KR101062779B1 - 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스 ｓｐｍ1005 균주 및 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 ｓｐｍ1005 균주 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 충치 예방용 식품 및 약제학 조성물 - Google Patents

충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스 ｓｐｍ1005 균주 및 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 ｓｐｍ1005 균주 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 충치 예방용 식품 및 약제학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 신규한 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005 (기탁번호 :KCTC 11670BP)균주 및 상기 SPM1005 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 충치 예방용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005 (기탁번호 :KCTC 11670BP) 균주 및 상기 SPM1005 균주 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 충치 예방용 조성물은, 충치 유발 세균에 대해 특이적이고 우수한 생육 억제 활성을 보이기 때문에, 이를 충치 치료에 활용할 경우 종래 충치의 치료에 있어 항생제 처리 등에 의해 발생하는 문제점과 부작용을 최소화할 수 있을 뿐만 아니라, 건강 보조 식품, 식품, 또는 식품 이외에도 발효 제품, 의약품 및 의약외품 등에 응용이 가능하다.

Description

충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스 ＳＰＭ1005 균주 및 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 ＳＰＭ1005 균주 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 충치 예방용 식품 및 약제학 조성물{BIFIDOBACTERIUM ADOLESCENTIS INHIBITING THE GROWTH OF STREPTOCOCCUS MUTANS AND FOODSTUFFS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING TOOTH DECAY CONTAINING BIFIDOBACTERIUM ADOLESCENTIS OR ITS CULTURE}
본 발명은 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 신규한 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005 (기탁번호 :KCTC 11670BP)균주 및 상기 SPM1005 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 충치 예방용 조성물에 관한 것이다.
오늘날 가장 일반적으로 이용되고 있는 생균제는 유산균(lactic acid bacteria)으로서, 이러한 유산균은 탄수화물을 분해하고, 이를 이용하여 유산을 만드는 세균으로서, 산소가 적은 곳에서 잘 증식하는 통성 혐기성균 또는 편성 혐기성균이다. 이러한 유산균은 소화기장관내 정상 상재균으로 많은 in vivo와 in vitro 연구에서 병원성 또는 기회성 미생물의 감염에 대한 아주 효과적인 방어막으로 작용한다고 보고되고 있다(Trejo et al., 2006; Yun et al., 2006;Fuller, 1991; von Wright와 Salminen, 1999; de Ross와 Katan, 2000; Kim et al., 2003).
이러한 유산균은 5개 속으로 구분할 수 있는데, 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 루코노스탁 (Leuconostoc), 비피도박테리아(Bifidobacteria), 그리고 페디오코커스 (Pediococcus)로 나뉜다. 연쇄상 구균인 스트렙토코커스 속 미생물은 동형발효균으로, 우유를 발효시켜 유산을 생성함으로써 부패균이나 병원균을 억제하는 것으로 알려져 있다. 락토바실러스 속 미생물은 동형 또는 이형발효를 하는 유산간균으로, 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있는 균이며, 쌍구균인 루코노스탁 속 미생물은 이형 발효를 하며 채소류의 발효에 주로 관여한다. 또한, 비피도박테리아 속 미생물은 산소가 있는 곳에서는 생육하지 못하는 편성 혐기성균으로, 당을 발효하여 유아에게 유용하게 대사될 수 있는 L(+)형의 유산을 생성한다. 페디오코커스 속 미생물은 사련균의 형태를 가지는 동형 발효균으로, 김치나 절임 식품에 존재하며 소시지 등의 육류 발효에 관여한다. 이들 중에서 사람의 장내에 가장 많은 유산균은 편성 혐기성 유산균인 비피도박테리아로, 락토바실러스, 스트렙토코커스 등과 같은 통성 혐기성 유산균보다 약 1백 내지 1천배 이상 많이 존재하는 것으로 알려져 있다.
유산균은 젖산 발효에 의해 생성되는 젖산에 의해서 병원균과 유해 세균의 생육이 저지되는 성질을 유제품, 김치류, 양조식품 등의 식품 제조에 이용되고 있다. 또한, 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상발효를 방지하여 정장제로도 이용되는 중요한 세균으로 숙주의 면역 기능을 증강시키고 장내에서 콜레스테롤의 흡수를 억제하여 심혈관 질환 예방의 가능성도 보고되고 있고, 조류 독감 바이러스에 대한 항바이러스력을 가지는 균주도 발견되었다. 이러한 결과를 바탕으로 유산균은 섭취의 용이성과 식품 첨가제 응용의 용이함으로 생균제(probiotic)로서의 개발이 주목받고 있다.
한편, 사람의 구강내는 400종류 이상의 세균이 번식하고 있으며, 그 균수는 100억개에 달하고 있다. 또한, 이에 더하여 타액에는 108∼109 CFU/㎖ 수준의 균수가 검출되고 있다. 치아는 미세한 구멍이 다수개 천공되어 있어서 충치를 일으키는 세균이 상기한 구멍으로 들어가 치아를 병들게 하는데 이것이 충치이다. 이러한 충치는 치아에서 가장 흔히 볼 수 있는 대표적인 질환의 하나로 치아우식증이라고도 한다. 구강 내 음식물이 내산성 연쇄상 구균과 유산균에 의해 부패되고 산에 의해 치아의 성분이 파괴되는 감염성 세균성 질환이다. 우리나라에서는 영구 치아의 충치 이환율이 약 80%에 이르고, 한 사람이 평균 2-3개의 충치를 가지고 있는 것으로 보고되고 있다.
충치를 일으키는 원인은 여러 가지가 복합적으로 작용하고 있는 것으로 밝혀져 있지만 가장 중요한 것은 치태이다. 치태에는 여러 세균이 섞여 있는데, 특히 내산성 연쇄상 구균과 유산균이 많고 그 중에서 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)가 주요 충치균으로 알려져 있다. 이같은 스트렙토코쿠스 뮤탄스는 치아의 표면에 부착하여 성장하면서 음식물 내의 당을 이용하여 산을 생성하여 치아를 부식시키고 동시에 치아 골세포에 침입하여 각종 치조 골 부식과 잇몸병을 발생시키는 데 이 과정을 상세히 설명하면 다음과 같다.
충치의 발생은 충치 원인균에 의해서 치태가 치면에 형성하는 과정을 제1단계로 하고, 치태내에서 유기산이 생성되는 과정을 제2단계로, 치태내에서 생성된 유기산, 단백질 분해효소 등에 의해서 치아 표면을 구성하는 무기질을 탈회하고 나아가 유기질을 용해하여 가는 제3단계로 이루어진다. 또한 치주질환의 경우, 치면 및 치주 조직에 부착된 치태가 치주질환의 발생과 진행의 주된 원인이 되는 바, 치태내의 세균에 의해서 유해한 대사 산물이나 세균성 효소를 생성하여 그 결과로서 치은염을 유발시켜 발생하고 진전되는 것으로 알려져 있다.
최근에 치주 질환은 단순한 잇몸 조직의 만성 감염에 그치지 않고, 심근경색, 동맥경화를 비롯하여 당뇨병, 조산(早産) 유발 등의 위험인자로서 주목을 받고 있다. 따라서, 충치를 비롯한 치주질환을 치료하기 위하여, 살균제를 투여하거나 항생물질 복용 등의 방법이 행해지고 있다. 그러나 치료를 위한 살균제나 항생물질의 장기 투여는 새로운 항생제에 대해 저항을 가지는 내성균을 키우는 등의 부작용을 유발하고 있다. 또한, 치아는 한 번 파괴되면 다시 재생되지 않기 때문에 충치는 치아를 대신하는 재료로 밀봉하여 치료하고 있다. 이러한 충치치료는 일반적으로 치아에서 충치 부위를 제거하고 인공적인 재료를 사용하여 충치가 제거된 부위를 금 인레이, 세라믹 인레이, 아말감 충전, 레진 충전 등의 재료로 메우는 것으로, 마취제로 해당 부위를 국소마취시킨 후 핸드 드릴을 이용하여 고속으로 연마시켜 충치부위를 제거하였다. 그러나 이러한 핸드 드릴을 통한 치료는 치료시 소음과 진동에 의하여 환자에게 고통과 불쾌감을 주게 되므로, 치과 치료를 꺼려서 충치를 더욱 확산시키는 문제점이 있었다.
현재 충치 예방 방법으로는 칫솔질과 적절한 식이 요법을 통해 당분의 섭취를 줄이거나 자일리톨을 이용하여 충치균에 의한 산의 생성을 방지하는 방법이 있다. 종래의 치약 조성물에는 이러한 충치를 비롯한 각종 치아 및 구강관련 질환을 예방할 목적으로 항균 효과가 있는 불소 화합물이나 그 밖의 합성 화학물질에 의존하여 스트렙토코쿠스 뮤탄스균 등의 활성을 억제하는 치약 조성물을 사용해 왔다. 이 방법은 충치는 예방되지만 불소 침투층이 치아표면에서 깊이 침투하지 못하고 쉽게 소실되는 한계성을 가진다. 결과적으로 이와 같은 방법은 근본적으로 충치 유발균의 사멸이나 골세포 침입 방지의 효과는 없다.
따라서, 본 발명에서는 치주병 또는 충치의 예방이나 치료의 목적으로 살균제나 항생물질의 투여에 대신하는 방법으로, 충치 유발 세균의 성장을 억제하는 활성을 나타내는 유산균을 새로이 분리 동정하고, 이러한 유산균을 이용한 충치 질환의 예방 또는 치료 방법을 개발하고자 하였다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간의 분변으로부터 분리된 인체에 무해하고 섭취가 용이하며, 충치 유발균의 생육을 효과적으로 저해할 수 있는 신규한 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005 (기탁번호 :KCTC 11670BP) 균주 및 상기 SPM1005 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 충치 예방용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005 (기탁번호 :KCTC 11670BP)균주를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 충치 유발 세균은 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)인 것을 특징으로 하는 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주를 제공한다.
본 발명은 상기의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 충치 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서 상기 충치 유발 세균은 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)인 것을 특징으로 하는 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 충치 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명은 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 충치 예방용 조성물을 포함하는 충치 예방용 음료를 제공한다.
본 발명은 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 충치 예방용 조성물을 포함하는 충치 예방용 식품을 제공한다.
본 발명은 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 충치 예방용 조성물을 포함하는 충치 예방용 발효제품을 제공한다.
본 발명은 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 충치 예방용 조성물을 포함하는 충치 예방용 의약품을 제공한다.
본 발명은 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 충치 예방용 조성물을 포함하는 충치 예방용 의약외품을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 의한 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005는 성인의 분변으로부터 분리하였으며, 이들 중 충치를 유발한다고 알려진 세균들에 대한 항균 실험을 통해 충치용 세균의 성장 억제 효과가 있는 균주들을 선발하였고, 선발된 균주들을 16S rRNA의 염기서열 분석, PCR-RAPD 분석, 형태학적, 배양학적 특성분석을 통해 동정하였다.
그 결과 본 발명에서 분리된 유산균이 “비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis)”임을 확인하였으며, 따라서, 본 발명자들은 상기 유산균을 "비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005"로 명명하여 2010년 4월 7일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다. (기탁번호 : KCTC 11670BP)
일반적으로, 충치 유발균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스균을 비롯한 연쇄상구균은 구강내에서 섭취된 탄수화물을 발효시켜 유산균을 형성하고 이 유기산에 의해 치아의 법랑질에 손상을 입혀 충치를 유발하는 것으로 알려져 있다. 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스균은 통성 혐기성균으로 산소의 유무에 관계없이 자랄 수 있는 그람 양성(Gram-positive) 균이다.
본 발명에서 상기 SPM1005 균주는 충치를 유발하는 세균의 생육을 억제하는 항균 활성을 나타내고 있는데, 종래 충치를 유발하는 세균으로는 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 소브리너스(Streptococcus sobrinus) 및 스트렙토코쿠스 고르도니이(Streptococcus gordonii) 등이 있다. 본 발명의 상기 SPM1005는 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 성장을 현저히 억제하는 효과를 나타내었다.
본 발명은 상기 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 충치 예방용 조성물을 제공한다.
상술한 조성물은 본 발명에 따른 유산균의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균, 건조균 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유할 수 있으며, 상기 배양물은 본 발명에 따른 유산균을 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소(lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 상기 SPM1005 또는 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향로와 혼합하여 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭실, 시럽, 산제, 현탁제 또는 과립제 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 상기 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구 투여하는 것이 바람직하다. 또한 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는 1회 투여시 0.1mg 내지 15mg 보다 바람직하게는 6mg 내지 10mg 의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 상기 SPM1005 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 조성물, 음료, 식품, 발효제품, 의약품 및 의약외품은 본 발명에 의한 항균제를 투입하여 항균력을 부여할 수 있다. 본 발명은 식품이나 발효제품으로 활용될 수 있으며, 발효제품의 제조를 위한 종균으로 사용될 수 있다. 상기 발효제품은 햄 및 소시지와 같은 발효육제품, 발효생식제품, 발효유제품, 김치 등을 포함한다. 본 발명의 유산균을 이용한 발효제품은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대 상기 발효생식제품은 현미와 율무 등의 곡류 분말, 과채류 분말, 버섯류 분말에 본 발명에 따른 유산균 원말을 혼합하여 제조될 수도 있다. 또한 상기 곡류 분말은 본 발명에 따른 유산균 또는 이를 포함하는 또는 이를 포함하는 2-3종의 혼합 유산균으로 적정 온도에서 발효시킨 후 과채류, 버섯류 분말을 영양적인 균형과 기호성이 우수하도록 적절히 배합하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 균주는 통상적인 비피도박테리움 속 미생물의 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 예컨대, GAM(general anerobic medium) 배지 또는 우유가 첨가된 배지를 사용할 수 있다. 미생물의 배양은 통상의 유산균 배양 조건상에서 가능하며, 예컨대 30℃ 내지 45℃에서 10시간 내지 45시간 정도 배양 할 수 있다. 보다 바람직하게는 37℃에서 18시간 배양하는 것이 바람직하다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따랄 냉동하거나 또는 냉동 건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다. 본 발명에 따른 균주는 공장에서 대량 배양하여 원말로 제조하는 경우에도 안정성이 유지된다.
본 발명에 의하면, 상기 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주 및 상기 SPM1005 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 충치 예방용 조성물은 충치균에 대해 특이적이고 우수한 성장 저해 효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주를 충치 치료에 이용할 경우 종래 충치 치료에 있어 항생제 처리 등에 의해서 발생하는 문제점과 부작용을 최소화할 수 있을 것이다.
또한, 분변으로부터 유래한 균주와 그 생산물은 건강 보조식품 또는 식품의 형태로 안전하게 장기간 섭취할 수 있으므로, 충치의 예방 및 치료하는 데 효과적일 것이다. 그리고 이는 식품 이외에도 발효제품, 의약품 및 의약외품 등에 응용이 가능하다.
도 1은 서열번호 1 내지 6으로 기재되는 마이크로바이얼 유니프라이머 (Microbial Uniprimer)을 이용하여 PCR-RAPD 분석을 수행한 결과이다.
도 2는 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 마이크로바이얼 유니프라이머 (Microbial Uniprimer)을 이용하여 PCR-RAPD 분석을 수행한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1005를 현미경으로 관찰한 모습이다.
도 4는 본 발명에 따른 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1005에 의하여 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 성장이 저해되는 것을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1005에 의해 스트렙토코쿠스 소브리너스의 성장 저해여부를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1005에 의해 스트렙토코쿠스 고르도니이의 성장 저해여부를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예을 통하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 단, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 분변으로부터 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis ) 균주 분리
정상적인 섭식 습관을 갖는 20 - 30 세의 건강한 성인 15명으로부터 분변을 수집하였다. 수집된 인분의 적당량을 생리식염수 100 ㎖에 현탁한 후, 적당량을 취하여 5% 양 혈청이 함유된 BL 아가 배지(Blood-Liver, Nissue)에 도말하였다. 박트론 혐기 챔버(Bactron Anaerobic chamber; Sheldon Manufacturing Inc.)를 이용하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다.
생존한 균주 중에서 0.5-2.0 mm 의 적갈색 중심 부분을 갖는 밝은 갈색, 유백색 또는 황갈색 형태의 비피도박테리움 속 미생물을 선별하였다. 선별된 3종의 유산균은 fructose-6-phosphate phosphoketlase (F6PPK) 시험을 통해 비피도박테리움속인 것을 확인하고, 이들을 각각 SPM0212, SPM1005, SPM1207, SPM1307-A, SPM1601, SPM1307 로 명명하였다.
<실시예 2> 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis )균주의 분리 및 동정
<실시예 2-1> 16S rRNA 분석
상기 실시예 1을 통해 분리되고 명명된 SPM0212, SPM1005, SPM1207, SPM1307-A, SPM1601, SPM1307를 동정하기 위하여, 당업계에 공지된 통상의 방법(Matsuki, T., et al., FEMS Microbiology Lett., 167: 113-121, 1998; Mullie, C., et al., FEMS Microbiology Lett., 222: 129-136, 2003; Venema, K., et al., FEMS Microbiology Lett., 224: 143-149, 2003)에 따라 16S rRNA 분석을 수행하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 유산균 SPM1005의 5' 영역과 3' 영역 모두 비피도박테리움 아돌레센티스 L2-32(1448bp)와 99 %의 상동성을 나타내었다.(결과 미도시)
<실시예 2-2> PCR-RAPD 분석
상기 과정을 통하여 분리되고 명명된 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212, SPM1005, SPM1207 및 SPM1601과 KCTC, ATCC 에서 구입한 균주들과의 유전적인 관계를 조사하기 위하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)-RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
유산균의 genomic DNA는 wizard genomic DNA purification kit (Promega, Co. Ltd., Madison, U.S.A.)를 사용하여 분리하였다. PCR 반응은 2.5 unit 택 DNA 폴리머라제(Taq polymerase), 1.5 mM MgCl2, 0.20 mM dNTP, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, template genomic DNA와 각각의 프라이머를 포함하는 30 ㎕ 부피에서 수행하였다. PCR 증폭 반응은 PTC-200 thermal cycler (MJ Research, U.S.A.)에서 수행하였으며, PCR-RAPD 분석을 수행하기 위한 primer들은 아래 표 1에서 제시되는 바와 같이 Microbial UniPrimersTM kit((주)서린바이오사이언스)를 이용하였고, 증폭된 PCR 산물들은 2% 아가로스 젤에서 전기영동법으로 분리하였고, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide (EtBr)) 염색법으로 결과를 판독하였다.
Primers Sequence (5'→3')
BOXA1R (서열번호 1) 5'- CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G -3'
BOXA2R (서열번호 2) 5'- ACG TGG TTT GAA GAG ATT TTC G -3'
ERIC1R (서열번호 3) 5'- ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C -3'
ERIC2 (서열번호 4) 5'- AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G -3'
TAP1 (서열번호 5) 5'- CAG CAG CCG CGG TAA TAC -3'
TAP2 (서열번호 6) 5'- CAG CAG CCG CGG TAA TTC -3'
PCR 반응 조건은 서열번호 1의 경우 92℃에서 30초; 52℃에서 1분; 및 72℃에서 2분을 한 사이클로 하여 총 35 사이클로, 서열번호 2의 경우는 95℃에서 45초; 35℃에서 1분; 및 65℃에서 2분을 한 사이클로 하여 총 30 사이클로, 서열번호 3 및 4의 경우는 94℃에서 30초; 48℃에서 1분; 및 72℃에서 5분을 한 사이클로 하여 총 35 사이클로, 서열번호 5 및 6의 경우는 92℃에서 30초; 38℃에서 1분; 및 68℃에서 1분 30초를 한 사이클로 하여 총 40 사이클로 하였다.
도 1의 경우 lane M1: 1 kb 사이즈 마커, lane M2: 100 bp 사이즈 마커를 나타내며, lane 1: Bifidobacterium adolescentis SPM0212, lane 2: Bifidobacterium adolescentis SPM1005, lane 3: Bifidobacterium adolescentis SPM1207, lane 4: Bifidobacterium adolescentis SPM1601, lane 5: Bifidobacterium adolescentis KCTC 3325 를 나타낸다.
도 2의 경우 lane M1: 1 kb 사이즈 마커, lane M2: 100 bp 사이즈 마커를 나타내며, lane 1: Bifidobacterium adolescentis SPM0212, lane 2: Bifidobacterium adolescentis SPM1005, lane 3: Bifidobacterium adolescentis SPM1207, lane 4: Bifidobacterium adolescentis SPM1601, lane 5: Bifidobacterium adolescentis KCTC 3325, lane 6: Lactobacillus fermentum ATCC 3112, lane 7: Lactobacillus ruminis ATCC 3601, lane 8: Bifidobacterium infantis KCTC 3127; lane 9: Bifidobacterium longum KCTC 3128, lane 10: Bifidobacterium catenulatum KCTC 3221, lane 11: Bifidobacterium pseudocatenulatum KCTC 3223, lane 12: Bifidobacterium thermophilum KCTC 3225, lane 13: Bifidobacterium ruminantiun KCTC 3425, lane 14: Bifidobacterium bifidum (BF), lane 15: Streptococcus spp.를 나타낸다.
도 1 및 도 2 에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 SPM1005는 SPM0212, SPM1207, SPM1601 을 비롯한 KCTC 3325, ATCC 3112, ATCC 3601, KCTC 3127, KCTC 3128, KCTC 3221, KCTC 3223, KCTC 3225, KCTC 3425, Bifidobacterium bifidum (BF), 및 Streptococcus spp.의 다른 균주들과는 전혀 다른 밴드 패턴을 보였으며, 이로써, 다른 유전적 구성을 나타냄을 알 수 있다.
<2-3> 형태학적 분석
본 발명에 따라 명명된 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005를 현미경으로 관찰한 결과를 도 3에 도시하였다. 도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 SPM1005는 비피도박테리움 속 미생물의 전형적인 형태인 막대균 모양이었다.
<2-4> 당 이용성 분석
비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212, SPM1005, SPM1601의 당 이용성은 아래 표 2와 같았다.
Sugar Bifidobacterium adolescentis
SPM0212 SPM1005 SPM1601
L-Srabinose - + -
D-Ribose - - -
Xylose + + +
Galactose + + +
Fructose + + +
Mannose - - +
Mannitol - + -
Sorbitol - - -
Salicine + -
Cellobiose - - +
Maltose + - -
Lactose + + -
Melibiose + + +
Saccharose + + +
Trehalose + + -
Inuline - + -
Melezitose + + -
Raffinose + - +
Starch + + +
Gluconate + - -
본 발명자들은 상기 분리되고 동정된 균주를 "비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005"로 명명하여 2010년 4월 7일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다. (기탁번호 : KCTC 11670BP)
<실시예 3> 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1005의 항균 활성 조사
상기 실시예에서 건강한 20 - 30세 한국인의 분변으로부터 분리, 동정된 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM0212, SPM1005, SPM1601 균주 중에서 충치균의 성장 증식 억제효과를 가진 균주를 선발하기 위하여, 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM0212, SPM1005, SPM1601 균주를 이용하여 충치를 유발하는 것으로 알려진 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 소브리너스(Streptococcus sobrinus) 및 스트렙토코쿠스 고르도니이(Streptococcus gordonii)의 성장 저해 실험을 실시하였다.
<실시예 3-1> 충치를 유발하는 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대한 성장 저해 효과
먼저, 본 발명의 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM0212, SPM1005, SPM1207, SPM1307-A, SPM1601, SPM1307 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum KCTC1048 균주들을 GAM(General anaerobic medium) (Nissui Pharm. Co. Ltd., Japan) broth 30 ㎖에 접종하여 N2(90%), H2(5%) 및 CO2 (5%)로 구성되는 혼합 가스로 채워진 혐기적 시스템(Bactron Anaerobic Chamber, Sheldon Manufacturing Inc.,USA))하에 37℃에서 18시간 동안 전배양하였다.
또한, 본 실시예에서 충치를 유발하는 세균으로는 스트렙토코쿠스 뮤탄스가 사용되었으며, 이는 경희대학교 구강미생물실로부터 획득되었다. 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스는 BHI(brain-heart infusion) broth 30 ㎖에 접종하여 37℃에서 18시간 동안 혐기성 조건에서 전배양하였다.
실시예로서는 전배양한 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM0212, SPM1005, SPM1207, SPM1307-A, SPM1601, SPM1307가 선택되었고, 비교예로서는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCTC1048 균주가 선택되었다.
이들 균주들을 전배양한 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스와 1:1로 혼합하여 잘 섞은 후 BHI(brain-heart infusion) broth 5ml을 추가하여, 37℃에서 2시간 동안 본 배양하였다. 반면, 대조군(Control)은 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스와 PBS(살린)를 1:1로 혼합하여 잘 섞은 후 BHI(brain-heart infusion) broth 5ml을 추가하여, 37℃에서 2시간 동안 본 배양하였다. 본 실시예에서 사용된 대조군, 실시군 및 비교군을 나타내면 표 3과 같다.
대조예 1 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 살린
실시예 1 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM0212
실시예 2 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1005
실시예 3 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1207
실시예 4 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1307-A
실시예 5 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1601
실시예 6 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1307
비교예 1 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 락토바실러스 플란타룸 KCTC1048
그 후 대조예 1, 실시예 1 내지 6 및 비교예 1의 본 배양액들로부터 균을 수득하였고, 수득된 균을 살린(saline)으로 10 배씩 계열 희석(serial dilution)한 후, 희석된 배양액을 BHI 아가 배지(agar plate)에 도말하여 호기성 조건하에 37℃ 에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지 위에 성장한 콜로니의 수를 계수하여 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생존율을 대조군과 비교하여 측정하였으며, 그 결과를 도 4a 에 나타내었다.
또한, 실시예 1 내지 6 및 비교예 1에서 사용한 균주들의 전 배양액을 원심분리한 후 균체를 제거하여 상등액만 취한후 이를 상기 전배양한 스트렙토코쿠스 뮤탄스와 혼합하여 37℃에서 2시간 동안 본 배양하였다. 그 후 상기와 같은 방법으로 BHI 아가 배지(agar plate)에 도말하여 호기성 조건하에 37℃ 에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지 위에 성장한 콜로니의 수를 계수하여 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생존율을 대조군과 비교하여 측정하였으며, 그 결과를 도 4b 에 나타내었다.
혐기성 균인 실시예 1 내지 6 및 비교예 1에서 사용된 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM0212, SPM1005, SPM1207, SPM1307-A, SPM1601, SPM1307 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCTC1048 균주들은 호기성 조건에서는 성장하지 못하므로, 상기 BHI 아가 배지(agar plate)에서 자란 콜로니는 통성 혐기성 세균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스이다. 따라서, 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생존율(%)은 다음과 같은 식에 의해 계산될 수 있다.
스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생존율(%)
= (대조군에서 배양된 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 CFU(colony forming unit)/ 실시예 또는 비교예에서 배양된 스트렙토코쿠스 뮤탄스 뮤탄스의 CFU(colony forming unit))×100
그 결과, 상기 SPM1005 균주는, 도 4a에 도시된 바와 같이, 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생장 억제에 현저한 효과를 나타냈다(도 4a의 SPM1005에 표시된 *은 p<0.05를 나타내어, 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생존율 감소 효과에 높은 신뢰도를 나타낸다). 그러나, 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1005의 균체를 제거하고 상등액만을 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스와 함께 혼합하여 배양한 경우에는 도 4b에 나타낸 바와 같이, 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 성장을 억제하는 효과가 나타나지 않았다. 또한, 도 4a 및 도 4b에 제시되는 바와 같이 상기 SPM1005를 제외한 다른 균주들은 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생장 억제에 별다른 효과를 나타내지 못했다.
<실시예 3-2> 스트렙토코쿠스 소브리너스에 대한 성장 저해
다음으로 본 발명의 비피도박테리움 아돌레센티스가 구강내 존재하는 또 다른 충치를 유발하는 세균인 스트렙토코쿠스 소브리너스의 성장을 저해시키는지 상기 <실시예 3-1>과 동일한 방법에 따라 조사하였으며, 그 결과를 도 5a, 도 5 b에 나타내었다.
본 실시예에서 상기 균주들의 스트렙토코쿠스 소브리너스에 대한 성장 저해 효과를 조사하기 위하여 사용된 대조군, 실시군 및 비교군을 나타내면 표 4와 같다.
대조예 2 스트렙토코쿠스 소브리너스 + 살린
실시예 7 스트렙토코쿠스 소브리너스 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM0212
실시예 8 스트렙토코쿠스 소브리너스 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1005
실시예 9 스트렙토코쿠스 소브리너스+ 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1207
실시예 10 스트렙토코쿠스 소브리너스+ 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1307-A
실시예 11 스트렙토코쿠스 소브리너스 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1601
실시예 12 스트렙토코쿠스 소브리너스+ 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1307
비교예 2 스트렙토코쿠스 소브리너스+ 락토바실러스 플란타룸 KCTC1048
<실시예 3-3> 스트렙토코쿠스 고르도니이에 대한 성장 저해
본 발명의 비피도박테리움 아돌레센티스가 구강내 존재하는 또 다른 충치를 유발하는 세균인 스트렙토코쿠스 고르도니이의 성장을 저해시키는지 상기 <실시예 3-1>과 동일한 방법에 따라 조사하였으며, 그 결과를 도 6a, 도 6b 에 나타내었다.
본 실시예에서 상기 균주들의 스트렙토코쿠스 고르도니이에 대한 성장 저해 효과를 조사하기 위하여 사용된 대조군, 실시군 및 비교군을 나타내면 아래 표 5와 같다.
대조예 3 스트렙토코쿠스 고르도니이 + 살린
실시예 13 스트렙토코쿠스 고르도니이 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM0212
실시예 14 스트렙토코쿠스 고르도니이 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1005
실시예 15 스트렙토코쿠스 고르도니이 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1207
실시예 16 스트렙토코쿠스 고르도니이 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1307-A
실시예 17 스트렙토코쿠스 고르도니이 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1601
실시예 18 스트렙토코쿠스 고르도니이 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1307
비교예 3 스트렙토코쿠스 고르도니이 + 락토바실러스 플란타룸 KCTC1048
한국생명공학연구원 KCTC11670 20100407

Claims (11)

  1. 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 충치 유발 세균은 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)인 것을 특징으로 하는 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주.
  3. 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 충치 예방용 약제학 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 충치 유발 세균은 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)인 것을 특징으로 하는 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 충치 예방용 약제학 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 충치 예방용 식품 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 충치 유발 세균은 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)인 것을 특징으로 하는 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005(기탁번호 :KCTC 11670BP)균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 충치 예방용 식품 조성물.

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KR20200071360A (ko) 2018-12-11 2020-06-19 주식회사 엘리바이오 로즈힙을 활성성분으로 함유하는 치약 조성물
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