KR101999383B1 - 매생이 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents
매생이 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 매생이 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 알코올로 인한 간세포의 손상을 보호하고, 활성산소종의 생성을 억제하며, 활성산소종의 생성을 억제한다. 본 발명은 알코올성 간 손상에 대한 보호 효과를 갖는 천연물로서 매생이 추출물을 제안한다. 천연물 소재의 조성물로 의약품 제조에 있어 입수가 용이하고 경제적인 이점을 갖는다.
Description
본 발명은 매생이 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
간질환에서 알코올성 간질환의 유병율과 사망률은 전세계적으로 중요한 문제이며, 알코올성 간질환은 간경변증, 간염 또는 간암으로 임상 진단되고 있다. 미국의 알코올성 간질환 통계에 의하면 습관적 음주자의 10-15%는 간경변으로 발전하며, 음주자 중 간경변 환자의 대부분을 자신이 간경변을 가지고 있는지 모른채로 살다가 30-40% 정도의 사람들이 부검에 의해 간경변 환자로 밝혀지고 이들의 5년 생존율은 계속 음주를 하는 경우 68.2%정도로 알려져 있다. 국내의 경우도 과음, 폭음, 잦은 음주의 형태로 인하여 알코올성 간질환 유병율이 높게 나타나고 있다. 알코올은 사회적으로 사람의 감정을 풍부하게 하고, 분위기를 즐겁게 하고, 적당한 알코올 섭취는 혈액순환을 도와주는 역할을 갖는 긍정적인 면을 갖고 있지만, 과음, 폭음, 무절제한 음주습관 등으로 인한 알코올 의존증, 알코올성 간경변 등의 만성적 알코올 질환을 유발할 수 있는 부정적인 면을 갖고 있는 기호식품이다. 섭취된 알코올은 위장과 소장의 사부에서 확산 작용에 의해 쉽게 흡수되며, 섭취된 에탄올은 거의 완전히 흡수되어 각 조직으로 운반되며 일부는 대사되지 않은 채 폐를 통해 배출되거나 소변 및 땀으로 배설된다. 알코올에 의한 독성은 고지혈증, 지방간 같은 간 기능의 이상을 유발하며, 만성적 간 조직의 구조 및 기능에 치명적인 손상을 가져오게 된다(1). 만성적인 알코올의 섭취는 지방산의 산화를 저해함으로써 혈중 중성지방의 농도를 높일 수 있고 결과적으로 지방간 원인이 될 수 있다(2). 알코올은 저장되지 않고 거의 대사되며, 알코올 디하이드로제아나제(Alcohol Dehydrogenase; ADH), 마이크로솜 에탄올-산화 시스템(Microsomal Ethanol-Oxidizing Systme; MEOS), 카탈라제(catalase) 등의 효소계에 의해 산화되어 아세트알데히드(acetaldehyde)로 산화되며 아세트알데히드는 아세트알데히드 디하이드로제나아제(ALDH)의 도움으로 대사되어 아세트산을 생성하며 이 아세트산은 아세틸-coA로 전환되어 TCA회로를 거쳐 에너지를 발생하거나 콜레스테롤과 지방산 합성에 이용된다(3). MEOS는 간세포 내 소포체에 결합되어 있고 시토크롬 p450의 효소를 보유하고 있어 과량의 알코올 섭취시 다량 발현되어 알코올의 산화에 작용한다. 이 효소 반응의 산물로 산화스트레스가 유발되고 지질과산화물의 다량 생산과 단백질 및 핵산에 손상을 유발시킬 수 있다. 카탈라제는 퍼옥시솜(peroxisome)에 존재하며 물과 함께 알코올의 산화에 작용한다. 과량 및 만성 알코올 섭취자의 간세포 손상은 알코올 섭취에 따른 CYP2E1 대사에 의한 과도한 산화스트레스가 병인으로 주목 받고 있다. 즉 이 과정에서 발생하는 활성산소의 생성과 항산화계 활성의 감소는 간손상의 주요 원인으로 보고되고 있다. 이러한 활성산소로 인한 간세포 손상을 억제하는 방법은 직접적으로 항산화효소를 증강 및 활성산소를 제거하는 것, 간접적으로 반응성이 강한 중간체를 만들어 시토크롬 P450 계열 효소의 활성을 조절하는 두 가지 기전을 제시하고 있다. 그리고 지질과산화는 활성산소종들에 의해 매개된 기작으로서 여러 동물 및 인체실험들을 통하여 다양한 종류의 간 손상을 일으키는 것으로 알려져 왔다. 알코올성 간질환과 예방 및 치료에 유효한 활성소재의 개발연구에서 시토크롬 P450 효소들의 활성에 작용하는 영향과 조직 내 항산화계의 활성을 연구하는 부분이 알코올성 간세포 손상을 보호하는 소재를 연구하는 중요한 연구 방향으로 알려져 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Chae HB. Alcoholic Liver Disease. Korean J Gastroenterol. 53(5) 275-357 (2009)
Rouach H, Clement M, Ofanelli MT, Janvier B, Nordmann J, Nordmann R. Hepatic lipid peroxidation and mitochondrial susceptibility to peroxidative attacks during ethanol inhalation and withdrawal. Biochem. Biophys. Acta. 753: 439-444 (1983)
Zakhari S. Overview: how is alcohol metabolized by the body?. Alcohol Res & Health. 29(4), 245-254 (2006)
본 발명자들은 알코올에 의해 유도된 간 손상에 대한 보호활성을 갖는 천연물 소재를 찾고자 노력하였다. 그 결과, 매생이 추출물이 알코올로 인한 간세포의 손상을 보호하고, 활성산소종의 생성을 억제하며, 동물실험을 통해 알코올에 의한 간 손상 개선 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 알코올성 간질환의 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 간 건강 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 간 건강 개선용 기능성식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 혈중 중성지방 개선용 기능성식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 매생이(Capsosiphon fulvescens) 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 알코올에 의해 유도된 간 손상에 대한 보호활성을 갖는 천연물 소재를 찾고자 노력하였다. 그 결과, 매생이 추출물이 알코올로 인한 간세포의 손상을 보호하고, 활성산소종의 생성을 억제하며, 활성산소종의 생성을 억제함을 확인하였다.
본 발명의 조성물에서 이용되는 매생이 추출물은 매생이에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다.
상기 매생이 추출물은 매생이를 물, 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 조추출물 일 수 있다.
매생이의 조추출물 제조에 사용되는 한 용매에 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는 1%이상 내지 100%(v/v)미만, 2%이상 내지 90%(v/v)미만, 3%이상 내지 80%(v/v)미만, 4%이상 내지 70%(v/v)미만, 5%이상 내지 60%(v/v)미만, 6%이상 내지 50%(v/v)미만, 7%이상 내지 40%(v/v)미만, 8%이상 내지 30%(v/v)미만, 9%이상 내지 20%(v/v)미만, 1%이상 내지 80%(v/v)미만, 1%이상 내지 70%(v/v)미만, 1%이상 내지 60%(v/v)미만, 5%이상 내지 50%(v/v)미만, 5%이상 내지 40%(v/v)미만, 5%이상 내지 30%(v/v)미만, 5%이상 내지 20%(v/v)미만 또는 5%이상 내지 15%(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액, 예를 들어, 10%(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액일 수 있다.
또한, 상기 알코올 수용액은 메탄올 수용액, 에탄올 수용액, 프로판올 수용액, 및 부탄올 수용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어, 에탄올 수용액인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 매생이 추출물은 용매 조추출물을 추가의 용매로 분획한 용매 분획물일 수 있으며, 예를 들면 상기 용매 조추출물에 에틸에테르, 아세트산에틸, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.
예를 들면, 상기 매생이를 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 용매 조추출물을 에틸에테르, 아세트산에틸, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.
상기 매생이 추출물은 매생이의 용매 조추출물, 용매 분획물을 포함하며 상술한 바와 같다.
상기 매생이 추출물은 매생이의 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을, 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 조추출물일 수 있다.
상기 용매는 1%이상 내지 100%(v/v)미만, 2%이상 내지 90%(v/v)미만, 3%이상 내지 80%(v/v)미만, 4%이상 내지 70%(v/v)미만, 5%이상 내지 60%(v/v)미만, 6%이상 내지 50%(v/v)미만, 7%이상 내지 40%(v/v)미만, 8%이상 내지 30%(v/v)미만, 9%이상 내지 20%(v/v)미만, 1%이상 내지 80%(v/v)미만, 1%이상 내지 70%(v/v)미만, 1%이상 내지 60%(v/v)미만, 5%이상 내지 50%(v/v)미만, 5%이상 내지 40%(v/v)미만, 5%이상 내지 30%(v/v)미만, 5%이상 내지 20%(v/v)미만 또는 5%이상 내지 15%(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액, 예를 들어, 10%(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 매생이 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 매생이 추출물에 포함되는 것이다.
본 발명에서 이용되는 매생이 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 하기의 매생이 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 천연식물재료인 매생이로부터 추출한 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 매생이 추출물이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “알코올성 간질환”은 알코올의 과도한 섭취에 의한 간 이상 상태로, 급성 또는 만성 알코올성 간질환을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 알코올성 간질환은 알코올성 지방간, 알코올성 간염, 알코올성 만성 간염, 알코올성 간섬유증, 알코올성 간경변 또는 알코올성 간암이다.
본 발명의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 매생이 추출물은 알코올에 의한 간내 AST(aspartate transaminase) 및 ALT(alanine transaminase) 활성 증가를 개선시키는 효과를 갖는다(표 4).
본 발명의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 매생이 추출물은 알코올에 의한 혈중 중성지방(TG)의 증가를 개선시키는 효과를 갖는다(표 5).
본 발명의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 매생이 추출물은 알코올 투여에 의한 간 내 CAT(catalase), SOD(superoxide dismutase), GST(glutathione S transferase), GR(glutathione reductase), GPx(glutathione peroxidase) 및 GSH(glutathione) 활성의 감소를 증가시키는 효과를 갖는다(표 6).
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 매생이 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 매생이 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한양을 의미한다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 매생이 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 건강 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 매생이 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 매생이 추출물 뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 매생이 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 매생이 추출물을 유효성분으로 포함하는 간건강 개선용 기능성식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 매생이 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 개선 또는 예방용 조성물은 기능성식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물이 기능성식품 조성물로 제조되는 경우, 식품 제조 시 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서 매생이 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마린, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 매생이 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈중 중성지방 개선용 기능성식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 혈중 중성지방의 개선은 알코올 섭취에 의해 증가된 혈중 중성지방의 개선이다.
본 발명의 상기 혈중 중성지방 개선용 기능성식품 조성물은 상기 알코올성 간질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 매생이 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물은 알코올로 인한 간세포의 손상을 보호하고, 활성산소종의 생성을 억제하며, 활성산소종의 생성을 억제한다.
(c) 본 발명은 알코올성 간 손상에 대한 보호 효과를 갖는 천연물로서 매생이 추출물을 제안한다. 천연물 소재의 조성물로 의약품 제조에 있어 입수가 용이하고 경제적인 이점을 갖는다.
도 1은 매생이 에탄올 추출물의 제조방법을 나타낸다.
도 2는 매생이 에탄올 추출물의 세포독성 결과를 나타낸다.
도 3은 HepG2/2E1 세포에서 매생이 에탄올 추출물의 알코올성 간손상 보호 활성을 나타낸다.
도 4는 HepG2/2E1 세포에서 매생이 에탄올 추출물의 세포내 활성산소종의 생성 억제 활성을 나타낸다.
도 5는 HepG2/2E1 세포에서 매생이 에탄올 추출물의 지질과산화 억제 활성을 나타낸다.
도 6은 동물 모델에서 매생이 에탄올 추출물의 알코올에 의해 유도된 지질과산화 과정의 억제 활성을 나타낸다. 데이터는 평균±표준편차로 나타냈고, Duncan's multiple range test (P < 0.05)를 통해 통계적 차이를 확인하였으며, ‘Control’은 ‘대조군’, ‘normal control’을 의미하고, ‘Ethanol’은 ‘에탄올 처리군’으로, ‘5 g/kg b.w./day 에탄올’을 투여한 군이고, ‘Silymarin’은 ‘양성 대조군’으로, 5 g/kg b.w./day ethanol with 50 mg/kg b.w./day 처리한 군이며, ‘CFE’는 매생이 10% 에탄올 추출물을 300 mg/kg/day로, 5 g/kg b.w./day 에탄올과 함께 처리한 군을 의미한다. 하기 도 7 및 8의 동물모델도 동일하다.
도 7은 동물 모델에서 매생이 에탄올 추출물의 간 조직 내 CYP2E1 mRNA 발현 증가 활성을 나타낸다.
도 8은 동물 모델에서 매생이 에탄올 추출물의 간 조직 내 AMPK(5' AMP-activated protein kinase), CPT-1(Carnitine palmitoyltransferase I), PPAR-α(Peroxisome proliferator-activated receptor alpha) 증가 및 SREBP-1c(Sterol regulatory element-binding proteins-1c), ACC(Acetyl-CoA carboxylase) 감소 활성을 나타낸다.
도 2는 매생이 에탄올 추출물의 세포독성 결과를 나타낸다.
도 3은 HepG2/2E1 세포에서 매생이 에탄올 추출물의 알코올성 간손상 보호 활성을 나타낸다.
도 4는 HepG2/2E1 세포에서 매생이 에탄올 추출물의 세포내 활성산소종의 생성 억제 활성을 나타낸다.
도 5는 HepG2/2E1 세포에서 매생이 에탄올 추출물의 지질과산화 억제 활성을 나타낸다.
도 6은 동물 모델에서 매생이 에탄올 추출물의 알코올에 의해 유도된 지질과산화 과정의 억제 활성을 나타낸다. 데이터는 평균±표준편차로 나타냈고, Duncan's multiple range test (P < 0.05)를 통해 통계적 차이를 확인하였으며, ‘Control’은 ‘대조군’, ‘normal control’을 의미하고, ‘Ethanol’은 ‘에탄올 처리군’으로, ‘5 g/kg b.w./day 에탄올’을 투여한 군이고, ‘Silymarin’은 ‘양성 대조군’으로, 5 g/kg b.w./day ethanol with 50 mg/kg b.w./day 처리한 군이며, ‘CFE’는 매생이 10% 에탄올 추출물을 300 mg/kg/day로, 5 g/kg b.w./day 에탄올과 함께 처리한 군을 의미한다. 하기 도 7 및 8의 동물모델도 동일하다.
도 7은 동물 모델에서 매생이 에탄올 추출물의 간 조직 내 CYP2E1 mRNA 발현 증가 활성을 나타낸다.
도 8은 동물 모델에서 매생이 에탄올 추출물의 간 조직 내 AMPK(5' AMP-activated protein kinase), CPT-1(Carnitine palmitoyltransferase I), PPAR-α(Peroxisome proliferator-activated receptor alpha) 증가 및 SREBP-1c(Sterol regulatory element-binding proteins-1c), ACC(Acetyl-CoA carboxylase) 감소 활성을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 세포 실험
매생이 에탄올 추출물의 제조
완도군 고금면에서 채취한 매생이(Capsosiphon fulvescens)를 건조시켜 분쇄 하여 25 g에 10% 에탄올 혼합용매 1.5 L를 가하여 250℃에서 3시간 동안 환류추출 한 다음 식혔다. 그 후에 원심분리(7,000 rpm, 30분)후 여과를 하였다. 여액을 감압 농축하여 -20℃에서 얼린 후 동결건조기를 이용하여 -80℃에서 7일 동안 동결건조기로 건조하였다. 본 발명의 매생이 10% 에탄올 추출물 25.2 g(수득률: 25.18%)을 수득하여 하기 실험예의 시료(이하 ‘CAFE10'라 명명함)로 사용하였다(도 1).
HepG2 세포의 2E1 DNA 트랜스펙션
본 실험에 사용된 HepG2/2E1 세포는 생리활성물질의 알코올성 산화스트레스 보호 활성을 평가하기 위해서 시토크롬 P450 2E1 및 시토크롬 p450 환원효소(reductase) 유전자를 과다 발현되도록 제조되었다. 이 세포는 일반 간암 세포주 및 정상 간세포에서 빠르게 분해되는 되는 효소인 CYP2E1과 알코올성 산화스트레스를 보다 효과적으로 평가할 수 있도록 설계하여 본 in vitro 연구에 이용하였다. HepG2/2E1 세포는 0.5%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신(50 g/㎖ 스트렙토마이신, 50 IU/㎖ 페니실린) 및 2 mM L-글루타민을 함유한 MEM(Minimum Essential Media)을 배양액에 10%(v/v) FBS(Fetal Bovine Serum)를 첨가하여 사용하였고, 37℃, 5% CO2, 95% 습공기(humid air)로 조절된 배양기에서 배양하였다. 배지는 2 일마다 교환하였으며, 컨플로언시(confluency)가 80% 되었을 때 0.05% Trypin/EDTA를 처리하여 계대배양을 실시하며 배양하였다.
형질전환 과정은 1 ㎕의 DNA(P450 2E1 및 시토크롬 p450 환원효소 과발현용 플라스미드)에 10 ㎕의 컴피턴트 세포를 혼합하여 형질전환 세포를 제조하였다. 4 g/100 ㎖(고체배지/증류수)로 삼각플라스크에 넣어 121℃에서 15분 동안 멸균을 한 후 30분 정도 식힌 후 굳기 전에 AMP(Ampicillin) 10 ㎕를 넣어주었다. 준비한 디쉬에 3분에 2만큼 부어주어 기포가 생기지 않게 해준 후 식힌 후 다 마르면 준비한 DNA, 컴피턴트 세포를 혼합한 형질전환 세포 10 ㎕를 도말하였다. 골고루 문질러 준 후 30℃ 항온반응기에 뒤집어서 14시간 배양하였다. 14시간 후 콜로니가 자라면 15 g/600 ㎖(액체배지/증류수)를 비커에 넣어 녹인 후 다 녹으면 삼각플라스크에 100 ㎕씩 6개로 나누어 멸균한다. 식힌 후 각 플라스크에 100 ㎕씩 AMP를 넣어준 후 고체배지에서 얻은 DNA 콜로니를 100 ㎕ 팁으로 때서 각각 삼각플라스크에 넣어준 후 16시간 동안 37℃에서 200 rpm에서 진탕배양 하였다. DNA 추출 과정은 플라스미드 DNA 정제 키트를 사용하여 DNA 추출하였다. 진탕배양이 끝난 후 50 ㎖ 튜브에 50 ㎖씩 옮긴 후 3,500 rpm에서 10분 동안 원심분리 후 상층액을 버렸다. M1 완충액(Resuspension Buffer, Intronbio, DMA-midiTM SV Plasmid DNA Purification kit) 2 ㎖을 넣고 덩어리가 없어질 때까지 볼텍싱 후 M2 완충액(Lysis Buffer) 2 ㎖를 넣고 위아래로 조심히 흔들어 준 후 3분 동안 상온에 방치하였다. 그 후 M3 완충액(Neutralization Buffer) 2 ㎖를 넣고 조심히 위아래로 흔들어 얼음에 5분 동안 방치하였다. 용 해물을 Pre 컬럼에 넣고 3,500 rpm에서 5분 동안 원심분리 후 통과액을 바인딩 컬럼에 옮겨 3,500 rpm에서 5분 동안 원심분리 후 바인딩 컬럼을 제거하고, 통과액을 버린 후 사용한 튜브에 바인딩 컬럼을 다시 끼워 세척 완충액 A(Washing Buffer A) 10 ㎖을 넣고 3,500 rpm에 5분간 원심분리 후 통과액을 버린 후 세척 완충액 B(Washing Buffer B) 10 ㎖을 넣고 3,500 rpm에 5분 동안 원심분리 후 바인딩 컬럼을 건조시키기 위해 3,500 rpm에서 15분 동안 원심 분리하고 50 ㎖ 새 튜브에 바인딩 컬럼을 옮겨 용해 완충액(Elution Buffer) 600 ㎕를 컬럼 중앙에 넣고 10분 동안 상온에서 항온반응 한 후 3,500 rpm에서 5분 동안 원심분리를 실시하였다. 수율을 높이기 위해 통과액을 다시 한번 원심분리를 실시하였다. 2E1 DNA 트랜스펙션 과정은, 트랜스펙션하기 바로 전날 6×10 (cells/dish) 으로 세포를 MEM 배양액에 10%(v/v) FBS만 첨가 된 배양배지를 사용하여 분주(seeding) 한 후 16시간동안 배양하였다. 다음날 리포펙타민 60 ㎕와 DNA 24 ㎍를 각각 Opti-MEM에 1.5 ㎖ 씩 분주 한 후 5분 뒤 DNA 및 리포펙타민을 합쳐서 20분 동안 항온반응하였다. 전날 분주해놓은 세포를 꺼내 PBS로 세척한 후 프리 배지(FBS 및 페니실린이 들어가지 않은 MEM)를 15 ㎖ 분주 후 20분간 항온반응이 끝난 DNA 및 리포펙타민의 혼합액을 모두 디쉬에 분주하였다. 다음날 배양배지(10% FBS, 1% 페니실린)를 교체하였다.
HepG2 2E1 세포에 CAFE10 시료 농도별 세포독성 평가
세포독성은 24 웰 플레이트에 2×105 cells/well의 세포를 분주한 후 16시간동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 시료가 용해된 3% FBS가 함유된 MEM 배지를 각 1 ㎖씩 분주하여 재배양 실시하고, 24시간 간격으로 시료 처리 및 배양을 3일 동안 반복하였다. 5일째 되는 날 각 웰에 0.25 ㎖의 XTT-PMS 용액(1 ㎎ XTT 및 10 ㎍ PMS/㎖ of PBS)을 첨가하고 2시간 배양 한 후에 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. CAFE10 시료를 대상으로 XTT 분석 방법을 이용하여 세포독성을 평가하였다. 최고 1000 ㎍/㎖까지 세포독성을 평가한 결과 세포독성이 나타나지 않았다. 최고 1000 ㎍/㎖까지 세포독성의 안전범위를 확인하였다(도 2).
HepG2 2E1 세포에 CAFE10 시료의 알코올성 간손상 보호 활성
세포독성실험을 바탕으로 안전성이 확인된 농도범위에서 매생이 10% 시료의 알코올성 간손상 억제 활성을 평가하였다. 24 웰 플레이트에 HepG2/2E1 세포를 5×104 cells/well로 씨딩하여 16시간 후에 시료를 첨가하고, 30분 후에 250 mM의 알코올을 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 간격으로 시료 처리와 알코올 처리를 3일 동안 반복하였다. 5일째 되는 날 각 웰에 0.25 ㎖의 XTT-PMS 용액(1 ㎎ XTT 및 10 g PMS/㎖ of PBS)을 첨가하고 다시 2 시간 동안 배양한 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군은 시료 대신 배지를 사용하였으며 양성 대조군으로는 250 mM 알코올만을 처리하였다. 실험방법은 다음에 제시하였다.
본 실험에서 사용된 HepG2/2E1 세포는 약물과 영양성분에 대한 대사가 사람 간세포에서 이루어지고 있는 것과 동일한 양상을 나타내어 사람의 간에서의 대사를 연구하는데 널리 이용되는 사람 간세포 유래의 배양세포 HepG2에 과량의 알코올대사 반응하여 산화스트레스를 유발하는 시토크롬 P450 2E1 효소 유전자를 트랜스펙션하여 제조한 세포이다. 본 연구에서는 이 세포를 이용하여 생체에서 일어나는 과량의 알코올성 산화스트레스에 대한 시료의 세포 보호효과를 평가하였다. 선행된 세포독성 평가를 바탕으로 CAFE10-500 ㎍/㎖과 함께 알코올로 유도된 HepG2/2E1 세포의 알코올성 세포독성에 대한 보호효과를 평가하였다. 세포독성에 대한 보호효과를 평가한 결과 세포보호효과가 나타났다(도 3). 따라서 CAFE10는 알코올성 간세포 손상 보호 효과를 갖는 활성물질이 함유 되어 있는 것으로 판단되었다.
HepG2 2E1 세포에 CAFE10 시료의 세포 내 ROS 억제 활성
세포내 ROS 형성능은 DCF-DA(Dichlorofluorescein diacetate)를 이용하여 측정하였다. HepG2/2E1 세포를 5×104 cells/well로 24 웰 플레이트에 24시간 배양하고 다음날 농도별로 제조한 시료를 1 ㎖씩 분주하였다. 24시간이 지난 후 에탄올을 150 mM DCF-DA와 시료를 첨가하고 2시간 경과 후 PBS로 세척 후 30 μM DCF-DA를 1 ㎖씩 처리하여 30분 동안 항온반응시켰다. 30분이 지난 후 DCF-DA를 제거한 후 PBS 1 ㎖씩 넣어 주어 여기(excitation) 485 ㎚ 및 방출(emission) 530 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
DCF-DA는 세포막을 통해 확산되며 세포내 에스터라아제에 의해 효소적으로 가수분해 되어 비형광성 DCF-H가 되며, 세포내 활성산소종(Reactive Oxygen Species; ROS)가 존재할 경우 매우 빠르게 높은 형광을 띈 DCF(Dichlorofluorescein)로 산화된다. 알코올성 간세포 손상 보호효과가 있는 CAFE10 시료 별로 DCF-DA를 UPE10을 최대 500 ㎍/㎖ 농도에서 DCFH-DA를 이용하여 세포내 ROS 생성량을 측정하였다. 그 결과, 도 4에서와 같이 알코올에 의해 세포내 다량 생성된 ROS가 미역과 매생이 추출물 처리에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다.
HepG2 2E1 세포에 CAFE10 시료의 지질과산화 억제 활성
용해한 세포를 대상으로 말론디알데히드(Malondialdehyde; MDA)가 지질과산화의 분해산물인 티오바르비탈산(Thiobarbituric acid; TBA)과 반응할 때 나타내는 붉은 색을 535 ㎚에서 측정하는 티오바르비탈산 분석 방법을 이용하여 측정하였다.
티오바르비탈산으로 반응으로 발색시켜 말론디알데히드의 양을 측정한 결과, 알코올 대조군인 p.control은 100±22.76 ㎍/㎖ 프로테인으로, control(40.14±10.64 ㎍/㎖ 프로테인), CAFE10(41.61±6.89 ㎍/㎖ 프로테인)에 비교하여 현저히 증가하였다(도 5). 이러한 결과로부터 CAFE10은 지질과산화물 생성을 억제시킬 수 있는 소재로 판단된다.
실시예 2: 동물 실험
실험재료
2014년 12월에 전남 완도군 고금면에서 재배된 매생이를 구입하여 사용하였다. 시료의 전체를 흐르는 물에 씻어 건조한 후 분쇄기(Hanil, Gimposi, Korea)로 분쇄하여 -20℃의 냉동고에 보관하여 사용하였다.
실험동물 및 식이
본 동물실험은 독성평가를 위해 4주령 수컷 ICR 마우스를 사용하였고, 간보호 효과 평가를 위해 8주령 수컷 C57BL/6 마우스를 구입하여 일주일간 사육실 환경에 적응 시킨 후 실험에 사용하였다. 조명시간을 아침 8시부터 저녁 8시 까지 12시간, 실내온도 및 습도는 23±3℃, 55±15%로 조절된 사육실에 사육 하였다. 사료는 일반식이 5L79 diet (Orient Bio, Iksan, Korea), 급수는 수돗물 을 사용하였으며 사료와 급수는 제한하지 않았다.
실험방법
매생이 추출물 제조
매생이를 건조시켜 분쇄한 분말 25 g에 10% 에탄올 혼합용매 1.5 L를 가하여 250℃에서 3시간 동안 환류 추출하였다. 냉각 후에 원심분리(7,000 rpm, 30분, Supra 22K, Hanil, Gimposi, Korea)한 후 Whatman paper No. 6 필터지(Whatman, New Jersey, USA)를 사용하여 여과 하고, 여액을 감압 농축하여 -20℃에서 얼린 후 동결건조기(freeze-dryer, Bondiro DC1316 Ilshin Lab CO., LTD., Yangju, Korea)를 사용하여 -80℃, 5기압 에서 일주일 동안 동결건조하여 실험에 사용할 때까지 20℃에 유지하였다. 매생이 추출물을 'CFE'로 명명하였다.
In vivo
에서 간 보호 활성
가. 동물모델에서 간 보호 효과
8주령의 수컷 C57BL/6 마우스(22-24 g)의 알코올성 간 손상 보호 활성을 확인 하고자 구입 후 1주일간 사육실 환경에 적응시킨 후, 무작위로 8마리씩 4군으로 나누었다. 음성대조군(Control), 에탄올 처리군(Ethanol), 양성대조군(Sily marin, 50 mg/kg b.w./day), CFE(매생이 10% 에탄올 추출물 : 300 mg/kg b.w./day)군으로 나누고 5일간 각 시료를 경구투여 하였다. 시료투여 기간 동안 음성대조군과 에탄올 처리군은 증류수를 시료대신 투여하였으며 시료 투여군은 각각 용량에 맞게 시료를 경구투여 하였다. 6일, 7일, 8일 총 3 일간 알코올 5 g/kg b.w./day의 양을 에탄올 처리군, 양성대조군, CFE군에 12시간 간격으로 5회에 걸쳐 투여하고 음성대조군은 동일한 용량의 증류수를 투여하였다. 마지막 투여 6시간 후에 해부하여 혈액 및 간 조직을 적출하였다. 8일간 실시되는 실험에서 사용된 모든 동물에 대하여 실험 초기부터 마지막 실험 종료 시까지 체중을 측정하고, 실험 종료 시 대조군 및 시료 투여 군의 모든 생존 동물을 부검하였다. 혈액 및 간 조직은 80℃에서 저장하였다.
나. 혈청 중 간기능지표 효소활성 측정
CFE의 농도별 투여에 의한 독성평가와 간보호 효과 평가로서 혈청 Alanine Aminotransferase(AST) 및 Aspartate Aminotransferase(ALT) 활성수준을 검토하였다. 간세포가 손상되면 수송기능 및 막 투과성에 변화를 초래하여 결국 세포로부터 AST 및 ALT와 같은 효소가 순환계로 다량 방출되게 되는데 이는 독성화 과정 중 간 조직 막의 손상을 의미한다. AST와 ALT는 Reitman과 Frankel's 방법으로 측정은 상용화된 키트(Asan, Seoul, Korea)를 사용하여 분석하였고, 그 단위는 Karmen/mL으로 표시하였다. 시료의 투여 6시간 후, 혈액 시료를 수집하고, 수집 한 후 1시간 내에 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하였다. 혈액은 80℃에서 저장하였다.
다. 조직의 항산화계 활성 측정
1) 간 균질화
채취한 간을 10배의 PBS(pH 7.4)와 함께 유리-테플론 균질기(Daihan, Seoul, Korea)로 균질화 하였다. 1 mL의 간균질액에 5Χ lysis buffer 200 μL를 첨가하여 13,000 rpm에서 30분간 원심분리 하였다. 투명한 상층액 100 μL에 PBS 900 μL로 희석하여 사용하였다. 본 균질액은 CAT, SOD, GST, GR, GPx 및 GSH, MDA 활성측정에 사용하였다.
2) 단백질 정량
단백질 함량은 소혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)을 표준 곡선으로 하고 브래드포드의 분석 방법으로 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
3) 카탈라아제(Catalase, CAT)
카탈라아제(CAT)활성은 Aebi 등의 분광광도계 방법으로 분석하였다. 조직액 10 uL에 20 mM H2O2용액 290 uL를 첨가하여 마이크로플레이트 리더기(Synergy HT, BioTek)의 kinetic방법을 이용하여 3분간 240 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 카탈라아제 효소의 활성은 U/mg protein으로 환산하였다.
4) 수퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide Dismutase, SOD)
수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)은 Ukeda 등의 방법으로 분석하였다. 활성은 시료와 대조군에 동일한 시료 20 μL씩을 준비한 후 WST-1 용액 (2-(4-lodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt)를 200 μL 씩 분주한 뒤, 잔틴 산화효소 용액을 20 μL씩 첨가하여 마이크로플레이트리더기(Synergy HT, BioTek)로 37 ℃에서 15분간 반응시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. SOD 효소활성은 상용화된 SOD 효소를 0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 U/mL 농도로 작성된 표준곡선으로 계산하고 U/mg protein으로 계산하였다.
5) 글루타티온-
S
-전이효소(Glutathione-
S
-Transferase, GST)
글루타티온-S-전이효소(GST)활성은 Habig 등의 방법으로 분석하였다. phosphate buffered saline 196 μL와 200 mM reduced glutathione 2 μL, 100 mM CDNB 용액 2 μL을 혼합한 기질액을 준비하여 조직액 20 μL에 기질액 180 μL를 첨가하여 마이크로플레이트리더기(Synergy HT, BioTek)의 kinetic방법을 이용하여 5분간 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. GST 효소활성은 U/mg protein으로 환산하였다.
6) 글루타티온 환원효소(Glutathione Reductase, GR)
글루타티온 환원효소(GR)는 Smith 등의 방법으로 분석하였다. 조직액 20 μL에 100 mM potassim phosphate buffer (pH7.0) 30 μL, 2 mM oxidized glutathione 100 μL, 3 mM DTNB 50 uL를 넣어 혼합한 후, 2 mM NADPH 10 μL를 첨가하여 효소반응을 유도하고 마이크로플레이트리더기(Synergy HT, BioTek)의 kinetic방법을 이용하여 5분간 412 nm에서 GR 효소 활성을 측정하였다. GR 효소활성은 U/mg protein으로 계산하였다.
7) 글루타티온 과산화효소(Glutathione Peroxidase, GPx)
글루타티온 과산화효소(GPx)활성은 Thomson 등의 방법으로 분석하였다. 조직액 20 μL에 3.5 mM reduced glutathione 120 μL, 2.5 mM NADPH 20 μL, 0.5 U glutathione reductase 20 μL를 넣어 잘 혼합한 후, 30 mM tert-butyl hydroperoxide 20 μL를 첨가하여 효소 반응을 유도하고 마이크로 플레이트리더기(Synergy HT, BioTek)의 kinetic방법을 이용하여 5분간 340 nm에서 GPx 활성을 측정하였다. GPx 효소활성은 U/mg protein으로 계산 하였다.
8) 글루타티온(Glutathione, GSH)
글루타티온(GSH)함량은 Akerboom 등의 방법으로 분석하였다. 100 mM potassim phosphate buffer (pH7.0) 7.54 mL, 6 unit glutathione reductase 228 μL, 3 mM DTNB 228 μL를 혼합하여 기질액을 준비한 후, 조직액 20 μL 와 준비한 기질액 150 μL를 잘 혼합한 후 50 mM NADPH를 50 μL 첨가하여 반응을 유도하고 마이크로플레이트리더기(Synergy HT, BioTek)의 kinetic방법을 5분간 412 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 조직내의 GSH량은 GSH 표준곡선으로 계산하여 μmoles/mg protein으로 나타내었다.
9) 말론디알데하이드(Malondialdehyde, MDA)
조직액 내의 지질과산화물의 함량은 지질과산화물이 티오바르비툴산과 반응하여 생성되는 티오바르비툴산 반응성물질(Thiobarbituric acid reactive substanc es, TBARs)을 생성하는 원리를 이용하여 이 티오바르비툴산 반응성물질인 말론디알데하이드(MDA)를 표준물질로 하여 그 함량을 평가하였다. 조직 균질액을 녹인 후 3,000 rpm에서 30분 동안 원심분리(MICRO 17R, Hanil, Gimposi, Korea)한 후 상층액을 1.5 mL tube에 옮긴 후 1X phosphoric acid를 250 μL과 0.375% TBA를 250 μL씩 첨가하여 잘 혼합하였다. 이 혼합액을 항온수조에 60℃, 60분 동안 반응시킨 후 부탄올 500 μL를 넣어 섞은 후 30분 동안 두었다가 5,000 g에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 535 nm에서 분광광도계(Synergy HT, BioTek)를 사용하여 측정하였다. 흡광도를 통해 MDA 표준곡선을 이용하여 계산하였고 μM/g tissue로 나타내었다.
라. Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real-Time PCR)을 이용한 조직의 mRNA발현량 측정
easy-BLUE™ (Intron Biotechnology, Gyeonggi-do, Korea)시약을 사용하여 추출된 RNA 샘플은 나노드롭 측정으로 RNA의 양을 확인 하였다. Real-Time PCR에 사용 된 프라이머 시퀀스들은 표 1에 나타내었다. cDNA합성은 cDNA Synthesis 키트(Bio-Rad, CA, USA)를 사용하여 합성하였다. Real-Time PCR은 키트에 지시되어있는 정량법에 따라 수행하였다. 본 실험을 위하여 SYBR® Green Supermix 키트(Bio-Rad, CA, USA)를 사용하였다.
| - | 프라이머 | 방향 | 서열 | 서열목록 |
| H u m a n |
β-ACTIN | F | ACGGCCAGGTCATCACTATTG | 제1서열 |
| R | CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA | 제2서열 | ||
| CYP2E1 | F | CGTGGAAATGGAGAAGGAAA | 제3서열 | |
| R | GGTGATGAACCGCTGAATCT | 제4서열 | ||
| AMPK | F | GGCACCCTCCCATTTGATG | 제5서열 | |
| R | ACACCCCCTCGGATCTTCTT | 제6서열 | ||
| SREBP-1c | F | CGGAACCATCTTGGCAACA | 제7서열 | |
| R | GCCGGTTGATAGGCAGCTT | 제8서열 | ||
| ACC | F | TGCAGATCTTAGCGGACCAA | 제9서열 | |
| R | GCCTGCGTTGTACAGAGCAA | 제10서열 | ||
| CPT-1 | F | TGTTGGGTATGCTGTTCATGACA | 제11서열 | |
| R | GCGGCCTGGGTAGGAAGA | 제12서열 | ||
| PPARα | F | AACATCCAAGAGATTTCGCAATC | 제13서열 | |
| R | CCGTAAAGCCAAAGCTTCCA | 제14서열 | ||
| M o u s e |
β-ACTIN | F | ACGGCCAGGTCATCACTATTG | 제15서열 |
| R | CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA | 제16서열 | ||
| CYP2E1 | F | ATGTCATCCCCAAGGGTACA | 제17서열 | |
| R | AGGGCTGAGGTCGATATCCT | 제18서열 | ||
| AMPK | F | TCGTGCCGCCCCTTT | 제19서열 | |
| R | GGTCAGCATGCCCACAAAA | 제20서열 | ||
| SREBP-1c | F | CCAGAGGGTGAGCCTGACAA | 제21서열 | |
| R | AGCCTCTGCAATTTCCAGATCT | 제22서열 | ||
| ACC | F | TCCCAAGTTCTTCACGTTCA | 제23서열 | |
| R | CAGGCTCCAAGTGGCGATAA | 제24서열 | ||
| CPT-1 | F | GTGACTGGTGGGAGGAATAC | 제25서열 | |
| R | GAGCATCTCCATGGCGTAG | 제26서열 | ||
| PPARα | F | TGGCAAAAGGCAAGGAGAAG | 제27서열 | |
| R | CCCTCTACATAGAACTGCAAGGTTT | 제28서열 |
통계 분석
실험결과는 in vitro는 평균±표준편차, in vivo는 평균±표준오차로 나타내었다. 군 간의 비교는 one-way ANOVA를 통해 분석하였으며, Duncan의 다중검정법(Duncan's multiple range test)을 이용하여 사후검정을 실시하였다 (P<0.05).
실험결과
가. 간 보호 효과 평가
1) 몸무게, 생존율 및 장기무게
마우스 몸무게(표 2), 생존율 및 장기(표 3) 무게를 나타낸 표이다. 모든 군의 생존율은 100%를 나타냈다. 음성대조군과 비교하여 에탄올처리 군에서 간 무게가 유의하게 증가된 것으로 나타났다.
| Group |
NO.of
Mouse |
Survival
Rate (%) |
Initial Weight (g) | Final Weight (g) |
| 대조군 | 8 | 100 | 23.69 ± 0.631)NS | 22.29 ± 0.851)NS |
| 에탄올 처리군 | 8 | 100 | 23.31 ± 0.85 | 21.96 ± 0.94 |
| 양성 대조군 | 8 | 100 | 23.51 ± 0.41 | 22.50 ± 0.68 |
| CFE | 8 | 100 | 24.13 ± 0.85 | 22.56 ± 0.92 |
| Group |
NO.of
Mouse |
Relative Organ Weights (%) | ||
| Liver | Kidney | Spleen | ||
| 대조군 | 8 | 3.82 ± 0.211)c | 1.23 ± 0.062)NS | 0.23 ± 0.012)NS |
|
에탄올
처리군 |
8 | 4.57 ± 0.32a | 1.20 ± 0.04 | 0.20 ± 0.03 |
|
양성
대조군 |
8 | 4.18 ± 0.35ab | 1.23 ± 0.04 | 0.19 ± 0.01 |
| CFE | 8 | 4.19 ± 0.33ab | 1.25 ± 0.10 | 0.20 ± 0.02 |
상기 표 2 및 3의 데이터는 평균±표준편차로 나타냈고, Duncan's multiple range test (P < 0.05)를 통해 통계적 차이를 확인하였으며, ‘NS’는 ‘not significant’를 의미하고, ‘대조군’은 ‘normal control’을 의미하며, ‘에탄올 처리군’은 ‘5 g/kg b.w./day 에탄올’을 투여한 군이고, ‘양성 대조군’은 Silymarin을 5 g/kg b.w./day ethanol with 50 mg/kg b.w./day 처리한 군이며, ‘CFE’는 매생이 10% 에탄올 추출물을 300 mg/kg/day로, 5 g/kg b.w./day 에탄올과 함꼐 처리한 군을 의미한다. 이하 표 4 내지 6도 동일하게 처리한 시료이다.
2) 혈청 AST 및 ALT 활성
표 3은 AST 및 ALT를 나타낸 표이다. 음성대조군과 비교하여 에탄올 처리군의 AST 및 ALT 활성수준을 검토하였다. AST활성은 음성대조군과 비교하여 에탄올 처리군은 52%로 증가하였다. 에탄올 처리군과 비교하여 Silymarin군과 CFE군은 16%로 정도 감소하였다. 이는 알코올 투여에 따른 간 손상과 혈중 AST 효소 활성의 증가가 Silymarin과 CFE투여로 정상 수준으로 유지될 수 있다고 생각된다. 또한 ALT활성은 음성대조군과 비교하여 에탄올 처리군에서 35%로 증가하였다. 에탄올 처리군과 비교하여 Silymarin군과 CFE군은 각각 20%, 16%로 정도 감소하였다. 이는 알코올 투여에 따른 간 손상과 혈중 ALT 효소 활성의 증가가 Silymarin군과 CFE군에서 정상 수준으로 유지 될 수 있음을 확인한 것이다. 이러한 결과로부터 CFE가 음성대조군과 유사한 알코올에 의한 간 보호 효과를 갖는 것으로 생각된다(표 4).
| Group | AST (Karmen/mL) | ALT (Karmen/mL) |
| 대조군 | 89.28 ± 3.211)c | 27.82 ± 1.511)c |
| 에탄올 처리군 | 136.42 ± 6.23a | 37.60 ± 1.55a |
| 양성 대조군 | 114.52 ± 4.37b | 29.85 ± 2.77b |
| CFE | 114.49 ± 6.23b | 30.94 ± 1.87b |
나. 중성지방(Triglyceride, TG)함량
중성지방(TG)은 체내에 있는 지방의 일종이다. 체내의 에너지 중 사용되지 않는 것은 피하지방으로 축적되는데 그 대부분이 중성지방이다. 혈중 중성지방의 유래에는 외인성(식사성)과 내인성(체내합성)이 있고, 고지방식, 고칼로리식, 고당질식, 비만, 지방간 등에서 증가하는 경향을 보인다. 본 연구에서는 각 군의 혈청 중성지방을 함량을 측정하였다. 음성대조군과 비교하여 에탄올 처리군은 78%로 증가하였다. 에탄올 처리군과 비교하여 Silymarin군과 CFE군은 각각 54%, 50%로 감소하였다(표 5).
| Group | TG (mg/dL) |
| 대조군 | 158.71 ± 2.82b |
| 에탄올 처리군 | 283.24 ± 19.90a |
| 양성 대조군 | 153.49 ± 7.46b |
| CFE | 141.82 ± 7.54b |
다. 에탄올 투여 마우스의 항산화 효소 활성
1) 간조직의 항산화 효소 활성
CAT는 시토크롬계를 보유하고 있는 모든 호기성 세포에 널리 분포되어 있는 효소로서 특히 간에 가장 많이 함유되어 있다. 이 효소는 과산화수소수를 물과 산소로 분해시키는 역할을 담당하고 있다. 알코올 투여 시 CAT 활성은 급격히 감소되었다. 이는 알코올에 의해 유도된 세포 내 라디칼에 의하여 효소활성이 감소된 것으로 보이며 효소 활성이상의 라디칼의 과생성에 기인되는 것으로 추정된다. 간 손상에 양성 대조군과 CFE 투여에 따른 CAT 활성 이 에탄올 처리군에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P < 0.05, 표 6). SOD는 반응성이 높으며 독성을 유발하는 라디칼 초과산화물 음이온을 과산화수소수로 불균등화 시키는 역할을 담당하는 매우 효과적인 항산화 효소이다. 본 실험에서 마우스에 알코올 투여 시 SOD 활성은 유의적으로 감소되었다. 그러나 양성 대조군과 CFE를 투여한 경우 SOD 효소활성은 에탄올 처리군과 비교할 때 유의적으로 높게 나타났다(P < 0.05, 표 6).
간의 세포질 및 소포체에 존재하는 수용성 단백질인 GST는 외인성 물질 및 그 활성 대사물들을 해독하는 역할을 한다. 또한, 과산화수소수를 비롯한 활성 대사물들을 제거함으로써 산화적 손상과 세포막의 지질과산화로 부터 세포를 보호한다. 알코올 투여에 의해 GST 활성이 현저히 낮아졌으며 Silymarin과 CFE 투여로 인해 GST 효소 활성이 양성 대조군과 CFE군에서 유의적으로 증가하였다(P < 0.05, 표 6). GR은 활성산소를 중화시키면서 GSSG로 산화된 글루타티온을 다시 환원시킨다. 활성산소를 제거하는 효소는 아니지만 글루타티온에 의한 항산화 경로를 유지시키는 효소이다. 알코올 투여에 의해 GR 활성이 현저히 낮아졌으며 양성 대조군과 CFE군 투여로 인해 GR 효소 활성이 통계적으로 유의하게 증가하였다(P < 0.05, 표 6). GPx는 과산화수소를 산소와 물로 분해하는 효소로서 과산화지질을 분해하고 해독시키는 글루타티온의 활성을 촉진시킨다. 알코올 투여에 의해 GPx 활성이 현저히 낮아졌으며 양성 대조군과 CFE 투여로 인해 GPx 효소 활성이 통계적으로 유의하게 증가하였다(P < 0.05, 표 6). GSH는 글루탐산, 시스테인, 글리신 세 개의 아미노산의 중합체가 산화되면 두 개의 GSH가 이황화결합으로 연결되어 GSSG가 되며 생체 내의 다른 분자들 대신 활성산소와 반응하여 산화됨으로써 활성산소를 제거하는 역할을 한다. 알코올 투여에 에탄올 처리군의 GSH가 낮아졌으며 양성 대조군과 CFE 투여로 인해 GSH 비효소 활성이 통계적으로 유의하게 증가하였다(P < 0.05, 표 6).
이상의 결과들로부터 마우스에 알코올 투여로 인한 간의 CAT, SOD, GST, GR, GPx 및 GSH 활성의 유의적 감소는 알코올 섭취에 의한 자유라디칼의 급격한 증가로 조직 내 항산화효소가 감소된 것으로 생각되며, CFE은 이러한 자유라디칼을 제거하는 항산화 효소들을 효과적으로 활성화시킴으로써 알코올성 산화스트레스로부터 간 보호 효과를 갖는 것으로 생각된다(표 6).
| Group | CAT | SOD | GST | GR | GPx | GSH |
| U/mg protein | U/mg protein | U/mg protein | U/mg protein | U/mg protein |
nmole/mg
protein |
|
| 대조군 | 1310.07±35.56a | 23.82±3.86a | 3.61±0.26a | 2.44±0.15a | 2.57±0.05a | 76.02±1.30a |
| 에탄올 처리군 | 669.79±90.58c | 14.34±1.41b | 1.82±0.31b | 1.60±0.24b | 2.32±0.05b | 48.72±2.01c |
|
양성
대조군 |
1005.49±110.39b | 24.19±3.77a | 4.34±0.28a | 2.50±0.17a | 2.60±0.04a | 61.76±2.63b |
| CFE | 1079.40±18.08b | 24.97±1.70a | 4.24±0.19a | 2.59±0.12a | 2.62±0.03a | 60.34±2.24b |
2) 간 조직의 말론디알데히드(MDA) 함량
지질의 과산화 측정은 생체조직의 산화적 손상 결과를 측정하는 대표적인 지표이다. 지질의 과산화측정법으로 가장 보편적인 방법은 TBA법으로서 이것은 각종 생체막의 과산화 반응 결과 생성되는 말론디알데히드(MDA)를 TBA와 반응시켜 생성물을 측정하는 것이다. 532 nm에서 말론디알데히드와 티오바르비툴산 반응물의 흡광도 측정한 후, 말론디알데히드(MDA) 표준용액으로부터 표준곡선을 얻고, 이 곡선으로부터 TBA 반응 물질의 양을 MDA equivalent로 산출하여 나타낸다. 음성대조군과 비교시 에탄올 처리군에서는 MDA 함량이 유의적으로 증가하는 경향을 보였다. 알코올과 함께 Silymarin과 CFE를 투여할 때, MDA 함량이 유의하게 감소함으로써 알코올에 의해 유도된 지질과산화 과정이 CFE에 의해 효과적으로 억제됨을 추정할 수 있다(도 6).
라. 에탄올 투여 마우스의 mRNA 발현량
1) 간 조직의 CYP2E1 mRNA 발현량
간 조직의 CYP2E1 mRNA 발현을 측정한 결과는 도 7과 같다. β-actin을 내부 대조군으로 사용하였다. 음성대조군에 비해 에탄올 처리군에서 세포내 CYP2E1의 mRNA의 발현이 증가한 것으로 나타났다. 그러나 CFE군 처리에 mRNA 발현이 감소하였다.
2) 간 조직의 AMPK, SREBP-1c, ACC, CPT-1 및 PPARα mRNA 발현량
간 조직의 AMPK, SREBP-1c, ACC, CPT-1 및 PPARα mRNA 발현을 Real-Time PCR로 측정하였다. β-Actin을 내부 대조군으로 사용하였다. AMPK는 에탄올 처리군에서 감소하였다가 양성대조군과 CFE군에서 증가 하였다. 그리고 지방산 흡수와 관련이 있는 SREBP-1c, ACC은 알코올을 투여한 에탄올 처리군에서 유의적으로 증가하였다가 양성대조군과 CFE군 처리로 발현이 감소되었다. 그리고 지방산 산화와 관련된 CPT-1, PPAR-α 은 에탄올 처리군에서 감소하였으나, 양성대조군과 CFE군의 처리로 음성대조군과 비슷하게 증가하였다(도 8).
따라서 본 연구의 결과에서는 매생이 추출물에서 알콜성 간손상 억제효능이 나타났음을 확인하였으며 특히 10% 에탄올 추출물에서 알콜성 간손상을 억제시킴으로서 효능이 좋았음을 확인하였다. 이러한 결과는 매생이 추출물이 알콜성 간손상 억제 효능을 지닌 국내 기능성 소재로서의 활용을 기대할 수 있도록 하였다.
상기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
CAFE 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
CAFE10% 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
CAFE70% 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제
CAFE 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
CAFE10% 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 식품의 제조
CAFE80% 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강 음료의 제조
CAFE10% 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY
<120> Pharmaceutical Composition for Improving, Protecting or Treating
Alcoholic Liver Disease comprising Capsosiphon fulvescens Extract
as Active Ingredient
<130> PN160282P
<150> KR 10-2016-0103802
<151> 2016-08-16
<160> 28
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> b-ACTIN F
<400> 1
acggccaggt catcactatt g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> b-ACTIN R
<400> 2
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP2E1 F
<400> 3
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP2E1 R
<400> 4
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<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AMPK F
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ggcaccctcc catttgatg 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AMPK R
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acaccccctc ggatcttctt 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SREBP-1c F
<400> 7
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
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<220>
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ccctctacat agaactgcaa ggttt 25
Claims (9)
- 매생이(Capsosiphon fulvescens) 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 지방간, 알코올성 간염, 알코올성 만성 간염, 알코올성 간섬유증, 알코올성 간 경변 및 알코올성 간암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 알코올성 간질환의 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 추출물의 용매는 5-15%의 에탄올 수용액인 것인, 약제학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 알코올성 간세포의 손상을 보호하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 활성산소종의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 지질과산화물의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 매생이(Capsosiphon fulvescens) 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 지방간, 알코올성 간염, 알코올성 만성 간염, 알코올성 간섬유증, 알코올성 간경변 및 알코올성 간암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 알코올성 간질환의 개선용 기능성식품 조성물에 있어서, 상기 추출물의 용매는 5-15%의 에탄올 수용액인 것인, 기능성식품 조성물.
- 삭제
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-
2017
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