69 mm, 1000 ppm; 31.30±0.11 mm)의 항균활성을 기준으로 유산균 배양액의 항균활성을 측정하였다. 측정결과 S. aureus에 대해 유산균은 24.43±0.01 mm의 클리어지역(clear zone)을 나타냈다. 따라서, 유산균 배양액은 CMP 100ppm보다 큰 clear zone을 나타내는 것으로 보아, CMP 100ppm (15.45±0.24mm) 보다 높은 항균활성을 가지고 있는 것을 확인할 수 있다. 반면, 유산균을 중성으로 중화시킨 배양액의 경우에는 clear zone은 나타나지 않았다.

② 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 유산균의 항균 활성

본 실험에서는 9.00 x 10⁸ CFU/ml, O.D.; 0.889 (1:1 = 멸균수:B. cereus) 인 B. cereus를 사용하였으며, 유산균 배양액의 B. cereus에 대한 항균활성은 [표 9]와 같다.

측정은 대표적인 항균제로 알려진 Chloramphenicol (100 ppm; 13.30±0.07 mm, 500 ppm; 17.71±0.19 mm, 1000ppm; 24.76±0.15 mm)의 항균활성을 기준으로 유산균 배양액의 clear zone을 측정했다. 그리고 유산균 배양액은 14.05±0.12 mm 의 clear zone으로 CMP와 대비하여 비교적 낮은 항균활성을 나타내었다. 반면, 유산균배양액을 중성으로 중성화시킨 배양액은 clear zone이 나타나지 않았다.

③ 리스테리아모노사이토제네스(L. monocytogenes)에 대한 유산균의 항균 활성

본 실험에서는 2.80 x 10⁸ CFU/ml, O.D.; 1.348 (1:1 = 멸균수:L. monocytogenes)인 L. monocytogenes를 사용하였으며, 유산균 배양액의 L. monocytogenes에 대한 항균활성은 [표 10]과 같다. 측정은 대표적인 항균제로 알려진 Chloramphenicol (100 ppm; 12.48±0.01 mm, 500 ppm; 17.86±0.14 mm, 1000ppm; 20.93±0.09 mm)의 clear zone을 기준으로 유산균의 항균활성을 측정하였다. 그리고 유산균배양액은 9.95±0.01mm의 clear zone으로 CMP와 대비하여 비교적 낮은 항균활성을 나타내었다. 반면, 유산균을 중성으로 중화시킨 배양액은 clear zone 이 나타나지 않았다.

④ 스트렙토코커스 무탄스(Streptococcus mutans)에 대한 유산균의 항균활성

본 실험에서는 1.50 x 10⁸ CFU/ml, O.D.; 1.140 (1:1 = 멸균수:S. mutans) 인 S. mutans를 사용하였으며, 유산균배양액의 S. mutans에 대한 항균활성은 [표 11]과 같다. 측정결과 대표적인 항균제로 알려진 Chloramphenicol (100 ppm; 18.33±0.34 mm, 500 ppm; 23.57±0.05 mm, 1000ppm; 24.76±0.03 mm)의 clear zone은 형성되었지만 유산균을 중성으로 중화시킨 배양액은 clear zone이 형성되지 않았다.

2)Gram-Negative bacteria에 대한 항균 활성

① 대장균(Escherichia coli )에 대한 유산균의 항균활성

본 실험에서는 1.1 x 10⁸ CFU/ml, O.D.; 0.678 (1:1 = 멸균수:E. coli) 인 E. coli를 사용하였으며, 유산균배양액의 E. coli에 대한 유산균배양액의 항균활성은 [표 12]과 같다. 측정은 대표적인 항균제로 알려진 Chloramphenicol (100 ppm; 21.43±0.61 mm, 500 ppm; 24.08±0.06 mm, 1000ppm; 26.01±0.01 mm)의 clear zone 기준으로 유산균배양액의 항균활성을 측정하였으며, 유산균배양액은 11.87±0.04mm clear zone으로 CMP와 대비하여 비교적 낮은 항균 활성을 나타내었다. 반면, 중성화시킨 유산균배양액의 항균활성은 나타나지 않았다.

② 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 대한 유산균의 항균활성

본 실험에서는 5.0 x 10⁸ CFU/ml, O.D.; 0.822 (1:1 = 멸균수:S. typhimurium) 인 S. typhimurium를 사용하였으며, S. typhimurium에 대한 유산균배양액의 항균활성능력은 [표 13]과 같다. 측정은 대표적인 항균제로 알려진 Chloramphenicol (100 ppm; 18.30 ±0.17 mm, 500 ppm; 24.12±0.17 mm, 1000ppm; 31.7±0.41 mm)의 clear zone을 기준으로 유산균의 항균활성을 측정하였으며, 유산균배양액은 17.51±0.01 mm의 clear zone을 나타내었다. 반면, 유산균을 중성화시킨 배양액의 항균활성은 나타나지 않았다.

3) 항곰팡이, 항효모의 활성

① 아스페르질루스푸미가투스(Aspergillus . fumigatus )에 대한 항곰팡이 활성

전배양시킨 곰팡이의 포자를 멸균수 1ml로 희석하여 포자 현탁액을 제조한 후 포자 현탁액 300㎕를 멸균된 PDA 150 ml 에 접종시켜 사용하였으며, A.fumigatus 대한 유산균배양액의 항곰팡이 활성을 측정한 결과, 유산균배양액은 [표 14]와 같이 항곰팡이(영양균사 및 포자형성억제)의 활성은 나타나지 않았다.

② 칸디다트알비칸스(Candidate albicans)에 대한 유산균의 항효모 활성

본 실험에서는 4.9 x 10⁸ CFU/ml, O.D.; 1.359 (1:1 = 멸균수:C. albicans) 인 C. albicans를 사용하였으며, C. albicans 대한 유산균배양액의 항효모 활성을 측정한 결과, 유산균배양액은 [표 15]와 같이 항효모 (영양균사 및 포자형성억제)의 활성은 나타나지 않았다.

Claims

내산성은 pH 5에서 9.93×10⁷CFU/ml, 내담즙산성은 0.1%에서 1.5×10⁷CFU/ml, 내열성은 60℃에서 10분간 열처리할 때 1.4×10⁶CFU/ml, 20분간 열처리할 때 2.9×10⁵CFU/ml, 30분간 열처리할 때 6.7×10⁴CFU/ml이며, 포도상균에 대한 항균활성은 클로람페니콜 100ppm(15.45±0.24mm) 기준 24.43±0.01mm를 나타내는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AS11-1(기탁번호:KACC 91659P).
락토바실러스 플란타룸 AS11-1(기탁번호:KACC 91659P) 또는 이의 배양물을 포함하는 대장균 또는 살모넬라 속 병원균에 대한 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
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락토바실러스 플란타룸 AS11-1(기탁번호:KACC 91659P) 또는 이의 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 정장용 조성물.
락토바실러스 플란타룸 AS11-1(기탁번호:KACC 91659P) 또는 이의 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
락토바실러스 플란타룸 AS11-1(기탁번호:KACC 91659P) 또는 이의 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가용 조성물.