KR102491640B1 - 치아우식증 유발균을 억제하는 활성을 갖는 와이셀라 시바리아 균주 및 그 용도 - Google Patents
치아우식증 유발균을 억제하는 활성을 갖는 와이셀라 시바리아 균주 및 그 용도 Download PDFInfo
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Abstract
치아우식증 유발균을 억제하는 활성을 갖는 와이셀라 시바리아 균주 및 그 용도를 제공한다.
Description
치아우식증 유발균을 억제하는 활성을 갖는 와이셀라 시바리아 균주 및 그 용도에 관한 것이다.
치아우식증 또는 충치는 대표적인 구강질환이다. 치아우식증은 구강내에 존재하는 세균, 특히 스트렙토코커스 뮤탄스가 대사과정에서 치아에 부착된 당분이나 전분등의 탄수화물을 분해시켜 각종 유기산을 생성시키고 이러한 산에 의해 치아의 무기질 성분이 탈회되어 유발된다고 알려져 있다. 치아우식증을 포함한 각종 구강질환을 예방하기 위하여 불소화합물, 아미노카프론산, 클로로헥시딘, 덱스트라나제 등이 현재 이용되고 있으며, 인체에 무해한 식물추출물, 한방성분 또는 유산균을 이용한 천연 항균성분을 포함하는 구강제품들이 연구되고 있다.
그러나, 종래 기술에 의하더라도 치아우식증 유발균에 대한 항균 활성을 갖는 와이셀라 시바리아 균주 및 그를 이용한 치아우식증 예방 또는 치료법이 요구되고 있다.
박미선, 전남대학교 대학원 의학과, 석사학위논문(2006.08.)
Food Sci. Biotechnol., Vol.28(3), pp.851-855(Epub.2018.11.20.)
일 양상은 치아우식증 유발균을 억제하는 활성을 갖는 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) LMT13-54 (기탁번호: KCTC14822BP) 균주 또는 이의 배양물을 제공한다.
다른 양상은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는, 치아우식증 유발균을 억제하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 균주 또는 이의 배양물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 치아우식증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
일 양상은 치아우식증 유발균을 억제하는 활성을 갖는 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) LMT13-54 (기탁번호: KCTC14822BP) 균주 또는 이의 배양물을 제공한다. 상기 배양물은 미생물 또는 그 조합의 배양액, 배양액 추출물, 또는 단백질 추출물일 수 있다. 상기 추출물은 미생물 또는 그 조합을 용균시킨 용균물, 또는 이를 원심분리하여 침전물을 제거하고 남은 상등액일 수 있다.
상기 치아우식증 유발균은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)인 것일 수 있다. 상기 균주는 pH 2 내지 4 또는 0.1% 이상, 예를 들면, 1.5% 이상, 2.0% 이상, 또는 3.0% 이상의 산, 예를 들면, 답즙산 함유 용액에서 생존 가능한 것일 수 있다. 또한, 상기 균주는 활성 산소 제거능을 가진 것일 수 있다. 상기 산은 유기산, 무기산 또는 그 조합일 수 있다. 상기 유기산은 개체를 구성하는 것 또는 그 대사 과정에서 발생하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 유기산은 아미노산, 아세트산, 프로피온산, 젖산, 부티르산, 펜탄산, 글루콘산, 또는 아디프산일 수 있다.
다른 양상은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) LMT13-54 (기탁번호: KCTC14822BP) 균주 또는 이의 배양물을 포함하는, 치아우식증 유발균을 억제하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 있어서, 상기 배양물은 미생물 또는 그 조합의 배양액, 배양액 추출물, 또는 그 조합의 단백질 추출물일 수 있다. 상기 추출물은 미생물 또는 그 조합을 용균시킨 용균물, 또는 이를 원심분리하여 침전물을 제거하고 남은 상등액일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 치아우식증 유발균은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)일 수 있다. 상기 균주는 pH 2 내지 4 또는 0.1% 이상, 예를 들면, 1.5% 이상, 2.0% 이상, 또는 3.0% 이상의 산, 예를 들면 답즙산 함유 용액에서 생존 가능한 것일 수 있다. 또한, 상기 균주는 활성 산소 제거능을 가진 것일 수 있다. 상기 산은 유기산, 무기산 또는 그 조합일 수 있다. 상기 유기산은 개체를 구성하는 것 또는 그 대사 과정에서 발생하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 유기산은 아미노산, 아세트산, 프로피온산, 젖산, 부티르산, 펜탄산, 글루콘산, 또는 아디프산일 수 있다.
상기 조성물은 치아우식증을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 상기 균주를 유효성분으로서 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 치아우식증을 예방 또는 개선하는 활성을 가진 식품인 것일 수 있다.
상기 조성물은 식품학적으로 또는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다.
상기 조성물 중 상기 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물을 "식품학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "치료학적 유효량"은 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 치료 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. 용어 "치료"는 개체, 예를 들면 사람을 포함한 포유류에서 질환 또는 의학적 증상, 예를 들면 비만 질병을 치료함을 의미하고, 이는 다음을 포함한다: (a) 질환 또는 의학적 증상의 발생을 예방, 즉, 환자의 예방적 치료; (b) 질환 또는 의학적 증상의 완화, 즉, 환자에서 질환 또는 의학적 증상의 제거 또는 회복 야기; (c) 질환 또는 의학적 증상의 억제, 즉, 개체에서 질환 또는 의학적 증상의 진행을 늦춤 또는 정지; 또는 (d) 개체에서 질환 또는 의학적 증상을 경감. 상기 "유효량"은 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 상기 "유효량"은 0.01mg 내지 10,000mg, 0.1mg 내지 1000mg, 1mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 1000mg, 0.01mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 10mg, 또는 0.01mg 내지 1mg일 수 있다.
상기 조성물은 경구 투여될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 수성액제 또는 현탁제 등의 다양한 형태로 제제화될 수 있다. 경구용 정제의 경우 락토즈, 옥수수 전분 등의 부형제 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제가 통상 가해질 수 있다. 경구 투여용 캡슐제의 경우, 락토즈 및/또는 건조 옥수수 전분이 희석제로서 사용될 수 있다. 경구용 수성 현탁제가 필요할 경우, 활성성분을 유화제 및/또는 현탁화제와 결합시킬 수 있다. 필요할 경우, 특정 감미제 및/또는향미제를 가할 수 있다. 상기 조성물은 구강에 투여되는 것일 수 있다. 상기 조성물은 구강 투여 제형일 수 있다.
다른 양상은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) LMT13-54 (기탁번호: KCTC14822BP) 균주, 이의 배양물 또는 추출물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 치아우식증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 투여는 상기한 조성물을 투여하는 것일 수 있다. 상기 균주에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 방법에 있어서, 당업자는 투여시 투여경로는 환자의 상태에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 투여는 경구, 또는 국부 투여일 수 있다. 상기 투여는 구강에 투여하는 것, 구강에 투여 후 구강에 머물게 하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 투여량은 전술한 바와 같이 환자의 상태, 투여 경로, 주치의의 판단 등과 같은 다양한 인자들에 따라서 다양해진다. 효과적인 투여량은 체외실험 또는 동물 모델 시험에서 얻어진 용량-반응곡선으로부터 추정할 수 있다. 투여되는 조성물에 존재하는 본 발명의 화합물의 비율 및 농도는 화학적 특성, 투여 경로, 치료적 투여량 등에 따라 결정될 수 있다. 상기 투여량은 개체에게 약 1 μg/kg 내지 약 1 g/kg per day, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 500 mg/kg per day의 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 용량은 개체의 나이, 체중, 감수성, 또는 증상에 따라 변경될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 개체는 사람을 포함한 포유동물일 수 있다. 상기 개체는 예를 들면, 사람, 개, 고양이, 소, 돼지, 염소, 또는 말과 같은 가축일 수 있다.
본 명세서 있어서, 상기 균주 또는 조성물은 코팅되거나 캡슐화된 것일 수 있다. 상기 캡슐화는 제어된 방출을 허용하는 이점, 예를 들어 물과의 접촉시, 또는 장기간 동안의 연속적인 재방출의 이점을 가질 수 있다. 더욱이, 상기 조성물은 제품의 저장 수명을 개선하기 위하여 분해로부터 보호되는 것일 수 있다. 활성 성분들의 캡슐화를 위한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 다수의 캡슐화 재료뿐만 아니라 특정 요구들에 따라 조성물에 그것들을 적용하는 방법도 이용가능하다.
또한, 상기 균주 또는 조성물은 용액, 현탁액, 유액, 정제, 과립, 파우더 또는 캡슐의 형태일 수 있다.
상기 균주 또는 조성물은 치약, 치아 겔, 치아 파우더, 치아 세정액, 치아 세정폼, 구강 세정제, 구강 스프레이, 치실, 츄잉껌 또는 로젠지 (lozenges)일 수 있다.
일 양상에 따른 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물은 치아우식증을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 조성물은 치아우식증을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 방법에 의하면, 치아우식증을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 LMT13-54 균주와 KCTC3807T 균주의 게놈을 주형으로 한 RAPD PCR 결과 얻어진 산물을 전기 영동한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 LMT13-54 균체의 스트렙토코커스 뮤탄스 KCTC3065T에 대한 생육저해환 실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 LMT13-54 및 trolox의 항산화 활성을 ABTS 분석법으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 LMT13-54 균체의 스트렙토코커스 뮤탄스 KCTC3065T에 대한 생육저해환 실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 LMT13-54 및 trolox의 항산화 활성을 ABTS 분석법으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주의 분리
1. 균주의 분리
균주의 분리는 가정에서 직접 담근 전통 발효 식품인 김치 100 g을 취하여 멸균수에 희석하고, 스토마커(stomacher)로 5 분간 균질화하였다. 균질화된 샘플은 단계적으로 희석하여 브로모페놀블루(Sigma, USA)를 포함하는 MRS (Difco, USA) 아가 평판 배지에 도말하여 37 ℃에서 2 내지 3일간 배양하였고 나타난 콜로니들을 형태 및 색깔 별로 구별하여 다시 순수 분리하여 최종 균주를 얻었다. 이하 이를 LMT13-54라 한다. 순수 분리된 유산균 LMT13-54는 계통을 확인하기 위하여 하기와 같이 16S rDNA 계통 분석을 실시하였다.
2. 16S rDNA 분석
선별된 유산균 LMT13-54는 27F (서열번호 2)과 1492R (서열번호 3)의 프라이머 세트와 LMT13-54의 게놈을 주형으로 하여 PCR를 수행하여, 16S rDNA 증폭 산물을 얻었다. 상기 증폭 산물의 뉴클레오티드 서열을 시퀀싱을 통하여 확인하였다.
그 결과 LMT13-54의 16S rDNA는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또한, 상기 16S rDNA의 뉴클레오티드 서열을 NCBI blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 사용하여 해석하였다. 계통수 분석 결과, LMT13-54는 와이셀라 시바리아 종과 같았다. LMT13-54의 16S rDNA는 와이셀라 시바리아 종과 서열 동일성이 100.0%이었다. 따라서, LMT13-54 균주는 와이셀라 시바리아 종에 속하는 새로운 균주로 확인되었다.
3. 선발된 LMT13-54 균주와 타입 균주의 16S DNA 서열 비교
선발된 와이셀라 시바리아 LMT13-54 균주와 타입 균주(type strain)와의 16S rDNA의 뉴클레오티드 서열 동일성을 비교하기 위해 와이셀라 시바리아 KCTC3807T를 KCTC로부터 상업적으로 구입하였다. LMT13-54 균주와 KCTC3807T 균주의 서열을 비교한 결과, 16s rDNA 서열 동일성이 100.0%임을 확인하였다. 또한, 선별된 LMT13-54 균주와 타입 균주 KCTC3807T의 유전적 유연관계를 조사하기 위해 각각의 균주 LMT13-54와 KCTC3807T은 OPA-13 (서열번호 4)의 프라이머와 각각의 균주의 게놈을 주형으로 하여 다형 DNA의 랜덤 증폭(Random Amplification of Polymorphic DNA, RAPD) PCR을 수행하여, 증폭 산물을 얻었다. 증폭 산물은 RedSafe™ nucleic acid staining solution (iNtRON Biotechnology, Korea)이 포함된 1.2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 한 후, ChemiDoc™ imaging system (Bio-Rad, USA)로 촬영하여 DNA 밴드 패턴을 얻었다. 도 1은 LMT13-54 균주와 KCTC3807T 균주의 게놈을 주형으로 한 RAPD PCR 결과 얻어진 산물을 전기 영동한 결과를 나타낸 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 두 균주 사이에 전기 영동 결과 다른 밴드 패턴을 보였다.
이러한 와이셀라 시바리아 LMT13-54와 와이셀라 시바리아 KCTC3807T의 DNA 밴드 패턴의 차이는 두 균주가 유전적 유연관계의 차이가 있음을 나타낸다. 따라서 LMT13-54 균주는 와이셀라 시바리아 종에 속하는 새로운 균주임을 확인하였다. 이에 상기 균주를 와이셀라 시바리아 (Weissella cibaria) LMT13-54로 명명하고 이를 한국생명공학연구원 소재 한국세포주은행 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2021년 12월 15일자로 기탁번호 KCTC14822BP로 기탁하였다.
실시예 2. 치아우식증 유발 균주 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 유산균의 항균 활성 측정
상기 선발 균주의 치아우식증 유발 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 항균 활성을 측정하기 위해 한국생명공학연구원 소재 한국세포주은행 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 스트렙토코커스 뮤탄스 KCTC3065T를 분양 받아 사용하였다. 먼저 스트렙토코커스 뮤탄스를 BHI (Difco, USA) 아가 배지에서 37 ℃, 24 시간 배양한 후, 스트렙토코커스 뮤탄스를 이용하여 스트렙토코커스 뮤탄스가 1x106 CFU/㎖로 첨가된 BHI 아가 플레이트를 제작하였다.
다음으로 치아우식증 유발하는 스트렙토코커스 뮤탄스의 생육을 저해하는 유산균을 선발하기 위하여, 실시예 1에서 분리된 상기 유산균을 MRS 액체 배지에서 37 ℃, 24시간 동안 배양하였다. 이때 OD600은 약 2.0이었다. 이후 상기 배양된 유산균으로부터 유산균체는 10㎕를 스트렙토코커스 뮤탄스가 첨가된 BHI 아가 플레이트에 점적하고 37 ℃에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 스트렙토코커스 뮤탄스의 생장을 저해하여 나타난 생육저해환을 측정하였다. 그 결과는 표 1 및 도 2에 나타내었다.
도 2는 LMT13-54 균체의 스트렙토코커스 뮤탄스 KCTC3065T에 대한 생육저해환 실험 결과를 나타낸 사진이다.
| 유산균 | 스트렙토코커스 뮤탄스 KCTC3065T 생육저해환(단위 mm) | |
| 와이셀라 시바리아 LMT13-54 | 균체 | 24 |
와이셀라 시바리아 LMT13-54 균체를 사용한 경우 저해환 길이는 24mm이었다. 이는 실험에 사용된 838종 중 38종의 유산균이 치아우식증 즉, 충치를 유발하는 스트렙토코커스 뮤탄스 균주에 우수한 항균 활성을 나타내었으며, 그 중에서 가장 우수한 항균 활성을 갖는 것이다.
실시예 3. 균주의 형태학적 및 발효특성 조사
1. 균학적 특성분석
치아우식증 유발 균주에 항균 활성이 우수한 와이셀라 시바리아 LMT13-54를 MRS 평판 배지에서 배양하고 콜로니의 형태를 관찰하였고 콜로니 형태는 하기 표 2에 나타내었다.
| LMT13-54 | |
| 형태 | 원형 |
| 크기 | 1㎜ |
| 색 | 크림색 |
| 불투명도 | 불투명 |
| 융기 | 볼록 |
| 표면 | 매끄러움 |
| 호기적 생장 | + |
| 혐기적 생장 | + |
2. 선발된 유산균주의 당 발효 특성
당 발효 특성은 API 50 CHL 키트(Biomerieux, France)를 이용하여 공급회사의 실험방법에 따라 조사하였다. 치아우식증 유발 균주에 대한 항균 활성이 우수한 와이셀라 시바리아 LMT13-54의 당 발효 특성을 하기 표 3에 나타내었다.
| LMT13-54 | |
| 글리세롤 | - |
| 에리트리톨 | - |
| D-아라비노스 | - |
| L-아라비노스 | + |
| D-리보스 | + |
| D-자일로스 | + |
| L-자일로스 | - |
| D-아도니톨 | - |
| 메틸-β D-자일로피라노사이드 | - |
| D-갈락토스 | - |
| D-글루코스 | + |
| D-프럭토스 | + |
| D-만노스 | + |
| L-소르보스 | - |
| L-람노스 | - |
| 둘시톨 | - |
| 이노시톨 | - |
| 만니톨 | - |
| D-소르비톨 | - |
| 메틸 αD-만노피라노사이드 | - |
| 메틸 αD-글로코피라노사이드 | - |
| N-아세틸글루코사민 | + |
| 아미그달린 | + |
| 아르부틴 | + |
| 에스쿨린 | + |
| 살리신 | + |
| D-셀로비오스 | + |
| D-말토스 | + |
| D-락토스 | - |
| D-멜리비오스 | - |
| D-사카로스 | + |
| D-트레할로스 | - |
| 이눌린 | - |
| D-멜레지토스 | - |
| D-라피노스 | - |
| 아미돈 | - |
| 글리코겐 | - |
| 자일리톨 | - |
| 겐티오비오스 | + |
| D-투라노스 | - |
| D-라익소스 | - |
| D-타가토스 | - |
| D-푸코스 | - |
| L-푸코스 | - |
| D-아라비톨 | - |
| L-아라비톨 | - |
| 포타슘 글루코네이트 | + |
| 포타슘 2-케토글루코네이트 | - |
| 포타슘 5-케토글루코네이트 | - |
그 결과, 와이셀라 시바리아 LMT13-54는 총 16개의 당을 이용하는 것으로 확인되었다.
실시예 4. 안정성
1. 유산균의 내산성 조사
상기 유산균 LMT13-54가 구강내에서 프로바이오틱스로서의 효능을 발휘하기 위해서는 섭취 후 낮은 pH의 환경을 통과하거나 유지되어야 한다. 예를 들면, 상기 균주는 치면의 세균막인 플라크 내에 서식하는 박테리아, 예를 들면, S. mutans 등이 배출하는 산성 환경에서 유지 또는 성장할 수 있는 것일 수 있다. 치아우식증 유발 균주에 대한 항균 활성이 우수한 와이셀라 시바리아 LMT13-54의 내산성을 조사하기 위해서 MRS 액체 배지에 접종 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 다음으로 MRS 액체 배지를 HCl (Sigma, USA)을 이용하여 pH 2.5로 조정된 pH 2.5 MRS 액체 배지를 준비하였고 배양된 유산균을 pH 2.5 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이때, 접종 직후의 유산균을 희석하여 MRS 평판 배지에 도말 하였고, pH 2.5 MRS 액체 배지에서 2시간 배양된 유산균도 MRS 평판 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, MRS 평판 배지 위의 유산균 집락 수를 계수하여 측정한 결과를 표 4에 나타내었다.
| LMT13-54 (CFU/㎖) | |
| MRS (pH 6.8) | 9.6×108 |
| MRS (pH 2.5) | 8.4×104 |
그 결과, 치아우식증 유발 균주에 대한 항균 활성이 우수한 와이셀라 시바리아 LMT13-54는 8.4×104 CFU/㎖ 균 수를 유지하여 높은 생존율을 보여 주었다. 이러한 유산균의 특징은 충치가 유발된 산성 pH 환경에서도 유지 또는 성장 즉, 산 내성을 갖는 것으로 예상할 수 있다. 충치가 발생하는 플라크 내에는 S. mutans와 같은 박테리아에 의하여 산이 방출되어 산성을 띄고 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 위의 생리적 pH와 가까운 pH 3 보다 낮은 pH에서 유산균 수를 유지하였기 때문에 위산 분비로 인한 낮은 pH에서도 안정하게 생균수가 유지 가능하며, 섭취 시 장내 도달율이 높을 것으로 예상할 수 있다.
2. 유산균의 내담즙성 조사
유산균의 내담즙성을 조사하기 위해 다음의 방법으로 실험을 실시하였다. 치아우식증 유발 균주에 대한 항균 활성이 우수한 와이셀라 시바리아 LMT13-54를 MRS 액체 배지에 접종 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 다음으로 장관 내 담즙산염 농도가 0.1% 내외임을 감안하여, 0.3%의 담즙산염 (Bile salt, Sigma, USA)이 함유된 MRS 액체 배지를 준비하였고 배양된 유산균을 0.3% Bile salt MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다.
이때, 접종 직후의 유산균을 희석하여 MRS 평판 배지에 도말 하였고, 0.3% Bile salt MRS 액체 배지에서 2시간 배양된 유산균도 MRS 평판 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, MRS 평판 배지 위의 유산균 집락 수를 계수하여 측정한 결과를 표 5에 나타내었다.
| LMT13-54 (CFU/㎖) | |
| MRS (0% Bile salt) | 9.6×108 |
| MRS (0.3% Bile salt) | 4.9×107 |
그 결과, 치아우식증 유발 균주에 대한 항균 활성이 우수한 와이셀라 시바리아 LMT13-54는 4.9×107 CFU/㎖ 균 수를 유지하여 높은 생존율을 보여 주었다. 따라서 장관 내 담즙산염 농도가 0.1% 내외임을 감안하여 장 내에서도 충분히 생존율이 높을 것으로 예상할 수 있다.
실시예 5. 유산균의 ABTS 라디칼 소거 활성
치주질환은 감염성 및 염증성 과정이 연속적으로 발생하면서 활성산소 (ROS, reactive oxidative species)가 생성되고 이 활성산소들이 치주염을 악화시킨다 (J Indian Soc Periodontol. 2013 Jul-Aug; 17(4): 411-416.). 이때 항산화제가 활성산소를 제거하여 산화 스트레스 감소를 통해 치주질환 개선에 도움을 준다.
따라서 치아우식증 유발 균주에 대한 항균 활성이 우수한 와이셀라 시바리아 LMT13-54의 항산화 효능을 확인하기 위해 ABTS (2,2′ -Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 분석(assay)을 수행하였다.
이 분석은 ABTS는 포타슘 퍼설페이트에 의해 전자를 잃어 짙은 청녹색을 띄지만 항산화 물질이 존재하는 경우, 그 전자공여능으로 인하여 색이 옅어지는 바, 이 과정을 보고 항산화능을 측정하는 방법이다. 먼저 14mM ABTS (38.4㎎/10㎖; Sigma, USA)와 6mM 포타슘 (8.1096㎎/10㎖; Sigma, USA)를 1:1 비율로 섞고 상온에서 16시간 암반응하여, 양이온(ABTS+)을 형성 시켰다. 이렇게 만들어진 ABTS+ 용액은 1/10 희석하여 사용하였다. 유산균은 OD600 약 2.0으로 배양 후, 배양액만을 회수하기 위해 원심분리하여 상등액만을 0.22㎛ 크기 필터로 필터하였다. 필터한 배양액 20㎕와 ABTS+ 용액 180㎕를 96 웰 플레이트에서 10분간 암반응시켰다. 이후, 반응이 끝난 시료는 마이크로플레이트 리더를 이용하여, 734nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성 대조군으로 항산화 물질인 비타민 E의 전구체 trolox (1㎎/㎖; Sigma, USA)를 사용하였다. 도 3은 LMT13-54 및 trolox의 항산화 활성을 ABTS 분석법으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, LMT13-54의 배양액 10% 농도는 86.3%로 높은 항산화 활성을 보여주었다. 따라서, 상기 LMT13-54는 활성산소 억제제로 작용하여 치아우식증 예방 또는 치료와 같은 구강 건강 개선에 도움을 줄 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Medytox Inc.
<120> Weissella cibaria strain for suppressing dental caries inducing bacteria and use thereof
<130> PN142654KR
<160> 4
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 1402
<212> DNA
<213> Weissella cibaria LMT13-54
<400> 1
gctttgtggt tcaactgatt tgaagagctt gctcagatat gacgatggac attgcaaaga 60
gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgggaaa cctacctctt agcaggggat aacatttgga 120
aacagatgct aataccgtat aacaatagca accgcatggt tgctacttaa aagatggttc 180
tgctatcact aagagatggt cccgcggtgc attagttagt tggtgaggta atggctcacc 240
aagacgatga tgcatagccg agttgagaga ctgatcggcc acaatgggac tgagacacgg 300
cccatactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatgggcgaa agcctgatgg 360
agcaacgccg cgtgtgtgat gaagggtttc ggctcgtaaa acactgttgt aagagaagaa 420
tgacattgag agtaactgtt caatgtgtga cggtatctta ccagaaagga acggctaaat 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtatgt tccaagcgtt atccggattt attgggcgta 540
aagcgagcgc agacggttat ttaagtctga agtgaaagcc ctcagctcaa ctgaggaatt 600
gctttggaaa ctggatgact tgagtgcagt agaggaaagt ggaactccat gtgtagcggt 660
gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctttctgg actgtaactg 720
acgttgaggc tcgaaagtgt gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccacaccg 780
taaacgatga gtgctaggtg tttgagggtt tccgccctta agtgccgcag ctaacgcatt 840
aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacggggacc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct 960
tgacatccct tgacaactcc agagatggag cgttcccttc ggggacaagg tgacaggtgg 1020
tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080
cccttattac tagttgccag catttagttg ggcactctag tgagactgcc ggtgacaaac 1140
cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200
gctacaatgg cgtatacaac gagttgccaa cccgcgaggg tgagctaatc tcttaaagta 1260
cgtctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agtcggaatc gctagtaatc 1320
gcggatcagc acgccgcggt gaatacgttc ccgggtcttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380
atgagagttt gtaacaccca aa 1402
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 2
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 3
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Claims (5)
- 구강 건강 개선 활성을 갖는 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) LMT13-54 (기탁번호: KCTC14822BP) 균주로서, 상기 구강 건강 개선 활성은 치아우식증 유발균을 억제하는 활성을 포함하는 것이고, 상기 치아우식증 유발균은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)인 것인 균주.
- 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) LMT13-54 (기탁번호: KCTC14822BP) 균주를 포함하는, 구강 건강 개선에 사용하기 위한 조성물로서,
상기 구강 건강 개선은 치아우식증 유발균을 억제하는 것을 포함하는 것이고, 상기 치아우식증 유발균은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)이고, 치아우식증을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물. - 삭제
- 삭제
- 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) LMT13-54 (기탁번호: KCTC14822BP) 균주를 포함하는, 구강 건강 개선에 사용하기 위한 조성물로서,
상기 구강 건강 개선은 치아우식증 유발균을 억제하는 것을 포함하는 것이고, 상기 치아우식증 유발균은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)이고, 치아우식증을 예방 또는 개선하는 활성을 가진 식품인 것인 조성물.
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| 박미선, 전남대학교, 석사학위논문(2006.08.)* * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023177215A1 (ko) * | 2022-03-16 | 2023-09-21 | (주)메디톡스 | 구강 건강 개선 활성을 갖는 와이셀라 시바리아 균주 및 그 용도 |
Also Published As
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