CN113018283A - Metformin在抑制牛病毒性腹泻病毒感染中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供Metformin在制备防治牛肠道病毒感染药物中的应用。本发明提供的化合物Metformin能够有效抑制牛肠道病毒病毒的增殖，经实验证明，使用Metformin预处理MDBK细胞能显著抑制BVDV mRNA和dsRNA积累、病毒颗粒形成，CPE现象明显减弱，Metformin对MDBK细胞的最终使用10mM效果较优，使用Metformin灌胃BALB/c小鼠后BVDV攻毒，Metformin能够显著减少小鼠内脏组织中BVDV mRNA含量，通过病理切片观察Metformin能有效缓解BVDV感染引起的组织病变，表明Metformin抑制BVDV在胞内及小鼠体内的复制，Metformin在抗病毒方面具有高效性；Metformin具有开发成预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物的前景，为Metformin开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗牛肠道病毒药物奠定实验基础并提供新的视野。

Description

Metformin在抑制牛病毒性腹泻病毒感染中的用途

技术领域

本发明属于Metformin用途的技术领域，具体地，本发明涉及Metformin在抑制牛病毒性腹泻病毒感染中的用途的技术领域。

背景技术

牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrheavirus，BVDV)引起的牛、羊、猪、鹿等动物接触性传染病，主要引起高热、腹泻、慢性黏膜病、黏膜充血等临床症状，还能造成奶牛产奶量下降、母畜流产、产死胎或畸形胎、繁殖障碍等。特别是非致细胞病变型(Non-cytopathogeniceffect，NCP)BVDV感染早期妊娠母牛造成犊牛持续性感染(Persistentinfection，PI)，终身带毒，并通过鼻涕、唾液、尿液、和乳汁等向外界排毒，成为潜在感染源，当PI牛感染发展为致细胞病变(Cytopathic，CP)型BVDV时，可导致严重的胃肠道黏膜病，致死率可达100％，严重影响牛群健康。Metformin是治疗2型糖尿病的一线治疗药物。近年来的研究表明，除了降糖的作用以外，二甲双胍在改善多囊卵巢综合征，控制体重，延缓衰老以及抗肿瘤等方面都有作用，其中对抗肿瘤作用的研究最为广泛，其临床研究主要集中于抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，改善肿瘤微环境，增强免疫以及联合其他药物增加药物敏感性等方面。而Metformin是否影响BVDV感染宿主细胞尚未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供Metformin在预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒相关疾病中的应用，本发明证实Metformin能够有效抑制牛病毒性腹泻病毒的增殖，且对细胞的毒性较小，从而为有效预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染引发的症状提供了新的途径和选择，具有开发成预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染药物的前景。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供Metformin在制备预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染药物中的应用。

根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗牛病毒性腹泻病毒相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。

同时，所述预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染药物中，Metformin取不低于10mM的药物浓度。

本发明的第二个方面，提供Metformin在制备抗牛病毒性腹泻病毒的药物中的应用。

本发明的第三个方面，提供Metformin在制备抑制和/或杀灭牛病毒性腹泻病毒的药物中的应用。

根据本发明，不仅公开了Metformin在制备预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染药物中的应用，而且还公开了，施用Metformin与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，Metformin还可以与其它非药物活性成分组合使用。

有鉴于此，本发明的第四个方面，提供一种预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染的药物组合物，所述药物组合物由Metformin与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

其中，Metformin取不低于10mM的药物浓度。

其中所述的其他非药物活性成分包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

本发明的第五个方面，提供一种预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染的药物组合物的给药剂型包括固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。

所述的，一种预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染的药物组合物的给药剂型包括片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液和小输液。

在本发明的意义上，本发明所述的药物组合物表示一种物质，其所含有的Metformin对牛病毒性腹泻病毒具有明显的抑制和/或杀灭作用，并主要作用于牛病毒性腹泻病毒生活周期的多个阶段，可以实现对牛病毒性腹泻病毒的直接杀灭作用。

本发明的有益技术效果：

本发明提供了Metformin应用于BVDV的用途，在胞内水平阐明Metformin显著抑制BVDV复制，Metformin显著性减少BVDV mRNA和dsRNA含量、降低BVDV滴度，表明Metformin能够抑制BVDV在宿主细胞中复制；以BALB/c小鼠为试验动物，使用Metformin灌胃小鼠，通过尾静脉注射BVDV的方式感染小鼠，其不仅出现了典型的临床症状，而且还表现出病理组织上的变化；通过qRT-PCR方法可以从攻毒小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和小肠中检测到BVDV 5’UTR mRNA，且肝脏和小肠中BVDV mRNA明显高于其他内脏，Metformin能显著性降低小鼠组织内BVDV mRNA；与体外复制研究发现的使用Metformin预处理MDBK有效抑制BVDV在MDBK细胞内的RNA积累、mRNA复制、致细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)、滴度变化等可共同表明，Metformin对BVDV体内外复制均有抑制作用，为BVDV防控提供有力的依据，同时为Metformin抗病毒的后续研究提供理新的论依据。Metformin具有开发成预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染药物的前景，为Metformin开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗牛病毒性腹泻病毒药物奠定实验基础并提供新的视野。

附图说明

图1所示为不同浓度Metformin和不同处理时间对MDBK细胞增殖的影响图。

图2所示为免疫荧光染色检测Metformin处理对BVDV dsRNA水平的影响图。

图3所示为qRT-PCR检测Metformin对BVDV5,UTR mRNA水平的影响图。

图4所示为Metformin对BVDV感染MDBK细胞CPE变化的影响图。

图5所示为Reed-Muench方法检测Metformin影响BVDV滴度图。

图6所示为qRT-PCR检测Metformin对BALB/c小鼠不同组织中BVDV mRNA影响图；

其中。图A所示为感染5d检测结果；图B所示为感染10d检测结果。

图7所示为BVDV感染5d病理切片检测结果。

图8所示为BVDV感染10d病理切片检测结果。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中MDBK细胞购自中国科学院上海细胞库；BVDV新疆分离株TC株由新疆农业大学动物医学学院传染病实验室分离，为常规BVDV病毒，普通公众可通过中国兽医微生物菌种保藏管理中心公共渠道购买获得；BALB/c小鼠购自新疆医科大学医学实验动物中心。

本发明中采用的试剂有：Metformin hydrochloride(HY-17471A)购自Med ChemExpress公司；DMSO购自SIGMA公司；高糖DMEM、胎牛血清FBS、青/链霉素双抗、0.25％Trypsin-EDTA均购自BI公司；MTT、抗荧光淬灭PVP封片液购自上海碧云天生物技术有限公司；Anti-dsRNA mAB J2(10010200)购自美国SCICONS公司；TRIzol购自Ambion公司；无酶水、氯仿、异丙醇、无水乙醇均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)(RR036A)购自TaKaRa公司；SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒购自QIAGEN公司；CoraLite488标记驴抗鼠二抗IgG(H+L)购自武汉三鹰生物技术有限公司。所述试剂、材料均可通过公共渠道购买。

本发明中所采用的仪器为：电泳凝胶成像仪(Gel Doc XR⁺)购自Bio-Rad公司；制冰机购自日本三洋公司；移液器等购自德国Eppendorf公司；细胞培养箱购自Glaxy公司；YJ-875医用净化工作台购自苏州净化设备公司；高压蒸汽灭菌锅购自上海申安医疗器械厂；倒置荧光显微镜(TS2)购自Nikon公司；激光共聚焦显微镜(LSM 510)购自Zeiss公司；低温高速离心机购自Thermo Fisher Scientific公司；实时荧光定量PCR仪(Fast 7500)购自ABI公司；二氧化碳细胞培养箱购自Galaxy公司。

本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例一：Metformin在抑制牛病毒性腹泻病毒感染中的用途

本发明的第一个方面，提供Metformin在制备预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染药物中的应用。

根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗牛病毒性腹泻病毒相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。

同时，所述预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染药物中，Metformin取不低于10mM的药物浓度。

本发明的第二个方面，提供Metformin在制备抗牛病毒性腹泻病毒的药物中的应用。

本发明的第三个方面，提供Metformin在制备抑制和/或杀灭牛病毒性腹泻病毒的药物中的应用。

根据本发明，不仅公开了Metformin在制备预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染药物中的应用，而且还公开了，施用Metformin与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，Metformin还可以与其它非药物活性成分组合使用。

有鉴于此，本发明的第四个方面，提供一种预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染的药物组合物，所述药物组合物由Metformin与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

其中，Metformin取不低于10mM的药物浓度。

其中所述的其他非药物活性成分包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

本发明的第五个方面，提供一种预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染的药物组合物的给药剂型包括固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。

所述的，一种预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染的药物组合物的给药剂型包括片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液和小输液。

在本发明的意义上，本发明所述的药物组合物表示一种物质，其所含有的Metformin对牛病毒性腹泻病毒具有明显的抑制和/或杀灭作用，并主要作用于牛病毒性腹泻病毒生活周期的多个阶段，可以实现对牛病毒性腹泻病毒的直接杀灭作用。

实施例二：MTT检测Metformin对MDBK细胞增殖的影响

将生长至对数期的MDBK细胞消化收集，以每孔5000个细胞传代至96孔板上，每孔加入100μL细胞培养液(90％DMEM+10％FBS+1％双抗)，置于细胞培养箱培养24h后，分别加入0、5、8、10、15、20和50mM的Metformin，分别处理0、12、24、36、48h；待处理结束时小心弃去上清，每孔加入100μL细胞培养液和10μL MTT溶液(终浓度为0.01M)；置于细胞培养箱中避光孵育4h；弃掉培养液，每孔加入150μL DMSO溶液，置摇床上100r/min避光振荡30min，在酶联免疫检测仪上测OD570 nm的吸光度。

为检测Metformin对MDBK细胞增殖的影响，分别以不同浓度的Metformin处理MDBK细胞不同时间段，使用MMT法测定MDBK细胞增殖情况。结果如附图1，与0mM的Metformin处理相比，5、8、10、20和50mM Metformin处理MDBK细胞0和12h时，对细胞增殖无明显影响；24、36和48h时显著性降低细胞活性(**p<0.01)。随着时间的增长和Metformin浓度的增大，MDBK细胞的活性随之降低。表明使用Metformin处理MDBK细胞12h内对细胞的毒性较小，而处理时间多于24h后造成细胞存活率显著性降低。

实施例三：免疫荧光染色检测Metformin对BVDV dsRNA含量的影响

将细胞爬片铺至24孔细胞培养板中，加入500μL 0.1％明胶溶液包被30min；吸弃明胶溶液，接种1×10⁵个MDBK细胞，置于细胞培养箱中；待细胞汇合度达60％，加入终浓度为0、5、10、20mM Metformin处理MDBK细胞8h；弃去含有药物的培养液，用PBS洗一次，加入1000TCID₅₀ BVDV悬液处理MDBK细胞2h后更换成5％FBS的细胞培养液；待感染24h后，吸弃培养液，用无菌PBS轻轻洗涤两次，3min/次；加入4％多聚甲醛室温固定15min；吸弃固定液，PBS洗3次，3min/次；加入封闭液(0.5％TritonX-100、1％BSA、1％Donkey serum)室温孵育2h；PBS洗三次，3min/次；每孔加用封闭液稀释的Anti-dsRNA RNA antibody(1∶1,200稀释)，4℃孵育过夜；弃去一抗，PBS洗三次，10min/次；加入CoraLite488标记驴抗鼠二抗IgG(H+L)(1∶200稀释)，室温孵育1h；弃去后PBS洗三次，10min/次；加入PI细胞核染液(1∶200稀释)，室温孵育20min，弃去后PBS洗三次，10min/次；使用抗荧光淬灭PVP封片液封片，在激光共聚焦显微镜下观察结果

为检测不同浓度Metformin对BVDV在细胞内复制的影响，分别使用不同浓度Metformin处理MDBK，于BVDV感染24h时固定细胞，使用dsRNA抗体进行免疫荧光染色标记BVDV病毒粒子。结果如附图2所示，BVDV感染0mM Metformin对照组时细胞中出现大量dsRNA阳性的绿色荧光，当Metformin工作浓度为5mM时，MDBK细胞中dsRNA阳性的绿色荧光明显减少；当Metformin工作浓度为10和20mM时绿色荧光完全消失，表明BVDV在细胞内的复制随着Metformin浓度增加而被抑制。10mM Metformin可完全抑制dsRNA形成和积累，影响BVDV复制。

实施例四：qPCR检测Metformin对BVDV 5’UTR mRNA水平的影响

1、引物合成

使用Primer premier 5.0软件参考GenBank数据库中BVDV NADL序列(登录号：NC_001461.1)设计荧光定量PCR引物，引物序列如表1所示，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 BVDV 5’UTR通用引物

2、样品总RNA的提取

使用10mM的Metformin提前处理MDBK细胞8h，弃掉培养液加入用DMEM原液稀释的1000TCID₅₀ BVDV病毒液，吸附2h后更换成5％FBS的细胞培养液，收集病毒感染后0、12、24、36、48h细胞，加入TRIzol裂解液，收集于1.5mL无酶EP管中。充分混匀后冰浴10～20min；加入200μL氯仿，盖紧离心管盖，漩涡震荡离心管至充分混匀，冰浴10min；4℃12,000rpm离心15min，吸取上层清亮液相移入新离心管，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管10次至充分混匀液体，-20℃孵育30min或-80℃孵育15min；4℃12,000rpm离心15min后用移液器小心吸弃上清；加入1mL无水乙醇，轻轻颠倒10次；4℃12,000rpm离心5min后吸弃上清，加入1mL75％乙醇，4℃12,000rpm离心5min后，室温干燥5min；加入适量DEPC处理水；使用核酸定量仪Nanodrop 2,000C测定总RNA的浓度和纯度；立即反转录或-80℃长期保存。

3、RNA反转录反应

使用PrimeScriptTM MasterMix(Perfect Real Time)(RR036A)试剂进行反转录合成cDNA，反转录体系见表2。

表2：反转录体系

试剂名称	体积(μL)
		5×PrimeScript RT Master Mix	2.0
Total RNA	1 000ng
		RNase Free dH2O	up to 10.0

反转录反应用PCR仪器控温，条件如下:37℃ 15min(反转录反应)85℃5s(反转录酶的失活反应)4℃，反转录的cDNA放置-20℃保存备用。

4、qRT-PCR反应

参考

Green PCR使用说明书，分别以BVDV 5’UTR-F和BVDV 5’UTR-R作为上下游引物，在八连排中配置反应体系。将反应混合物充分混合并立即离心。将PCR管置于实时荧光定量PCR仪中。

反应体系见表3，PCR仪的反应条件为：95℃2min，95℃5s，60℃30s，循环次数为35次。

表3：qRT-PCR反应体系

试剂名称	体积(μL)
		2x QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix	10.0
QN ROX Reference Dye	0.1
		BVDV 5’UTR-F	1.4
BVDV 5’UTR-R	1.4
		cDNA	1.0
ddH2O	6.1

为检测Metformin处理是否影响BVDV感染MDBK细胞不同时段mRNA水平，使用Metformin处理细胞8h后，于BVDV感染后0、12、24、36和48h时收集细胞和培养液，提取总RNA并反转录成cDNA，使用qRT-PCR检测BVDV 5’UTR mRNA水平。结果如附图3所示，与对照0mMMetformin处理相比，BVDV感染10mM Metformin处理的MDBK细胞0h时5’UTR mRNA含量显著性降低(*p<0.05)，12、24、36和48h时5’UTR mRNA极显著性降低(**p<0.01)。其中BVDV感染48h时，差异最为明显，表明Metformin处理可抑制BVDV mRNA的复制和积累。

实施例五：Metformin对BVDV感染造成MDBK细胞CPE的影响

接种3×10⁵个/孔MDBK细胞至6孔细胞培养板中，加入10％FBS培养液培养待细胞汇合度达70％时，分别使用0和10mmol Metformin处理MDBK细胞8h；分别加入1,000TCID₅₀BVDV吸附2h后换为5％FBS的细胞培养液，于BVDV感染的0、12、24、36、48h时在倒置显微镜下观察CPE情况。

为了观察Metformin处理对BVDV感染MDBK细胞CPE是否有影响，使用相同滴度的BVDV分别感染0mM Metformin和10mM Metformin处理的MDBK细胞，分别于病毒感染不同时间点使用倒置显微镜观察细胞形态变化。结果如附图4所示，BVDV感染对照0mM Metformin处理的MDBK细胞12、24、36、48h时出现较为明显的细胞变圆、聚集、拉丝、融合、脱落等CPE现象，而BVDV感染10mM Metformin处理的MDBK细胞CPE情况明显减弱，表明Metformin可抑制BVDV在MDBK细胞中复制，减弱BVDV感染造成的CPE。

实施例六：TCID₅₀检测Metformin对BVDV感染的影响

按照3×10⁵个/孔将MDBK细胞接种至6孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中继续培养至细胞汇合度约70％，加入0和10mmol Metformin处理MDBK细胞8h，分别加入1000TCID₅₀BVDV悬液吸附2h后更换成5％FBS的细胞培养液，于感染后0、12、24、36、48h收取细胞及病毒液，置于-80℃反复冻融3次，1000r/min离心病毒悬液5min，弃掉细胞碎片；按10⁰、10¹、10²、...、10⁸梯度稀释病毒液，接种至细胞汇合度约70％的96孔细胞培养板中，每个稀释度进行8个重复，吸附2h后更换成5％FBS的细胞培养液，于感染后5-7d观察细胞病变并记录各个稀释度的细胞病变孔数，按Reed-Muench两氏法计算TCID₅₀，计算公式如下：

lgTCID₅₀＝距离比例×稀释对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数，TCID₅₀＝10^lg·TCID ₅₀/0.1·mL。

为检测Metformin处理对BVDV复制产生子代病毒滴度的影响，使用相同滴度的BVDV分别感染0mM Metformin和10mM Metformin处理的MBDK细胞，于感染后不同时间点后收集病毒悬液，经反复冻融处理后使用Reed-Muench法测定子代病毒滴度的变化情况。结果如图5所示，与对照0mM Metformin处理相比，BVDV感染10mM Metformin处理MDBK细胞后12h时子代病毒滴度显著性降低(*p<0.05)，24、36和48h时形成的病毒颗粒极显著性减少(**p<0.01)表明Metformin可显著抑制BVDV在MDBK细胞中的复制。

实施例七：Metformin对BVDV感染小鼠预防作用的影响

(一)试验方法

1、Metformin灌胃和BVDV攻毒BALB/c小鼠

将18只3～4月龄健康BALB/c小鼠分为3组，每组6只。第一组为对照组每组每天灌胃0mg/kg的Metformin；第二组为实验组灌胃400mg/kg Metformin；第三组为实验组灌胃800mg/kg Metformin。每日1次，共灌胃3次。3d后尾静脉注射BVDV 10¹⁶TCID₅₀，每48h注射一次。感染病毒后继续使用Metformin灌胃，每48h一次。接种后的小鼠在相同饲养条件、不同的饲养笼中饲养。

2、样品采集

于BVDV感染后5d和10d时将小鼠处死后，解剖取肝脏、脾脏、肾脏、小肠等组织，观察病变情况。取部分组织在研钵中磨碎，收集至无RNA酶的离心管中，提取总RNA，并通过RT-qPCR分析病毒RNA在小鼠体内复制情况。将剩余内脏组织置于4mL离心管，加入4％多聚甲醛浸泡，用于后续病理切片制备。

3、qRT-PCR检测Metformin对各组织中BVDV mRNA的影响方法同上述实施例四。

4、病理切片观察各组织病变情况

(1)、石蜡切片制备

①冲洗：取上述固定的组织样品，置于流水下冲洗12h。

②脱水透明：从低浓度乙醇逐步递增至无水乙醇：70％乙醇(1.5h)、80％乙醇(1.5h)、90％乙醇(1.5h)、95％乙醇(30min)、无水乙醇I(30min)、无水乙醇II(30min)。将脱水后的组织放入无水乙醇与二甲苯1:1混合液(5min)，二甲苯I(5min)和二甲苯II(5min)。

③浸蜡包埋：将二甲苯与石蜡1:1混合液、石蜡I和石蜡II置于56～58℃的恒温箱中熔化，将脱水后的组织依次放入上述石蜡，浸蜡时间为：二甲苯与石蜡1:1混合液(1h)，蜡杯I(1h)，蜡杯II(1h)。使用模具将组织完全包埋于石蜡内，并且使其凝固成块。

④切片与烤片：使用石蜡切片机把石蜡组织块切成3～5μm的薄片，在37℃水中展开，用载玻片将其捞出，放入恒温箱中40～45℃烘烤2h。

(2)、H&E染色

①脱蜡：二甲苯I(3min)，二甲苯II(2min)溶去切片上的石蜡。

②复水和染色：将脱蜡后的组织切片依次放入各级不同浓度的乙醇溶液和染色液：无水乙醇与二甲苯1:1混合液(2min)、无水乙醇(1min)、95％乙醇(1min)、90％乙醇(1min)、80％乙醇(1min)、70％乙醇(1min)、蒸馏水(1min)、苏木素(5min)、自来水冲洗(5min)、1％盐酸乙醇(5s)、自来水冲洗(5min)、氨水(10s)、自来水冲洗(5min)、伊红(3min)。

③脱色透明：将载玻片放入70％乙醇(1min)、80％乙醇(1min)、90％乙醇(1min)、95％乙醇(1min)、无水乙醇(1min)。无水乙醇与二甲苯1:1混合液(1min)、二甲苯I(2min)、二甲苯II(5min)。在载玻片中央滴一滴中性树胶，盖上盖玻片，干燥后进行镜检。

5、统计分析

使用GraphPadPrism 5软件进行做图；使用IBM SPSS 19(SPSS Inc.Chicago，IL，USA)软件的独立样本t检验分析进行统计学分析。P<0.05具有统计学差异(其中*P<0.05代表显著性差异；**P<0.01代表极显著性差异)。

(二)试验结果

1、qRT-PCR检测Metformin对各组织中BVDV mRNA的影响

荧光定量RT-PCR用于检测Metformin对BVDV攻毒后不同天数BALB/c小鼠各组织的BVDV 5’UTR mRNA水平的影响。结果如附图6所示，将400和800mg/kg Metformin与对照DMSO相比，BVDV感染5d和10d时，400mg/kg Metformin对小鼠肾脏中BVDV 5’UTR mRNA含量无明显影响，而800mg/kg Metformin在BVDV感染5d时小鼠肾脏中BVDV 5’UTR mRNA显著性降低(*p<0.05)，在BVDV感染10d时小鼠肾脏中BVDV 5’UTR mRNA极显著性降低(**p<0.01)，表明Metformin对小鼠肾脏组织中BVDV 5’UTR mRNA含量的降低随计量的增大和时间的增长而明显。BVDV攻毒后5和10d，与DMSO对照组相比，400mg/kg Metformin和800mg/kg Metformin能够极显著降低(**p<0.01)小鼠肝脏、脾脏和小肠中BVDV 5’UTR mRNA含量。其中BVDV感染10d，800mg/kg Metformin对小肠中BVDV 5’UTR mRNA含量降低最为明显，约3.3倍；800mg/kg Metformin对肝脏中BVDV 5’UTR mRNA含量出现极显著性降低(**p<0.01)，与DMSO对照组相比，降低约7.0倍。结果表明，在BVDV攻毒后5d和10d时，与DMSO对照相比，400和800mg/kg Metformin能显著性降低小鼠肝脏、脾脏、肾脏和小肠中BVDV 5’UTR mRNA含量，抑制BVDV体内复制。

2、理切片检测BALB/c小鼠各组织病变情况

取肝脏、脾脏、肾脏和小肠四种组织进行H&E染色，观察结果如附图7和附图8显示：BVDV感染可引起大部分脏器都表现出不同程度的组织病变。

BVDV感染导致的肝脏出血、肝静脉充血、肝细胞中出现颗粒变性，细胞质呈空泡状等，400mg/kg Metformin处理BALB/c小鼠5、10d可减少肝脏出血、肝静脉充血，800mg/kgMetformin处理5d可减轻肝脏组织局部出血，10d可显著抑制肝脏出血、肝静脉充血，减少细胞中颗粒状物质产生及细胞质空泡状现象的发生，使肝小叶结构完整、肝细胞索呈整齐的放射状、中央静脉清晰；BVDV感染可致小鼠脾脏充血，组织局部出血，有少量淋巴细胞浸润，红细胞显著增多，红髓与白髓界限不清晰，小梁增多，400mg/kg Metformin处理BALB/c小鼠5d可减少脾脏充血，中性粒细胞增多，10d时脾小梁减少，巨细胞增多，800mg/kg Metformin处理5d可减少组织充血，白细胞增多，10d时脾脏充血显著减轻且红髓与白髓界限清晰，出现少量巨细胞；BVDV感染导致肾皮质、肾小管周围出血，肾小球充血水肿及炎性细胞增多肾盂萎缩等现象，800mg/kg Metformin处理BALB/c小鼠5、10d可显著抑制肾脏出血及肾小球肿大，400mg/kg Metformin处理BALB/c小鼠5、10d可减缓肾小球充血肿大，减少炎性细胞浸润，使肾小球和肾小管间质病变均；BVDV感染可致小鼠小肠黏膜充血水肿，肠绒毛固有层淋巴细胞浸润，部分肠绒毛上皮细胞坏死，小肠毛细血管出血，肠绒毛代偿性增宽且缩短，隐窝减少且形态改变，400mg/kg Metformin处理BALB/c小鼠5d可减少小黏膜下层的炎性细胞浸润，10d可使隐窝增多，肠绒毛增长且隐窝增大，800mg/kg Metformin处理5、10d可使绒毛上皮固有层细胞坏死和脱落减少。

基于上述实施例，Metformin能够抑制BVDV体内外的复制。使用Metformin预处理MDBK细胞能显著抑制BVDV mRNA和dsRNA积累、病毒颗粒形成，CPE现象明显减弱，表明Metformin抑制BVDV胞内复制。使用Metformin灌胃BALB/c小鼠后BVDV攻毒，Metformin能够显著减少小鼠内脏组织中BVDV mRNA含量，通过病理切片观察Metformin能有效缓解BVDV感染引起的组织病变，表明Metformin抑制BVDV在小鼠体内的复制，Metformin具有开发成预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染药物的前景，为Metformin开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗牛病毒性腹泻病毒药物奠定实验基础并提供新的视野。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明优化的保护范围内。

Claims (10)

1.Metformin在制备预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染药物中的应用。

2.如权利要求1所述Metformin在制备预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述Metformin的药物浓度不低于10mM。

3.如权利要求1所述Metformin在制备预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染药物中的应用，其特征在于，Metformin在制备抗牛病毒性腹泻病毒药物中的应用。

4.如权利要求1所述Metformin在制备预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染药物中的应用，其特征在于，Metformin在制备抑制和/或杀灭牛病毒性腹泻病毒的药物中的应用。

5.一种预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由Metformin与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

6.如权利要求5所述的一种预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染的药物组合物，其特征在于，Metformin的药物浓度不低于10mM。

7.如权利要求5所述的一种预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染的药物组合物，其特征在于，所述其它药物活性成分包括具有抑制和/或杀灭牛病毒性腹泻病毒或者协助抑制和/或杀灭牛病毒性腹泻病毒的物质。

8.如权利要求5所述的一种预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染的药物组合物，其特征在于，其他非药物活性成分包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

9.如权利要求5所述的一种预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染的药物组合物，其特征在于，给药剂型包括固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。

10.如权利要求9所述的一种预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染的药物组合物，其特征在于，给药剂型包括片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液和小输液。

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