CN103655476B - 一种CSN8shRNA纳米脂质体的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种CSN8shRNA纳米脂质体（nano-liposome）的制备方法及其在治疗炎症性肠病的应用，通过向磷酸卵磷脂和胆固醇混合物中加入CSN8shRNA质粒缓冲液后进行超声水浴、过滤、分离、富集等工艺即可制得，制备方法步骤简单；制得的CSN8shRNA纳米脂质体能进入肠道黏膜，有效抑制肠道细胞CSN8的表达，缓解肠炎症状，治疗效果显著。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种CSN8shRNA纳米脂质体（nano-liposome）的制备方法及其用于疾病治疗方面的应用。
背景技术
脂质体最早约在40年前发展起来，是一种人工膜。当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成直径25～1000nm不等的具有双分子层结构的的封闭囊泡，即脂质体。
细胞主要通过内吞的方式摄取周围的大分子物质。一些药物和大分子物质通常不能穿过细胞的脂质双分子层。脂质体的疏水双分子层有利于包裹水溶性物质如用于治疗的蛋白等，并将大分子物质封装于其亲水的内核中，既可以通过网格包被蛋白小窝上的受体介导的细胞内吞作用，也可以通过细胞膜的直接融合作用将目的物质运输入胞内。因此脂质体广泛应用于生化、医药、食品和化妆品等行业。目前，脂质体作为给药载体的途径通常有静脉注射、肌内和皮下注射和口服给药等。
当物质颗粒小于100nm时，物质本身的固有特性发生质的变化，呈现出奇特的物理化学性能，即纳米效应，包括表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应和宏观粒子效应等。纳米粒子载体的表面效应可提高装载率、溶出速率和吸收速率，且可延长被载物质在血液中的滞留时间以提高其生物利用度。多数纳米粒可直接穿过粘膜上皮细胞孔隙和血脑屏障。
基于上述纳米脂质体的特性以及脂质体作为载体系统的经验，理想的运用于转运基因的脂质体，大小应达到纳米尺度，粒径平均为100nm或者更小，可直接穿过粘膜上皮细胞孔隙，对于质粒DNA具有高包封率，保护DNA不被血浆核酸酶降解，介导细胞特异性内吞。
CSN8是泛素化调节蛋白COP9复合物的第八个亚基，发挥细胞信号调节蛋白的功能，影响细胞增殖和凋亡。我们的研究表明CSN8在炎症性肠病发生发展过程中起重要作用，抑制CSN8蛋白的表达可显著缓解炎症性肠病症状。而反义寡核酸技术是基因治疗的常用方法，根据核酸杂交原理设计特定靶序列的反义核酸，在蛋白水平抑制特定基因表达。由于体内无处不在的核酸酶作用，进入胞内的核酸容易被降解。纳米脂质体与核酸结合后，可避免核酸被过多降解，并提高其被细胞捕获的可能性，因此近年来脂质体作为基因的有效载体应用越来越受到重视。本发明中制备了包裹CSN8shRNA质粒的纳米脂质体，并用小鼠DSS炎症性肠病模型评价该脂质体对炎症性肠病的疗效，发现包裹CSN8shRNA质粒的纳米脂质体能进入肠道黏膜，有效抑制肠道细胞CSN8的表达，缓解肠炎症状，可能作为一种新的治疗炎症性肠病的药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种CSN8shRNA纳米脂质体的制备方法及其该纳米脂质体在治疗炎症性肠病的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
一种CSN8shRNA纳米脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）：将磷酸卵磷脂（phosphatidylcholine）和胆固醇（cholesterol）溶于10倍体积的氯仿中，旋转蒸发，直至形成具有均匀薄膜的第一混合物；
步骤（2）：向所述第一混合物中加入1/2第一混合物体积的氯仿，形成第二混合物，再加入所述1/3第二混合物体积的CSN8shRNA质粒缓冲液室温搅拌4～8小时形成第三混合物；
步骤（3）：将所述第三混合物在4～37℃条件下，30～50W功率水浴超声处理5～30分钟，减压蒸发除去有机溶剂，再补充与步骤（2）中所加氯仿同等体积的缓冲液，再进行4～37℃条件下，30～50W功率水浴超声处理5～30分钟即得脂质体混悬液；
步骤（4）：将步骤（3）制得的脂质体混悬液通过0.1μm的微孔滤膜，20000～36000g超速离心20～60min，上层即为所需的CSN8shRNA纳米脂质体，所述CSN8shRNA纳米脂质体的直径小于等于100nm。
优选的，所述缓冲液为PBS、HEPES或生理盐水。
优选的，所述步骤（4）中将步骤（3）制得的脂质体混悬液通过0.1μm的微孔滤膜后，再通过0.02μm的超滤膜进行过滤，取被截留液体，即可富集到所需的CSN8shRNA纳米脂质体。
优选的，所述CSN8shRNA质粒是根据RNAi技术设计合成的针对CSN8的编码基因的siRNA(Small interfering RNA)编码序列与表达载体连接而成的。
所述CSN8shRNA质粒制备的步骤如下：
首先，设计针对人CSN8编码基因的siRNA(Small interfering RNA)目标序列，优选的目标序列为“GCACTTAGAGATGCAACAA”，同时设计针对小鼠CSN8编码基因的siRNA(Small interfering RNA)目标序列，优选的目标序列为“GCCCTTAGAGATGCAACAA”；按照pSilencerTM hygro Kit(Ambion PartNumber AM5760,AM5766)操作说明，合成针对上述目标序列的siRNA茎环模板序列（Hairpin siRNA Template Insert）,并分别连接合成序列至表达载体pSilencer3.1-H1hygro。
优选的，所述CSN8shRNA质粒缓冲液中CSN8shRNA质粒的浓度为1μg/ml～1000μg/ml。
优选的，步骤（1）中磷酸卵磷脂和胆固醇的体积比为（1：1）～（10：1）。
利用如上所述制备方法制得的CSN8shRNA纳米脂质体的应用，其特征在于，该CSN8shRNA纳米脂质体可用于炎症性肠病治疗。
所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。
发明优点：
本发明所述制备方法的制备工艺简单，制得的CSN8shRNA纳米脂质体稳定易进入肠道黏膜，有效抑制肠道细胞CSN8的表达，缓解肠炎症状，而且治疗方法易操作，可通过口服，治疗效果明显。
附图说明
图1为人CSN8shRNA纳米脂质体干扰人直肠癌细胞株SW480中CSN8蛋白表达Western Blotting检测结果；
图2为DSS诱导的C57BL/6小鼠肠炎模型DAI评分结果；
图3为小鼠CSN8shRNA纳米脂质体灌胃DSS诱导的C57BL/6小鼠后小鼠CSN8蛋白表达量Western Blotting检测结果；
图4为灌胃小鼠CSN8shRNA纳米脂质体的炎症性肠病C57BL/6小鼠DAI评分结果；
图5为小鼠CSN8shRNA纳米脂质体灌胃DSS诱导的C57BL/6小鼠小肠上皮TNF-α、IL-6和IL-1蛋白表达量ELISA检测结果；
图6为灌胃对照纳米脂质体的DSS诱导的炎症性肠病C57BL/6小鼠的小肠病理切片结果；
图7为灌胃小鼠CSN8shRNA纳米脂质体的DSS诱导的炎症性肠病C57BL/6小鼠的小肠病理切片结果。
具体实施方式
以下实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1：
一、制备方法
实验组：CSN8shRNA纳米脂质体的制备
步骤（1）：将磷酸卵磷脂（phosphatidylcholine）和胆固醇（cholesterol）溶于10倍体积的氯仿中，旋转蒸发，直至形成具有均匀薄膜的第一混合物；磷酸卵磷脂和胆固醇的体积比例可为2：1。
步骤（2）：向所述第一混合物中加入1/2第一混合物体积的氯仿，形成第二混合物，再加入所述1/3第二混合物体积的CSN8shRNA质粒的缓冲液室温搅拌4～8小时形成第三混合物；所述CSN8shRNA质粒缓冲液中CSN8shRNA质粒的浓度为500μg/ml。
CSN8shRNA质粒制备步骤如下：设计针对人CSN8编码基因的siRNA(Smallinterfering RNA)目标序列，优选的目标序列为“GCACTTAGAGATGCAACAA”，同时设计针对小鼠CSN8编码基因的siRNA(Small interfering RNA)目标序列，优选的目标序列为“GCCCTTAGAGATGCAACAA”；按照pSilencerTM hygroKit(Ambion Part Number AM5760,AM5766)操作说明，合成针对上述目标序列的siRNA茎环模板序列（Hairpin siRNA Template Insert）,并分别连接合成序列至表达载体pSilencer3.1-H1hygro。
步骤（3）：将所述第三混合物在4～37℃条件下，30～50W功率水浴超声处理5～30分钟，减压蒸发除去有机溶剂，再补充与步骤（2）中所加氯仿同等体积的缓冲液，再进行4～37℃条件下，30～50W功率水浴超声处理5～30分钟即得脂质体混悬液；
步骤（4）：将步骤（3）制得的脂质体混悬液通过0.1μm的微孔滤膜，20000～36000g超离20～60min，上层即为所需的CSN8shRNA纳米脂质体，所述CSN8shRNA纳米脂质体的直径小于等于100nm。
对照组：对照组质粒采用pSilencerTM hygro Kit(Ambion Part Number AM5760,AM5766)试剂盒中自带的阴性对照质粒pSilencer3.1-H1hygro Negative Control。除加入的质粒不同外，含有对照质粒的纳米脂质体制备步骤同CSN8shRNA纳米脂质体制备方法步骤1～4。
二、应用及疗效评估：
一）人CSN8shRNA纳米脂质体对人结肠癌细胞株SW480中CSN8蛋白表达干扰评估
用上述制得的人CSN8shRNA纳米脂质体处理人结肠癌细胞株SW480，检测SW480细胞中CSN8蛋白表达量，同时比对对照组的实验结果。
在37℃，5%CO2条件下，用10%FBS的RPMI1640培养基培养SW480细胞，取对数生长期的SW480细胞以3×105个/孔接种于6孔板，待细胞丰度达到85%时，实验组用2ml含人CSN8shRNA纳米脂质体的RPMI1640培养基处理SW480细胞，对照组用2ml含对照质粒的RPMI1640培养基处理SW480细胞。对照组和实验组均做3个复孔。6小时后，换成10%FBS的RPMI1640培养基培养上述被纳米脂质体处理的SW480细胞。
36小时后，用Western Blotting法分别检测SW480细胞CSN8蛋白表达量。如图1所示：结果显示，与对照组（Nano-liposome+vector）相比，实验组(Nano-liposome+CSN8shRNA)CSN8蛋白表达量明显被下调。β-actin表达量为内参。
为了评估CSN8shRNA纳米脂质体对炎症性肠病的疗效，我们建立了DSS诱导的小鼠炎症性肠病模型，采用上述制得的小鼠CSN8shRNA纳米脂质体以灌胃方式给药，治疗炎症性肠病模型小鼠，治疗过程和结果如下：
二）、DSS诱导小鼠炎症性肠病模型的建立
1）实验材料
动物：C57BL/6小鼠，♀，体重20-25g，SPF级，40只。
动物分组：A，正常对照组n=10；B，3.5%DSS实验组n=30，n指小鼠的数量。
2）DSS诱导炎症性肠病模型的方法
给予实验组雌性C57BL/6小鼠含有3.5%DSS的饮用水，同时给予对照组等量蒸馏水作为饮用水，7天后改成正常饮用水。每天观察小鼠大便情况，并称量小鼠体重。
3）炎症性肠病模型建立结果
（1）疾病活动度指数(The Disease Activity Index,DAI)评分
根据体重减失率分数和大便隐血程度判断疾病活动指数。参考文献（Okayasu I,Hatakeyyama S,Yamada M,Ohkusa T,Inagaki Y,Nakaya R.A novelmethod in the induction of reliable experimental acute chronic ulcerative colitis inmice.Gastroenterology1900;98:694-702）对小鼠进行DAI评分。
体重减失率计算方法：注射实验前称量小鼠体重，注射后每天称量小鼠体重按照公式100%×（实验前体重-称量后体重）÷实验前体重。
大便隐血程度由尿粪隐血试剂盒测定。
各组小鼠DAI评分曲线见图2，饮用含3.5%DSS的小鼠与对照组（饮用蒸馏水）相比，DAI评分在实验进行的7天之内明显升高。
（2）小肠病理切片观察
在正常对照组和实验组分别选择3只小鼠处死，分离小肠，参考文献（Ekstrom CM.Oxazolone-induced colitis in rats:effects of budesonide,cyclosporinA,and5-aminosal cylic acid.Scand J Gastroenterol1998;33:174-179），对小鼠小肠进行病理组织学评分。
| 组别 | n | 病理评分 |
| A正常对照组 | 3 | 0.50±0.89 |
| B实验组 | 3 | 12.10±1.05 |
表1小鼠炎症性肠病模型病理评分结果
根据疾病活动度指数(The Disease Activity Index,DAI)评分（表1），该小鼠炎症性肠病模型已经成功建立，可用于后续实验。
三）、小鼠CSN8shRNA纳米脂质体及对照纳米脂质体混悬液灌胃DSS诱导的炎症性肠病C57BL/6小鼠
选择上述DSS诱导的炎症性肠病小鼠20只，随机分成2组，即实验组（n=10）和对照组（n=10），空腹12小时，用5ml生理盐水冲洗肠道后，用小鼠CSN8shRNA纳米脂质体灌胃，每天灌胃一次，连续灌胃7天。
实验组：灌胃包封小鼠CSN8shRNA质粒的纳米脂质体（<100nm），灌胃量5ml/kg，n=10。
对照组：灌胃包封对照质粒的纳米脂质体（<100nm），灌胃量5ml/kg，n=10。
四）、小鼠CSN8shRNA纳米脂质体干扰DSS诱导的炎症性肠病C57BL/6小鼠肠上皮细胞CSN8蛋白表达量测定
纳米脂质体混悬液连续灌胃DSS诱导的炎症性肠病C57BL/6小鼠7天后，分别取实验组和对照组小鼠各5只，处死，分离小肠上皮，称重，取相同质量的上皮组织，Western Blotting检测CSN8蛋白表达量（图3）。
小鼠CSN8shRNA纳米脂质体灌胃DSS诱导的炎症性肠病C57BL/6小鼠后，Western Blotting分别检测小鼠肠上皮组织CSN8蛋白表达量。如图3所示：结果显示，与对照组(Nano-liposome+vector）相比，实验组(Nano-liposome+CSN8shRNA)CSN8蛋白表达量明显被下调。β-actin表达量为内参。
五）、小鼠CSN8shRNA纳米脂质体灌胃的炎症性肠病C57BL/6小鼠DAI评分及病理评分
每日记录上述脂质体灌胃的两组小鼠的体重和大便隐血情况，做DAI评分。连续7日的DAI评分曲线如图4。与对照组相比，实验组，即灌胃了小鼠CSN8shRNA纳米脂质体的小鼠在连续灌胃的7天内DAI评分明显降低。对照组DAI评分也有所降低，推测这是因为停止饮用含DSS的水后，小鼠自身肠炎症状有所缓减。
将上述连续7天灌胃了脂质体的实验组和对照组的C57BL/6小鼠，全部处死，分离小肠，按照病理组织学评分标准评分。实验组和对照组的病理计分结果见表2。实验组，即灌胃了CSN8shRNA纳米脂质体的小鼠与对照组相比病理评分明显降低。由此可见，CSN8shRNA纳米脂质体能有效缓解肠炎症状。
| 组别 | n | 病理评分 |
| 实验组 | 10 | 2.50±0.79 |
| 对照组 | 10 | 13.10±1.05 |
表2灌胃脂质体的小鼠病理评分结果
六）、小鼠CSN8shRNA纳米脂质体对炎症性肠病相关因子IL-1、IL-6和TNF-α等表达影响测定
纳米脂质体混悬液灌胃DSS诱导的炎症性肠病C57BL/6小鼠后7天分别取实验组和对照组小鼠各5只，处死，分离小肠上皮，称重，取相同质量的上皮组织，用含0.1%Triton X-100及蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的Hanks缓冲液分别处理上述组织样品，ELISA检测样品中TNF-α、IL-6和IL-1蛋白表达量，如图5所示。
结果显示，实验组（Nano-liposome+CSN8shRNA）的TNF-α、IL-6和IL-1蛋白表达量均低于对照组（Nano-liposome+vector），并呈显著性差异。
实验组（Nano-liposome+CSN8shRNA）的TNF-α、IL-6和IL-1蛋白表达量均低于对照组（Nano-liposome+vector），并呈显著性差异。
七）、纳米脂质体灌胃DSS诱导的炎症性肠病C57BL/6小鼠后病理切片观察
纳米脂质体混悬液灌胃DSS诱导的炎症性肠病C57BL/6小鼠7天后分别取实验组和对照组全部存活小鼠处死，分离小肠，冰冻切片，苏木精-伊红（HE）染色，显微镜观察肠道组织结构。
对照组小鼠小肠病理切片如图6所示，结果显示隐窝结构被破坏，基膜变薄，整个绒毛膜上皮层变薄。
实验组小鼠小肠病理切片如图7所示，结果显示隐窝结构恢复正常，基膜变厚，整个绒毛膜上皮层变厚。小鼠CSN8shRNA纳米脂质体灌胃对DSS诱导的炎症性肠病C57BL/6小鼠肠炎症状有减轻作用。
需要指出的是，以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图据以对本发明作任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (6)
1.一种CSN8shRNA纳米脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：将磷酸卵磷脂和胆固醇溶于10倍体积的氯仿中，旋转蒸发，直至形成具有均匀薄膜的第一混合物；
步骤(2)：向所述第一混合物中加入1/2第一混合物体积的氯仿，形成第二混合物，再加入所述1/3第二混合物体积的CSN8shRNA质粒缓冲液室温搅拌4～8小时形成第三混合物；
步骤(3)：将所述第三混合物在4～37℃条件下，30～50W功率水浴超声处理5～30分钟，减压蒸发除去有机溶剂，再补充与步骤(2)中所加氯仿同等体积的缓冲液，再进行4～37℃条件下，30～50W功率水浴超声处理5～30分钟即得脂质体混悬液；
步骤(4)：将步骤(3)制得的脂质体混悬液通过0.1μm的微孔滤膜，20000～36000g超速离心20～60min，上层即为所需的CSN8shRNA纳米脂质体，所述CSN8shRNA纳米脂质体的直径小于等于100nm。
2.根据权利要求1所述的CSN8shRNA纳米脂质体的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS、HEPES或生理盐水。
3.根据权利要求1所述的CSN8shRNA纳米脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中将步骤(3)制得的脂质体混悬液通过0.1μm的微孔滤膜后，再通过0.02μm的超滤膜进行过滤，取被截留液体，即可富集到所需的CSN8shRNA纳米脂质体。
4.根据权利要求1所述的CSN8shRNA纳米脂质体的制备方法，其特征在于，所述CSN8shRNA质粒是根据RNAi技术设计合成的针对CSN8的编码基因的siRNA(Small interfering RNA)编码序列与表达载体连接而成的。
5.根据权利要求1所述的CSN8shRNA纳米脂质体的制备方法，其特征在于，所述CSN8shRNA质粒缓冲液中CSN8shRNA质粒的浓度为1μg/ml～1000μg/ml。
6.根据权利要求1所述的CSN8shRNA纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中磷酸卵磷脂和胆固醇的体积比为(1：1)～(10：1)。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150819 Termination date: 20181203 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |