KR20200065546A

KR20200065546A - 와이셀라 시바리아 jw15 균주를 포함하는 세균성 장질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20200065546A
Application number: KR1020180152113A
Authority: KR
Inventors: 백현동; 유형석; 이나경; 배천호; 최애진; 최정숙; 박대철
Original assignee: 건국대학교 산학협력단; 주식회사 아람; 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2020-06-09
Also published as: KR102171898B1

Abstract

본 발명은 와이셀라 시바리아 JW15 균주를 유효성분으로 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 및 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병원성 세균으로 인한 세균성 장질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물; 및 상기 병원성 세균에 대한 항균용 조성물에 관한 것이다.

Description

와이셀라 시바리아 JW15 균주를 포함하는 세균성 장질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING, TREATING OR IMPROVING OF BACTERIAL INTESTINAL DISEASE COMPRISING STRAIN OF WEISSELLA CIBARIA JW15}

본 발명은 와이셀라 시바리아 JW15 균주를 포함하는 세균성 장질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

전통적으로 이용되어 온 일부 유산균은 프로바이오틱스(probiotics)에 속하며 섭취 시 장내 미생물총의 일부분으로 정착하여 숙주의 생리활성에 있어 이로움을 제공한다. 최근 들어 각광받는 유산균을 포함한 프로바이오틱스는 정장작용, 염증성 질환의 억제, 알러지 증상 개선과 같은 면역조절 및 병원성 세균의 감염 방지 및 제어 등 다양한 질병의 예방과 치료에 이용되고 있다.

와이셀라균은 비교적 최근에 동정된 유산균 중 하나로써, 23종이 보고된 바 있다. 발효 식품과 관련된 주요 균종에는 Weissella kimchii , Weissella koreensis, Weissella confusa 및 Weissella cibaria 등이 있으며 그 중 특히 Weissella cibaria는 우리나라의 김치에서 주로 발견되며, Leuconostoc mesenteroides 및 Lactobacillus plantarum와 더불어 김치의 우점종 중 하나로써 김치의 발효 초기에 관여하는 것으로 알려져 있다. 와이셀라균은 비교적 적은 양의 유산을 생성하며 기능성 세포 외 다당류를 생성하는 것으로 보고된 바 있다. Weissella cibaria의 면역 조절활성, 구강 유해균 억제와 같은 기능성이 보고되고 있으며, 이에 따라 이들 일부 균주를 이용한 기능성 프로바이오틱스 제품들이 생산되고 있다.

장은 프로바이오틱스의 주요 서식지일 뿐만 아니라, 신체 전체의 미생물총(microbiome) 중 가장 큰 비율을 차지하기 때문에 미생물에 의한 이로운 효과의 대부분은 장에서 유래하며, 면역계의 70% 이상이 장에 의해 조절된다는 연구가 보고된 바 있다. 실제로 건강한 사람의 분변을 대장질환자에게 이식하여 대장 내 미생물총을 개선함으로써 질병을 치료하는 시도들이 이루어지고 있다.

본 발명은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(KACC 91811P)를 유효성분으로 포함하는, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 및 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병원성 세균으로 인한 세균성 장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등을 제공하고자 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(KACC 91811P)를 유효성분으로 포함하는, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 및 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병원성 세균으로 인한 세균성 장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 균주는 ⅰ) 내지 ⅳ)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 추가로 가질 수 있다:

ⅰ) 우수한 내산성, 내담즙성, 알코올 내성 및 장부착능;

ⅱ) β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 활성 억제 및 β-글루코시다아제(β-glucosidase) 활성 촉진;

ⅲ) 용혈성 및 레시티나아제(lecithinase) 활성의 불활성화; 및

ⅳ) 테트라사이클린(Tetracycline), 클로람페니콜(chloramphenicol), 에리트로마이신(erythromycin) 또는 반코마이신(vancomycin)에 대한 항생제 저항성.

상기 균주는 젖산, 아세트산 및 피로글루탐산으로부터 선택된 하나 이상의 유기산을 생산할 수 있다.

상기 균주는 장 병원성 세균의 장내 부착 저해능을 가지고, 상기 장 병원성 세균은 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔터라이티디스(Salmonella enteritidis) 및 대장균(Escherichia coli)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 균주는 항산화 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(KACC 91811P)를 유효성분으로 포함하는, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 및 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병원성 세균으로 인한 세균성 장질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로, 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(KACC 91811P)를 유효성분으로 포함하는, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 및 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병원성 세균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(KACC 91811P)를 포함하는 세균성 장질환 예방, 치료 또는 개선용도 혹은 항균 용도에 관한 것으로, 상기 균주(KCCM 91811P)는 안정성 및 안전성이 우수한 이점을 가지는바, 프로바이오틱스로서 활용 가능하다.

특히, 상기 균주(KCCM 91811P)는 특정 병원성 세균에 대한 항균 활성을 가지고, 유기산 생성능을 가지며, 특정 장 병원성 세균의 장내 부착 저해능을 가질 뿐만 아니라, 항산화 활성 역시 우수하므로, 장 환경을 현저히 개선시킬 수 있다.

도 1은 혈액한천배지를 이용하여, (A) Vibrio parahaemolyticus 및 (B) Weissella cibaria JW15의 용혈성을 평가한 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 난황한천배지를 이용한 (A) Staphylococcus aureus와 (B) Weissella cibaria JW15의 Lecithinase 활성을 평가한 결과를 나타낸 그림이다.

본 발명자들은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(KACC 91811P)의 용도에 대해 연구를 하던 중, 상기 균주(KCCM 91811P)의 프로바이오틱 특성(안정성 및 안전성)을 검증한 다음, 특정 병원성 세균에 대한 항균 활성이 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 내 "세균성 장질환"이라 함은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 및 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병원성 세균으로 인한 장질환을 의미하는 것으로, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 또는 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)으로 인한 장질환인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적인 장질환으로는 식중독, 만성/급성 위장염 등을 들수 있다.

상기 균주(KCCM 91811P)는 프로바이오틱스로서 활용가능하기 위해, 안정성 및 안전성이 우수한 것을 특징으로 한다. 따라서, 상기 균주(KCCM 91811P)는 하기 ⅰ) 내지 ⅳ)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 추가로 가질 수 있다:

ⅰ) 우수한 내산성, 내담즙성, 알코올 내성 및 장부착능;

ⅲ) 용혈성 및 레시티나아제(lecithinase) 활성의 불활성화; 및

상기 ⅰ)에서 내산성은 pH 2.5 조건에서 3시간 반응시, 상기 균주(KCCM 91811P)의 생존율이 90% 이상일 수 있고, 내답즙성은 0.3%(w/v) oxgall 조건에서 24시간 반응시, 상기 균주(KCCM 91811P)의 생존율이 90% 이상일 수 있다. 또한, 알코올 내성은 5~20% 에틸알코올 조건에서 4시간 반응시, 상기 균주(KCCM 91811P)의 생존율이 80% 이상일 수 있다.

상기 ⅱ)에서 β-글루쿠로니다아제(β-Glucuronidase) 활성 억제를 통해, 생체 안전성을 확보할 수 있다. 뿐만 아니라, β-글루코시다아제(β-Glucosidase) 활성 촉진을 통해, 유용 물질의 생물 전환을 기대할 수 있다.

상기 균주(KCCM 91811P)는 젖산, 아세트산 및 피로글루탐산으로부터 선택된 하나 이상의 유기산을 생산할 수 있는데, 이와 같이 생산된 젖산 및 아세트산은 항균 효과에 있어 시너지 효과를 나타낼 수 있고, 피로글루탐산은 장의 방어작용에 간접적으로 기여할 수 있는바, 궁극적으로 장 환경 개선에 기여할 수 있다.

상기 균주(KCCM 91811P)는 장 병원성 세균의 장내 부착 저해능을 가지고, 상기 장 병원성 세균은 앞서 언급한 병원성 세균과는 구별되는 것으로, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔터라이티디스(Salmonella enteritidis) 및 대장균(Escherichia coli)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 대장균(Escherichia coli)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 균주는 항산화 활성을 가질 수 있는데, 상기 항산화 활성과 관련하여, 상기 균주(KCCM 91811P)의 항산화 활성은 유리라디칼 모델인 DPPH, ABTS+와, 산화라디칼 모델인 Hydroxyl에서 라디칼 소거능 평가를 통해, 또는 지방산 산화 모델인 β-carotene에서 표백 억제능 평가를 통해 확인될 수 있다.

그밖에, 상기 균주(KCCM 91811P)는 자가-응집성 및 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis) 등 장 병원성 세균과의 공동-응집성을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 균주(KCCM 91811P)는 37℃에서 24시간 동안 배양시 자가-응집성이 50% 이상이고, 동일한 조건에서 장 병원성 세균과 혼합 배양시 공동-응집성이 30% 이상일 수 있다. 따라서, 상기 균주(KCCM 91811P)는 장내 군집화를 통해 효과적으로 장 정착을 할 수 있을 뿐만 아니라, 장 병원성 세균의 장내 군집화를 저해할 수 있는 이점을 가진다.

또한, 상기 균주(KCCM 91811P)는 포름산, 프로피온산 및 부티르산으로부터 선택된 하나 이상의 단쇄지방산을 생성할 수 있는데, 이로써, 항균 및 항곰팡이 활성을 향상시킬 수 있으며, 면역 및 신경 질환에 대한 예방 효능을 향상시킬 수 있다.

한편, 상기 균주(KCCM 91811P)는 생균체, 사균체 또는 배양여액인 것일 수 있다.

또한, 상기 균주(KACC 91811P)의 용량은 1 μg/mL 내지 100 μg/mL인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 균주(KACC 91811P)의 용량이 상기 범위 미만인 경우, 해당 효능을 제대로 발휘하기 어려운 문제점이 있고, 상기 균주(KACC 91811P)의 용량이 상기 범위를 초과하는 경우, 독성의 우려사항이 있을 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제는 상기 균주에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(KACC 91811P)를 유효성분으로 포함하는, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 및 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병원성 세균으로 인한 세균성 장질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(KACC 91811P)와, 상기 세균성 장질환에 대해서는 전술한 바와 같다.

한편, 상기 균주(KACC 91811P)는 생균체, 사균체 또는 배양여액인 것일 수 있다. 또한, 상기 균주(KACC 91811P)의 용량은 1 μg/mL 내지 100 μg/mL인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 균주(KACC 91811P)의 용량이 상기 범위 미만인 경우, 해당 효능을 제대로 발휘하기 어려운 문제점이 있고, 상기 균주(KACC 91811P)의 용량이 상기 범위를 초과하는 경우, 독성의 우려사항이 있을 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품에 있어서, 상기 균주를 건강기능식품의 첨가물로 사용하는 경우 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

건강기능식품의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.

상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.

일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 균주는 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.

상기 외에 본 발명에 따른 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 따른 건강기능식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명에 따른 건강기능식품 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(KACC 91811P)를 유효성분으로 포함하는, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 및 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병원성 세균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 명세서 내 "항균"이라 함은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 및 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병원성 세균의 생육 저해능을 의미하는 것으로, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 또는 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)의 생육 저해능을 의미하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(KACC 91811P)에 대해서는 전술한 바와 같다.

한편, 상기 균주(KACC 91811P)는 생균체, 사균체 또는 배양여액인 것일 수 있다. 또한, 상기 균주(KACC 91811P)의 용량은 1 μg/mL 내지 100 μg/mL인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 균주(KACC 91811P)의 용량이 상기 범위 미만인 경우, 해당 활성을 제대로 발휘하기 어려운 문제점이 있고, 상기 균주(KACC 91811P)의 용량이 상기 범위를 초과하는 경우, 독성의 우려사항이 있을 수 있다.

그밖에, 본 발명은 상기 항균용 조성물을 포함하는 약학 조성물, 건강기능식품, 의약외품 또는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(KACC 91811P)를 포함하는 세균성 장질환 예방, 치료 또는 개선용도 혹은 항균 용도에 관한 것으로, 상기 균주(KCCM 91811P)는 안정성 및 안전성이 우수한 이점을 가지는바, 프로바이오틱스로서 활용 가능하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1

와이셀라 시바리아 JW15(Weissella cibaria JW15; KACC 91811P) 균주는 한국농업미생물자원센터(KACC)에서 제공받아 사용하였고, 대조군으로 대표적인 상업용 프로바이오틱 균주인 락토바실러스 람노서스 GG(Lactobacillus rhamnosus GG; KCTC 12202BP) 균주를 사용하였다.

실험예 1: 균주의 프로바이오틱 안정성 평가

(1) 내산성 및 내담즙성 평가

와이셀라 시바리아 JW15 균주의 내산성은 pH를 2.5로 조정하고 펩신을(0.3%) 포함하는 MRS 액체배지에 균주를 접종하고 37℃에서 2시간 배양한 후의 균수를 초기 접종 균수와 비교하였다. 내담즙성은 oxgall을(0.3%) 포함하는 MRS 액체배지에 균주를 접종하고 37℃에서 24시간 배양한 후의 균수를 초기 접종 균수와 비교하였다.

처리	균수(Log CFU/mL)
처리	Lactobacillus rhamnosus GG	Weissella cibaria JW15
초기 균수	9.36 ± 0.02^b	9.25 ± 0.03^b
0.3%(w/v) pepsin, pH 2.5, 3시간	9.28 ± 0.02^a	9.13 ± 0.03^a
0.3%(w/v) oxgall, 24시간	9.35 ± 0.02^b	9.21 ± 0.09^b

* 동일한 행에 있는 상이한 위첨자는 균주 간의 통계적 차이를 나타낸다(p<0.05). 값은 평균±SD(n = 3)로 표현된다.

표 1에 나타난 바와 같이, 와이셀라 시바리아 JW15 균주의 내산성 평가 결과, 락토바실러스 람노서스 GG 균주와 유사하게, 초기 균수와 비교하여 균수가 약 0.1 Log CFU/mL 정도 감소하는 우수한 저항성을 나타냈다. 내담즙성의 경우, 와이셀라 시바리아 JW15 균주 및 락토바실러스 람노서스 GG 균주 모두 충분한 저항성을 나타내어 배양 후 균수가 초기 균수와 비교하여 통계적 유의적 차이를 보이지 않았다.

따라서, 와이셀라 시바리아 JW15 균주의 경우, 소화 환경에 대한 저항성을 가지고 장으로 전달될 수 있을 것이라 사료된다.

(2) 알코올 내성 평가

와이셀라 시바리아 JW15 균주의 알코올 내성은 MRS 액체배지에 균주를 접종하고 37℃에서 16시간 간격으로 3회 계대배양하여 활성화한 후, ethyl alcohol을 첨가한(5, 10, 20%) MRS 액체배지에 와이셀라 시바리아 JW15 균주를 1% 접종하고, 37℃에서 2시간, 4시간 배양하여 초기 접종 균수와 비교하였다.

균주	처리	균수(Log CFU/mL)
		알코올 농도(%)
		5	10	20
Lactobacillus rhamnosus GG	초기 균수	9.41 ± 0.03^b	9.32 ± 0.05^b	9.45 ± 0.06^c
	2시간	9.41 ± 0.01^b	9.30 ± 0.03^b	8.56 ± 0.01^b
	4시간	9.32 ± 0.04^a	9.08 ± 0.10^a	8.39 ± 0.02^a
Weissella cibaria JW15	초기 균수	9.29 ± 0.02^b	9.32 ± 0.02^c	9.15 ± 0.01^c
	2시간	9.27 ± 0.02^b	9.00 ± 0.06^b	8.26 ± 0.04^b
	4시간	9.06 ± 0.09^a	8.55 ± 0.01^a	7.45 ± 0.07^a

표 2에 나타난 바와 같이, 와이셀라 시바리아 JW15 균주의 경우 알코올 함량 5, 10, 20%에 대해 배양 두시간 후 각각 99.75 ± 0.21, 96.56 ± 0.69, 91.11 ± 0.40%의 생존률을 보였으며 배양 4시간 후에는 97.57 ± 0.28, 91.76 ± 0.11, 82.22 ± 0.72%의 생존률을 보였는바, 와이셀라 시바리아 JW15 균주는 80% 이상의 생존률을 통해 장 내에서 충분한 저항성을 가지고 프로바이오틱 활성을 나타낼 것이라 사료된다.

(3) 장부착능 평가

인간유래 장 상피세포인 HT-29 세포주를 24-well plate에 접종하여(2×10⁵ cells/well) 단일층을 형성할 때까지 배양한 후, 와이셀라 시바리아 JW15 균주를 100 μL(1×10⁸ CFU/mL) 접종하고 37℃에서 2시간동안 배양하였다. PBS로 세 번 세척하여 세포에 부착되지 않은 균을 제거하고 1%의 Triton X-100 용액으로 부착된 세포를 용해시키고, 적정배수로 희석한 용해액을 MRS 한천배지에 평판 도말하고 37℃에서 24시간 배양하여 부착된 균수를 측정하였다.

처리	균수 (Log CFU/mL)
처리	Lactobacillus rhamnosus GG	Weissella cibaria JW15
초기 균수	8.22 ± 0.05	8.29 ± 0.04
부착 균수	7.46 ± 0.13	7.70 ± 0.05
장부착능(%)	18.04 ± 5.81^a	25.53 ± 3.23^b

* 장부착능= 부착 균수/초기 균수 × 100으로 표기하였다.

표 3에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 람노서스 GG 균주의 경우, 장 부착 활성은 18.04 ± 5.81%로 8.22 Log CFU/mL로 접종하였을 때 7.46 Log CFU/mL의 균 수가 장 상피세포에 부착된 반면, 와이셀라 시바리아 JW15 균주의 장 부착 활성은 25.53 ± 3.23%로 균주를 8.29 Log CFU/mL로 접종하였을 때 7.70 Log CFU/mL의 균 수가 장 상피 부착되었다. 장 상피세포에 대한 부착 활성의 경우, 와이셀라 시바리아 JW15 균주의 경우가 락토바실러스 람노서스 GG 균주에 비교하여 통계적으로 유의적인 결과를 보였다.

실험예 2: 균주의 프로바이오틱 안전성 평가

(1) 효소 생산능 평가

API ZYM kit를 이용하여 와이셀라 시바리아 JW15균주의 효소의 생산능을 검증하고 그 중에서도 발암 물질의 생성을 유도하는 효소 중 하나인 β-glucuronidase와 유용 생리활성 물질의 생성을 유도하는 β-glucosidase의 생산 여부를 확인하였다.

효소	효소 생산능
효소	Lactobacillus rhamnosus GG	Weissella cibaria JW15
Control	-	-
Alkaline phosphate	+	+
Esterase	+	+
Esterase lipase	+	+
Lipase	+	-
Leucine arylamidase	+	+
Valine arylamidase	+	+
Cystine arylamidase	+	+
Trypsin	-	-
α-Chymotrypsin	-	-
Acid phosphatase	+	+
Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase	+	+
α-Galactosidase	+	-
β-Galactosidase	+	+
β-Glucuronidase	-	-
α-Glucosidase	+	-
β-Glucosidase	+	+
N-Acetyl-β	-	-
α-Mannosidase	-	-
α-Fucosidase	+	+

* +: 양성; -: 음성을 의미한다.

표 4에 나타난 바와 같이, 와이셀라 시바리아 JW15 균주는 발암성 물질의 생성을 유도하는 효소인 β-glucuronidase를 생성하지 않음을 확인하였다. 와이셀라 시바리아 JW15 균주는 lipase를 포함한 3종류의 효소를 제외하고 락토바실러스 람노서스 GG 균주와 유사한 수준의 효소 생산 활성을 보였다. 또한, 당류의 생물전환을 유도할 수 있는 유용 효소 중 하나인 β-glucosidase의 활성이 제외하고 락토바실러스 람노서스 GG 균주와 비교하여 높은 것으로 확인되었으며 유용 물질의 생물 전환을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.

(2) 용혈성 및 Lecithinase 활성 평가

Sheep blood를 5% 첨가한 Columbia agar 배지와 난황을 5% 첨가한 Baired-Parker agar 배지에 와이셀라 시바리아 JW15 균주를 획선도말하여 용혈성 여부 및 Lecithinase활성을 각각 검증하였다. 용혈성 여부는 생성된 콜로니 주위의 clear zone의 생성 여부와 형태에 따라 α-용혈, β-용혈, 및 γ-용혈로 판단하였다. Lecithinase 활성 또한 생성된 콜로니 주변의 clear zone의 생성 여부에 따라 판단하였다.

그 결과, Blood agar 상에서 β형 용혈 현상을 일으켜 투명환을 생성하는 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)와 달리 와이셀라 시바리아 JW15 균주의 경우, γ형으로 용혈을 일으키지 않음을 확인하였다(도 1 참고). 또한 난황배지에서 콜로니 주변에 투명환을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 달리 와이셀라 시바리아 JW15 균주는 투명환을 생성하지 않음으로써 lecithinase 활성이 음성임을 확인하였다(도 2 참고).

(3) 항생제 저항성 평가

항생제 저항성은 disk diffusion assay를 이용하여 측정하였으며, CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute) 기준에 맞추되, Weissella spp.에 대한 기준이 정립되지 않은 관계로 Lactobacillus app.에 대한 기준에 준해, 평가하였다. 와이셀라 시바리아 JW15 균주를 MRS 한천배지에 10⁷ CFU/mL의 농도로 평판도말한 후, 각각의 항생제(ampicillin, gentamicin, kanamycin, streptomycin, tetracycline, ciprofloxacin, chloramphenicol, doxycycline, erythromycin, vancomycin)를 각각 주입한 paper disc(8 mm)를 loading하였다. 37℃에서 24시간 배양한 뒤 생성된 clear zone의 지름을 측정하였다.

항생제	항생제 저항성
항생제	Lactobacillus rhamnosus GG	Weissella cibaria JW15
Ampicillin (10 μg)	S	S
Gentamycin (10 μg)	R	R
Kanamycin (30 μg)	R	R
Streptomycin (10 μg)	R	R
Tetracycline (30 μg)	S	I
Ciprofloxacin (5 μg)	R	R
Chloramphenicol (30 μg)	S	I
Doxycycline (30 μg)	S	I
Erythromycin (30 μg)	S	I
Vancomycin (30 μg)	R	R

* S: 감수성; I: 중간; R: 저항성을 의미한다.

표 5에 나타난 바와 같이, 항생제에 대한 와이셀라 시바리아 JW15 균주의 저항성은 락토바실러스 람노서스 GG 균주와 유사한 양상을 보였으나, 와이셀라 시바리아 D30 균주와 비슷하게 투명환의 크기가 조금씩 작은 결과를 보였다. 이는 Weissella spp.가 기존에 보고된 다른 유산균들에 비해 항생제 저항성이 비교적 높다는 연구 보고들과 일치하는 경향으로 사료된다.

실험예 3: 균주의 장 환경 개선 작용 평가

(1) 항균 작용 평가

1) 병원성 세균 생육 저해능 평가

MRS 액체배지에서 24시간 배양한 와이셀라 시바리아 JW15 균주 배양액을 5 μL 취하여 MRS 한천배지에 분주하고 37℃에서 24시간 배양한 후, 24시간 배양한 0.7%의 한천을 첨가한 MH 배지에 병원성 세균을 10⁷ CFU/mL 농도로 희석하고 앞서 배양한 MRS 한천배지에 overlay하였다. 상온에서 10분간 방치하여 MH배지의 고형화를 유도하고, 37℃에서 24시간 배양하여 형성된 clear zone의 반지름을 측정하여 병원성 세균의 생육 저해능을 검증하였다.

병원성 세균 균주명	생육 저해능(mm)
병원성 세균 균주명	Lactobacillus rhamnosus GG	Weissella cibaria JW15
Micrococcus flavus KCCM 10240	38.2 ± 0.85^b	34.7 ± 0.24^a
Bacillus cereus KCCM 29544	12.0 ± 0.41^c	9.5 ± 0.82^b
Streptococcus mutans KCTC 5124	17.0 ± 0.71^a	20.2 ±1.25^c
Salmonella Typhimurium	18.3 ± 1.03^a	20.5 ± 1.08^b
Campylobacter jejuni	20.7 ± 1.31^a	22.0 ± 0.41^b
Campylobacter coli	19.2 ± 1.25^a	22.0 ± 0.41^b
Vibrio parahaemolyticus KCCM 11965	18.5 ± 0.41^a	21.5 ± 0.82^c

표 6에 나타난 바와 같이, 와이셀라 시바리아 JW15 균주는 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 제외하고 락토바실러스 람노서스 GG 균주에 비해 통계적으로 유의적인 생육 억제능을 보였다.

2) 유기산 생성능 평가

MRS 액체 배지에서 16시간 간격으로 3회 계대배양하여 활성화 한 와이셀라 시바리아 JW15 균주를 MRS 액체배지에 1% 접종하고, 37℃에서 24시간 배양한 후 원심분리기를 이용하여 상등액을 취하였다. 상등액은 0.45 μm cellulose membrane filter로 여과한 후, HPLC 분석을 실시하였다. HPLC 분석은 Agilent 1100 series와 Bio-Rad Aminex HPX-87H column을 이용하였으며 5 mM 황산을 이동상으로 하고, 0.6 mL/min의 유속으로(isocratic) 55℃에서 25분간 분석하였다, 생성된 피크는 UV 검출기를 이용하여 210 nm에서 확인하였다.

균주	유기산(g/L)
균주	젖산	아세트산	피로글루탐산
Lactobacillus rhamnosus GG	17.23 ± 0.98^c	0.57 ± 0.04^a	0.08 ± 0.01^a
Weissella cibaria JW15	12.60 ± 0.31^a	1.30 ± 0.05^c	0.12 ± 0.00^b

표 7에 나타난 바와 같이, 와이셀라 시바리아 JW15 균주는 락토바실러스 람노서스 GG 균주에 대해 비교적 낮은 젖산(12.60 ± 0.31 g/L)와 높은 아세트산(1.30 ± 0.05 g/L)을 생성하였는바, 와이셀라 시바리아 균주가 다른 유산균들에 비해 비교적 약한 유기산 생성능을 보인다는 기존의 연구보고와 일치하는 결과를 보였다. 그러나, 락토바실러스 람노서스 GG 균주와 비교하여 높은 생육 속도에 따른 빠른 유기산 생성능을 보였으며, 병원성 세균에 대한 항균 효과가 가장 효과적인 것으로 알려진 아세트산의 생성능이 특히 높음을 보였다. 한편, 아세트산 및 젖산은 항균 효과에 있어 시너지 효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있다. 장 환경 내에서 유기산 생성을 통해 병원성 세균의 증식을 억제하고 긍정적인 영향을 끼칠 수 있는 것으로 사료된다.

또한, 와이셀라 시바리아 JW15 균주는 피로글루탐산을 생성하였는데 이는 산화적 스트레스에 대해 항산화 작용을 하는 주요 효소 중 하나인 글루타티온(glutathione)의 중간 대사물질로 작용하거나, 항균 활성을 나타내는 프라마니신(pramanicin)의 전구체로 작용하는바, 장의 방어작용에 간접적으로 기여함으로써 장 환경 개선을 유도할 수 있으리라 사료된다.

3) 자가-응집성과 장 병원성 세균과의 공동-응집성 평가

MRS 액체배지에서 24시간 배양한 와이셀라 시바리아 JW15 및 병원성 균주들을 원심분리하여 균체를 회수하고 PBS로 세 번 세척하였다. 그리고 PBS에 부유시켜 600 nm에서의 흡광도를 0.30±0.01로 조정하였다. 37℃에서 4시간, 24시간 배양하여 배양 시간에 따른 흡광도를 600 nm에서 측정하였다.

공동-응집성(co-aggregation)은 흡광도를 조정한 각각의 주요 장 병원성 세균과 와이셀라 시바리아 JW15 균주의 부유액을 동량 혼합한 후, 37℃에서 각각 4시간, 24시간 배양하였다. 배양시간에 따른 흡광도를 600 nm에서 측정하였다. 다음의 식을 이용하여 자가응집성 및 공동응집성을 산출하였다.

Auto-aggregation/Co-aggregation(%) = (1 - A₁/A₀) × 100

A₀, 배양전 균주 부유액의 흡광도; A₁, 배양 후 균주 부유액의 흡광도

균주	자가-응집성(%)
균주	4시간	24시간
Lactobacillus rhamnosus GG	24.55 ± 3.13^b	61.68 ± 3.56^b
Weissella cibaria JW15	17.66 ± 1.12^a	56.48 ± 2.16^a

표 8에 나타난 바와 같이, 자가-응집성의 경우, 와이셀라 시바리아 JW15 균주는 4시간 및 24시간 배양 후, 락토바실러스 람노서스 GG 및 와이셀라 시바리아 D30 균주과 유사한 수준의 활성을 보였다.

장 병원성 세균	배양시간	공동-응집성(%)
장 병원성 세균	배양시간	Lactobacillus rhamnosus GG	Weissella cibaria JW15
Staphylococcus aureus	4시간	22.02 ± 1.65^a	23.10 ± 1.15^a
Staphylococcus aureus	24시간	58.20 ± 1.48^b	50.82 ± 2.38^a
Listeria monocytogenes	4시간	26.44 ± 3.73^b	17.50 ± 1.16^a
Listeria monocytogenes	24시간	60.90 ± 0.99^b	55.94 ± 1.98^a
Salmonella Typhimurium	4시간	23.25 ± 1.25^b	14.35 ± 2.13^a
Salmonella Typhimurium	24시간	49.95 ± 2.13^b	41.62 ± 2.75^a
Salmonella Enteritidis	4시간	18.36 ± 1.01^b	16.66 ± 0.86^a
Salmonella Enteritidis	24시간	36.90 ± 1.93^a	35.27 ± 1.76^a
Escherichia coli	4시간	17.97 ± 2.65^b	13.30 ± 1.35^a
Escherichia coli	24시간	52.41 ± 2.04^b	44.42 ± 2.03^a

표 9에 나타난 바와 같이, 와이셀라 시바리아 JW15 균주의 주요 장 병원성 세균에 대한 공동-응집성의 경우, 특히, 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis)에 대해서 락토바실러스 람노서스 GG 균주와 유사한 수준의 활성을 나타냈다.

4) 장 병원성 세균에 대한 장내 부착 저해능 평가

인간유래 대장상피 세포주인 HT-29 세포주를 24-well plate에 접종하고(2×10⁵ cells/well) 단일층을 형성할 때까지 37℃에서 배양하였다. 각각 10⁷ CFU/mL의 농도로 희석한 식중독 세균 100 μL 또는 와이셀라 시바리아 JW15 균주와의 동량 혼합액 200 μL을 접종한 뒤 37℃에서 2시간동안 배양하였다. PBS로 세 번 세척하여 세포 표면에 부착되지 않은 균을 제거한 뒤 1%의 Triton X-100 용액으로 세포를 용해시키고, 각각의 병원성 세균에 해당하는 선택 배지(MSA, Oxford, XLD, and EMB)를 이용해 부착된 병원성 세균의 균수를 측정하였다.

장 병원성 세균	균주	균수 (CFU/mL)		장 병원성 세균의 장내 부착 저해능(%)
		초기 균수	2시간 후
Staphylococcus aureus	Lactobacillus rhamnosus GG	8.1 × 10⁶	3.9 × 10⁶	52.11 ± 6.70^b
	Weissella cibaria JW15		4.6 × 10⁶	42.70 ± 6.77^a
Listeria monocytogenes	Lactobacillus rhamnosus GG	8.8 × 10⁶	5.1 × 10⁶	41.01 ± 5.97^a
	Weissella cibaria JW15		4.3 × 10⁶	51.52 ± 5.93^b
Salmonella typhimurium	Lactobacillus rhamnosus GG	6.2 × 10⁶	4.0 × 10⁶	35.73 ± 8.44^a
	Weissella cibaria JW15		3.6 × 10⁶	41.11 ± 5.86^b
Salmonella enteritidis	Lactobacillus rhamnosus GG	4.5 × 10⁶	2.8 × 10⁶	40.79 ± 7.50^a
	Weissella cibaria JW15		2.2 × 10⁶	49.39 ± 8.56^a
Escherichia coli	Lactobacillus rhamnosus GG	7.3 × 10⁶	4.6 × 10⁶	36.70 ± 5.56^a
	Weissella cibaria JW15		4.0 × 10⁶	45.45 ± 8.38^b

표 10에 나타난 바와 같이, 와이셀라 시바리아 JW15 균주는 락토바실러스 람노서스 GG 균주와 비교하여 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 제외하고 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 상기 장 병원성 세균은 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔터라이티디스(Salmonella enteritidis) 및 대장균(Escherichia coli)의 장내 부착을 유의적으로 억제하였다. 이를 통해, 와이셀라 시바리아 JW15 균주는 주요 장 병원성 세균의 침입 및 정착을 효과적으로 억제할 수 있을 것이라 사료된다.

(2) 단쇄지방산 생성능 평가

단쇄지방산 생성능의 경우 2) 유기산 생성능 평가에서 얻은 상등액을 Thermo Hypersil Gold aQ column을 이용하여 분석하였다. pH를 2.8로 조정한 50 mM KH₂PO₄를 이동상으로 하고, 1.25 mL/min의 유속으로(isocratic) 25℃에서 25분간 분석하였다. 생성된 피크는 UV 검출기를 이용하여 210 nm에서 확인하였다.

균주	단쇄지방산 생성능(g/L)
균주	포름산	프로피온산	부티르산
Lactobacillus rhamnosus GG	0.46 ± 0.03^c	1.89 ± 0.10^b	0.20 ± 0.02^b
Weissella cibaria JW15	0.32 ± 0.35^b	0.65 ± 0.04^a	0.16 ± 0.01^a

표 11에 나타난 바와 같이, 와이셀라 시바리아 JW15 균주는 락토바실러스 람노서스 GG 균주에 대해 비교적 낮은 단쇄지방산 생산능을 였으나, 특이적 기질에 따라 달라질 수 있는 정도인 것으로 확인된다. 이때, 단쇄지방산 중 포름산 및 프로피온산은 항균 및 항곰팡이 활성이 보고된 바 있으며, 소장 및 대장과 같은 장관계에서 부티르산과 같은 단쇄지방산 생성 활성이 있는 프로바이오틱스의 비율이 증가함에 따라 면역계 및 신경계가 활성화되어 파킨슨 병, 알츠하이머와 같은 질병에 대한 예방 효과가 실험적으로 보고된 바 있다.

(3) 항산화능 평가

균주의 항산화능을 다양한 모델에 대하여 검증하였다. 다음의 항산화능 관련 실험을 위해 와이셀라 시바리아 JW15 균주를 MRS 액체배지에서 18시간 간격으로 3회 계대 배양하고 원심분리기를 이용하여 균체를 회수한 후, PBS로 3회 세척하였다. 이후 최종적으로 균체는 PBS에 부유시켜 1×10⁹ CFU/mL이 되도록 농도를 조정한 후 이용하였다.

1) DPPH (1,1- diphenyl -2- picrylhydrazyl ) 라디칼 소거능 평가

DPPH 라디칼 소거능은 균주 부유액 200 μL과 에탄올에 DPPH를 용해시켜 100 μM로 제조한 DPPH 용액 1 mL과 실온의 암소에서 30분 간 반응시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하여 검증하였다.

2) ABTS ⁺ (2,2'- azino -bis(3- etylbenzothiazoline -6- sulphonic acid)) 라디칼 소거 능 평가

ABTS⁺ 라디칼 소거능은 7.4 mM의 ABTS 시약과 2.6 mM의 potassium persulfate를 동량 혼합하여 상온의 암소에서 18시간 반응시킨 후, PBS를 이용하여 734 nm에서 흡광도가 0.700±0.005이 되도록 1 mL을 취하여 균주 부유액 100 μL와 혼합하였다. 실온의 암소에서 30분 간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3) Hydroxyl 라디칼 소거능 평가

Hydroxyl 라디칼 소거능은 pH 7.4의 20 mM potassium phosphate buffer에 ferric chloride, EDTA, deoxyribose를 각각 0.1 mM, 0.1 mM, 2.8 mM로 용해시키고 1 mL을 취하여 동량의 균주 부유액과 혼합하고, 1 mM ascorbic acid, 20 mM hydrogen peroxide를 각각 0.1 0.5 mL을 첨가한 후 37℃에서 90분 간 반응시켰다. 그리고, 60 mM TCA (trichloroacetic acid) 1 mL과 100 mM의 TBA 0.3 mL을 첨가하여 95℃에서 15분 간 반응시켰다. 상온으로 식힌 뒤, 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4) Superoxide anion 라디칼 소거능 평가

Superoxide anion 소거능은 NBT (nitroblue tetrazolium)과 NADH (nicotinamide adenine dinucleotide)를 각각 각각 78 μM과 468 μM로 포함하는 pH 7.4의 20 mM potassium phosphate buffer를 1 mL과 동량의 부유액과 혼합하였다. 60 μM의 PMS (phenazine methosulphate)를 0.4 mL 첨가하여 상온에서 5분 간 반응시킨 후, 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 4.3.1~4.3.4의 라디칼 소거능에 의한 항산화 실험들의 활성은 다음과 같은 식을 이용하여 계산하였다:

라디칼 소거능(%) = [1 - (A_s/A_c)] × 100

A_s, 시료의 흡광도; A_c, 음성대조구의 흡광도.

5) 지방산 산화 억제능 평가

β-Carotene 표백 억제능의 경우, β-carotene, linoleic acid 및 Tween 80을 각각 2 mg, 44 μL, 200 μL를 Chloroform 10 mL에 용해시키고, 45℃에서 감압 농축한 후, 증류수 100 mL을 첨가하여 β-carotene 에멀젼을 제조하였다. 제조한 β-carotene 에멀젼 4 mL을 취해 1 mL의 균주 부유액과 혼합하고 50℃에서 4시간 반응시킨 뒤, 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. β-carotene 표백 억제능은 다음과 같이 계산하였다:

β-Carotene bleaching inhibition activity (%) =

[1 - (S_{4 h} - S_{0 h})/(C_{4 h} - C_{0 h})]]×100

S_{4 h}, C_{4 h}, 4시간 후 시료 및 음성대조구의 흡광도; S_{0 h}, C_{0 h}, 시료 및 음성 대조구의 초기 흡광도.

항산화 활성 평가 실험 방법	항산화 활성(%)
항산화 활성 평가 실험 방법	Lactobacillus rhamnosus GG	Weissella cibaria JW15
DPPH 라디칼 소거능	18.88 ± 1.57^a	23.53 ± 0.77^c
ABTS⁺ 라디칼 소거능	49.03 ± 2.46^a	60.85 ± 3.75^b
Hydroxyl 라디칼 소거능	39.30 ± 6.57^a	51.66 ± 7.18^c
Superoxide anion 라디칼 소거능	75.55 ± 1.94^c	68.38 ± 2.40^b
β-Carotene 표백 억제능	17.50 ± 4.22^a	33.31 ± 4.53^c

표 12에 나타난 바와 같이, 와이셀라 시바리아 JW15 균주는 유리라디칼 모델인 DPPH, ABTS⁺에서 각각 23.53 ± 0.77%, 60.85 ± 3.75%의 라디칼 소거능을 보였으며, 이는 락토바실러스 람노서스 GG 균주에 비교하여 유의적으로 높은 소거능을 나타냈다.

산화라디칼 모델인 Hydroxyl 및 Superoxide anion의 경우, 각각 51.66 ± 7.18%, 68.38 ± 2.40%의 라디칼 소거능을 나타냈다. Hydroxyl의 경우에만 락토바실러스 람노서스 GG 균주에 비교하여 유의적인 소거능을 나타냈다.

지방산 산화 모델인 β-carotene 표백 억제능의 경우, 와이셀라 시바리아 JW15 균주는 배양 4시간 후 33.31 ± 4.53%의 표백 억제 활성을 보였으며 락토바실러스 람노서스 GG 균주에 비교하여 유의적으로 높은 억제 활성을 나타냈다. 와이셀라 시바리아 JW15 균주는 외부에서 유입된 독성 물질이나 대사과정에서 발생한 산화적 스트레스로 인해 발생하는 다양한 라디칼이나 산화 물질들의 소거를 통해 장 내의 항산화 작용에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

하기에 본 발명의 균주를 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1: 산제의 제조

Weissella cibaria JW15 균주 20 mg

유당수화물 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제제예 2: 정제의 제조

Weissella cibaria JW15 균주 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당수화물 100 mg

스테아르산마그네슘 2mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3: 캅셀제의 제조

Weissella cibaria JW15 균주 10 mg

미결정셀룰로오스 3 mg

유당수화물 14.8 mg

스테아르산마그네슘 0.2 mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캅셀제의 제조방법에 따라서 젤라틴캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조하였다.

제제예 4: 주사제의 제조

Weissella cibaria JW15 균주 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

인산일수소나트륨 26 mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1앰플당(2 mL) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

제제예 5: 액제의 제조

Weissella cibaria JW15 균주 10 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

레몬향 적량

상기의 성분을 통상의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100 mL로 조절한 후 멸균시켜 갈색병에 충진하여 액제를 제조한다.

제제예 6: 건강기능식품의 제조

Weissella cibaria JW15 균주 10 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7: 건강음료의 제조

Weissella cibaria JW15 균주 10 mg

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

정제수 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(KACC 91811P)를 유효성분으로 포함하는,
스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 및 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병원성 세균으로 인한 세균성 장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 균주는 ⅰ) 내지 ⅳ)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는, 세균성 장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
ⅰ) 우수한 내산성, 내담즙성, 알코올 내성 및 장부착능;
ⅱ) β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 활성 억제 및 β-글루코시다아제(β-glucosidase) 활성 촉진;
ⅲ) 용혈성 및 레시티나아제(lecithinase) 활성의 불활성화; 및
ⅳ) 테트라사이클린(Tetracycline), 클로람페니콜(chloramphenicol), 에리트로마이신(erythromycin) 또는 반코마이신(vancomycin)에 대한 항생제 저항성.
제1항에 있어서,
상기 균주는 젖산, 아세트산 및 피로글루탐산으로부터 선택된 하나 이상의 유기산을 생산하는 것을 특징으로 하는, 세균성 장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 균주는 장 병원성 세균의 장내 부착 저해능을 가지고,
상기 장 병원성 세균은 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔터라이티디스(Salmonella enteritidis) 및 대장균(Escherichia coli)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 세균성 장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 균주는 항산화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 세균성 장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(KACC 91811P)를 유효성분으로 포함하는,
스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 및 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병원성 세균으로 인한 세균성 장질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(KACC 91811P)를 유효성분으로 포함하는,
스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 및 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병원성 세균에 대한 항균용 조성물.