CN112587541B - Nadph和维生素e联合用于制备预防或者治疗肝损伤的药物的应用 - Google Patents

Nadph和维生素e联合用于制备预防或者治疗肝损伤的药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药研究领域，具体涉及NADPH和维生素E联合用于制备预防或者治疗肝损伤的药物的应用。NADPH和维生素E在一定剂量范围内可发挥协同作用，对四氯化碳引起的肝损伤具有很好的保护作用，不仅能够显著降低谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)以及总胆红素(TB)的含量，而且能够增加肝细胞ATP的含量，降低肝细胞和血清中的MDA水平，提高肝细胞和血清中的SOD、GSH水平以及肝细胞中的CAT水平。通过细胞实验也证明，NADPH和维生素E联合用药可以显著减轻由CCl4诱导的肝损伤模型的肝细胞存活率的降低程度，从而发挥预防或者治疗肝损伤的作用。

Description

NADPH和维生素E联合用于制备预防或者治疗肝损伤的药物的 应用
技术领域
本发明涉及生物医药研究领域，具体涉及NADPH和维生素E联合用于制备预防或者治疗肝损伤的药物的应用。
背景技术
肝脏作为人体第二大器官，并且参与维持体内药物和化学毒物的解毒，是对于生物体来说必不可少的代谢解毒器官。肝损伤在许多急性和慢性临床疾病中发生，这些疾病包括药物或者化学毒物诱导的肝毒性、病毒感染、血管损伤、自身免疫疾病和创伤等。因为这些临床疾病而发生的肝损伤的症状包括例如，暴发性肝衰竭伴随胆汁淤积、肝病变和肝组织坏死，严重影响患者的存活率，因此寻找预防或者治疗肝损伤的药物具有重要意义。
临床上用于治疗肝损伤的药物主要有：注射用还原型谷胱甘肽，中药材五味子，甘草酸苷注射液，N-乙酰半胱氨酸(NAC)，多烯磷脂酰胆碱等。但是存在疗效不理想、使用不方便、使用剂量过大、甚至伴有严重不良反应等的问题。还原性辅酶II(NADPH)主要来源于磷酸戊糖途径，可由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)，6-葡萄糖磷酸脱氢酶(6GPDH)，NADP依赖性苹果酸酶(MEP)和异柠檬酸脱氢酶(IDP)以及反式氢化酶(TH)产生。NADPH作为一种递氢体参与体内多中合成代谢反应，如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成，并且在维持生物体内还原型谷胱甘肽(GSH)的含量以及提高过氧化氢酶(CAT)水平以增加抗氧化能力以及在降低活性氧(ROS)的水平中起到重要作用。但是NADPH又可作为NADPH氧化酶的底物产生ROS。发明人前期研究发现NADPH对对乙酰氨基酚(APAP)诱导的急性肝损伤没有改善作用，NADPH对肝损伤的作用也未见其他报道。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种NADPH的新应用，即NADPH和维生素E联合用于制备预防或者治疗肝损伤的药物的应用。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供了NADPH和维生素E联合用于制备预防或者治疗肝损伤的药物中的应用。
其中，NADPH的结构式如下：
Figure BDA0002880350360000021
进一步地，所述NADPH和维生素E的质量比为2-8:40-160。
进一步地，所述NADPH和维生素E的质量比为4:80。
进一步地，所述NADPH和维生素E在同一制剂单元中，或者所述NADPH和维生素E分别在不同种的制剂单元中。
进一步地，所述NADPH和药学上可接受的载体形成第一制剂；所述维生素E和药学上可接受的载体形成第二制剂。
进一步地，所述第一制剂为注射剂，所述第二制剂为口服给药制剂；所述口服给药制剂为片剂、溶液剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、混悬剂或者口服缓控释制剂；所述药学上可接受的载体选自药学上可接受的溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗粘合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、高分子骨架材料和成膜材料中的至少一种。
进一步地，所述肝损伤为急性肝损伤。
进一步地，所述肝损伤为化学性肝损伤。
进一步地，所述肝损伤为四氯化碳诱导的肝损伤。
进一步地，所述肝损伤是癌症、肝硬化、病毒感染、先天性代谢障碍、创伤、自身免疫性疾病、血色素沉积症、高草酸尿、草酸盐沉积症、威尔逊氏病、药物或者化学毒物诱导的肝毒性导致的。
进一步地，所述癌症为肝癌、胆管癌或肝腺瘤；所述自身免疫疾病为自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化或原发性硬化性胆管炎；所述病毒感染为甲型肝炎感染、乙型肝炎感染或戊型肝炎感染；
所述药物诱导的肝毒性为对乙酰氨基酚诱导的肝毒性或者中药药源性肝损伤；所述化学毒物诱导的肝毒性为酒精诱导的肝毒性或者四氯化碳(CCl4)诱导的肝毒性。
本发明还提供了一种预防或治疗肝损伤的药物，所述药物包括NADPH和维生素E。
进一步地，所述NADPH和维生素E的质量比为2-8：40-160，优选为4:80。
进一步地，所述药物包括NADPH和药学上可接受的载体形成的第一制剂，以及维生素E和药学上可接受的载体形成的第二制剂。
进一步地，所述第一制剂为注射剂，所述第二制剂为口服给药制剂；所述口服给药制剂为片剂、溶液剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、混悬剂或者口服缓控释制剂；所述药学上可接受的载体选自药学上可接受的溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗粘合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、高分子骨架材料和成膜材料中的至少一种。
本发明还提供了NADPH在制备预防或治疗化学性肝损伤的药物中的应用。
进一步地，所述化学性肝损伤是四氯化碳诱导的肝损伤。
进一步地，所述化学性肝损伤是化学毒物诱导的肝毒性导致的，所述化学毒物诱导的肝毒性为酒精诱导的肝毒性或者四氯化碳诱导的肝毒性。
进一步地，所述药物以NADPH为活性成分，还包括药学上可接受的载体；
所述药物为凝胶剂、乳霜剂、片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、糖浆剂、煎膏剂、栓剂、气雾剂、贴膏剂、软膏剂、注射剂、喷剂、搽剂、酊剂、湿敷剂、糊剂、洗剂或者口服缓控释制剂；
所述药学上可接受的载体选自药学上可接受的溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗粘合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、高分子骨架材料和成膜材料中的至少一种。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明通过NADPH和维生素E(简写为VE)联合用药，两者可发挥协同作用，对四氯化碳引起的肝损伤作用具有很好的保护作用，不仅能够显著降低谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)以及总胆红素(TB)的含量，而且能够增加肝细胞ATP的含量，降低肝细胞和血清中的MDA水平，提高肝细胞和血清中的SOD、GSH水平以及肝细胞中的CAT水平。通过细胞实验也证明，NADPH和维生素E联合用药可以显著减轻由CCl4诱导的肝损伤模型的肝细胞存活率的降低程度，从而发挥预防或者治疗肝损伤的作用。
2、本发明通过细胞实验证实NADPH单独用药可以明显减轻由CCl4诱导的肝损伤模型的肝细胞存活率的降低程度，提高肝细胞存活率；通过动物实验证明NADPH中高剂量组可以显著降低谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的活性，高剂量组可以显著降低碱性磷酸酶(ALP)以及总胆红素(TB)的含量，对于四氯化碳诱导的肝损伤能够发挥较好的治疗作用。
3、NADPH在四氯化碳和对乙酰氨基酚引起的急性肝损伤都有一定的抗氧化作用，但是在对乙酰氨基酚引起的急性肝损伤中没有保护作用，由此说明NADPH保护四氯化碳引起的肝损伤有独特的机制，而抗氧化也许不是他的主要机制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中NADPH联合VE给药两小时后NADPH在体内各脏器的含量分布结果示意图；
图2为实施例2中NADPH联合VE对CCl4诱导的小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)的影响结果示意图；
图3为实施例2中NADPH联合VE对CCl4诱导的小鼠血清中谷草转氨酶(AST)的影响结果示意图；
图4为实施例2中NADPH联合VE对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤中肝指数(Liverindex)的影响结果示意图；
图5为实施例2中NADPH联合VE对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤中碱性磷酸酶(ALP)的影响结果示意图；
图6为实施例2中NADPH联合VE对CCl4诱导的小鼠血清中总胆红素(TB)的影响结果示意图；
图7为实施例2中NADPH联合VE对CCl4诱导的急性小鼠肝损伤模型中肝脏组织HE染色图(×100)；
图8为实施例2中NADPH联合VE对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型中肝脏组织的油红O染色图；
图9为实施例2中NADPH联合VE对CCl4诱导的小鼠ATP水平的影响结果示意图；
图10为实施例3中NADPH联合VE对CCl4诱导的体外L-02细胞存活率(CellViability)的影响结果示意图；
图11为实施例2中NADPH联合VE对CCl4诱导的小鼠肝脏组织以及血清中SOD水平和MDA水平的影响结果示意图；
图12为实施例2中NADPH联合VE对对CCl4诱导的小鼠肝脏组织以及血清中GSH水平和CAT水平的影响结果示意图；
图13为实施例4中NADPH在对乙酰氨基酚过量引起的肝损伤的影响结果示意图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实验例1NADPH在体内各脏器的代谢分布情况
1、药物与试剂
pH 8的NaOH缓冲溶液：称取适量NaOH溶于蒸馏水，充分溶解后，加浓盐酸(分析纯)将pH调至8；
NADPH溶液的配制：称取8mg NADPH溶于10ml pH＝8的NaOH缓冲溶液中，得到浓度为0.8mg/ml的NADPH溶液。
2、实验方法
ICR小鼠10只，雄性，20～25g，随机分成2组，分别为正常组(Ctrl)，NADPH组(NADPH)。
实验前，对各组小鼠进行称重，各组小鼠24h内禁食不禁水，然后对各组进行以下处理，正常组：根据小鼠体重，按10ml/kg动物体重腹腔注射生理盐水。NADPH组：先配制0.8mg/ml的NADPH缓冲液，然后根据小鼠体重按10ml/kg动物体重腹腔注射配好的NADPH缓冲液。禁食不禁水，2h后处死各组小鼠，取小鼠各脏器用生理盐水冲洗干净后，采用NADPH试剂盒(购自Bio Assay Systems公司)并按照试剂盒说明书进行各脏器NADPH含量的测定。
各脏器NADPH的含量测试结果如图1所示，实验结果显示，在给药两小时后，各脏器NADPH含量都有所升高。其中，心脏、大脑NADPH含量升高并不显著，但是肝脏、肾脏在给予NADPH两小时后较正常组有明显升高。这表明NADPH相比于其他脏器更容易汇集于肝脏及肾脏，提示NADPH可能对肝脏疾病有较好的治疗效果。
实验例2NADPH联合维生素E对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的影响
一、试剂与动物
维生素E溶液(VE溶液)：将40、80、160mg维生素E粉末溶于10ml的10％甘油水溶液中制得三支浓度分别为4、8、16mg/ml的VE溶液。
NADPH溶液：将2、4、8的NADPH粉末溶于NaOH缓冲液制得三支浓度分别为0.2、0.4、0.8mg/ml的NADPH溶液。
橄榄油：购自西班牙伯爵集团。
CCl4溶液：将CCl4(分析纯)溶解于纯橄榄油中，制得体积百分数为0.35％的CCl4溶液。
ICR的雄性小鼠，体重范围为20-25g，购自于昭衍新药研究中心(中国，苏州)。将动物饲养在温度为22±1℃和湿度为65±5％的环境中，光照/黑暗周期为12h/12h。所有涉及动物实验均根据《苏州大学实验动物饲养管理和使用指南》进行。
二、实验方法
1、分组给药方案
将ICR雄性小鼠随机分为15组，每组七只，分别为模型组(又称为CCl4组)、正常组、3组NADPH单用组、3组VE单用组和7组联合用药组。各NADPH单用组、VE单用组和联合用药组均为治疗组，各个治疗组在实验造模前0.5h给予一次相应药物治疗，然后为了诱导急性肝损伤肝损伤模型，给予除正常组以外各组一次单一剂量的CCl4(均是以10ml/kg动物体重的剂量灌胃给予体积百分数为0.35％的CCl4溶液)，CCl4造模后0.5h第二次药物治疗，第二次给药后4h进行最后一次药物治疗，共三次药物治疗。当各治疗组和模型组造模时，灌胃按体重给予正常组相应体积的橄榄油，每次治疗组给药时均对正常组小鼠腹腔注射相同体积的pH为8的NaOH缓冲溶液。在给予CCl4后禁食不禁水。其中，各治疗组按照下述进行给药处理：
NADPH单用组分为(1)NADPH低剂量组：腹腔注射浓度为0.2mg/ml的NADPH溶液；以NADPH的质量计，给药剂量为2mg/kg动物体重；
(2)NADPH中剂量组：腹腔注射浓度为0.4mg/ml的NADPH溶液；以NADPH的质量计，给药剂量为4mg/kg动物体重；
(3)NADPH高剂量组：腹腔注射浓度为0.8mg/ml的NADPH溶液；以NADPH的质量计，给药剂量为8mg/kg动物体重；
VE单用组分为(1)VE低剂量组：灌胃给予浓度为4mg/ml的VE溶液；以VE的质量计，给药剂量为40mg/kg动物体重；
(2)VE中剂量组：灌胃给予浓度为8mg/ml的VE溶液；以VE的质量计，给药剂量为80mg/kg动物体重；
(3)VE高剂量组：灌胃给予浓度为16mg/ml的VE溶液；以VE的质量计，给药剂量为160mg/kg动物体重。
联合用药组分为(1)联合用药2:40组：腹腔注射浓度为0.2mg/ml的NADPH溶液；以NADPH的质量计，给药剂量为2mg/kg动物体重，然后灌胃给予浓度为4mg/ml的VE溶液；以VE的质量计，给药剂量为40mg/kg动物体重；
(2)联合用药2:80组：腹腔注射浓度为0.2mg/ml的NADPH溶液；以NADPH的质量计，给药剂量为2mg/kg动物体重，然后灌胃给予浓度为8mg/ml的VE溶液；以VE的质量计，给药剂量为80mg/kg动物体重；
(3)联合用药2:160组：腹腔注射浓度为0.2mg/ml的NADPH溶液；以NADPH的质量计，给药剂量为2mg/kg动物体重，然后灌胃给予浓度为16mg/ml的VE溶液；以VE的质量计，给药剂量为160mg/kg动物体重；
(4)联合用药2:40组：腹腔注射浓度为0.2mg/ml的NADPH溶液；以NADPH的质量计，给药剂量为2mg/kg动物体重，然后灌胃给予浓度为4mg/ml的VE溶液；以VE的质量计，给药剂量为40mg/kg动物体重；
(5)联合用药4:40组：腹腔注射浓度为0.4mg/ml的NADPH溶液；以NADPH的质量计，给药剂量为4mg/kg动物体重，然后灌胃给予浓度为4mg/ml的VE溶液；以VE的质量计，给药剂量为40mg/kg动物体重；
(6)联合用药8:40组：腹腔注射浓度为0.8mg/ml的NADPH溶液；以NADPH的质量计，给药剂量为8mg/kg动物体重，然后灌胃给予浓度为4mg/ml的VE溶液；以VE的质量计，给药剂量为40mg/kg动物体重；
(7)联合用药4:80组：腹腔注射浓度为0.4mg/ml的NADPH溶液；以NADPH的质量计，给药剂量为4mg/kg动物体重，然后灌胃给予浓度为8mg/ml的VE溶液；以VE的质量计，给药剂量为80mg/kg动物体重。
2、实验处理
(1)生化测试
CCl4造模后48h，对各组小鼠眼球取血，4℃下离心取血清储存于-80℃以做血清生化分析用。血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、肝指数、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(DB)均通过全自动生化仪进行测量。
(2)HE染色
小鼠取血后颈椎脱臼处死，取各组小鼠肝脏称重后一部分用做组织病理学分析，一部分储存于-80℃备用。染色步骤如下：冰冻切片：取出动物实验结束后固定在10％甲醛中固定的小鼠肝脏组织，将组织切片成20μM的厚度，全部切好后冻存于-20℃冰箱中。固定切片：从冰箱中取出冰冻切片，在室温下复温处理。使用组织固定液对切片上的细胞进行固定，在固定结束后通风晾干。油红染色：将晾干后的切片放入新鲜的油红染液中染色，染色结束后用蒸馏再次冲洗。分化背景：使用75％酒精分化后用蒸馏水流清洗干净。苏木素染色：苏木素染色，蒸馏水冲洗，分化，返蓝。封片：吸干切片上残留的水份，吸取少量的甘油明胶封片。使用尼康光学显微镜在镜下观察，并保存图像。
(3)对肝细胞中腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的影响测定
取联合用药4:80组、VE中剂量组(80mg/kg)和NADPH中剂量组(4mg/kg)动物进行如下实验。
每组动物剪取适量肝脏组织按常规方法制成组织裂解液，使用二辛可宁酸(BCA)蛋白定量试剂盒(购自Thermo公司)按照试剂盒说明书中记载的方法对每组的蛋白浓度进行测定，加入生理盐水将各组蛋白浓度调节至一致水平，采用ATP试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)，根据ATP试剂盒供应厂家提供的说明书对各组蛋白样中ATP的含量进行测定，然后在Excel表格中计算出每毫克蛋白中ATP的含量(单位：％)。
(4)对肝细胞和血清中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的影响测定
每组动物剪取适量肝脏组织按常规方法制成组织裂解液，使用二辛可宁酸(BCA)蛋白定量试剂盒按照试剂盒说明书中记载的方法对每组的蛋白浓度进行测定，采用SOD试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)和MDA试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)分别按照试剂盒说明书的方法测试SOD和MDA的水平，其中SOD和MDA相互配合，SOD反应细胞清除自由基的能力，MDA反应细胞受自由基攻击的程度，测定结束后，在Excel表格中中计算出单位蛋白浓度下相关抗氧化相关酶的酶活力(单位：U/mg蛋白)。
(5)对肝细胞和血清中GSH和CAT含量的影响测定
每组动物剪取适量肝脏组织按常规方法制成组织裂解液，使用二辛可宁酸(BCA)蛋白定量试剂盒，按照试剂盒说明书中记载的方法对每组的蛋白浓度进行测定，采用GSH试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)和CAT试剂盒(同上)分别按照试剂盒说明书的方法测试GSH和CAT的水平，其中GSH是一种自由基清除剂，可以清除各类自由基，由于过氧化氢酶它的独特的分解过氧化氢的作用，因此也是作为评价抗氧化作用能力的一个重要指标，测定结束后，在Excel表格中中计算出单位蛋白浓度下相关抗氧化相关酶的酶活力(单位：U/mg蛋白)。
3、实验结果
(1)生化测试结果
模型组小鼠肝脏表面出现明显的颗粒状并且部分小鼠肝脏变白硬化，如图2-6所示，相比于正常组，模型组小鼠肝指数(Liver index)明显升高，血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)以及总胆红素(TB)的含量均有明显升高(*p<0.05**p<0.01***p<0.001****p<0.0001，####p<0.0001)。相比于模型组，NADPH高剂量组和VE高剂量组小鼠肝脏指数、AST、ALT、ALP和TB的含量均有明显降下降，而其他NADPH单用组和其他VE单用组小鼠肝脏指数、ALT、ALP和TB的含量无明显变化。相比于模型组，联合用药组小鼠肝脏指数、AST、ALT、ALP和TB的含量均有明显降下降。
根据金氏定律q＝C/(A+B-A×B)，其中C代表联用组检测指标变化率，A,B代表单用组检测指标变化率，变化率＝(模型组-试验组)/模型组×100％；当q值大于1.16代表两药具有协同作用。各组ALT、AST、肝指数、ALP和TB的q值见下表所示，表明NADPH联合VE使用好于单独使用NADPH和单独使用VE的作用之和，达到协同效果。我们选取效果最好的一组即两种药物的中间剂量联合使用组进行下一步实验。
表1各剂量组合联合应用后的q值
组别 鼠数 ALT/q值 AST/q值 ALP/q值 肝指数/q值 TB/q值
联合用药2：40组 7 2.3 2.32 1.64 3.36 2.33
联合用药4：40组 7 1.92 2.09 1.73 176.29 1.72
联合用药8：40组 7 1.33 1.51 1.16 7.21 0.98
联合用药2：40组 7 2.35 2.18 1.57 3.89 2.43
联合用药2：80组 7 2.2 2.33 1.79 170.73 1.61
联合用药2：160组 7 1.58 1.63 1.14 5.08 1.33
联合用药4：80组 7 2.28 2.02 1.78 4.89 1.3
(2)HE染色结果
如图7所示，正常组肝脏组织结构完整，无炎症细胞浸润、水肿现象，CCl4组细胞大量丢失，炎性浸润、水肿明显。联合用药组细胞形态恢复，排列有序。
如图8所示，CCl4组可以看到明显的脂滴聚集，联合用药组细胞的脂肪变性和脂质积累明显得到改善。
(3)对肝细胞中ATP的影响
结果见图9所示，与CCl4组相比，NADPH单用组和VE单用组可以部分升高小鼠肝脏中ATP含量，而联合用药4:80组可以明显增加小鼠肝细胞中ATP的含量。
(4)对肝细胞和血清中SOD和MDA的影响
结果见图11所示，与正常组相比，CCl4组小鼠血清和肝脏中SOD水平明显下降(p<0.01,p<0.01)，而相比于CCl4组，联合用药4:80组由造模导致的SOD水平下降程度得到改善，SOD水平显著提高(p<0.01,p<0.01)。与正常组相比，造模组小鼠肝脏和血清中的MDA水平明显上升(p<0.01，p<0.0001)，联合用药4:80组由CCl4导致的MDA水平升高程度明显改善，MDA水平明显降低(p<0.01,p<0.0001)。
(5)对肝细胞和血清中GSH和CAT的影响
结果见图12所示，在小鼠肝脏组织中，与正常组相比，CCl4组肝细胞中GSH水平下降(p<0.01)。与SOD变化类似，在给予NADPH联合VE治疗后明显改善了由CCl4导致的GSH水平下降，与CCl4组相比，联合用药4:80组肝细胞中GSH水平得到明显提高(p<0.0001)。在小鼠肝脏组织中，与正常组相比，CCl4组肝细胞中CAT水平明显下降(p<0.0001)，再给予联用治疗后，改善了由CCl4导致的CAT水平下降，与CCl4组相比，联合用药4:80组肝细胞中CAT水平得到明显提高(p<0.0001)。而血清中的CAT水平与肝组织中相反，这可能是因为小鼠在应激状态下(CCl4施用)机体出现的一种保护反应(释放大量的过氧化氢酶入血)来抵抗这种应激状态。
实验例3NADPH联合维生素E对L-02细胞的影响
1、实验材料
NADPH溶液：将NADPH溶于无菌注射用水中配置成10mM(mmol/L)的NADPH母液，使用无菌过滤器过滤灭菌后分装与-80℃保存。使用时，采用完全培养基为稀释试剂，按照母液与稀释试剂的体积比为1：2000将10mM的NADPH母液进行稀释，得到浓度为5μM(μmol/L)的NADPH溶液。
VE溶液：将10％甘油水溶液用无菌过滤器过滤灭菌，维生素E粉末在紫外灯下照射灭菌，使用10％甘油水溶液将VE溶液配置成100mM的VE母液。使用时，采用完全培养基为稀释试剂，按照母液与稀释试剂的体积比为1：1000将100mM/L VE母液进行稀释，得到100μM的VE混悬液。
完全培养基：1640培养基与FBS按照体积比为9：1混合，1640培养基购自Sigma，FBS购自SERANA。
2、实验方法
在体外培养L-02细胞(人正常肝细胞)，待细胞汇合至80％进行处理，将细胞用完全培养基进行重悬并调整细胞浓度为105/ml浓度，铺至96孔板中，每孔给予200μl，各组接种6个复孔，放入37℃培养箱进行培养。待细胞汇合至70％左右时，依次在每组对应的孔中加入相应的药物进行处理，其中正常组和CCl4组进行等量换液处理，吸去液体，加入200μl新鲜的完全培养基，将各组96孔板放至37℃培养箱继续培养24h。其中各组按照如下给药方案进行给药：
NADPH组：每孔加入上述用培养基稀释成浓度为5μM的NADPH溶液200μl。
VE组：每孔加入上述用培养基稀释成浓度为100μM的VE溶液200μl。
联合用药组：每孔加入完全培养基200μl，按照1:1000的比例加入浓度为5mM的NADPH母液0.2μl，同时按照1:1000的体积比给予浓度为100mM的VE母液0.2μl。轻轻晃动使混匀。
培养24h后，用长枪尖吸去培养基内液体，在CCl4组、NADPH组、VE组和联合用药组各孔中加入用完全培养基稀释至浓度为10mM的CCl4溶液200μl，对照孔正常换液，处理后放入37℃培养箱中孵育24h。待24h后加入2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(CCK8)溶液和完全培养基以体积比为1：10混合均匀的溶液于各个孔中并放入37℃培养箱中继续培养3h。3h后取出96孔板在450nm处测量吸光度。
3、实验结果
结果见图10所示，CCl4组较正常组的吸光度值显著降低，细胞存活率大大降低。NADPH组和维生素E组可以部分减轻由CCl4引起的细胞存活率降低，相比于CCl4组，联合用药组细胞存活率显著提高，说明NADPH联合VE可以显著减轻由CCl4诱导的细胞存活率降低，q＝1.18>1.16，说明联合用药组中NADPH和维生素E产生了协同增效的作用。
实验例4NADPH对对乙酰氨基酚(APAP)诱导的急性肝损伤的作用及其机制初探
一、实验材料与动物
维生素E溶液：与实验例2中维生素E溶液的配制方法相同；
NADPH溶液：与实验例2中NADPH溶液的配制方法相同；
对乙酰氨基酚(APAP)溶液：将对乙酰氨基酚溶于37℃的热水中，配制得到浓度为370mg/kg的APAP溶液；
N-乙酰半胱氨酸(NAC)溶液：将100mgNAC溶于10ml生理盐水中，配制得到NAC溶液。
ICR小鼠，体重范围为20-25g，购自于昭衍新药研究中心(中国，苏州)。将动物分类并饲养在温度为22±1℃和湿度为65±5％的环境中，光照/黑暗周期为12h/12h。所有涉及动物实验均根据《苏州大学实验动物饲养管理和使用指南》进行。
二、实验方法
1、动物分组给药
将ICR小鼠随机分为6组，每组七只，分别为模型组、正常组、NADPH低剂量组、NADPH中剂量组和NADPH高剂量组。在实验开始前，每组小鼠禁食不禁水9h。除正常组以外，每组小鼠灌胃给予37mg/ml的APAP溶液以诱导对乙酰氨基酚过量模型，以APAP的质量计，每组小鼠给予370mg/kg动物体重，正常组小鼠给予相同体积的橄榄油。NADPH低剂量组、NADPH中剂量组和NADPH高剂量组在给予APAP半小时后开始给药，每隔4h给一次，共三次。每次给药时均对正常组小鼠腹腔注射相同体积的pH为8的NaOH缓冲溶液。NAC组腹腔注射一次质量浓度为10mg/ml的NAC溶液；以NAC的质量计，给药剂量为100mg/kg。各组小鼠正常饮食饮水。其中，NADPH低剂量组、NADPH中剂量组和NADPH高剂量组按照如下进行给药处理：
(1)NADPH低剂量组：腹腔注射浓度为0.2mg/ml的NADPH溶液；以NADPH的质量计，给药剂量为10ml/kg动物体重；
(2)NADPH中剂量组：腹腔注射浓度为0.4mg/ml的NADPH溶液；以NADPH的质量计，给药剂量为10ml/kg动物体重；
(3)NADPH高剂量组：腹腔注射浓度为0.8mg/ml的NADPH溶液；以NADPH的质量计，给药剂量为10ml/kg动物体重。
2、实验处理
在APAP处理24h后，对各组小鼠采取眼球取血方式取净血液，将小鼠肝脏冻存于-80备用。小鼠的肝脏组织使用MDA试剂盒并按照试剂盒说明书的方法各组小鼠肝脏中的检测MDA水平，并且使用Western blotting检测与抗氧化相关蛋白4-羟基壬烯醛(4-HNE)蛋白水平变化。
3、实验结果
如图13所示，ALT、AST结果表明，无论是2,4,8mg/kg的NADPH都不能改善对乙酰氨基酚过量诱导的肝损伤，而NAC能够较好地改善由于对乙酰氨基酚过量引起的肝损伤。并且我们发现各组的MDA水平没有显著性差异，并且氧化损伤相关蛋白4-HNE蛋白水平正常组较低，模型组显著升高，2,4,8mg/kg NADPH依次梯度降低，NAC组蛋白水平显著下降。4-HNE氧化损伤相关蛋白在给予NADPH后梯度降低，但却没有药效，且MDA水平在每组之间没有明显差异。
在两种模型中，NADPH和维生素E对四氯化碳引起的肝损伤都有良好的保护作用，在联合应用NADPH+维生素E后产生协同作用，有更好的肝保护作用。NAC对对乙酰氨基酚引起的急性肝损伤有保护作用，但是NADPH没有保护作用。NADPH在四氯化碳和对乙酰氨基酚引起的急性肝损伤都有一定的抗氧化作用，但是在对乙酰氨基酚引起的急性肝损伤中没有保护作用，由此说明NADPH保护四氯化碳引起的肝损伤有独特的机制，而抗氧化也许不是他的主要机制。NADPH的肝保护作用没有公考资料报道，NADPH与维生素E的联合应用产生了协同效应也没有公开文献报道。本发明可为四氯化碳引起的化学性肝损伤提供一个潜在的治疗药物。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.NADPH和维生素E联合用于制备预防或者治疗肝损伤的药物的用途，其特征在于，所述NADPH为外源NADPH，所述NADPH和维生素E的质量比为2-8：40-160；所述肝损伤为四氯化碳诱导的肝损伤。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述NADPH和维生素E的质量比为4:80。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述NADPH和维生素E在同一种制剂单元中，或者所述NADPH和维生素E分别在不同种的制剂单元中。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述NADPH和药学上可接受的载体形成第一制剂；所述维生素E和药学上可接受的载体形成第二制剂。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述第一制剂为注射剂，所述第二制剂为口服给药制剂；所述口服给药制剂为片剂、溶液剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、混悬剂或者口服缓控释制剂；所述药学上可接受的载体选自药学上可接受的溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗粘合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、高分子骨架材料和成膜材料中的至少一种。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述肝损伤为急性肝损伤；所述肝损伤为化学性肝损伤。
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