CN110507614B - miR#4脂质体药物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种对于急性肝衰竭有预防和治疗作用的miR#4脂质体药物及其制备方法，该脂质体药物包括空白阳性脂质体和功能化miR#4，按照摩尔比40‑50：40‑30：10：10‑1称取阳离子脂质、胆固醇、二硬磷脂酰胆碱和结构磷脂，将所称取的原料加入无水乙醇中，加热至全部溶解得到脂质乙醇溶液，将脂质乙醇溶液在高速搅拌下滴加至柠檬酸钠缓冲液中，然后在水化形成混合溶液，将混合溶液进行孵育，然后利用脂质体挤压器通过80nm孔径的滤膜后得到空白阳性脂质体；取功能化miR#4的水溶液，用柠檬酸钠缓冲液和无水乙醇配置成含醇30％的功能化miR#4溶液；将空白阳性脂质体通过交叉流的方式与等体积的功能化miR#4溶液混合，并孵育制得miR#4脂质体药物。

Description

miR#4脂质体药物及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种miR#4脂质体药物及其制备方法。
背景技术
急性肝衰竭是众所周知的临床急重症，目前除了人工肝脏和肝移植等有限的疗法外，无任何药物可以治疗，而世界范围内，约半数的急性肝衰竭是由药物性肝损伤引发。随着2017年美国食品药品监督局(FDA)批准三项基因治疗药物上市，目前全球共有七种基因治疗药物在美国或欧洲实现临床商业化应用。在此大背景下，随着Ionis Pharmaceuticals公司的反义寡核苷酸药物(ASO)Spinraza(nusinersen)和Tegesedi(inotersen)以及Alnylam Pharmaceuticals公司的siRNA药物Onpattro(patisiran)近日相继获得FDA的批准，RNA疗法作为基因疗法的一个重要组成部分同样受到医药界和资本界的热烈追捧。目前在美国共有包括由赛诺菲，罗氏，阿斯利康等世界药物巨头牵头进行的20多项RNA疗法已经进入了临床2-3期试验。
急性肝衰竭是一种预后凶险的疾病，目前尚未有任何有效药物预防或治疗急性肝衰竭，目前急性肝衰竭主要的治疗手段主要集中在以下几个方面：内科基础治疗、人工肝治疗及肝移植等。现阶段药物综合治疗和人工肝治疗仍然作为国内治疗的主要手段，国外则多以肝移植来治疗。
1.内科基础治疗：内科基础治疗的原则是早期诊断、早期治疗，针对不同病因采取相应的综合治疗，并积极防治各种并发症，为肝细胞的再生赢得时间。首先是一般支持治疗，如严格消毒隔离、保证每日能量和液体供给、维持内环境稳定、动态监测肝功能等，然后是针对病因给予一定药物治疗，如对病毒性肝炎引起的急性肝衰竭进行抗病毒治疗；对酒精性肝衰竭患者给予糖皮质激素治疗(糖皮质激素对HBV所致慢加急性肝衰竭患者的应用存在争议)；为减少肝细胞坏死，促进肝细胞再生，可使用促肝细胞生长素和前列腺素El(PEG1)脂质体等药物(疗效尚需进一步确认)。最后就是强调营养支持治疗，为肝细胞再生赢取时间。
2.人工肝支持治疗：原理是通过将肝衰竭患者血浆与新鲜血浆进行置换，达到清除有害物质，补充机体必需物质，改善内环境的作用，暂时替代衰竭肝脏部分功能，为肝细胞再生及肝功能恢复创造条件或等待机会进行肝移植。人工肝治疗也是内科综合治疗的一部分。
3.肝移植：对于各种原因所致的中、晚期肝衰竭，经积极内科和人工肝治疗仍呈不可逆转的急性肝衰竭者应及早考虑肝移植。肝移植尽管可以有效改善患者的肝脏功能，但因手术复杂性、器官来源、免疫排斥反应以及相当高昂的费用(国内肝移植手术平均费用30万左右，不包括为避免免疫排斥而长期使用免疫抑制剂带来的后期费用)等原因，大大限制了肝移植治疗的开展。
据中国人民解放军第302医院对2002到2011年收入院治疗的近500例急性及亚急性肝衰竭病因学普查显示，药物毒性导致的肝衰竭患者占到近20％。同时因药物中毒导致的未达临床肝衰竭指征的肝炎、肝损伤患者数目更加庞大。而目前急性肝衰竭的临床诊疗尚无有效的药物治疗方案，人工肝脏透析疗法花费约50000元/疗程，肝移植的手术费用平均为300000元/例。其医疗成本和后续医护费用高昂，并且由于肝源严重短缺，大多数患者无法得到有效的救助，加重了患者的痛苦及社会医疗负担。
急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是各种原因引起肝细胞坏死或大部分功能失常而导致肝功能衰竭的一种危重肝病表现。作为一项全球性疾病，其病因包括肝炎、药物毒物中毒，遗传代谢障碍、自审免疫异常等等。在欧美发达国家，急性肝衰竭的发病率约为10例/百万人(考虑到部分患者在送医途中已经病故，急性肝衰竭的发病率应该更高)，其中因药物性肝损伤导致的急性肝衰竭占比高达50％。根据最新流行病学调查显示，在美国，每年因药物导致的肝损伤(Drug-induced liver injury,DILI)大约是60000例(20例/10万人/年)，其中数千人发展成为急性肝衰竭。而在中国，解放军第302医院肝衰竭诊疗与研究中心赵攀等人的研究报告通过分析我国7家三级部队医院的177例急性肝衰竭患者病因发现，我国急性肝衰竭(ALF)的最主要病因依然是药物中毒(特别是中草药)，达到43.5％(如表1所示)。
表1：我国7家三级部队医院177例急性肝衰竭患者病因分类
Figure BDA0002201499430000021
急性肝衰竭病例：
经典案例1：2013年4月1日，复旦大学2010级硕士研究生黄洋同学因喝饮水机里的被室友投毒的水，经抢救无效，于2013年4月16日在附属中山医院去世。“复旦投毒案”一出，震惊全国。经鉴定，该案所投毒物是N-二甲基亚硝胺，该物质毒性强，用于在实验动物中人为制造肝损伤的模型。黄洋同学因为饮用过量毒物引发急性肝衰竭，最终多器官衰竭不治而亡。
经典案例2：2015年12月，中南林业科技大学硕士崔飞，先后在两家医院治疗脱发，坚持服用了两家医院共计1.89kg生首乌、1.06kg制首乌，剂量总共达到5.9斤，最终引发药物性肝衰竭不治身亡。
基于目前无任何药物可以治疗急性肝衰竭，本发明提供一种miR#4脂质体药物及其制备方法，以对急性肝衰竭进行药物性治疗、预防和缓解。
发明内容
本发明的目的在于提供一种miR#4脂质体药物及其制备方法，解决对急性肝衰竭进行预防和缓解的问题。
为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种miR#4脂质体药物，包括空白阳性脂质体和功能化miR#4。
进一步的技术方案是，所述空白阳性脂质体由阳离子脂质、胆固醇、二硬磷脂酰胆碱和结构磷脂制成，所述阳离子脂质：胆固醇：二硬磷脂酰胆碱：结构磷脂的摩尔比为40-50：40-30：10：10-1。
更进一步的技术方案是，所述阳离子脂质包括双油基双甲基氯化铵、N,N-二甲基-2,3-二油氧基丙胺、双十八烷基二甲基溴化铵、1,2-二油酰基-3-二甲基丙二醇胺、N-(N’,N’-二甲氨基乙基)氨甲酰基-胆固醇、N,N-二甲基-N-羟乙基-N-(1,2-双十四烷氧基)丙基溴化铵、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基丙胺、1,2-二亚麻氧基-N,N-二甲基丙胺中的一种或几种。
更进一步的技术方案是，所述结构磷脂包括硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
更进一步的技术方案是，所述功能化miR#4为化学合成双链的miR#4核苷酸的模拟物或类似物，所述功能化miR#4的正义链为5’-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-3’，所述功能化miR#4的反义链为5’-ACGCGAGCCGAACGAACAAAUU-3’。
本发明提供的第二种技术方案是：
一种miR#4脂质体药物的制备方法，包括如下步骤：按照摩尔比40-50：40-30：10：10-1称取阳离子脂质、胆固醇、二硬磷脂酰胆碱和结构磷脂，将所称取的原料加入无水乙醇中，加热至全部溶解得到脂质乙醇溶液，将所述脂质乙醇溶液在高速搅拌下滴加至柠檬酸钠缓冲液中，然后在水化形成混合溶液，将所述混合溶液进行孵育，然后利用脂质体挤压器通过80nm孔径的滤膜后得到空白阳性脂质体；
取功能化miR#4的水溶液，用柠檬酸钠缓冲液和无水乙醇配置成含醇30％的功能化miR#4溶液；
将所述空白阳性脂质体通过交叉流的方式与等体积的所述功能化miR#4溶液混合，并孵育制得所述miR#4脂质体药物。
更进一步的技术方案是，按照摩尔比40：40：10：10称取阳离子脂质、胆固醇、二硬磷脂酰胆碱和结构磷脂共600mg，将所称取的原料加入30mL无水乙醇中，加热至60℃并使原料全部溶解到无水乙醇中得到脂质乙醇溶液，将所述脂质乙醇溶液在高速搅拌下滴加至70mL、50mM、pH＝4的柠檬酸钠缓冲液中，然后在60℃下水化30min形成混合溶液，将所述混合溶液在22℃下孵育5min，然后利用脂质体挤压器通过80nm孔径的滤膜1-3次后得到空白阳性脂质体；
取功能化miR#4的水溶液，用50mM、pH＝4的柠檬酸钠缓冲液和无水乙醇配置成含醇30％的0.6mg/mL的功能化miR#4溶液；
将100mL的功能化miR#4溶液通过交叉流的方式与等体积的所述功能化miR#4溶液混合，并在37℃下孵育30min后制得所述miR#4脂质体药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的miR#4脂质体药物能很好的对肝组织起到保护和缓解急性肝损伤，本miR#4脂质体药物利用粒径分析仪检测得平均电位为+30-50mV，其包封率在90％以上，本miR#4脂质体药物中脂质体包覆可以显著提高miR#4在血清中的稳定性，抑制了RNase的降解，并且本miR#4脂质体药物可显著提高HL-7702细胞中miR#4的表达。
附图说明
图1为本发明中miR#4@LNP对RNA的保护作用的示意图。
图2为本发明中HL-7702细胞miR#4的表达的示意图。
图3为本发明中小鼠实验流程图。
图4为本发明小鼠实验中不同时间小鼠血清ALT含量的柱状图。
图5为本发明小鼠实验中小鼠肝脏HE染色的示意图。
图6为本发明小鼠实验中小鼠肝脏miR#4的表达的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
本实施例提供一种miR#4脂质体药物，MiR#4脂质体药物由空白阳性脂质体和功能化miR#4混合制备而成。空白阳性脂质体的脂质由阳离子脂质、胆固醇、二硬磷脂酰胆碱(DSPC)和结构磷脂按照一定的摩尔比例(阳离子脂质：胆固醇：二硬磷脂酰胆碱(DSPC)：结构磷脂＝40-50：40-30：10：10-1)组成。其中阳离子脂质包括双油基双甲基氯化铵(N,N-dioleyl-N,N-dimethylammonium chloride，DODAC)、N,N-二甲基-2,3-二油氧基丙胺(N,N-dimethyl-(2,3-dioleyloxy)pro pylamine，DODMA)、双十八烷基二甲基溴化铵(N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide，DDAB)、1,2-二油酰基-3-二甲基丙二醇胺(1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-3-dimethylaminopropane，DODAP)、N-(N’,N’-二甲氨基乙基)氨甲酰基-胆固醇(3-(N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl)cholesterol，DC-Chol)、N,N-二甲基-N-羟乙基-N-(1,2-双十四烷氧基)丙基溴化铵(N-(1,2-dimyristyloxyprop-3-yl)-N,N-dimethyl-N-hydroxyethyl ammonium bromide，DMRIE)、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基丙胺(1,2-Dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane，DLinDMA)和1,2-二亚麻氧基-N,N-二甲基丙胺(1,2-Dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane，DLenDMA)中的一种或多种。结构磷脂包括一种或多种PEG化磷脂，如硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]，DSPE-PEG2000)，carbamoyl]-1,2-dimyri-styloxlpropyl-3-amine-N-[(methoxy poly(ethylene glycol)(C-DMA-PEG2000),R-3-[(ω-methoxy poly(ethylene glycol)2000)carbamoyl)]-1,2-dimyristyloxl-propyl-3-amine(C-DOMG-PEG2000)。功能化miR#4为化学合成双链的miR#4核苷酸的模拟物或类似物，功能化miR#4的正义链为5’-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-3’，功能化miR#4的反义链为5’-ACGCGAGCCGAACGAACAAAUU-3’。
在本发明中，miR#4为miR-375。
实施例2：
本实施例提供一种miR#4脂质体药物的制备方法，按照摩尔比40-50：40-30：10：10-1称取阳离子脂质、胆固醇、二硬磷脂酰胆碱和结构磷脂，将所称取的原料加入无水乙醇中，加热至全部溶解得到脂质乙醇溶液，将脂质乙醇溶液在高速搅拌下滴加至柠檬酸钠缓冲液中，然后在水化形成混合溶液，将混合溶液进行孵育，然后利用脂质体挤压器通过80nm孔径的滤膜后得到空白阳性脂质体；取功能化miR#4的水溶液，用柠檬酸钠缓冲液和无水乙醇配置成含醇30％的功能化miR#4溶液；将空白阳性脂质体通过交叉流的方式与等体积的功能化miR#4溶液混合，并孵育制得miR#4脂质体药物。
实施例3：
本实施例提供一种功能化miR#4的制备方法，包括如下步骤：
S1、利用化学合成的方法制备双链的miR#4核苷酸的模拟物或类似物；
S2、利用磷酸三酯、磷酸酯或亚磷酰胺化学和固相技术，或，经由脱氧核苷氢膦酸酯中间体，合成miR#4；
S3、利用核糖修饰、磷酸链修饰、碱基修饰、突出修饰和末端修饰中的一种或几种，对合成的miR#4进行结构改造。
其中，S1中的miR#4核苷酸的模拟物或类似物的正义链为5’-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-3’，反义链为5’-ACGCGAGCCGAACGAACAAAUU-3’。
S2步骤的目的在于提高miR#4的效价、血浆稳定性和专一性。
核糖修饰包括：2'-OH-或4'-O-基团被选自下组的基团取代：H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN，R＝C1-C 6烷基、烯基或炔基。
磷酸链修饰包括以硫代磷酸酯取代磷酸酯。
碱基修饰包括以含有非天然产生的核碱基代替天然产生的核碱基的核糖核苷酸，如5位处具有修饰的尿苷和胞苷，如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；8位处具有修饰的腺苷和鸟苷，如8-溴鸟苷；去氮核苷酸，如7-去氮-腺苷；O-和N-烷基化的核苷酸，如N6-甲基腺苷。
突出修饰包括脱氧残基修饰。
末端修饰包括磷酸化修饰。
实施例4：
按照摩尔比40:40:10:10称取DLinDMA，胆固醇，DSPC和DSPE-PEG2000共600mg，加入30mL无水乙醇，于60℃加热至全部溶解。随后将脂质乙醇溶液在高速搅拌下缓慢滴加至70mL柠檬酸钠缓冲液(50mM，pH＝4)中，于60℃水化30min。将混合溶液于22℃孵育5min，利用脂质体挤压器通过80nm孔径的滤膜1-3次后得到的空白脂质体(含醇30％)溶液备用。另取功能化miR#4的水溶液，用柠檬酸钠缓冲液(50mM，pH＝4)和无水乙醇配置成含醇30％的功能化miR#4溶液(0.6mg/mL)。将上述100mL功能化miR#4溶液通过交叉流的方式与等体积前述空白脂质体溶液混合，于37℃孵育30min后制备得到MiR#4脂质体药物(miR#4@LNP-1)。在进行后续实验前，miR#4@LNP-X使用透析袋(3.5MW CO)在PBS缓冲液中进行透析以去除乙醇，冻干得到粉末状miR#4@LNP-1。
实施例5：
按照摩尔比50:30:10:10称取DLinDMA，胆固醇，DSPC和DSPE-PEG2000共600mg，加入30mL无水乙醇，于60℃加热至全部溶解。随后将脂质乙醇溶液在高速搅拌下缓慢滴加至70mL柠檬酸钠缓冲液(50mM，pH＝4)中，于60℃水化30min。将混合溶液于22℃孵育5min，利用脂质体挤压器通过80nm孔径的滤膜1-3次后得到的空白脂质体(含醇30％)溶液备用。另取功能化miR#4的水溶液，用柠檬酸钠缓冲液(50mM，pH＝4)和无水乙醇配置成含醇30％的功能化miR#4溶液(0.6mg/mL)。将上述100mL功能化miR#4溶液通过交叉流的方式与等体积前述空白脂质体溶液混合，于37℃孵育30min后制备得到MiR#4脂质体药物(miR#4@LNP-2)。在进行后续实验前，miR#4@LNP-X使用透析袋(3.5MW CO)在PBS缓冲液中进行透析以去除乙醇，冻干得到粉末状miR#4@LNP-2。
实施例6：
按照摩尔比45:40:10:5称取DLinDMA，胆固醇，DSPC和DSPE-PEG2000共600mg，加入30mL无水乙醇，于60℃加热至全部溶解。随后将脂质乙醇溶液在高速搅拌下缓慢滴加至70mL柠檬酸钠缓冲液(50mM，pH＝4)中，于60℃水化30min。将混合溶液于22℃孵育5min，利用脂质体挤压器通过80nm孔径的滤膜1-3次后得到的空白脂质体(含醇30％)溶液备用。另取功能化miR#4的水溶液，用柠檬酸钠缓冲液(50mM，pH＝4)和无水乙醇配置成含醇30％的功能化miR#4溶液(0.6mg/mL)。将上述100mL功能化miR#4溶液通过交叉流的方式与等体积前述空白脂质体溶液混合，于37℃孵育30min后制备得到MiR#4脂质体药物(miR#4@LNP-3)。在进行后续实验前，miR#4@LNP-X使用透析袋(3.5MW CO)在PBS缓冲液中进行透析以去除乙醇，冻干得到粉末状miR#4@LNP-3。
对miR#4@LNP-1、miR#4@LNP-2和miR#4@LNP-3进行性能分析：
将前述实施例4-6中分别制得的miR#4@LNP-1、miR#4@LNP-2和miR#4@LNP-3进行粒径和电位分析，将一定体积的miR#4@LNP-1，miR#4@LNP-2和miR#4@LNP-3溶液分别用0.9％氯化钠溶液进行稀释，经0.22μm无菌过滤膜过滤。滤液移至经1ml EP管，用粒径分析仪(Malvern公司)检测其平均粒径为miR#4@LNP-1(92.5nm,pdi＝0.092)，miR#4@LNP-2(88.2nm,pdi＝0.075)和miR#4@LNP-3(87.6nm，pdi＝0.086)。同时用粒径分析仪(Malvern公司)检测其平均电位为miR#4@LNP-1(+37.6mV)，miR#4@LNP-2(+43.2mV)和miR#4@LNP-3(+40.9mV)。
对前述施例4-6中分别制得的miR#4@LNP-1、miR#4@LNP-2和miR#4@LNP-3进行包封率检测，将miR#4@LNP-1，miR#4@LNP-2和miR#4@LNP-3分别用TE缓冲液稀释到500ng/mL左右将采用Quant-iT RiboGreen试剂盒检测样品中miRNA的荧光值(激发波长480nm，发射波长520nm，检测范围1ng/mL到1μg/mL)。该值为游离miRNA的质量。根据公式：包封率＝(1-游离miRNA的值/miRNA总量)×100％。计算得到miR#4@LNP的包封率分别为miR#4@LNP-1为87.3％，miR#4@LNP-2为92.7％，miR#4@LNP-3为91.1％。
miR#4@LNP-1、miR#4@LNP-2和miR#4@LNP-3的粒径和电位分析、包封率数据如表2所示。
表2：miR#4脂质体药物的制备与表征
Figure BDA0002201499430000081
如图1所示，测试了miR#4@LNP-1、miR#4@LNP-2和miR#4@LNP-3对RNA的保护作用，将miR#4@LNP-1，miR#4@LNP-2，miR#4@LNP-3和未包埋miR#4分别与RNA酶37℃共孵育30min以除去可能未参与自组装的RNA，加入2mM的EDTA溶液使RNA酶失活。然后加入Triton-X100和肝素，使miR#4与LNP分离。将该溶液与6x loading buffer混匀等待上样。另将miR#4与Triton-X100和肝素混匀，与6x loading buffer混匀，作为阳性对照。制备0.5％琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，成像结果表明三种miR#4@LNP均可显著提高miR#4在血清中的稳定性,抑制了RNase的降解。
如图2所示，测试了miR#4@LNP-1、miR#4@LNP-2和miR#4@LNP-3对体外肝细胞miR#4表达调控的检测，将人肝细胞HL-7702接种于24孔板，每孔细胞接种量和培养条件均一致，培养过夜后，在每孔中加入等量的miR#4@LNP-1，miR#4@LNP-2和miR#4@LNP-3。继续培养24h后，收集细胞提取总RNA，并按照SYBR@PrimeScript@miRNA RT-PCR Kit试剂盒进行反转录和RT-PCR的检测过程。结果表明miR#4@LNP-1，miR#4@LNP-2和miR#4@LNP-3均可显著提高HL-7702细胞中miR#4的表达，其中miR#4@LNP-2组中miR#4的表达最高。
对miR#4@LNP-1、miR#4@LNP-2和miR#4@LNP-3进行小鼠实验，测试miR#4@LNP-1、miR#4@LNP-2和miR#4@LNP-3对APAP小鼠急性肝损伤的预防保护作用，将SPF级雄性BABL-C小鼠(18-22g)随机分为6组：生理盐水对照组，APAP模型组，miR#4干预组，miR#4@LNP-1干预组，miR#4@LNP-2干预组和miR#4@LNP-3干预组。干预组尾静脉注射50μg的miR#4或含相同质量miRNA的LNP。给药2h后，APAP模型组和干预组小鼠均给予350mg/kg体重的APAP，对照组小鼠给予等体积的生理盐水。给药后6,12,18,24h取血测血清生化指标谷丙转氨酶ALT的含量，给药24小时后处死小鼠，同时迅速剥离肝脏，称重后分割成小块经中性甲醛固定后HE染色观察病理学改变；其余肝组织用于提取总RNA，并按照SYBR@PrimeScript@miRNA RT-PCRKit试剂盒进行反转录和RT-PCR的检测过程。结果表明三种miR#4@LNP干预组小鼠肝脏组织学形态均较为完好，与生理盐水对照组相比无显著性差异，血清ALT水平与APAP模型组小鼠相比均显著降低。miR#4@LNP-1，miR#4@LNP-2和miR#4@LNP-3干预组小鼠肝组织中miR#4的含量与生理盐水对照组相比显著升高。其中，miR#4@LNP-2干预组小鼠肝组织中miR#4的含量升高量最大，且其血清ALT水平下降程度最高。以上结果均提示尾静脉注射miR#4@LNP可通过上调肝组织中miR#4的含量而显著保护和缓解APAP诱导的小鼠急性肝损伤，且miR#4@LNP-2的作用效果最佳。
尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

Claims (2)

1.一种 miR#4 脂质体药物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：按照摩尔比 40-50：40-30：10：10-1 称取阳离子脂质、胆固醇、二硬磷脂酰胆碱和结构磷脂，将所称取的原料加入无水乙醇中，加热至全部溶解得到脂质乙醇溶液，将所述脂质乙醇溶液在高速搅拌下滴加至柠檬酸钠缓冲液中，然后在水化形成混合溶液，将所述混合溶液进行孵育，然后利用脂质体挤压器通过 80nm 孔径的滤膜后得到空白阳性脂质体；取功能化miR#4的水溶液，用柠檬酸钠缓冲液和无水乙醇配置成含醇30%的功能化miR#4溶液；将所述空白阳性脂质体通过交叉流的方式与等体积的所述功能化 miR#4 溶液混合，并孵育制得所述 miR#4 脂质体药物。
2.根据权利要求 1 所述的 miR#4 脂质体药物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：按照摩尔比 50:30:10:10 称取 DLinDMA，胆固醇，DSPC 和 DSPE-PEG2000 共 600mg，将所称取的原料加入 30mL 无水乙醇中，加热至 60℃并使原料全部溶解到无水乙醇中得到脂质乙醇溶液，将所述脂质乙醇溶液在高速搅拌下滴加至 70mL、50mM、pH=4 的柠檬酸钠缓冲液中，然后在 60℃下水化 30min 形成混合溶液，将所述混合溶液在 22℃下孵育5min，然后利用脂质体挤压器通过 80nm 孔径的滤膜 1-3 次后得到空白阳性脂质体；取功能化 miR#4 的水溶液，用 50mM、pH=4 的柠檬酸钠缓冲液和无水乙醇配置成含醇 30%的0.6mg/mL 的功能化 miR#4 溶液；将 100mL 的功能化 miR#4 溶液通过交叉流的方式与等体积的所述空白阳性脂质体混合，并在 37℃下孵育 30min 后制得所述 miR#4 脂质体药物。
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