CN112999358A - 一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白、其制备方法及其应用 - Google Patents

一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白、其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白、其制备方法及其应用。所述的生物活性蛋白为酸酐化乳铁蛋白、酸酐化乳清蛋白或酸酐化组蛋白，所述的酸酐化是采用4‑羟基苯酐、4‑羟基苯酐的衍生物、琥珀酸酐或马来酸酐对蛋白进行修饰而得。本发明的生物活性蛋白具有阻断HPV病毒入侵细胞、阻止病毒扩大感染、抗菌、抗氧化、安全、稳定、便于保存和运输、成本低等优点。

Description

一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白、其制备 方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白、其制备方法及其应用，属于医药技术领域。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human papilloma viruses,HPV)是少数几种明确与人类癌症相关的病毒之一,其持续感染是导致宫颈癌发生的重要危险因素。据统计，在所有宫颈癌的患者中，超过99％的病例可被检测到高危型HPV DNA。大约50％以上性生活活跃的女性一生中都曾有过HPV感染，持续性高危型HPV感染者患宫颈癌的风险增加100-300倍。因此，及早干预和清除HPV感染对于宫颈病变CIN的预防非常重要。目前针对HPV感染的治疗较多，其中局部用药为常用方法之一，药物种类繁多，但临床治愈率均不理想。
目前已有商品化的二价(HPV-16、18型)或四价HPV疫苗(HPV-6、11、16和18型)，可用于预防同型别病毒感染。但疫苗价格过高，特定疫苗对其他型HPV的疫苗无交叉免疫。目前上市销售预防和治疗人乳头瘤病毒感染的药物和生物制剂较少，仍需开发新的药物和生物制剂。
中国专利201510537630.7提供了一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物及其制备方法，此发明公开了一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物，包括0.01重量份的LK蛋白、1.5重量份的卡拉胶、5重量份的卡波姆、50重量份的甘油、0.1重量份的尼泊金乙酯。该组合药物为凝胶剂、栓剂、敷料中一种。该专利中所用的LK蛋白是通过3-羟基-邻苯二甲酸酐对乳铁蛋白进行修饰，由于3-羟基-邻苯二甲酸酐空间位阻大，活性较低，对乳铁蛋白的修饰效果不佳，影响抗HPV病毒的效果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白、其制备方法及其应用。
本发明的技术思路如下：酸酐化乳铁蛋白来源于牛奶蛋白，经过酸酐化修饰后得到的乳铁蛋白表面带有更多的负电荷，与HPV衣壳蛋白的L1区的C端L2区的N端的正电荷区域相结合，阻断病毒侵入宿主细胞内的过程，从而达到阻断HPV感染的目的。发明人通过大量研究工作，意外发现了一种对乳铁蛋白的修饰效果更佳的酸酐，得到的酸酐化乳铁蛋白具有更好的抗HPV病毒的效果。
本发明的技术方案如下：
一种用于预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白，所述的生物活性蛋白为酸酐化乳铁蛋白、酸酐化乳清蛋白或酸酐化组蛋白，所述的酸酐化是采用4-羟基苯酐、4-羟基苯酐的衍生物、琥珀酸酐或马来酸酐对蛋白进行修饰而得。
优选地，
本发明中，用于预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白，为4-羟基苯酐修饰的乳铁蛋白。
本发明中，所述的4-羟基苯酐修饰的乳铁蛋白为酸酐化乳铁蛋白冻干粉，所述的酸酐化乳铁蛋白冻干粉的制备方法如下：在温度为25-50℃的条件下，将4-羟基苯酐溶于二甲基亚砜中，得到饱和的4-羟基苯酐溶液；将乳铁蛋白溶于0.1M磷酸三钠溶液中，得到终浓度为30-80mg/mL的蛋白溶液；将上述4-羟基苯酐溶液加入蛋白溶液中，搅拌混匀，4-羟基苯酐在反应体系中的终浓度为30-80mM，静置反应2小时；得到酸酐化乳铁蛋白；用0.45uM滤膜抽滤除菌后使用pH 7.2磷酸盐缓冲液进行超滤置换纯化(所用超滤膜截留分子量为10KD)或离子交换纯化；再用0.45uM微孔滤膜抽滤除菌，加入保护剂使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，收集冻干粉，即得酸酐化乳铁蛋白冻干粉。
本发明中，所述蛋白冻干步骤包括以下阶段：预冻阶段：隔板温度下降到-70℃，保持时间6h；一次升华阶段：保持12h；二次升华阶段：保持7h。所述的冻干保护剂为甘露醇、蔗糖、葡萄糖、海藻糖或果糖。
本发明还提供了上述生物活性蛋白在制备预防和治疗人乳头瘤病毒感染药物中的应用。应用时，可以将上述生物活性蛋白制成制剂进行应用，所述的制剂中含有药学上有效剂量的生物活性蛋白和药学上可接受的辅料或辅助性成分。
本发明中，所述的制剂可以为液体制剂、膏剂、凝胶剂或栓剂。
例如，为了制备用于外用给药的固体剂型,可以使用卡波姆、卡拉胶、麦芽糊精、羟丙基甲基纤维素、明胶等本领域已知的固体载体。另外，还可以使用和活性成分或已使用的成分相容的任何其它通常用于防腐等目的的载体。
为了制备用于外用给药的液体剂型，可以使用水、乙醇、甘油、丙二醇等以及本领域己知的液体载体。
优选地，
所述的制剂为敷料，所述的生物活性蛋白为4-羟基苯酐修饰的酸酐化乳铁蛋白，所述敷料的组分及其重量百分含量如下：酸酐化乳铁蛋白冻干粉0.01-0.1％，卡波姆9341-2％，甘油0.5％-2％以及余量的纯化水。
所述的敷料的制备方法，包括如下步骤：
1)将卡波姆放入纯化水中搅拌，静置溶解。
2)将酸酐化乳铁蛋白加入适量纯化水溶解后，加入到步骤1)的溶液中，再加入甘油搅拌20-60分钟混匀后，加入纯化水搅拌30min，即得敷料。
本发明的技术效果如下：
本发明生物活性蛋白具有阻断HPV病毒入侵细胞、阻止病毒扩大感染、安全、稳定、便于保存和运输、成本低等优点。
本发明的技术方案，与现有技术，即申请号为201510537630.7、专利名称为一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物相比，具有以下优势:
1)本方案在对乳铁蛋白进行修饰的时候，对加入乳铁蛋白的浓度进行了优化，确保乳铁蛋白的负电荷量最大。
2)本方案意外发现在对乳铁蛋白进行修饰时采用4-羟基苯酐对蛋白进行修饰，相对于3-羟基邻苯二甲酸酐，4-羟基苯酐空间位阻小，活性提高，而且来源更广，价格更低，对乳铁蛋白的修饰效果更好。
3)本方案采用冻干的方法保存酸酐化修饰蛋白。由于酸酐化修饰蛋白溶液在常温或者4℃保存都易降解，难以长期保存。本方案采用冻干的方法保存酸酐化修饰蛋白，解决了蛋白活性长期保存的问题。
4)本方案采用超滤置换纯化或离子交换纯化的方法纯化蛋白。现有专利采用透析的方法纯化蛋白，不仅一次处理的蛋白量小，处理时间长，不适合工业化生产，而且不能够根据实际需要，得到不同浓度的纯化蛋白。本方案采用超滤置换纯化或离子交换纯化的方法进行蛋白纯化克服了以上缺点，更有利于工业化生产。
综上，本发明所述的蛋白制备工艺简单、稳定性好、效果显著、安全可靠，易于推广。所述敷料含有卡波姆，可将失活的HPV吸附、包裹排出体外，并加快受损、糜烂组织快速修复与再生，促进愈合。适用于隔离阻断HPV感染，促进受损、糜烂组织的愈合，对宫颈癌的发生有预防、治疗作用。
附图说明
图1为采用3-羟基邻苯二甲酸酐得到的修饰蛋白电位检测结果。
图2为采用4-羟基苯酐修饰得到的修饰蛋白电位检测结果。
图3为Anti HPV E7抗体检测结果。其中，1正常Hela细胞样；2为1mg/ml样品24hr细胞总蛋白样；3为1mg/ml样品48hr细胞总蛋白样；4为0.5mg/ml样品24hr细胞总蛋白样；5为0.5mg/ml样品48hr细胞总蛋白样；6为0.25mg/ml样品24hr细胞总蛋白样；7为0.25mg/ml样品48hr细胞总蛋白样。
图4为Anti HPV 18E7抗体检测结果。其中，1正常Hela细胞样；2为1mg/ml样品24hr细胞总蛋白样；3为1mg/ml样品48hr细胞总蛋白样；4为0.5mg/ml样品24hr细胞总蛋白样；5为0.5mg/ml样品48hr细胞总蛋白样；6为0.25mg/ml样品24hr细胞总蛋白样；7为0.25mg/ml样品48hr细胞总蛋白样。
具体实施方式
本发明中，涉及到的材料来源说明如下：
乳铁蛋白为外购，CAS号为146897-68-9。
实施例1制备酸酐化乳铁蛋白
本实施例中，酸酐化乳铁蛋白的制备包括以下步骤：在温度为25℃的条件下，将4-羟基苯酐溶于二甲基亚砜中，得到饱和的4-羟基苯酐溶液；将乳铁蛋白溶于0.1M磷酸三钠溶液中，得到终浓度为30mg/mL的蛋白溶液；将上述4-羟基苯酐溶液加入蛋白溶液中，搅拌混匀，4-羟基苯酐在反应体系中的终浓度为60mM，静置反应2小时；得到酸酐化乳铁蛋白；用0.45uM滤膜抽滤除菌后使用pH 7.2磷酸盐缓冲液进行超滤置换纯化，所用超滤膜截留分子量为10KD；再用0.45uM微孔滤膜抽滤除菌，加入保护剂甘露醇，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，收集冻干粉，即得酸酐化乳铁蛋白冻干粉。
蛋白冻干步骤包括以下阶段：预冻阶段：隔板温度下降到-70℃，保持时间6h；一次升华阶段：保持12h；二次升华阶段：保持7h。
实施例2制备酸酐化乳铁蛋白
在温度为35℃的条件下，将4-羟基苯酐溶于二甲基亚砜中，得到饱和的4-羟基苯酐溶液；将乳铁蛋白溶于0.1M磷酸三钠溶液中，得到终浓度为50mg/mL的蛋白溶液；将上述4-羟基苯酐溶液加入蛋白溶液中，搅拌混匀，4-羟基苯酐在反应体系中的终浓度为80mM，静置反应2小时；得到酸酐化乳铁蛋白；用0.45uM滤膜抽滤除菌后使用pH 7.2磷酸盐缓冲液进行超滤置换纯化，所用超滤膜截留分子量为10KD；再用0.45uM微孔滤膜抽滤除菌，加入保护剂海藻糖使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，收集冻干粉，即得酸酐化乳铁蛋白冻干粉。
蛋白冻干步骤包括以下阶段：预冻阶段：隔板温度下降到-70℃，保持时间6h；一次升华阶段：保持12h；二次升华阶段：保持7h。
实施例3制备酸酐化乳铁蛋白
在温度为50℃的条件下，将4-羟基苯酐溶于二甲基亚砜中，得到饱和的4-羟基苯酐溶液；将乳铁蛋白溶于0.1M磷酸三钠溶液中，得到终浓度为80mg/mL的蛋白溶液；将上述4-羟基苯酐溶液加入蛋白溶液中，搅拌混匀，4-羟基苯酐在反应体系中的终浓度为80mM，静置反应2小时；得到酸酐化乳铁蛋白；用0.45uM滤膜抽滤除菌后使用pH 7.2磷酸盐缓冲液进行超滤置换纯化，所用超滤膜截留分子量为10KD；再用0.45uM微孔滤膜抽滤除菌，加入保护剂蔗糖使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，收集冻干粉，即得酸酐化乳铁蛋白冻干粉。
蛋白冻干步骤包括以下阶段：预冻阶段：隔板温度下降到-70℃，保持时间6h；一次升华阶段：保持12h；二次升华阶段：保持7h。
实施例4制备酸酐化乳铁蛋白
在温度为25℃的条件下，将4-羟基苯酐溶于二甲基亚砜中，得到饱和的4-羟基苯酐溶液；将乳铁蛋白溶于0.1M磷酸三钠溶液中，得到终浓度为30mg/mL的蛋白溶液；将上述4-羟基苯酐溶液加入蛋白溶液中，搅拌混匀，4-羟基苯酐在反应体系中的终浓度为30mM，静置反应2小时；得到酸酐化乳铁蛋白；用0.45uM滤膜抽滤除菌后使用pH 7.2磷酸盐缓冲液进行离子交换纯化；再用0.45uM微孔滤膜抽滤除菌，加入保护剂葡萄糖使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，收集冻干粉，即得酸酐化乳铁蛋白冻干粉。
蛋白冻干步骤包括以下阶段：预冻阶段：隔板温度下降到-70℃，保持时间6h；一次升华阶段：保持12h；二次升华阶段：保持7h。
实施例5制备预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白敷料
本实施例中，预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白敷料，组分及重量百分含量如下：酸酐化乳铁蛋白冻干粉0.01％，卡波姆934 1％、甘油2％以及余量的纯化水。
制备方法，包括如下步骤：
1)将卡波姆放入纯化水中搅拌，静置溶解。
2)将实施例1制备的酸酐化乳铁蛋白冻干粉加入适量纯化水溶解后，然后加入到步骤1)的溶液中，再加入甘油搅拌20分钟混匀后，加入纯化水搅拌30min，即得敷料。
实施例6制备预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白敷料
本实施例中，预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白敷料，组分及重量百分含量如下：酸酐化乳铁蛋白冻干粉0.05％，卡波姆934 1％、甘油1.5％以及余量的纯化水。
制备方法，包括如下步骤：
1)将卡波姆放入纯化水中搅拌，静置溶解。
2)将实施例3制备的酸酐化乳铁蛋白冻干粉加入适量纯化水溶解后，然后加入到步骤1)的溶液中，再加入甘油搅拌20分钟混匀后，加入纯化水搅拌30min，即得敷料。
实施例7制备预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白敷料
本实施例中，预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白敷料，组分及重量百分含量如下：酸酐化乳铁蛋白冻干粉0.1％，卡波姆934 1％、甘油2％以及余量的纯化水。
制备方法，包括如下步骤：
1)将卡波姆放入纯化水中搅拌，静置溶解。
2)将实施例2制备的酸酐化乳铁蛋白冻干粉加入适量纯化水溶解后，然后加入到步骤1)的溶液中，再加入甘油搅拌20分钟混匀后，加入纯化水搅拌30min，即得敷料。
实施例8测定酸酐化乳铁蛋白浓度
将实施例1-4第一次纯化后未冻干的酸酐化乳铁蛋白浓度按照BCA蛋白浓度分析试剂盒(购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司)的操作步骤测定，具体方法如下:
(1)稀释BSA蛋白标准品，使终浓度为0，0.0625，0.125，0.25，0.5，1，1000，2ug/ul，标准品的稀释与待测蛋白样品溶液相同；
(2)将稀释好的BSA标准品和待测蛋白样品(原液或稀释液)各100ul分别加到作好标记的试管中。
(3)制备反应工作液，将BCA-A(A液)与BCA-B(B液)按照50:1的体积比，配置BCA工作液，充分混匀。
(4)向每个试管中各加入2mlBCA工作液，充分混匀，充分混匀，37℃水浴中孵育30分钟，将各管冷却至室温，须在3-5分钟内完成检测。
(5)用分光光度计在562nm处，测定每个样品及BSA标准品的吸光值，同时做好记录。
绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。
将实施例1-4中的蛋白按以上方法检测浓度，结果见下表：
表1：纯化后的蛋白浓度
蛋白浓度mg/ml
实施例1 25.34mg/ml
实施例2 26.32mg/ml
实施例3 26.83mg/ml
实施例4 25.59mg/ml
通过以上结果可以发现通过超滤置换纯化或离子交换纯化，能够获得浓度较高的蛋白可供冻干处理。
实施例9酸酐化乳铁蛋白Zeta电位检测
将实施例1-4冻干后的酸酐化乳铁蛋白配制成1mg/ml的蛋白溶液，用MALVERN ZEN3600仪器检测其Zeta电位。实施例1-4中的蛋白检测结果如下表：
表2：酸酐化乳铁蛋白电位
Zeta电位(Mv)
实施例1 -46.6
实施例2 -48
实施例3 -46.2
实施例4 -46.1
未进行酸酐化修饰乳铁蛋白的电位通常为4.6Mv。
采用其他酸酐进行修饰，如3-羟基邻苯二甲酸酐进行酸酐化修饰乳铁蛋白的电位通常为-36Mv。
通过以上结果可以发现，通过采用4-羟基苯酐酸酐化修饰乳铁蛋白获得更多的负电荷，电位更低。
实施例10酸酐化乳铁蛋白稳定性检测
将实施例1的酸酐化乳铁蛋白按冻干后和未冻干分别保存12个月后，分别检测蛋白浓度，结果如下：
表3：蛋白浓度检测结果
蛋白浓度mg/ml
酸酐化乳铁蛋白冻干后 24.32
酸酐化乳铁蛋白未冻干后 5.24
通过以上结果可以发现采用冻干方法将酸酐化修饰乳铁蛋白保存12个月后蛋白浓度基本没有变化，稳定性更好。
将实施例1的酸酐化乳铁蛋白按冻干后和未冻干分别保存12个月后，再配制成1mg/ml的蛋白溶液，分别进行电位检测：
其中，酸酐化乳铁蛋白冻干后电位检测结果如下表：
表4：冻干蛋白电位检测结果
Zeta电位(Mv)
实施例1 -46
其中，未冻干电位后检测结果如下表：
表5：未冻干蛋白电位检测结果
Zeta电位(Mv)
实施例1 -42.2
通过以上结果可以发现采用冻干方法将酸酐化修饰乳铁蛋白保存12个月后，电位基本没有变化，稳定性更好。
实施例11 4-羟基苯酐和3-羟基邻苯二甲酸酐对蛋白的修饰比较
按照实施例1分别采用4-羟基苯酐和3-羟基邻苯二甲酸酐进行酸酐化修饰后，将得到的冻干粉，分别配制成1mg/ml的蛋白溶液分别进行电位检测，结果如图1和图2所示。
从图1中可以看出，采用3-羟基邻苯二甲酸酐进行酸酐化修饰后的修饰蛋白杂峰较多，冻干粉Zeta电位为-36Mv。
从图2中可以看出，采用4-羟基苯酐进行酸酐化修饰后的修饰蛋白杂峰较少，得到的冻干粉负电荷为--46.2Mv。
结论：采用4-羟基苯酐得到的修饰蛋白杂峰更少，所含负电荷更多，电位更低。
实施例12乳铁蛋白及酸酐化修饰乳铁蛋白抑菌活性的测定
将斜面菌株接种肉汤蛋白胨培养液扩培16～20h，营养琼脂培养基平板计数，调整菌悬液浓度为106～108CFU/ml。在营养琼脂培养基上接种上述菌株幼龄菌菌悬液，涂布均匀。在培养皿中央放置无菌牛津杯，在杯内加入0.1ml经过无菌微滤的不同稀释度的乳铁蛋白和实施例1的酸酐化修饰乳铁蛋白溶液(pH为7.0)，以无菌水为对照。培养皿置于37℃恒温培养箱内培养24h后，测量抑菌圈直径大小(mm)。大于对照组抑菌圈直径(8mm)的最低样品浓度为最低抑菌浓度(MIC，μg/ml)。
表6乳铁蛋白对不同微生物抑菌效果产生的抑菌圈直径(mm)
Figure BDA0002961301420000101
表7酸酐化修饰乳铁蛋白对不同微生物抑菌效果产生的抑菌圈直径(mm)
Figure BDA0002961301420000102
可以发现乳铁蛋白本身就具有广谱抗菌、抗氧化作用，对许多微生物，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性需氧菌和厌氧菌及一些真菌，都具有不同程度的抑制和杀灭作用，采用4-羟基苯酐进行酸酐化修饰后依然保持良好的抗菌效果。
实施例13酸酐化修饰乳铁蛋白抗HPV活性检测
(1)培养Hela细胞：将培养好的Hela细胞(购自北纳创联生物科技有限公司)均匀的铺在60mm的细胞培养皿中
(2)将实施例1制得的酸酐化乳铁蛋白冻干粉加纯水配置成1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml的浓度。
(3)加样：每细胞培养皿加入3毫升的步骤2)中所制备的不同浓度的酸酐化乳铁蛋白冻干粉样品；
(4)收集细胞：24小时收集一次细胞，并提取细胞总蛋白，48小时收集一次细胞，并提取细胞总蛋白；
(5)蛋白质免疫印迹分析：上样、跑胶、转膜分别用Papillomavirus 16E7抗体(购自Abcam)和Anti HPV 18E7抗体(购自Abcam)孵育反应。
结果如图3和图4所示。
图3为Anti HPV 16E7抗体检测结果。其中，1正常Hela细胞样；2为1mg/ml样品24hr细胞总蛋白样；3为1mg/ml样品48hr细胞总蛋白样；4为0.5mg/ml样品24hr细胞总蛋白样；5为0.5mg/ml样品48hr细胞总蛋白样；6为0.25mg/ml样品24hr细胞总蛋白样；7为0.25mg/ml样品48hr细胞总蛋白样。
图4为Anti HPV 18E7抗体检测结果。其中，1正常Hela细胞样；2为1mg/ml样品24hr细胞总蛋白样；3为1mg/ml样品48hr细胞总蛋白样；4为0.5mg/ml样品24hr细胞总蛋白样；5为0.5mg/ml样品48hr细胞总蛋白样；6为0.25mg/ml样品24hr细胞总蛋白样；7为0.25mg/ml样品48hr细胞总蛋白样。
可以看出，在加入1mg/ml的酸酐化乳铁蛋白冻干粉反应24h后，就检测不到HPV16E6蛋白和HPV 18E7蛋白的表达，这表明在加入1mg/ml的酸酐化乳铁蛋白冻干粉后，HPV病毒外壳蛋白就不能够正常合成，说明酸酐化乳铁蛋白对HPV 16和HPV 18有抑制作用。
实施例14 4-羟基苯酐修饰乳铁蛋白和3-羟基邻苯二甲酸酐修饰乳铁蛋白抗病毒活性比较
1、构建HPV假病毒
将HPV L2相关基因进行密码子优化，利用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增，克隆到真核细胞表达载体，然后进行酶切和测序鉴定，形成稳定表达的pHPV6、pHPV16、pHPV18的表达载体。将测序鉴定正确的三个表达载体质粒和报告质粒pN31-EGFP大量扩增备用。所用表达载体质粒和报告质粒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
将293FT细胞(购自北纳创联生物科技有限公司)铺于96孔细胞培养板,12h后将pHPV6、pHPV16、pHPV18表达质粒、pN31-EGFP表达质粒按比例混合,以不同的用量加入0.25mol/L CaCl2溶液中,将质粒的CaCl2溶液滴加至等体积2×HeBS(pH＝6.97)溶液中，混合均匀,静置5min后将混合液加至预铺的293FT细胞孔中,12h后更换培养基.转染48h后,收集各孔细胞,用相同体积的裂解液在37℃条件下裂解16h,收集上清即为假病毒悬液,分装,置于-80℃,备用。
2、病毒滴度测定
将HPV假病毒悬液进行连续10倍的稀释，从10-1到10-6，去除96孔中的培养基,加入50微升假病毒稀释液,再加入5微升正常培养基，37℃、5％CO2继续培养72h,取50微升培养液上清，利用默克碱性磷酸酶检测试剂盒检测，以此计算TCID50 o
3、4-羟基苯酐修饰乳铁蛋白和3-羟基邻苯二甲酸酐修饰乳铁蛋白对HPV6、HPV16和HPV18的抑制活性检测
将293FT细胞传代至96孔板,每孔细胞数为1X105个,37℃、5％CO2培养8h。分别将100TCID50的HPV6、HPV16、HPV18假病毒(50M)与不同浓度的按照实施例1制备的4-羟基苯酐修饰乳铁蛋白冻干粉溶液和3-羟基邻苯二甲酸酐修饰乳铁蛋白冻干粉溶液进行孵育，37℃孵育30min。去除96孔板中的培养基,加入上述孵育后的混合物,37℃、5％CO2继续培养12小时，更换新鲜培养基,培养72小时后，取50M培养液上清液,利用默克碱性磷酸酶检测试剂盒检测，利用SPSS 25计算4-羟基苯酐修饰乳铁蛋白和3-羟基邻苯二甲酸酐修饰乳铁蛋白的IC50(半数抑制浓度)。结果见表10。
表10 4-羟基苯酐修饰乳铁蛋白和3-羟基邻苯二甲酸酐修饰乳铁蛋白抗HPV的活性
Figure BDA0002961301420000121
Figure BDA0002961301420000131
可以看出，4-羟基苯酐修饰乳铁蛋白对HPV6、HPV 16和HPV 18的抑制作用明显优于3-羟基邻苯二甲酸酐修饰乳铁蛋白的作用效果。
实施例15
将本发明的预防和治疗人乳头瘤病毒感染的敷料进行功效实验。
具体如下：
方法与资料
收集2018年1月-2018年6月间在就诊的患者，选取HPV高危感染合并宫颈CINⅠ患者160例，随机分为试验组和对照组，试验组80例，患者年龄(18-60)岁。对照组80例，患者年龄(18-58)岁。两组年龄和宫颈细胞学异常率比较，差异均无统计学意义。
纳入标准：
(1)年满18岁且自愿参与本次研究的女性；
(2)有过性生活的女性；
(3)经诊断符合宫颈炎的患者；
(4)经镜检和活检确诊为宫颈上皮内瘤变患者；
(5)经检查为高危型HPV-DNA阳性患者；
(6)近三个月内没接受过任何治疗的患者。
剔除标准：
(1)妊娠期和哺乳期妇女；
(2)急性生殖道炎症；
(3)恶性肿瘤和其他影响机体免疫状况的疾病。
试验组采用实施例5制备的抗HPV阴道液体敷料(3g/支)阴道给药，每次1支，隔日1次(睡前使用)，9次为1个疗程，连用3个疗程。避开经期使用。
对照组未用任何药物。
两组均于用药后进行宫颈脱落细胞学检查和HPV检测。
试验结果：
2.1、两组患者HPV感染分型，详见表12。
表12两组患者HPV感染情况(n)
组别 16型 18型 58型 56型 其它亚型
试验组 25(12) 11(6) 12(7) 10(8) 22(12)
对照组 23(10) 7(3) 15(7) 8(4) 27(11)
注：表中括号内数字为合并感染其它型别病毒的病例数。
2.2、两组患者HPV清除率比较
用药治疗后3个月随访两组患者共160例无失访病例；研究组HPV清除率(92.5％)与对照组HPV自然转阴率(36.25％)比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，详见表13。
组别 例数 治愈 有效 无效 总有效率
试验组 80 41 33 6 92.50
对照组 80 14 15 51 36.25
表13两组患者HPV清除率比较(n，％)
2.3、两组患者宫颈脱落细胞学转阴率比较
研究组中HPV合并宫颈细胞学ASCUS/LSIL者26例，对照组HPV合并宫颈细胞学ASCUS/LSIL者20例。用药治疗后6个月复查，试验组宫颈脱落细胞学检查转阴率(80.77％)优于对照组(30.00％)，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，详见表14。
表14两组TCT检查转阴结果比较(n，％)
组别 例数 转阴例数 转阴率
试验组 26 21 80.77
对照组 20 6 30.00
2.4、不良反应
试验组在用药期间无不良反应发生，依从性好。需再次取检的患者其病理分级无升级加重病例。
临床试验结论：本发明所涉及的液体敷料治疗高危型HPV感染疗效显著，能明显改善临床症状，尤其对分泌物多、性交后出血、宫颈糜烂等症状改善显著，尤为重要的是能明显提高HPV转阴率，临床应用安全可靠，无明显毒副作用及不良反应。抗HPV阴道液体敷料可以改善阴道微环境、减轻阴道炎性反应，高效快速非特异性杀HPV病毒，不会引起病毒变异，不会引起阴道内环境的改变，消除HPV感染，预防宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的发生，提高局部免疫功能。
实施例16安全性检测
对采用实施例5酸酐化修饰乳铁蛋白制备的敷料进行安全性检测，按照GB/T1688.10-2017规定的方法进行检测，敷料细胞毒性细胞存活率为91.4％，阴道刺激指数为3.1，无皮肤致敏反应。

Claims (10)

1.一种用于预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白，其特征在于，所述的生物活性蛋白为酸酐化乳铁蛋白、酸酐化乳清蛋白或酸酐化组蛋白，所述的酸酐化是采用4-羟基苯酐、4-羟基苯酐的衍生物、琥珀酸酐或马来酸酐对蛋白进行修饰而得。
2.根据权利要求1所述的生物活性蛋白，其特征在于，所述的生物活性蛋白为4-羟基苯酐修饰的乳铁蛋白。
3.根据权利要求2所述的生物活性蛋白，其特征在于，所述的4-羟基苯酐修饰的乳铁蛋白为酸酐化乳铁蛋白冻干粉，所述的酸酐化乳铁蛋白冻干粉的制备方法如下：在温度为25-50℃的条件下，将4-羟基苯酐溶于二甲基亚砜中，得到饱和的4-羟基苯酐溶液；将乳铁蛋白溶于0.1M磷酸三钠溶液中，得到终浓度为30-80mg/mL的蛋白溶液；将上述4-羟基苯酐溶液加入蛋白溶液中，搅拌混匀，4-羟基苯酐在反应体系中的终浓度为30-80mM，静置反应2小时；得到酸酐化乳铁蛋白；用0.45uM滤膜抽滤除菌后使用pH 7.2磷酸盐缓冲液进行超滤置换纯化(所用超滤膜截留分子量为10KD)或离子交换纯化，；再用0.45uM微孔滤膜抽滤除菌，加入保护剂使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，收集冻干粉，即得酸酐化乳铁蛋白冻干粉。
4.根据权利要求3所述的生物活性蛋白，其特征在于，所述蛋白冻干步骤包括以下阶段：预冻阶段：隔板温度下降到-70℃，保持时间6h；一次升华阶段：保持12h；二次升华阶段：保持7h。
5.根据权利要求3所述的生物活性蛋白，其特征在于，所述的冻干保护剂为甘露醇、蔗糖、葡萄糖、海藻糖或果糖。
6.如权利要求1-5中任意一项所述的生物活性蛋白在制备预防和治疗人乳头瘤病毒感染药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将如权利要求1-5中任意一项所述的生物活性蛋白制成制剂应用，所述的制剂中含有药学上有效剂量的生物活性蛋白和药学上可接受的辅料或辅助性成分。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的制剂为液体制剂、膏剂、凝胶剂或栓剂。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的制剂为敷料，所述的生物活性蛋白为4-羟基苯酐修饰的酸酐化乳铁蛋白，所述敷料的组分及其重量百分含量如下：酸酐化乳铁蛋白冻干粉0.01-0.1％，卡波姆934 1-2％，甘油0.5％-2％以及余量的纯化水。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的敷料的制备方法，包括如下步骤：
1)将卡波姆放入纯化水中搅拌，静置溶解。
2)将酸酐化乳铁蛋白加入适量纯化水溶解后，加入到步骤1)的溶液中，再加入甘油搅拌20-60分钟混匀后，加入纯化水搅拌30min，即得敷料。
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