CN110498852A - 一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法。包括以下步骤：将3‑羟基‑邻苯二甲酸酐HP溶于二甲基亚飒DMSO中，得到饱和的HP溶液；将乳铁蛋白溶于pH8.5，0.1M磷酸钠溶液中，得到蛋白终浓度为20 mg/mL的蛋白溶液；再将上述HP溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，震荡混匀，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM，在温度为25℃的条件下，放置l小时，pH7.4 PBS超滤置换，再用0.45uM微孔滤膜抽滤除菌，4℃保存，加甘露醇冻干成粉，即得成品。本发明药物具有阻断HPV病毒入侵细胞、阻止病毒扩大感染、安全、稳定、成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法。
背景技术
乳多空病毒科(papovaviridae)的英文名源自乳头瘤病毒(papilloma virus)、多瘤病毒(polyoma virus)和猿猴空泡形病毒(similar vacuolating virus)三种，该病毒科包括乳头瘤病毒属(papillomavirus)和多瘤病毒属(polyomavirus)两个属，均为致瘤DNA病毒。乳头瘤病毒包括人乳头状瘤病毒及动物乳头状瘤病毒，已从多种动物及人类细胞中分离出来，具有种特异性的乳头瘤病毒已见于多种动物。由于乳头瘤病毒宿主范围很窄，命名常以宿主名称命名，如人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)；牛乳头瘤病毒(bovine papilloma virus，BPV)；犬口腔乳头瘤病毒(canine oral papillomatosisvirus，COPV)；多乳小鼠乳头瘤病毒(mastomys natalensis papilloma virus，MNPV)等。HPV在人类广泛传播，能引起人类皮肤和黏膜的多种良性乳头状瘤，在宫颈细胞学异常的患者中，不仅检出了高危型HPVl6，低危型HPV66也很常见，提示有必要进一步研究这些以往被认为是低危型的HPV是否可引起宫颈病变，它们的感染是引发组织恶性肿瘤尤其是宫颈癌的主要原因。
宫颈癌也称子宫颈癌，指发生在子宫阴道部及宫颈管的恶性肿瘤，是女性常见恶性肿瘤之一，发病率位于女性肿瘤的第二位。全世界每年大约有20万妇女死于这种疾病。发病原因目前尚不清楚，早婚、早育、多产及性生活紊乱的妇女有较高的患病率。宫颈癌早期症状多为接触性出务，阴道排液，液体为白色或血性或腥臭味。后期根据癌灶累及范围出现不同的继发性症状。癌肿压迫或累及输尿管时，可引起输尿管梗阻、肾盂积水及尿毒症；晚期可有贫血、恶病质等全身衰竭症状。目前，该疾病在全球每年新发病例约50万例。我国每年新发病例约13.5万，约占世界宫颈癌新发病例总数的1/4，死亡人数约为5万人。特别是近十年来，其发病率飙升，增长幅度高达68.8%，成为死亡率增长最快的疾病，居妇女癌症的首位。随着我国性开放程度的加深，宫颈癌的发病率及发病年龄可能将有明显上升及提前的趋势。因此，目前我国急需能够有效预防和控制 HPV 病毒感染的药物及生物制剂。
人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)属于乳头瘤病毒科的乳头瘤病毒属，为球形无包膜的双链DNA病毒，直径为52~55nm。病毒基因组为双链环状DNA，约7.8~8.0kb，分为早期区、晚期区和调节区。早期区编码与病毒复制、转录调控和细胞转化有关的蛋白(如E5，E6，E7)，晚期区编码主要壳体蛋白L1和次要壳体蛋白L2。本病毒不能在体外培养。100多个型，型间DNA的同源性低于50%。人乳头瘤病毒以人作为唯一宿主，感染人体皮肤组织和黏膜组织的上皮细胞，尤其集中在口腔、手脚和男女生殖器等部位。病毒与细胞的直接接触是 HPV 感染宿主必要的先决条件，当皮肤或黏膜表层的物理组织保护受损，导致组织细胞暴露于游离的成熟病毒，病毒就有机会通过这种上皮细胞的微创伤侵犯并进入细胞，这通常被认为是病毒生命周期的开始阶段，也是预防的最佳阶段。同样，当病毒成熟后也会从细胞中释放，从而感染新的细胞，在口腔、手脚及男女生殖器处造成更多的感染及病变，最后导致病情的扩大、恶化及最后免疫系统无法清除形成尖锐湿疣、宫颈糜烂、慢性宫颈炎甚至肿瘤。HPV对皮肤和黏膜上皮细胞有高度亲嗜性，核酸原位杂交方法在皮肤基底层细胞可以检测到病毒早期基因;晚期基因仅在分化的角质细胞中检测到。病毒复制能诱导上皮增生，表皮变厚，伴有棘层增生和某些程度表皮角化，在颗粒层常出现嗜碱性核内包涵体。上皮增生形成乳头状瘤，也称为疣。目前，在国际上能有效预防和控制 HPV 病毒感染的药物还相对缺乏，公认疗效显著的主要还是预防型的疫苗，临床证实 HPV 的疫苗几乎能100％地预防一些HPV 病毒株的感染，但是它并不能预防所有类型病毒株的感染，并且价格高昂。而在治疗上由于没有特效药因而采用的免疫调节药物由于普遍存在无法有效地预防HPV 感染、疗效不明确、价格昂贵等方面的缺陷而大大限制了其在临床上的使用，特别是在低收入的发展中国家。
HPV造成的损伤受免疫因子的影响，细胞介导的免疫较为重要。HPV感染后出现皮肤疣，持续较长时间后会自行消退;而免疫抑制患者疣及宫颈癌的发生率会增加。因此，现在国际国内都倾注了极大的热情在研发新型的对多种 HPV 毒株都具有预防及控制效应的药物及生物制剂上，但是一直没有突破性的进展。
本专利发明人之一的姜世勃教授是国际著名病毒学家，长期从事抗病毒药物的研究，其在国际上发现了第一个抗艾滋病病毒的C-多肽-SJ-2176，用于开发抗 HIV 药物- 恩夫韦肽 (Enfuvirtide,T-20)。Enfuvirtide在2003年被美国FDA批准上市成为全世界第一个多肽类HIV进入/融合抑制剂，该药物的发现被视为艾滋病药物研究领域的一个里程碑，姜世勃教授也因此开辟了多肽蛋白类病毒进入/ 融合抑制剂的新领域。病毒进入/融合抑制剂就是作用在病毒入侵靶细胞的第一阶段，阻断了病毒对细胞的感染，从而达到预防和控制病毒的效果，Enfuvirtide 在美国临床上使用的成功证明了该策略对治疗病毒所引发的疾病是非常有效的。本发明专利建立在姜世勃教授多年研究的基础上，是将预防及控制艾滋病病毒的成功经验运用到了对人乳头瘤病毒HPV的预防和控制上，经过实验检测该蛋白药物对HPV的感染具有显著的抑制活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法。
本发明的发明思路是：发明人利用多肽蛋白类病毒进入/融合抑制剂，在病毒入侵靶细胞的第一阶段，阻断了病毒对细胞的感染，从而达到预防和控制病毒的效果。使用一种活性酸酐来修饰一种分离和纯化的蛋白质表面带正电荷的氨基酸，从而使其具有阻断人乳头瘤病毒HPV进入和感染靶细胞的功能。
本发明是采用如下技术方案实现的：一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法。包括以下步骤：将3-羟基-邻苯二甲酸酐（3-hydroxyphthalicanhydride，缩写 HP）溶于二甲基亚飒DMSO中，得到饱和的HP溶液；将乳铁蛋白溶于pH8.5，0.1M磷酸钠溶液中，得到蛋白终浓度为20mg/mL的蛋白溶液；再将上述HP溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，震荡混匀，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM，在温度为25℃的条件下，放置l小时，pH 7.4 PBS超滤置换，再用 0.45uM微孔滤膜抽滤除菌，4℃保存，加甘露醇冻干成粉，即可制得成品。
所述的乳铁蛋白从牛乳中分离及纯化得到。
所述的乳铁蛋白用鸡血清蛋白OVA、兔血清蛋白RSA、猪血清白蛋白PSA、冷水鱼皮明胶G-FS、猪皮明胶G-PS代替。
所述的3-羟基-邻苯二甲酸酐用3-羟基-邻苯二甲酸酐
（3-hydroxyphthalicanhydride）的衍生物、琥珀酸酐（Succinic anhydride）、马来酸酐（maleic anhydride）酸酐代替。
所述的剂型可以是凝胶制剂、膏霜剂、喷雾剂、搽洗剂、盥洗剂。
本发明药物具有阻断HPV病毒入侵细胞、阻止病毒扩大感染、安全无毒副作用、稳定性高、成本低廉等显著优势，可用于开发成为以其为主要活性成分的预防和控制 HPV 感染的各种剂型，制备方法简单，易于推广。
具体实施方式
实验例1
一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法，包括以下步骤：
从牛乳中分离及纯化乳铁蛋白为主的稳定性蛋白质 ；
利用活性酸酐对分离纯化的蛋白质进行酸酐化，超滤置换再次纯化活性蛋白；
首先将 3-羟基-邻苯二甲酸酐（HP）溶于二甲基亚飒 DMSO 中，浓度达到饱和，然后将乳铁蛋白溶于pH8.5，0.1M 磷酸钠溶液中，使蛋白终浓度为20mg/mL，再将上述HP加入蛋白溶液中，震荡混匀，在温度为 25℃的条件下，放置l小时，pH7.4 PBS超滤置换，再用0.45uM微孔滤膜抽滤除菌，4℃保存，加甘露醇冻干成粉，然后按照现有方法制成凝胶剂。
实验例2
一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法，包括以下步骤：
首先将HP 溶于二甲基亚飒DMSO中，浓度达到饱和，然后将鸡血清蛋白OVA 溶于pH8.5，0.1M 磷酸钠溶液中，使蛋白终浓度为20mg/mL，再将上述HP 溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，震荡混匀，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM。在温度为25℃的条件下，放置1小时，pH7.4 磷酸缓冲溶液PBS超滤置换，再用0.45uM微孔滤膜抽滤除菌，4℃保存，加甘露醇冻干成粉，然后按照现有方法制成膏霜剂。
实验例3
一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法，包括以下步骤：
首先将HP 溶于二甲基亚飒DMSO中，浓度达到饱和(1.19M)，然后将兔血清蛋白RSA溶于pH8.5，0.1M 磷酸钠溶液中，使蛋白终浓度为20mg/mL，再将上述HP溶液分为五等份，每12min 加入蛋白溶液中，震荡混匀，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM。在温度为 25℃的条件下，放置1小时，pH7.4 磷酸缓冲溶液PBS 超滤置换，再用 0.45uM 微孔滤膜抽滤除菌，4℃保存，加甘露醇冻干成粉，然后按照现有方法制成喷雾剂。
实验例4
一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法，包括以下步骤：
首先将HP溶于二甲基亚飒DMSO中，浓度达到饱和 (1.19M)，然后将猪血清白蛋白PSA、冷水鱼皮明胶G-FS、或者猪皮明胶G-PS溶于pH8.5，0.1M 磷酸钠溶液中，使蛋白终浓度为20mg/mL，再将上述HP溶液分为五等份，每12min 加入蛋白溶液中，震荡混匀，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM。在温度为25℃的条件下，放置l小时，pH7.4磷酸缓冲溶液 PBS 超滤置换，再用0.45uM微孔滤膜抽滤除菌，4℃保存，加甘露醇冻干成粉，然后按照现有方法制成搽洗剂。
实验例5
一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法，包括以下步骤：
首先将3-羟基-邻苯二甲酸酐的衍生物溶于二甲基亚飒 DMSO 中，浓度达到饱和(1.19M)，然后将鸡血清蛋白OVA 溶于pH8.5，0.1M 磷酸钠溶液中，使蛋白终浓度为20mg/mL，再将上述3-羟基-邻苯二甲酸酐的衍生物溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，震荡混匀，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM。在温度为25℃的条件下，放置l小时，pH7.4磷酸缓冲溶液PBS超滤置换，再用0.45uM微孔滤膜抽滤除菌，4℃保存，加甘露醇冻干成粉，然后按照现有方法制成灌洗剂。
实验例6
一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法，包括以下步骤：
首先将琥珀酸酐溶于二甲基亚飒DMSO中，浓度达到饱和(1.19M)，然后将兔血清蛋白RSA溶于pH8.5，0.1M磷酸钠溶液中，使蛋白终浓度为20mg/mL，再将上述琥珀酸酐溶液分为五等份，每12min 加入蛋白溶液中，震荡混匀，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM。在温度为25℃的条件下，放置l小时，pH7.4 磷酸缓冲溶液PBS 超滤置换，再用0.45uM 微孔滤膜抽滤除菌，4℃保存，加甘露醇冻干成粉，然后按照现有方法制成凝胶剂。
实验例7
一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法，包括以下步骤：
首先将马来酸酐溶于二甲基亚飒DMSO中，浓度达到饱和(1.19M)，然后将猪血清白蛋白PSA、冷水鱼皮明胶G-FS、或者猪皮明胶G-PS 溶于pH8.5，0.1M 磷酸钠溶液中，使蛋白终浓度为20mg/mL，再将上述HP 溶液分为五等份，每12min 加入蛋白溶液中，震荡混匀，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM。在温度为25℃的条件下，放置l小时，pH7.4 磷酸缓冲溶液PBS超滤置换，再用0.45uM 微孔滤膜抽滤除菌，4℃保存，加甘露醇冻干成粉，然后按照现有方法制成膏霜剂。
实验例8 酸酐修饰蛋白浓度测定:
合成的酸酐修饰蛋白浓度按照BCA 蛋白浓度分析试剂盒的操作步骤测定，具体方法如下:
(1) 稀释BSA 蛋白标准品，使终浓度为0，25，125，250，500，750，1000，2000ug/mL，标准品的稀释与待测蛋白样品溶液相同;
(2) 分别将25ul 各浓度标准品和25ul 待测样品加入96 孔圆底细胞板中，复孔对照;
(3) 制备反应工作液，将ReagentA 与ReagentB 按50:1 比例混匀;
(4) 每孔200ul 反应工作液，轻柔震荡30s，混匀;
(5) 37℃孵育 30min，冷却至室温，680 型酶标仪测定OD562nm 吸光度;
(6) 绘制蛋白质浓度标准曲线，根据标准曲线，计算待测样品浓度。
实验例9 TNBS 法及p-HPG 法测定蛋白的酸酐修饰比率，及检测正电荷氨基酸赖氨酸和精氨酸残基的被修饰率
采用2，4，6 一三硝基苯磺酸(TNBS) 检测修饰后蛋白末端的赖氨酸残基被相应酸酐修饰的比率。
（1）系列稀释的待测酸配修饰蛋白样品与阴性对照未修饰的蛋白各25ul加入96孔圆底细胞培养板中，空白对照孔加入25ul/ 孔0.1M 磷酸钠溶液;
（2）25ul/ 孔的0.1M 四硼酸钠Na2B4O7: 与各待测样品室温混匀5min; 各孔加入10ul的，TNBS，室温混匀，5min。
（3）加入100ul/ 孔的终止液 (0.1M NaH2PO4; 和l.5mM Na2SO3)，终止反应，测OD420nm值，根据其与阴性对照蛋白OD 值差异，计算赖氨酸的修饰率。
（4）赖氨酸修饰率%=[1-(OD450nm样品-OD450nm空白)/(OD450nm阴性-OD450nm空白)]x100。
采用p-HPG 检测合成的修饰蛋白末端的精氨酸残基被相应酸酐修饰的比率。
（1）系列稀释的待测酸配修饰蛋白样品与阴性对照未修饰的蛋白各90ul加入96孔圆底细胞培养板中，空白对照孔加入90uL/ 孔0.1M磷酸钠溶液，调节各孔溶液pH 为9.0。
（2）10uL/ 孔 50Ml p-HPG， pH9.0，与各样品室温避光反应 90min。
（3）测0D340nm 值，计算精氨酸的修饰率。
（4） 精氨酸修饰率%=[1-(OD450nm样品 -OD450nm空白)/(OD450nm阴性-OD450nm空白)] x 100。
Claims (5)
1.一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法，其特征是包括以下步骤 ：
将3-羟基-邻苯二甲酸酐HP 溶于二甲基亚飒DMSO 中，得到饱和的 HP 溶液 ；将 乳铁蛋白溶于pH8.5，0.1M 磷酸钠溶液中，得到蛋白终浓度为 20mg/mL 的蛋白溶液；再将上述HP 溶液分为五等份，每12min 加入蛋白溶液中，震荡混匀，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM，在温度为25℃的条件下，放置l小时，pH 7.4 PBS超滤置换，再用0.45uM 微孔滤膜抽滤除菌，4℃保存，加甘露醇冻干成粉，即可按照常规方法制成各种剂型的成品。
2.根据权利要求1所述的一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法，其特征是所述的乳球蛋白从牛乳中分离及纯化得到。
3.根据权利要求1所述的一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法，其特征是所述的乳铁蛋白用鸡血清蛋白OVA、兔血清蛋白RSA、猪血清白蛋白PSA、冷水鱼皮明胶G-FS、猪皮明胶G-PS 代替。
4.根据权利要求1或2所述的一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法，其特征是所述的3-羟基-邻苯二甲酸酐用3-羟基-邻苯二甲酸酐的衍生物、琥珀酸酐、马来酸酐代替。
5.根据权利要求1或2所述的一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白的制备方法，其特征是所述的剂型为凝胶制剂、膏霜剂、喷雾剂、搽洗剂、盥洗剂。
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