KR20160027796A

KR20160027796A - 락토바실러스 플랜타룸 jsa22 균주 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20160027796A
Application number: KR1020140116367A
Authority: KR
Inventors: 최혜선; 엄정선; 이선영; 송진; 최윤희; 박신영
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2014-09-02
Filing date: 2014-09-02
Publication date: 2016-03-10
Also published as: KR101634270B1

Abstract

본 발명은 락토바실러스 플랜타룸 JSA22 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장내 병원성 세균 억제능을 갖는 락토바실러스 플랜타룸 JSA22 균주 및 상기 균주를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 JSA22(기탁번호:KACC91973P) 균주는 장내 병원성 세균에 대한 항균활성 뿐만 아니라, 내산성, 내담즙성 및 내열성까지 보유하고 있으므로, 장내 세균에 의한 감염질환 치료용 조성물, 정장용 조성물, 생균제 조성물 및 사료용 조성물의 제조에 이용될 수 있다.

Description

락토바실러스 플랜타룸 JSA22 균주 및 이를 포함하는 조성물{LACTOBACILLUS PLANTARUM JSA22 STRAIN AND COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 락토바실러스 플랜타룸 JSA22 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장내 병원성 세균 억제능을 갖는 락토바실러스 플랜타룸 JSA22 균주 및 상기 균주를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

인수공통 전염성 세균에는 대표적으로 식중독을 일으키는 살모넬라 속균(Salmonella spp.), 포도상 구균(Staphylococcus aureus), 장독성 대장균(enterotoxigenic E. coli), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 캠필러박터 제주니(Campylobacter jejuni) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)등이 있으며, 이러한 인수공통 전염성 세균의 억제를 위해 지금까지는 주로 항생제를 사용하였다.

그러나, 이러한 항생제의 사용은 내성 및 잔류 등의 문제로 사용량에 대한 규제가 엄격한데다 장내 유익한 균총 또한 파괴하기 때문에 정상 균총에 의한 병원성 세균 감염에 대한 예방 효과를 잃게 한다. 따라서, 유산균과 같은 유익한 균을 사용하는 프로바이오틱 제제를 개발함으로서 병원성 세균들을 저해함과 동시에 여러 가지 문제를 나타내는 항생제 사용량을 낮출 필요가 있다.

프로바이오틱 유산균에는 다음과 같은 특징들이 요구되는데, 구체적으로 장내 우점 경쟁 및 정착성 등과 관련하여 적용하고자 하는 숙주로부터 분리하는 것이 유리해야 하고, 섭취 후 장내의 소화기관들에서 분비되는 여러 물질들을 견뎌낼 수 있는 내산성 및 내담즙성 등을 나타내어 장내 생존력이 우수해야 하며, 정착(colonization)의 첫단계인 장 부착성(adherence) 뿐 아니라 낮은 pH, 영양소 소비, 전위차 감소, 과산화수소 생산 및 항균물질 생산(예, 박테리오신) 등에 의한 병원성 세균 억제능이 우수해야 하며, 프로바이오틱 제제로 제조되는 동안 온도 및 습도 등의 환경적 스트레스에 강하면서 내산소성 및 저장기간 안정성 등이 우수해야 한다(Salminen, S. 등, In Lactic acid bacteria: Microbiology and functional aspects. Series: Food science and technology, Marcel Dekker Inc., 211-253, 1998).

프로바이오틱 제제로 사용할 수 있는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)에 관한 한국등록특허 제10-1274467호가 있으나, 상기 특허의 균주가 항균 활성을 갖는 것은 엔테로박터 사카자키(Enterobacter sakazakii)에 한정되는 한계가 있다. 따라서 다양한 병원성 세균에 대해 항균활성을 가지면서, 내산성, 내담즙성 및 내열성을 갖는 우수한 프로바이오틱 유산균의 개발이 필요하다.

한국등록특허 제10-1274467호

이에 본 발명자들은 다양한 장내 병원성 세균에 대해 항균효과가 우수한 프로바이오틱 제제를 연구하던 중, 다양한 장내 병원성 세균에 대해 항균활성을 보이고, 내산성, 내담증성 및 내열성이 우수한 락토바실러스 플랜타럼 JSA22 균주를 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 장내 병원성 세균 억제능을 갖는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) JSA22(기탁번호:KACC91973P)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 락토바실러스 플랜타럼 JSA22 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 여러 용도의 유용한 조성물을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 장내 병원성 세균 억제능을 갖는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) JSA22(KACC91973P)를 제공한다.

상기 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 락토바실러스 플랜타럼 JSA22 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 여러 용도의 유용한 조성물을 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 JSA22(KACC91973P)는 장내 병원성 세균에 대한 항균활성 뿐만 아니라, 내산성, 내담즙성 및 내열성까지 보유하고 있으므로, 정장용, 생균제, 사료용 조성물 뿐만 아니라, 장내 세균에 의한 감염질환 치료용 약학적 조성물 또는 개선용 식품 조성물의 제조에 이용될 수 있다.

도 1은 각 균주들의 내산성 및 내담즙성을 비교한 그래프이다.(X축 : 균주 / Y축 : 균주 생존률(%) / 진한 막대 : 인공 위액 결과 / 하얀 막대 : 인공 담즙액 결과)
도 2는 락토바실러스 플랜타럼 JSA22 균주의 장 상피세포 부착능을 나타낸 그래프이다.(대조군 : 엔테로코커스 패시움)
도 3은 락토바실러스 플랜타럼 JSA22 균주와 락토바실러스 람노서스 GG의 열안정성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 락토바실러스 플랜타럼 JSA22 균주와 락토바실러스 람노서스 GG의 소수성 특성을 나타낸 그래프이다.
도 5의 A는 락토바실러스 플랜타럼 JSA22 균주와 락토바실러스 람노서스 GG의 병원성 세균에 대한 저해환 생성을 나타낸 사진이다.
도 5의 B는 락토바실러스 플랜타럼 JSA22 균주와 락토바실러스 람노서스 GG의 병원성 세균에 대해 생성한 저해환의 지름을 나타낸 그래프이다.
도 6의 A는 락토바실러스 플랜타럼 JSA22 균주와 락토바실러스 람노서스 GG의 쥐티푸스균에 대한 항균활성을 DAPI 염색하여 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 6의 B는 쥐티푸스균의 상대적인 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 7의 A는 쥐티푸스균의 독성 단백질 발현 여부를 웨스턴 블랏팅(western blotting)으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7의 B는 쥐티푸스균의 독성 단백질의 상대적인 발현량을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 장내 병원성 세균 억제능을 갖는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) JSA22(기탁번호:KACC91973P) 균주를 제공한다.

상기 균주는 깻잎집장에서 분리된 신규한 미생물로서, 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)의 표준 균주에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되어, 락토바실러스 플랜타럼 JSA22로 명명하고, 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 2014년 06월 20일자로 기탁하였다(기탁번호 : KACC91973P).

상기 균주는 장내 병원성 세균 억제능 이외에도 내산성, 내담즙산성 및 내열성을 갖고 있어, 정장용 조성물, 생균제 조성물, 사료용 조성물, 약학적 조성물, 및 식물 조성물 등과 같은 여러가지 조성물의 형태로 제조하기에 적합하다.

또한, 상기 균주는 통상적인 물리, 화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 갖고 필드 안정성이 뛰어나거나 또는 보다 뛰어난 항바이러스 활성을 나타내도록 개선 또는 개량될 수 있음은 당업자에게 충분히 이해될 것이다. 상기 균주는 동결건조 되거나 캡슐화된 형태 또는 배양 현탁액이거나 건조분말 형태일 수 있다. 또한, 상기 균주는 상기 균주의 파쇄된 세표벽 분획, 생균, 사균 또는 건조균의 형태로 이용될 수 있다.

상기 장내 병원성 세균은 이에 한정되지는 않지만, 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 살로넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 락토바실러스 플랜타럼 JSA22(기탁번호:KACC91973P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 정장용, 생균제 또는 사료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 배양물은 액체배지에서 락토바실러스 플랜타럼 JSA22 균주를 배양한 배양액, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액, 상기 배양액을 초음파 처리 또는 용해효소(lysozyme) 처리하여 얻은 세포 파쇄액을 의미할 수 있다.

상기 조성물은 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 조성물 내 락토바실러스 플랜타럼 JSA22 균주 또는 이의 배양물의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다.

상기 '정장용'이란 동물의 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반증상을 치료 및 개선하는 용도를 말한다.

상기 '생균제'는 살아 있는 균 즉, 동물이 섭취했을 때 위장관에 머물러 생존할 수 있는 미생물로서 특정 병리 상태를 예방하거나 치료할 수 있는 효과가 있는 미생물 제제를 말한다. 일반적으로 생균제는 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반 증상을 치료하고 개선하는 효과가 있으며 체내에 투여되면 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해 미생물이 정착하지 못하게 하는 작용을 하고 유산을 생성하여 장내 pH를 낮추어서 유해 미생물의 증식을 억제한다. 또한, 투여된 생균제는 영양분의 흡수를 담당하는 장융모의 활동을 도와주는 역할을 수행한다.

본 발명에 따른 정장용 또는 생균제 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 락토바실러스 플랜타럼 JSA22 균주 또는 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭실, 시럽, 산제, 현탁제 또는 과립제 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 상기 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여 방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여 용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 사료용 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 유산균과 여러 가지 미생물 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조될 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 JSA22 또는 이의 배양물을 혼합하여 제조될 수 있다. 펠렛형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼 JSA22로 발효시킴으로서 제조될 수 있다.

본 발명은 또한 락토바실러스 플랜타럼 JSA22(기탁번호:KACC91973P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 장내 병원성 세균 감염질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 ‘치료’는 장내 병원성 세균에 의해 유발된 감염질환의 억제 또는 상기 감염질환의 경감을 의미한다.

상기 장내 병원성 세균은 이에 한정되지는 않지만, 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 살로넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있고, 상기 감염질환은 이에 한정되지는 않지만, 식중독, 장티푸스, 복막염, 궤양성 대장염, 크론병, 장관 베체트병, 감염성 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장관 급이성 설사 및 허혈성 장염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 락토바실러스 플랜타럼 JSA22 또는 이의 배양물을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은, 경구형 제형인 경우 성인 기준으로 체중 1㎏ 당 0.1㎍ 내지 100mg 투여할 수 있다. 그러나 상기 조성물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 조성물을 장내 병원성 세균 감염성 질환의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명은 락토바실러스 플랜타럼 JSA22(기탁번호:KACC91973P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 장내 병원성 세균 감염질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 식품 조성물이 예방 또는 개선할 수 있는 감염질환은 상기 약학적 조성물에서 설명한 바와 동일하다.

상기 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공

지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물의 종류에는 특별한 제한은 없지만, 예컨대 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 JSA22 균주 또는 이의 배양물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 조성물은 1×10¹ 내지 1×10¹⁰ CFU/g의 JSA22 균주를 포함할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 JSA22 균주 또는 이의 배양물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다.

상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 특별히 제한되지 않지만, 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 - 세포외다당 생성 균주의 분리 및 동정>

실시예 1. 장류로부터 다양한 유산균 분리

전국 각지에서 된장, 막장 및 집장 등 12종류의 장류를 수집하였다. 수집한 장류 시료 20g을 80mL의 0.85%(w/v) 멸균 생리식염수에 현탁한 후, 저영양 배지로 20% MRS 아가(agar) 배지(Difco, Sparks, MD, USA)에 도말하여 37℃에서 정치배양하였다. 일반적으로 영양원이 충분할 경우, 배양 초반에 우점종이 되는 균주부터 선택되기 때문에 저영양 배지를 사용하여 유산균 성상을 보이는 458개의 콜로니(colony)를 선택하였다. 선택된 콜로니는 동일한 배지에 순수 분리하여 3대 계대배양한 후 단일 콜로니를 취하여 MRS 액체 배지에 배양하고, 75% glycerol 용액에 현탁하고 -80℃에 보관하여 실험에 사용했다.

실시예 2. 세포외다당 생성 유산균의 분리 및 동정

상기 유산균 성상을 보이는 458개 균주의 세포외다당(EPS, Exopolysaccharide) 생성 여부를 스크리닝하기 위해 박막크로마토그래피(TLC) 분석을 실시하였다.

호모(homo)-세포외다당 생성 확인을 위하여 MRS 배지를 5 kDa 컷오프 초미세여과(cutoff ultrafiltration; Pall, Port Washington, NY, USA)하여 배지 내 단백다당을 제거한 후, 2% 수크로즈와 말토오즈를 첨가하였다. 분리 균주는 37℃에서 24시간, 30℃에서 7시간 배양 후, 8,000 rpm에서 10분 동안 원심분리(6200, Kubota, Tokyo, Japan) 하여 상등액을 TLC 스크리닝 시료로 사용하였다. 배양물 1 μL 4회 점적하고 전개용매(ACN : water=85:15)로 4회 전개하였으며, 발색용매(0.5% naphtal, 5% H2SO4 in ethanol)로 발색시킨 후, 105°C 오븐에 3분 굽고 스팟(spot)을 확인하였다. 다당 생성 농도를 정량적 스크리닝 하기 위해 배양물의 스팟 농도는 멀티 게이지(multi gauge; Fuji film, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 균을 배양하지 않은 배지(control) 스팟의 농도와 균배양물의 스팟의 농도를 비교하여 180% 이상 차이를 보인 6개의 균주를 EPS 우수생성 균주로 선발하였다.

상기 6개 균주의 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석은 ㈜제노텍(대전, 한국)에 의뢰하여 분석하였으며, 사용된 프라이머(primer)는 518F(5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3')와 800R(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3’)을 사용하였다. 16S rDNA 유전자의 염기서열 분석 후, NCBI의 데이터베이스를 통하여 유사균주들과 비교하였다. 또한 염기서열을 클로스터 엑스 프로그램(Clustal X program)을 이용하여 정렬한 후, 인접결합방법(neighbor-joining method, Saitou N et.al., Mo; Biol Evol;4:406-425, 1987)에 의거하여 분리 균주의 계통분류학적 위치를 조사하였다. TLC 분석 결과 및 균주 동정 결과는 하기 표 1에 표시하였다. TLC로 측정한 EPS 생성능은 아래의 식으로 표시할 수 있다.

6개 균주의 동정결과

균주	동정 결과
HSB15	락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius)
JSA22	락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)
JSA57	락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus )
JSB22	락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis )
JSB66	락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius )
JSB89	락토바실러스 파라브레비스(Lactobacillus parabrevis )

상기 JSB22균주의 기탁번호는 “KACC91760P”이고, 2012년 11월 20일에 특허출원(출원번호:10-2012-0132034)된 바 있다.

실험예 1. 6개 균주의 항균 활성 측정

분리 균주의 항균 활성은 한천 확산법(agar-well diffusion assay)을 사용하여 분석하였다(Hechard Y et.al., Lett Appl Microbiol 11: 185-188, 1990). 대상세균으로는 식중독 감염의 원인균으로 보고된 그람양성 세균인 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes) LMG 13305, 스타필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus) DSM 346, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) ATCC 27348, 그람음성 세균인 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) DSM 30083, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) IFO 3313을 사용하였고, 상기 균주들은 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에서 분양받아 사용하였다. 유해 균주 배양물의 광학밀도(660 nm)가 0.5가 되도록 일정농도의 균수로 조절하여 0.7% 영양 반고체 아가 배지(NA soft agar, Difco)에 0.3%의 농도로 접종하여 혼합한 뒤 상기 반고체 아가 평판배지에 5 mL 분주하여 굳힌 후, 1 mm의 구멍을 내고 전 배양된 분리 균주를 5 μL씩 접종하여 배양하여 저해환(clear zone)을 확인하였다. 결과는 하기 표 2에 표시하였다. -는 저해환이 없는 것이고, +는 저해환이 있는 것을 의미한다.

6개 균주의 항균활성

	LMG 13305	DSM 30083	DSM 346	IFO 3313	ATCC 27348
HSB15	-	-	-	+	-
JSA22	+	+	+	+	+
JSA57	-	+	-	-	-
JSB22	+	+	-	+	-
JSB66	-	-	-	+	-
JSB89	-	-	-	-	-

깻잎집장으로부터 분리된 JSA22가 시험한 5개 모두의 병원성 균주에 대해 항균력을 나타내었고, JSB22가 3개의 병원성 균에 대한 항균력을 나타내었으며, HSB15, JSA57 및 JSB66은 각각 1개의 병원성 균에 대한 항균력을 나타내었다. 유산균은 젖산을 생성하여 산도를 낮춤으로써 병원성 세균의 생육을 억제하는 것으로 알려져 있으며, 박테리오신(bacteriocin) 등의 항균성 펩티드를 생성하여 항균작용을 나타낸다. 따라서 항균 활성이 우수한 분리 균주 JSA22는 장에 머물면서 유해 균주 증식을 억제하여 장내균총을 개선시키는 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다.

실험예 2. 6개 균주의 인공 위액 및 인공 담즙액에 대한 저항성

인공 위액 및 인공 담즙액에 대한 저항성을 실험할 때, 상업적으로 이용되는 대표적인 프로바이오틱 균주인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG(ATCC53103)를 양성대조군으로서 같이 실험하였다(상기 ATCC53103 균주를 이하, LGG로 표현).

분리 균주의 체내 소화관 조건과 유사한 환경에서 측정하기 위하여 인공위액 내성실험을 실시하여 확인하였다. 인공위액 내성 실험은 코바야시(Kobayashi)의 방법(Kobayashi Y et . al ., Nihon Saikingaku Zasshi ; 29:691-697)을 변형하여 1 N HCl로 pH 2.5로 조정한 MRS 액체배지(Difco)에 0.22 μm 막 여과(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)한 1% 펩신(Sigma-Aldrich Co.)을 첨가하여 인공위액을 제조하였다. MRS 액체배지에 균을 접종하여 37℃에서 24시간 동안 200 rpm의 조건에서 배양(VS-8480SF,Vision, Bucheon, Korea)한 후, 배양물 1 mL를 50 mL의 인공위액을 가하여 배양(37°C, 2 hr, 200 rpm)하고 생균수를 계수하여 생존율(%) [(실험구의 Log 지수값/대조구의 Log 지수값)×100]로 나타내었다. 대조구는 펩신을 첨가하지 않고 pH 조절하지 않은 MRS 액체배지를 사용하였다.

인공 담즙에 대한 저항성은 백(Paik)의 방법(Paik HD et.al., Korean J Food Sci Technol;34:73-78, 2002)을 변형하여 멸균된 10% 옥스골(oxgall)을 1% 첨가하여 인공담즙을 제조하였다. MRS 액체배지에 균을 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 배양물을 인공위액에 넣고, 진탕배양(37℃, 2 시간) 후 생균수를 측정하여 생존율(%)로 나타내었다. 대조군은 10% 옥스골을 첨가하지 않은 MRS 액체배지를 사용하였다.

실험은 3회 수행하였으며, SPSS 12.0(Statistical package for the social science, IBM, Armonk, NY, USA)를 이용하여 일원배치분산분석(ANOVA)을 실시하였으며, 사후검정은 Duncan’s multiple range test에 의하여 실행하였다. 통계적 유의성은 P<0.05을 기준으로 하였다. 유의성 차이는 알파벳 소문자로 표시하였다.

인공 위액 및 인공 담즙액 저항성 결과는 도 1에 표시하였다. 인공 위액 및 담즙액에 대한 저항성 모두 JSA22, JSA57 및 JSB22는 LGG와 유의적 차이 없이 유사하였다. 반면, HSB15는 인공 담즙액 저항성이 다른 균주들에 비해 떨어지는 편이였고, JSB66 및 JSB89는 각각 36.49%, 44.26%의 인공 위액 내성을 갖고 있어 다른 균주들보다 눈에 띄게 약한 저항성을 나타내었다. 도 1에서 항균활성이 가장 우수한 JSA22는 LGG만큼이나 위액 및 담즙액 저항성이 우수하다는 것을 알 수 있다.

이에, 본 발명자들은 다른 균주들보다 내산성, 내담즙성, 항균활성이 우수한 “락토바실러스 플랜타룸 JSA22”를 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 2014.6.20.일자로 KACC91973P의 기탁번호로 기탁하였다.

실험예 2. 6개 균주의 인공 위액 및 인공 담즙액에 대한 저항성

인공 담즙에 대한 저항성은 백(Paik)의 방법(Paik HD et . al ., Korean J Food Sci Technol;34:73-78, 2002)을 변형하여 멸균된 10% 옥스골(oxgall)을 1% 첨가하여 인공담즙을 제조하였다. MRS 액체배지에 균을 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 배양물을 인공위액에 넣고, 진탕배양(37℃, 2 시간) 후 생균수를 측정하여 생존율(%)로 나타내었다. 대조군은 10% 옥스골을 첨가하지 않은 MRS 액체배지를 사용하였다.

실험예 3. JSA22 균주와 프로바이오틱스와의 비교

실험예 1 및 2를 통하여 JSA22가 항균활성, 위액 및 담즙액에 대한 저항성이 가장 우수한 균주임을 발견하였다. 이에, JSA22 균주를 LGG와 장내 부착능, 열안정성, 소수성 특성 분석 및 항균활성을 비교해보았다.

실험예 3-1. 장 상피세포 부착능

단층(monolayer)을 이룬 장상피세포 ccd18-co(ATCC CRL-1459) 1×10⁵cell/mL와 락토바실러스 플란타럼JSA22 8 LOG CFU/mL를 공동배양(37℃, 1시간)한 후, 멸균 살린(saline)으로 3회 세척한 후, 트립신을 처리하여 MRS 아가(agar)에 도말하여 배양하여 부착된 유산균을 계수하였다. 초기 투입 균수 대비 세포에 부착된 균수를 계수하여 장내 부착능(%)을 평가하였고, 그 결과는 도 2에 표시하였다. 도 2에서 JSA22가 대조군보다 장내 부착능이 더 우수함을 확인할 수 있다.

실험예 3-2. 열안정성 및 소수성 특성 분석

JSA22 및 LGG 각각의 배양물을 65℃에서 각각 30, 60, 90분간 놓아둔 후 잔존하는 생균수를 측정하여 열안정성 정도를 확인하였다. 시간에 따른 생균수를 도 3에 표시하였다. 도 3에서 JSA22의 생균수 감소 속도가 LGG와 유사한 것을 확인할 수 있고, 이는 JSA22의 열안정성이 LGG와 비슷한 수준인 것을 의미한다.

또한, 상기 두 유산균의 세포 표면 소수성을 측정하기 위하여 탄화수소에 부착하는 정도를 측정하였다. 소수성 측정을 위한 탄화수소로는 n-헥사데카인(hexadecane) 및 자일렌(xylen)을 사용하였다. JSA22 및 LGG를 각각 인산완충용액을 이용하여 현탁액으로 만들어 660nm에서의 흡광도(A₀)를 측정하고, 상기 현탁액에 소수성이 높은 유기용매인 n-헥사데카인(hexadecane) 및 자일렌(xylen)을 각각 동량으로 가하여 볼텍스 믹서(vortex mixer)로 충분히 혼합하였다. 60분 동안 실온에서 방치하여 두 층이 나뉘어지게 한 후, 유기용매를 제외한 현탁액의 660nm에서의 흡광도(A₁)를 측정하여 유산균주가 용매에 부착하는 정도를 아래 식으로 계산하였다.

* 표면 소수성(%)=100×(A₀ - A₁)/A₀

소수성 특성 결과는 도 4에 표시하였다. 도 4에서 JSA22 균주는 LGG만큼이나 소수성을 갖는 다는 것을 알 수 있다. 소수성이 강하면, 장막과 소수성 결합을 강하게 할 수 있기 때문에 장내 부착이 잘 이뤄진다.

실험예 3-3. 항균활성

JSA22와 LGG의 항균활성을 비교해보았다. 실험방법은 상기 실험예 1과 동일하고, 병원균주는 국립농업과학원 농업유전자원센터에서 분양받은 스타필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus) DSM 346, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) ATCC 27348, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) DSM 30083, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) IFO 3313를 사용했다. 저해환 생성 사진은 도 5의 A에 표시하였고, 저해환의 지름크기는 도 5의 B에 표시하였다.

상기 도 5에서 JSA22 균주가 스파필로코커스 오레우스(DSM 346)를 제외한 나머지 병원균에 대한 항균활성이 LGG보다 더 우수함을 확인할 수 있다.

실험예 3-4. 쥐티푸스균 세포 침투 억제 여부

JSA22가 쥐티푸스균인 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) UK1 SF530의 장상피세포 침투를 억제하는지 여부를 쥐티푸스 균의 독성단백질인 SopB 단백질을 이용하여, 면역 염색(immunocytochemistry staining) 및 면역 블랏팅(immunoblotting)으로 살펴보았다.

단층의 CCD-18Co 세포에 JSA22와 쥐티푸스 균 현탁액을 접종하여 1시간 동안 배양시켜 감염시킨 후, 3.7% 파라 포름알데하이드로 세포고정을 하였다. 고정된 세포를 10% 정상 염소 혈청을 이용하여 블로킹한 후, 인산완충액으로 3회 수세 하였다. 여기에 토끼 항SopB 항체와 Alexa 488이 부착된 항-토끼 IgG 이차 항체를 이용하여 SopB를 형광염색한 후, 회흐스트(hoechst)로 대비 염색하였고, 염색 여부를 공초점 주사 레이저(Confocal laser scanning) 및 DIC(미분간섭 현미경)으로 관찰하여 6의 A에 표시하였다. 유산균 없이 쥐티푸스 균만 감염시킨 대조군에서 가장 많은 SopB가 발견되었고, 쥐티푸스 균과 함께 JSA22 유산균을 감염시킨 실험군(쥐티푸스 균+JSA22)은 JSA22 대신 LGG로 감염시킨 양성대조군(쥐티푸스 균+LGG)과 비슷한 수준의 SopB가 발견되었다.

각 실험군 및 대조군에서 SopB에 염색된 형광의 발광 정도를 현미경 내 부착된 이미지 농도 분석 장치로 측정하여 도 6의 B에 표시하였다. 도 6의 B를 통해, JSA22가 LGG와 비슷한 수준으로, 쥐티푸스 균의 침투를 억제한다는 것을 알 수 있다.

CCD-18Co 세포를 JSA22와 쥐티푸스 균으로 상기 면역 염색을 위한 실험과 같은 방법으로 감염시킨 후, 세포를 파쇄하여 SDS-PAGE를 실시하였고, 로딩 대조군으로는 액틴을 사용하였다. 전기영동이 완료된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮긴 후, 상기 멤브레인을 상온에서 2시간 동안 3% BSA용액으로 블로킹하고, 1차 항체(Affinity purified goat anti-SopB)와 반응시켰다. 다시 2차 항체(horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat IgG secondary antibody)와 반응시키고 POD(Roche, Mannheim, Germany)로 X-ray 필름에 감광하여 현상하였다. 현상된 밴드를 도 7의 A에 표시하였고, SopB 발현량을 도 7의 B에 표시하였다.

농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터

KACC91973P

20140620

Claims

장내 병원성 세균 억제능을 갖는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) JSA22(기탁번호:KACC91973P).
제1항에 있어서,
상기 장내 병원성 세균이 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 살로넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는, 락토바실러스 플랜타럼 JSA22(기탁번호:KACC91973P).
제1항에 있어서,
상기 락토바실러스 플랜타럼 JSA22가 내산성, 내담즙산성 및 내열성을 갖는, 락토바실러스 플랜타럼 JSA22(기탁번호:KACC91973P).
락토바실러스 플랜타럼 JSA22(기탁번호:KACC91973P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물.
락토바실러스 플랜타럼 JSA22(기탁번호:KACC91973P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물.
락토바실러스 플랜타럼 JSA22(기탁번호:KACC91973P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 사료용 조성물.
락토바실러스 플랜타럼 JSA22(기탁번호:KACC91973P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 장내 병원성 세균 감염질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 장내 병원성 세균이 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 살로넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로 이루어진 군에서 선택되는, 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 장내 병원성 세균 감염질환이 식중독, 장티푸스, 복막염, 궤양성 대장염, 크론병, 장관 베체트병, 감염성 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장관 급이성 설사 및 허혈성 장염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학적 조성물.
락토바실러스 플랜타럼 JSA22(기탁번호:KACC91973P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 장내 병원성 세균 감염질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.