CN104906080A

CN104906080A - 二甲双胍用于制备治疗柯萨奇病毒b3所致病毒性心肌炎药物的用途

Info

Publication number: CN104906080A
Application number: CN201510337052.2A
Authority: CN
Inventors: 张克斌; 谢玮; 王蕾; 周小波; 代黔; 钱桂生; 周世文; 余华; 何晓梅; 熊浚智; 辛榕
Original assignee: Second Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Second Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2015-06-17
Filing date: 2015-06-17
Publication date: 2015-09-16

Abstract

本发明涉及一种二甲双胍用于制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病药物的用途。采用本发明所述药物治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病，具有抗CVB3病毒复制的作用，改善心肌功能，抑制心肌炎症及纤维化效果明显，可用于制备治疗病毒性心肌炎的药物，该药物副作用小，疗效高，在目前临床上治疗CVB3所致病毒性心肌炎尤其是在感染后期，治疗的疗效不够满意的情况下，其应用前景良好。

Description

二甲双胍用于制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎药物的用途

技术领域

本发明属于医药领域，特别涉及一种二甲双胍用于制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病的药物的用途。

背景技术

柯萨奇病毒(CVB)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)，病毒颗粒为二十面体，立方对称呈球形，无包膜，直径约25-30nm，病毒衣壳包绕着一条单股正链RNA。柯萨奇病毒B组(coxsackievirus B)具有高度亲心肌性和流行性，共包括6种血清型(CVB1-CVB6)，其中柯萨奇病毒B3被认为是引起心肌炎和扩张型心肌病最为常见的病原体，回顾性研究表明50％以上的病毒性心肌炎和25％的心肌病与之有关。

病毒性心肌炎(viral myocarditis)是指嗜心性病毒感染引起的以心肌炎性病变为主的疾病，可引起急性心功能不全，且约有1/3的患者进一步发展为慢性心肌炎和扩张型心肌病，是引发心力衰竭的常见病因之一。近年来该病发病率呈上升趋势，已成为危害青少年健康的常见疾病之一，但迄今尚无有效的疫苗以及特异性治疗方法。

目前对于病毒性心肌炎的临床治疗，还存在诸多不足。现临床主要采用抗病毒和调节细胞免疫功能疗法。其中临床抗病毒药物包括阿昔洛韦、病毒唑和更昔洛韦等，在感染早期，这些抗病毒药物能有效抑制病毒复制，减轻心肌损伤，提高生存率，但是，在感染后期，其疗效有限，因此，目前临床应用的抗病毒药物的疗效均不够满意。在细胞免疫功能调节方面，目前临床上使用的药物包括：丙种球蛋白、人白细胞干扰素等，虽然这些药物能减弱免疫反应，清除病毒，改善左心室功能，提高生存率，但仍存在个体疗效差异大，有一定副作用，成本过高等问题。因而，筛选和研制治疗病毒性心肌炎的新药具有重要意义。

二甲双胍(Metformin，其分子式为C₄H₁₁N₅·HCl，分子量为165.62)作为临床上广泛应用的治疗2型糖尿病的降糖药物，近年来不断有研究表明其还具有一定的保护心血管及抗肿瘤的作用，但对于抗柯萨奇病毒B3及所致病毒性心肌炎的活性尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种二甲双胍用于制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病药物的用途。采用本发明所述药物，治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病，具有抗CVB3病毒复制的作用，抑制心肌炎症及纤维化效果明显，可用于制备治疗病毒性心肌炎的药物，该副作用小，疗效高，在目前临床上治疗CVB3所致病毒性心肌炎尤其是在感染后期，治疗的疗效不够满意的情况下，应用前景良好。

本发明的技术方案是：

二甲双胍在制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病的药物中的用途。

本发明所述药物采用口服方式给药，对于成人而言，用药量为每公斤体重每天5～10mg。

本发明的有益效果是：

(1)药理活性方面

申请人的动物实验证明，二甲双胍显著改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率，心脏组织实验方面，二甲双胍能明显的抑制炎症细胞浸润和组织坏死，具有抗CVB3作用和抑制其复制的作用，血清样本用全自动生物分析仪进行检测，结果表明，二甲双胍具有抑制心肌酶活性的作用、保护心肌功能的作用，体外抗CVB3活性作用表明二甲双胍具有显著的抑制病毒蛋白表达水平的作用。

(2)药学方面

二甲双胍为双胍类口服降血糖药，其本身理化性质稳定，药理作用广泛，毒性和副作用较小。

附图说明

图1为二甲双胍改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率的曲线；

图2为二甲双胍改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠心脏功能(EF为射血分数，LV mass为左心室质量)，*表示p<0.05；

图3为二甲双胍抑制CVB3感染所致炎症细胞浸润的结果；

图4为小鼠心肌组织切片H&E染色结果，图中Mock为正常对照组，CVB3为CVB3感染组，CVB3+Met为二甲双胍治疗组；

图5为小鼠心肌组织切片Masson染色结果；

图6为二甲双胍抑制CVB3在心肌组织中的复制，图为dsRNA染色结果；

图7为二甲双胍抑制小鼠心肌组织中CVB3衣壳蛋白VP1RNA表达量(注：*表示p<0.05)；

图8为Western blot检测二甲双胍体外抗CVB3的作用，其中A图为Western blot检测条带结果，β-actin为内参对照；B图为对A图条带进行灰度扫描定量分析结果(注：*表示p<0.05)；

图9为qRT-PCR检测二甲双胍体外抗CVB3作用(注：*表示p<0.05)。

具体实施方式

一、材料和试剂

1.动物、病毒株

BALB/c小鼠，雄性，4-6周龄，购买于第三军医大学大坪医院动物中心；

柯萨奇病毒B3(Nancy株)购买于中国科学院武汉病毒研究所；

Hela细胞株购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

2.主要试剂

PBS液(0.01mol/L，pH 7.4)：NaCl 8.00g，KCl 0.20g，KH₂PO₄0.20g，NaH₂PO₄·H₂O 1.56g，1000ml ddH₂O溶解，高温高压灭菌，4℃保存。

3.主要仪器设备

ISO 9001电子天平	德国Sartorius公司
		Milli-Q Elix纯水器	美国Millipore公司
PB-20pH计	德国Sartorius公司
		PTC-100^TM PCR仪	美国MJ Research公司
MDF-382E(N)超低温冰箱	日本Sanyo公司
		D-37520型低温高速离心机	德国Heraeus公司
－80℃低温冰箱	SANYO公司
		Vevo2100小动物超声成像仪	Visualsonics
Vii7PCR仪	ABI
		Image Quant LAS4010凝胶成像仪	GE

二、实验方法

1.病毒性心肌炎模型的建立

BALB/c小鼠，雄性，4-6周龄，适应性喂养3天。实验分为正常对照组、病毒性心肌炎模型组、二甲双胍治疗组。小鼠腹腔注射0.1ml CVB3病毒液(3×10⁵PFU/ml)，次日分别给予灌胃PBS(正常对照组、病毒性心肌炎模型组)、二甲双胍(50mg/kg)(转算成人每日适应剂量是：5-10mg/kg)。连续灌胃7天，7天后每周灌胃3次，21天时进行心功能检测，28天处死小鼠，收集心肌组织和血液标本。

2.小鼠心肌功能检测

小鼠给药21天(感染CVB3后连续给药7天，7天后每周给药3次)，小鼠用7％水合氯醛按3ml/kg经腹腔注射麻醉，固定，用Vevo2100高分辨率超声系统经小鼠胸廓进行超声心动图(30MHz，100帧/秒)，经测量计算得到射血分数(EF)和左心室质量(LV mass)的数值。

5.免疫组化染色方法

小鼠心脏组织用4％多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5μm，组织切片经脱蜡水化，抗原修复，封闭内源性过氧化氢酶，抗体杂交(CD45、CD68、CD3及dsRNA抗体)，DAB显色，复染，脱水、透明和封片后镜检。

6.H&E及Masson染色方法

小鼠心脏组织用4％多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5μm，苏木素伊红染色(hematoxylin-eosine,H&E)及Masson三色法染色后镜检。光学显微镜下观察组织切片心肌组织炎性细胞浸润、细胞损伤程度，以及心肌纤维化程度。

7.qRT-PCR检测方法

具体步骤包括：设计并合成VP1和GAPDH引物；Trizol试剂提取RNA，核酸仪检测RNA浓度和纯度，逆转录试剂盒合成cDNA；以cDNA为模板，采用SYBR Green试剂盒进行实时定量PCR。

8.Western blot检测

药物处理后的细胞进行总蛋白提取；BCA法进行蛋白浓度测定；然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗稀释液孵育过夜，相应二抗孵育2h(室温)，化学发光显影。应用Image J软件测定灰度值。

9.心肌酶谱检测方法

将小鼠血清用自动生物化学分析仪(公司：日立，型号：7170S)进行检测，测定天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)和α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)的活性。

10.HeLa细胞感染及药物处理

以含10％FBS的高糖DMEM培养基调整HeLa细胞密度，以5×10⁵/孔接种于六孔板中，37℃、5％CO₂的条件培养24小时。用CVB3(MOI＝3)感染1小时，弃去病毒液，PBS洗涤两次，加药处理。提取RNA和总蛋白进行定量PCR及Western blot检测。

三、结果

1.二甲双胍显著改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率

在小鼠感染CVB3后，灌胃二甲双胍(50mg/kg)，灌胃28天(连续灌胃7天，7天后每周灌胃3次)，二甲双胍干预组小鼠生存率明显得到提高。结果显示二甲双胍可显著改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率(参见图1)。

2.二甲双胍具有保护心肌功能的作用

将二甲双胍治疗21天的小鼠进行心功能检测，结果表明二甲双胍治疗组具有保护心肌功能的作用(参见图2)。

3.二甲双胍抑制炎症细胞浸润

小鼠心肌组织用4％多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5μm，经CD45、CD68及CD3抗体进行免疫组化染色后镜下观察。结果表明二甲双胍治疗组可明显抑制炎症细胞浸润(见图3)。

4.二甲双胍抑制炎症细胞浸润和组织损伤

小鼠心肌组织用4％多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5μm，苏木素伊红染色(hematoxylin-eosine,H&E)后镜下观察。结果表明二甲双胍治疗组明显的抑制炎症细胞浸润和组织坏死(见图4)。

5.二甲双胍抑制心肌组织纤维化

小鼠心脏组织用4％多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5μm，Masson三色法染色后镜检。光学显微镜下观察心肌纤维化程度。结果表明二甲双胍治疗组明显抑制心肌组织的纤维化(见图5)。

6.二甲双胍具有抑制心肌酶活性的作用

小鼠血清样本进行心肌酶活性检测，结果表明二甲双胍治疗组中天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)和α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)的活性相对于病毒感染组明显被抑制，见表1。

表1.小鼠血清心肌酶谱结果(平均值±标准误)

	AST(IU/L)	CK(IU/L)	CK-MB(IU/L)	LDH(IU/L)	α-HBDH(U/L)
						Mock	215.6±15.5	867.8±15.9	469.5±17.6	878.5±18.8	518.1±29.8
CVB3	482.3±25.0^a	1941.4±46.6^a	1118.0±34.5^a	2945.5±119.2^a	853.4±35.8^a
						Metformin	219.3±11.6	806.8±29.3	498.3±22.1	886.8±24.4	533.5±35.4
CVB3+Metformin	329.8±25.7^b	1058.5±66.6^b	582.1±22.8^b	1003.3±47.1^b	657.3±30.9^b

a.p＜0.05 CVB3感染组与正常对照组比较；

b.p＜0.05二甲双胍治疗组与CVB3感染组比较。

7.二甲双胍具有抗CVB3作用

小鼠心脏组织用4％多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5μm，组织切片经脱蜡水化，抗原修复，封闭内源性过氧化氢酶，抗体杂交(dsRNA抗体)，DAB显色，复染，脱水、透明和封片后镜检。结果表明二甲双胍治疗组具有明显的抗CVB3作用和抑制其复制的作用(见图6)。

qRT-PCR方法检测小鼠心肌组织中CVB3衣壳蛋白VP1的RNA水平，结果表明二甲双胍治疗组明显降低其RNA水平(见图7)。

8.二甲双胍体外抗CVB3活性作用

将HeLa细胞经药物处理12小时后，提取总蛋白，Western blot检测CVB3衣壳蛋白VP1的表达水平，结果表明，二甲双胍具有显著的抑制VP1蛋白表达水平的作用(见图8)。提取总RNA，实时定量PCR检测CVB3衣壳蛋白VP1的RNA水平，结果表明，二甲双胍具有显著的抑制VP1的RNA水平的作用(见图9)。

Claims

1.一种二甲双胍在制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物以口服给药。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述药物用药量为每公斤体重每天5～10mg。