KR101270493B1 - 인간 유두종 바이러스 억제 활성을 갖는 비피도박테리움 아돌레센티스 ｓｐｍ1005-ａ, 및 인간 유두종 바이러스 억제 활성을 갖는 비피도박테리움 아돌레센티스 ｓｐｍ1005-ａ 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

인간 유두종 바이러스 억제 활성을 갖는 비피도박테리움 아돌레센티스 ｓｐｍ1005-ａ, 및 인간 유두종 바이러스 억제 활성을 갖는 비피도박테리움 아돌레센티스 ｓｐｍ1005-ａ 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 유두종 바이러스 억제 활성을 갖는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM 1005-A(KCTC 12014 BP)와, 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1005-A(KCTC 12014 BP) 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 신규 유산균인 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1005-A 는 인간 유두종 바이러스(HPV), HPV 16 타입의 활성을 억제하며, 특히 인간 유두종 바이러스의 E6, E7 단백질 발현을 효과적으로 저해하여, 자궁 경부암의 발생을 저해할 수 있다.

Description

인간 유두종 바이러스 억제 활성을 갖는 비피도박테리움 아돌레센티스 ＳＰＭ1005-Ａ, 및 인간 유두종 바이러스 억제 활성을 갖는 비피도박테리움 아돌레센티스 ＳＰＭ1005-Ａ 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물{BIFIDO BACTERIUM ADOLESENTIS SPM 1005-A HAVING ANTIVIRAL ACTIVITY FOR HUMAN PAPILLOMAVIRUS, AND COMPOSITION FOR PREVENTING OR CURING OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS INFECTION COMPRISING BIFIDO BACTERIUM ADOLESENTIS SPM 1005-A OR CULTURED MATERIAL OF THE SAME}
본 발명은 인간 유두종 바이러스 억제 활성을 갖는 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A)와, 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
유두종바이러스(papiloma virus)는 다수의 고등 생물에서 단리되어 왔으며, 이들은 피부와 점막 상피 조직을 감염시킨다. 현재, 100개 이상의 인간 유두종바이러스(HPV) 유전자형(genotype)이 인간에서 동정되어 있으며(Stoler, 2000, Int. J. Gyunecol. Path 19, 16-28), 보통 양성 종양과 연관되는 "저위험" 유전자형(예를 들면, HPV-6 및 HPV-11)과, 전-악성 손상부위(lesion)(예를 들면, 경부 상피내 신생물, CIN)로 진행되어 최종적으로 악성 종양이 될 가능성을 갖는 손상부위와 연관되는 "고위험" 유전자형으로 분류될 수 있다. 예를 들면, 99% 이상의 경부암은 HPV DNA를 함유하며, 5개의 "고위험" HPV (HR-HPV) 유전자형이 주된 원인으로 인식되어 왔고, 이 중 HPV-16 및 HPV-18은 전세계적으로 진단된 침입성 경부암의 대략 70%에서 검출되고(Clifford et al., 2003, Br J Cancer 88, 63-73), HPV-31, HPV-33 및 HPV-45는 추가 10%에서 검출된다(Cohen et al., 2005, Science 308, 618-621).
유두종바이러스는 단백질 캡시드(capsid)에 의해 둘러싸인 작은 DNA 바이러스이다(예를 들면, Pfister, 1987, in The papovaviridae: The Papillomaviruses, Salzman and Howley edition, Plenum Press, New York, p1-38). 그 게놈은 3개의 기능성 부위인 얼리(early, E), 레이트(late, L) 및 긴 조절(long control, LCR) 부위로 이루어진 약 7,900 염기쌍의 이중사슬 원형 DNA이다. 상기 LCR은 인핸서(enhancer) 및 프로모터(promoter)와 같은 전사 조절 서열을 함유한다. 상기 레이트 부위는 각각 메이저 및 마이너 캡시드 단백질에 해당하는 L1 및 L2 구조 단백질을 코딩하는 반면, 얼리 부위는 바이러스 복제, 전사 및 세포 변형(transformation)을 조절하는 핵 내에서 우선적으로 발견되는 조절 단백질(E1-E7)을 코딩한다.
상기 E1 단백질은 유두종바이러스 게놈에 의해 코딩되는 가장 크고(HPV-16 E1은 649개 아미노산 길이), 가장 보존된(conserved) 단백질이다. E1은 바이러스 복제를 자극하기 위해 E2와의 이량체화 및 상호작용을 필요로 하는 ATP-의존적 헬리카제(helicase) 활성을 갖는 DNA 결합 인단백질이다(Desaintes and Demeret, 1996, Semin. Cancer Biol. 7, 339-347; Wilson et al, 2002, Virus Gene 24, 275-290). 상기 헬리카제 활성은 E1의 C-말단 도메인 및 중앙 도메인의 DNA 결합 도메인에 위치해 있다. 상기 E2 단백질(HPV-16 E2는 365개 아미노산 길이)은 바이러스 유전자의 전사를 조절하고 DNA 복제를 조절하는 다기능성 DNA 결합 인단백질이다(Bechtold et al., 2003, J. Virol. 77, 2021-2028). 바이러스 전사의 조절은 E2 이량체와 E2-결합 부위(보존적 ACCN6GGT 서열)에 이량체화 및 결합하는 것을 필요로 하며, 그 문맥(context)이 바이러스 전사가 트랜스-활성인지 또는 억제되는지를 결정한다(Ham et al., 1991, Trends Biochem. Sci. 16, 440-444; McBride et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, 18411-18444). E2는 또한 E6 및 E7 암단백질의 발현을 조절하는 HPV-16 p97 프로모터를 억제한다.
마지막으로, E2는 딸세포에서 바이러스 게놈의 영역화에 관여한다. HPV-16 E2의 N-말단 도메인은 트랜스-활성, E1과의 상호작용 및 복제의 촉진에 관여하는 반면, C-말단 도메인은 DNA 결합 및 이량체화에 관여한다(McBride et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 510-514). 상기 E4-코딩된 단백질은 세포질 케라틴 네트워크에 결합하여 붕괴시키며, 바이러스를 성숙시키는 역할을 한다. E5 단백질의 기능은 여전히 논란이 있다.
E6 및 E7 단백질은 각각 세포의 종양 억제 유전자 산물인 p53 및 레티노블라스토마(Rb)에 이들 바이러스 단백질이 결합함으로써(Howley, 1996, Papillomaviruses and their replication, p2045-2076. In B.N. Fields, D.M. Knipe and P.M. Howley(ed), Virology, 3 ed. Lippincott-Raven Press, New York, N.Y.에서 리뷰됨), HR-HPV 에 감염된 세포의 암유전자 변형에 관여한다(Kanda et al., 1988, J. Virol. 62, 610-613; Vousden et al., 1988, Oncogene Res. 3, 1-9; Bedell et al., 1987, J. Virol. 61, 3635-3640).
HPV 감염은 가장 빈번하게 성적으로 전파되는 감염 중 하나이며, 성적으로 활성인 성인의 약 25%가 HPV에 감염되어 있다(Woodman et al., 2001, The Lancet 357, 1831-1836). 대략 80%의 대상은 6-12개월 내에 자연적으로 바이러스가 소멸된다(Ho et al., 1998, N Eng J Med 338, 423-428). 그러나, 나머지 20%에서, HPV 감염은 전-악성 CIN 손상부위로 진행되며, 진단되지 않는다면, 이는 침입성 암으로 발전할 수 있다(O'Shaughnessy et al., 2002, Clinical Cancer Research 2, 314-346). 종양형성(neoplasia)-유도 메카니즘은 HPV 게놈이 세포의 염색체 내로 삽입되는 것을 포함하는 것으로 보인다(Cullen et al., 1991, J. Virol. 65, 606-612). 대부분의 경우, 이는 E1/E2 부위 내의 HPV 게놈 DNA의 붕괴, E2 억제 효과로부터의 E6/E7 프로모터의 방출, 및 결과적으로 E6 및 E7 발현의 상향조절과 세포의 변형을 이끈다.
현재 HPV 감염 방지를 목적으로 하는 예방 백신이 시장에 나올 예정이다. 현재 HPV 감염 방지를 목적으로 하는 예방 백신이 거의 시장에 나올 예정이다. 이들은 바이러스가 숙주 세포 내로 침입하기 이전에 주로 중화 항체(neutralizing antibody)의 유도를 통해 바이러스를 차단하기 위하여 바이러스 표면에 발현되는 캡시드 단백질을 표적으로 한다. 일반적으로 이들은 자연스럽게 VLP(Virus like particle)로 재조립되는 재조합적으로 제조된 L1 단백질에 의존한다. 머크 및 글락소스미스클라인(GSK)에 의해 제조되는 2가지 HPV 백신이 임상 시험 3상을 성공적으로 완료하였으며, 타입-특이적 경부 감염을 거의 100% 효능으로 방지하는 것을 보여주었다. GSK의 백신은 HPV-16 및 HPV-18의 VLP 혼합물을 포함하는 반면, 머크의 백신은 또한 생식기의 혹(wart)을 초래하는 HPV-6 및 HPV-11 유래의 VLP를 포함한다.
HPV 감염은 일반적으로 비정상(abnormal) 스크리닝(예를 들면, 팝 스미어 검사)에 따라 검출된다. 오늘날, HPV 감염을 진단하는 유일한 의학적 이점은 손상부위가 발생할 때 가능한 빨리 손상부위(예를 들면, 높은 등급의 CIN 2/3)를 검출하기 위하여 보다 빈번하게 추적조사(follwo-up)를 수행하는 것이며, 이후 상기 손상부위는 루프 전기외과적 절제술(LEEP) 및 콘 생검(conization)과 같은 제거 방법에 의해 제거될 수 있다. 이러한 방법은 전체적으로 90% 효과가 있지만, 산부인과적 합병증의 위험이 있다(예를 들면, 가임 연령의 여성에서 임신 가능성에 영향을 미칠 수 있음). 의학적인 관점에서 충분히 만족스럽지 않은 것에 더하여, 이러한 상황은 또한 환자를 불편(불안)하게 한다.
따라서, 특히 이러한 집단에서 전-악성 손상부위와 순차적으로는 암으로 진행할 위험성이 크다는 측면에서, 잠복기가 긴 HPV로 감염된 환자를 치료하기 위한 새로운 방법을 개발할 필요성이 있다.
유산균은 사람 및 동물의 장내에 분포하여 장내 유해 미생물 생장 억제, 이상 발효의 치료, 혈중 콜레스테롤 저하, 면역 기능의 증진 등의 효과를 나타내며, 항암 작용도 있는 것으로 보고되고 있다. 이러한 유산균을 사람이 섭취하여 건강을 증진할 수 있도록 유산균 함유 발효 유제품 및 정장제가 상용화되어 널리 음용 또는 식용되고 있다. 최근에 유산균에 의한 바이러스 감염억제에 관한 연구결과들이 보고되었다. 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)과 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)를 보충한 분유를 섭취함으로써 로타바이러스에 의한 유아 설사증을 예방하는 데 효과가 있는 것으로 보고되었으며, 조류인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 식물유래 유산균(대한민국 특허등록 제0808910호)도 보고되었다.
그러나, 유산균에 의한 바이러스 감염 억제, 특히 인간유두종바이러스(HPV)에 대한 증식 억제 효능을 나타내는 유산균에 대한 시험 결과는 찾아보기 어렵다. 따라서, 본 발명에서는 단순포진바이러스(HSV) 감염 예방 또는 치료의 목적으로 살균제나 항생물질의 투여에 대신하는 방법으로, 유산균을 이용한 인간유두종 바이러스(HPV) 감염의 예방 또는 치료 방법을 개발하고자 하였다.
본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 인간 유두종 바이러스(HPV)를 효과적으로 저해할 수 있는 안전한 물성의 새로운 천연 항균성 물질을 생산하는 균주인 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) 를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 인간 유두종 바이러스 억제 활성을 갖는 안전한 물성의 새로운 천연 항균성 물질을 생산하는 균주인 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) (KCTC 12014 BP)를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) (KCTC 12014 BP)는 인간 유두종 바이러스 HPV 16 타입에 대해 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) (KCTC 12014 BP)는 인간 유두종 바이러스의 E6 단백질 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) (KCTC 12014 BP)는 인간 유두종 바이러스의 E7 단백질 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은, 또한, 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) (KCTC 12014 BP) 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 인간 유두종 바이러스 HPV 16 타입에 대해 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 인간 유두종 바이러스의 E6 단백질 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 E7 단백질 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물, 또는 의약외품 조성물인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 및 필터충진제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제조에 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) (KCTC 12014 BP) 는 생균, 건조균 또는 사균인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 신규 유산균인 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) 는 인간 유두종 바이러스(HPV), HPV 16 타입의 활성을 억제하며, 특히 인간 유두종 바이러스의 E6, E7 단백질 발현을 효과적으로 저해하여, 자궁 경부암의 발생을 저해할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예와 비교예에 있어서, 세포의 모폴로지의 변화를 측정한 결과를 나타내었다. 도 1의 (A) 는 상기 실시예 1의 비피도박테리움 아돌레센티스 1005-A 를 처리하지 않은 경우를 나타내고, 도 1의 (B) 내지(D) 는 상기 실시예 1의 비피도박테리움 아돌레센티스 1005-A 를 처리한 후 각각 24 시간, 48시간, 72 시간이 경과한 후의 모폴로지를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 자궁경부암 SiHa 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 3.6×105 개의 세포를 100㎕ 부피로 첨가하고 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양한 다음, 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A 를 5.1 × 107 cfu/ml 의 농도로 함께 접종하고 각각 24 시간, 48시간, 72 시간이 경과한 후 살아있는 세포의 수를 헤모사이토메타로 측정하여 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예의 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A 와 48시간동안 혼합 배양된 자궁경부암 SiHa 세포의 qRT-PCR 실시 결과를 나타내었다.
도 4는 상기 실시예 1에서 제조한 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) 와 24시간, 48시간동안 혼합 배양된 자궁경부암 SiHa 세포와 비교예로서 PBS 만을 처리한 자궁경부암 SiHa 세포 시료를 대상으로 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸다.
도 5 내지 도 8은 BOXA1R primer, BOXA2R primer, ERIC1R primer, ERIC2 primer 를 사용하여 돌연변이 균주의 특성을 분석한 결과를 나타내었다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 권리범위가 아래 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 인분으로부터 유산균의 분리 및 돌연변이 유발
정상적인 섭식 습관을 갖는 20-30세의 건강한 성인 15명으로부터 분변을 수집하였다. 이후, BBL의 혐기성 샘플 컬렉션 & 트랜스포트 시스템(BBL's anerobic sample collection & transport system)을 이용하여 편성 혐기성 (obligate anaerobic) 유산균을 분리하였으며, 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005 로 명명하였다.
상기 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) 균주는 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 것을 발결하고 이를 2010년 4월 7일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다. (기탁번호 : KCTC 11670BP)
본 발명에서는 상기 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM 1005 균주를 이용하여 인공 돌연변이를 유발시킨다. 구체적으로, 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM 1005 균주를 엠엔엔지 (MNNG) 등을 이용하는 일반적인 과정으로 인공 돌연변이시킴으로 변이 균주 SPM 1005-A, SPM 1005-B, SPM 1005-C, SPM 1005-D 를 유도하였다.
수집된 인분의 적당량을 생리식염수 100 ㎖에 현탁한 후, 적당량을 취하여 5% 양 혈청이 함유된 BL 아가 배지(Blood-Liver, Nissue)에 도말하였다. 트론 혐기 챔버(Bactron Anaerobic chamber; Sheldon Manufacturing Inc.)를 이용하여 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 상기 상등액을 동결건조하여 분말 형태로 만들어 사용하였다.
<실시예 2> 인간 유두종 바이러스 배양 및 세포 모폴로지 관찰
인간 유두종 바이러스 HPV16 타입을 발현하는 자궁경부암 SiHa 세포를 미국 ATCC(American Type Culture Collection) 로부터 구매하였다.
구매한 자궁경부암 SiHa 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 페니실린 G, 스트렙토마이신, 암포테리신 B(amphotericin B)를 첨가한 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 플라스크당 1.0 × 105 세포씩 접종하고, 상기 자궁경부암 SiHa 세포가 접종된 플라스크에 대조군으로서 PBS 만을 처리한 경우를 비교예로하고, 상기 실시예 1의 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 1005-A 를 5.1 × 107 cfu/ml 의 농도로 함께 접종하고 배양한 경우를 실시예로 하였다.
상기 비교예와 상기 실시예에 있어서, 세포의 모폴로지의 변화를 측정하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1의 (A) 는 상기 실시예 1의 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 1005-A 를 처리하지 않은 경우를 나타내고, 도 1의 (B) 내지(D) 는 상기 실시예 1의 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 1005-A 를 처리한 후 각각 24 시간, 48시간, 72 시간이 경과한 후의 모폴로지를 측정한 결과를 나타낸다.
도 1에서 상기 자궁경부암 SiHa 세포는 상기 실시예 1의 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 1005-A 를 처리한 후, 24 시간 내지 72 시간 동안에는 모폴로지의 변화가 없었으나, 72 시간이 경과한 후에는 수축된 모습을 나타내는 것을 알 수 있다.
<실시예 3> 세포 독성 검사
공지의 방법 (Korba, B. E. et al., Use of a standardized cell culture assay to assess activities of nucleoside analogs against hepatitis B virus replication, Antiviral research, 19, 55-70, 1992)을 이용하여 본 발명의 유산균 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A 이 자궁경부암 SiHa 세포에 대해 나타내는 독성을 조사하였다.
자궁경부암 SiHa 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 3.6×105 개의 세포를 100㎕ 부피로 첨가하고 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양한 다음, 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A 를 5.1 × 107 cfu/ml 의 농도로 함께 접종하고 각각 24 시간, 48시간, 72 시간이 경과한 후 살아있는 세포의 수를 헤모사이토메타로 측정하여 세포 독성을 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 24 시간, 48시간, 72 시간에서 세포 독성이 각각 92, 95, 89% 로 측정되었으며, 이로 인해 본 발명의 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) 가 자궁경부암 SiHa 세포의 독성에는 영향을 미치지 않는다는 것을 확인할 수 있다.
<실시예 4> 인간 유두종 바이러스에 대한 항바이러스능 시험
<실시예 4-1> 총 RNA 분리
본 발명을 위해 사용한 총(Total) RNA 분리 방법은 다음과 같다.
총 RNA는 RNeasy mini Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 트리졸 용액(Tri-reagent; TR118, MRC co.) 추출 방법을 이용하여 분리하였다. 상기 실시예 1의 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A 와 24시간, 48시간 동안 혼합 배양된 자궁경부암 SiHa 세포와, 상기 비교예의 자궁경부암 SiHa 세포를 유발에 담아 액체 질소를 넣어 유봉을 이용하여 잘게 마쇄하고, 마쇄된 식물체 조직을 온도를 떨어뜨린 용기에 담고 트리졸 용액 1ml를 넣고 볼텍싱(vortexing)으로 고루 섞었다. 여기에 200㎕ 클로로포름(Chloroform)을 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 15분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리한 뒤, RNA를 함유하고 있는 수층을 채취하여 여기에 200㎕ 클로로포름을 첨가하고 혼합한 다음 실온에서 15분간 정치한 다음 4℃ 에서 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리한 뒤 수층을 채취하였다. 수득한 수층의 80% 정도 부피의 이소프로판올을 혼합하여 실온에서 20분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 20분간 원심분리하고, 침전물의 이소프로판올액을 건조시켜 1ml의 70% 에탄올을 넣어 침전물을 흔들어 세척한다. 70% 에탄올에 부양되어있는 침전물을 4℃에서 13000rpm으로 15분 동안 원심분리하여 상층액을 버리고 침전물의 70% 에탄올 액을 건조시켜 100㎕ 증류수로 녹여서 냉동보관한다.
<실시예 4-2> qRT-PCR 방법에 의한 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) 의 E6, E7 발현 억제여부 검출 실험
상기 실시예 4-1의 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A)와 24시간, 48시간동안 혼합 배양된 자궁경부암 SiHa 세포와 비교예로서 PBS 만을 처리한 자궁경부암 SiHa 세포의 추출한 총 RNA를 이용하여 qRT-PCR 방법으로 본 발명의 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A가 E6, E7 단백질 발현을 억제하는지 여부를 확인하였다.
각각의 단백질 발현 여부는 GAPDH 에 대하여 표준화 처리 되었으며, 각각의 단백질에 대한 정방향, 역방향 프라이머는 다음과 같다.
Primers Sequence (5'→3')
E6 -정방향 5’- GAC CCA GAA AGT TAC CAC AG-3’
E6 -역방향 5’- CAT AAA TCC CGA AAA GCA AAG-3’
E7 -정방향 5’- GGA GGA GGA TGA AAT AGA TGG-3’
E7 -역방향 5’- TGA GAA CAG ATG GGG CAC AC-3’
GAPDH - 정방향 5’- CTG CAC CAC CAA CTG CTT AG-3’
GAPDH - 역방향 5’- TTC TGG GTG GCA GTG ATG-3’
qRT-PCR 실시 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 상기 실시예의 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A)와 48 시간동안 혼합 배양된 자궁경부암 SiHa 세포에서는 E6, E7 단백질 발현이 유의하게 감소되며, 특히 E6 의 경우 24시간 배양후에도 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있다.
<실시예 4-3> immunoblotting 방법에 의한 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A 의 E6, E7 발현 억제여부 검출 실험
상기 실시예 1에서 제조한 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A)와 24시간, 48시간동안 혼합 배양된 자궁경부암 SiHa 세포와 비교예로서 PBS 만을 처리한 자궁경부암 SiHa 세포 시료를 대상으로 17.5％ 트리신 SDS-PAGE를 수행하였으며, PVDF 막에 전이하여 항-베타 아밀로이드 항체로 웨스턴 블럿을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) 의 경우 24시간, 48시간 동안 자궁경부암 SiHa 세포와 혼합 배양된 경우 E6, E7 발현량이 현저히 감소하는 것을 알 수 있다.
상기 변이 균주를 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) 로 명명하고 이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 2011년 9월 19일자로 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 12014 BP).
<실시예 5> 돌연변이 균주의 특성 분석
상기 실시예 1 에서 유도된 돌연 변이 균주의 특성을 분석하기 위하여 fingerprinting pattern 을 분석하였다.
BOXA1R primer, BOXA2R primer, ERIC1R primer, ERIC2 primer 를 사용한 경우를 각각 도 5 내지 도 8로 나타내었다. 도 5 내지 도 8에서 각각의 lane 이 나타내는 균주들은 다음 표 2와 같으며, 대조군으로 KCTC 3352 균주 및 보유 비피도박테리움 균주들을 사용하였다.
lane NO. 사용된 균주
1 Bifidobacterium adolescentis KCTC 3352
2 Bifidobacterium adolescentis SPM 0212
3 Bifidobacterium adolescentis SPM 0212-B
4 Bifidobacterium adolescentis SPM 0212-C
5 Bifidobacterium adolescentis SPM 0214
6 Bifidobacterium adolescentis SPM 0308
7 Bifidobacterium adolescentis SPM 1005
8 Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A
9 Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-B
10 Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-C
11 Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-D
12 Bifidobacterium adolescentis SPM 1307-A
13 Bifidobacterium adolescentis SPM 1307-B
14 Bifidobacterium adolescentis SPM 1307-C
15 Bifidobacterium adolescentis SPM 1601
16 Bifidobacterium adolescentis SPM 1604
17 Bifidobacterium adolescentis SPM 1605
18 Bifidobacterium adolescentis SPM 1606
19 Bifidobacterium adolescentis SPM 1608
도 5 내지 도 8에서 돌연변이 균주 Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A 내지 Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-D 는 원균주인 Bifidobacterium adolescentis SPM 1005 와는 다른 유전적 특성을 나타냄을 확인할 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC12014BP 20110919

Claims (12)

  1. 인간 유두종 바이러스 억제 활성을 갖는 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) (KCTC 12014 BP)
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) (KCTC 12014 BP) 는 인간 유두종 바이러스 HPV 16 타입에 대해 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) (KCTC 12014 BP)
  3. 제 1 항에 있어서,
    인간 유두종 바이러스의 E6 단백질 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) (KCTC 12014 BP)
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) (KCTC 12014 BP) 는 인간 유두종 바이러스의 E7 단백질 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) (KCTC 12014 BP)
  5. 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) (KCTC 12014 BP) 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) (KCTC 12014 BP) 는 인간 유두종 바이러스 HPV 16 타입에 대해 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물은 인간 유두종 바이러스의 E6 단백질 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물은 인간 유두종 바이러스의 E7 단백질 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 삭제
  10. 제 5 항에 있어서,
    상기 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가지는 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 제 5 항에 있어서,
    상기 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 및 필터충진제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제조에 사용되는 의약외품 조성물인 것을 특징으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 제 5 항에 있어서,
    상기 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1005-A (Bifidobacterium adolescentis SPM 1005-A) (KCTC 12014 BP) 는 생균, 건조균 또는 사균인 것을 특징으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물.
KR1020110105707A 2011-10-14 2011-10-17 인간 유두종 바이러스 억제 활성을 갖는 비피도박테리움 아돌레센티스 ｓｐｍ1005-ａ, 및 인간 유두종 바이러스 억제 활성을 갖는 비피도박테리움 아돌레센티스 ｓｐｍ1005-ａ 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물 KR101270493B1 (ko)

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