CN113999846B - 一种抑制afap1-as1表达的干扰rna及在增加乳腺癌放疗敏感性中的应用 - Google Patents

一种抑制afap1-as1表达的干扰rna及在增加乳腺癌放疗敏感性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种抑制AFAP1‑AS1表达的干扰RNA及在增加乳腺癌放疗敏感性中的应用。本发明通过实验发现长链非编码RNA(lncRNA)AFAP1‑AS1在放射抵抗的乳腺癌细胞中高表达，本发明所提供的干扰RNA可以显著抑制lncRNAAFAP1‑AS1在乳腺癌细胞中的表达，可以增加乳腺癌细胞的放疗敏感性，对于乳腺癌的治疗有着非常积极的效果。本发明还公开了一种用于携带上述的抑制AFAP1‑AS1表达的干扰RNA的载体，可通过采用还原响应的高分子聚合物有助于消耗放疗抵抗肿瘤细胞中过量的GSH，打破胞内氧化还原平衡，提高胞内反应活性氧的比率，进一步提高肿瘤细胞的放疗敏感性。联合放疗和基因治疗，对于肿瘤的治疗效果更明显。

Description

一种抑制AFAP1-AS1表达的干扰RNA及在增加乳腺癌放疗敏感 性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抑制AFAP1-AS1表达的干扰RNA及在增加乳腺癌放疗敏感性中的应用。
背景技术
癌症发病率呈逐年上升趋势，目前已成为威胁人类健康最严重的疾病之一，其中全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。
手术、化疗和放射治疗(简称放疗)是常规的癌症治疗方法。几乎一半的癌症患者都接受放疗。在治愈的癌症患者中，有将近40％患者都受益于放疗。大部分癌症患者在治疗之初对放疗非常敏感，但是患者在治疗过程中逐步产生获得性放疗抵抗，进而促进了肿瘤复发和侵袭转移，导致治疗失败。虽然增加放疗剂量可以促进对肿瘤细胞的杀伤，但是放射线不可避免对正常细胞和组织产生严重的毒副作用。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术近年来发展迅速，可以用于多种疾病的治疗。和小分子靶向药物相比，siRNA对靶点的选择性会更好，能够特异性结合靶基因并下调靶基因表达，而且不会影响细胞中其它正常基因的表达。但是RNAi技术在临床转化时最大难题是缺少低毒高效的载体将siRNA输送到病灶部位和细胞内。对于基于RNAi技术的癌症治疗， siRNA在输送过程需要解决一系列生理屏障，例如如何靶向肿瘤细胞、穿透肿瘤组织和细胞膜、从内涵体高效逃逸以及在细胞质内有效释放siRNA等。
传统的病毒载体如腺病毒和逆转录病毒传递siRNA虽然可以克服上述各种生理屏障，但具有制备困难、siRNA容量小、靶向特异性差、免疫原性强等缺点。由于高分子纳米材料具有相容性好、携带RNA容量大、低免疫原性、易于功能一体化、容易大规模制备等优点，高分子材料被广泛应用于siRNA传递和肿瘤治疗。尤为重要的是，相对于正常组织，实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，使得纳米尺寸的颗粒能够更趋向于富集和滞留在肿瘤组织(即肿瘤组织的高通透性和滞留效应，又称EPR效应)。因此，构建新型高分子纳米材料并用于siRNA的高效传递一直是国内外研究热点。尤其是近几年来，基于肿瘤特殊的微环境如弱酸及乏氧环境、特定酶过度表达等，国内外研究者致力于开发出肿瘤微环境响应的高分子纳米载体材料并用于siRNA高效传递。目前已经报道的肿瘤微环境响应纳米载体包括酸响应、乏氧响应、酶响应等高分子纳米载体。这些纳米载体能在血液循环和正常生理组织中稳定存在；到达肿瘤部位后，能够对肿瘤细胞内外微环境做出快速响应，加快siRNA的释放效率，显著提高基因治疗效果并减轻毒副作用。
谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是一种常见的还原性物质，其在细胞浆(浓度约为2～10× 10-3M)和细胞外基质中(浓度约为2～10×10-6M)的浓度存在巨大差异。因此，使用还原响应的纳米材料传递治疗物质尤其是生物大分子时，能够加快治疗物质在胞浆内释放，从而提高治疗效果。在过去几十年里，国内外研究者报道了多种还原反应的高分子材料，并用于各种治疗药物的输送和治疗。其中一种具有代表性的高分子材料是含二硫键的高分子聚合物，这种高分子材料在还原剂(例如GSH)的作用下，可以快速降解(降解时间从几分钟到几小时)。这一降解速度远远快于脂肪类聚酯聚合物和聚碳酸酯类纳米材料(降解的过程通常持续数天、数周甚至数月)。由于具有快速降解以及能在细胞内迅速释放所携带的基因或药物的优点，目前国内外很多研究者都在致力于构建还原响应的新型纳米材料，用于治疗药物尤其是生物大分子如siRNA的高效输送和肿瘤治疗。但是，这些还原响应的纳米材料合成步骤繁琐、制备工艺复杂、功能单一，无法真正能够实现临床转化及应用。
发明内容
本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷(不足)，提供一种抑制AFAP1-AS1表达的干扰RNA，该干扰RNA可抑制AFAP1-AS1在乳腺癌细胞中的表达，增加乳腺癌细胞的放疗敏感性。
本发明采取的技术方案是，一种抑制AFAP1-AS1表达的干扰RNA，所述干扰RNA的正义链序列为GCACAGGUUCUCCAAACAATT，如SEQ NO.1所示；反义链序列为UUGUUUGGAGAACCUGUGCTT，如SEQ NO.2所示。或者，所述干扰RNA的正义链序列为GCUACUUCUGUCUCAUUAATT，如SEQ NO.3所示；反义链序列为UUAAUGAGACAGAAGUAGCTT，如SEQNO.4所示。
本发明通过实验构建乳腺癌放射抵抗细胞株，再将其与亲本株进行高通量测序，发现长链非编码RNA(lncRNA)AFAP1-AS1在放射抵抗的乳腺癌细胞中高表达，本发明中干扰RNA 可以显著抑制lncRNAAFAP1-AS1在乳腺癌细胞中的表达，可以增加乳腺癌细胞的放疗敏感性，对于乳腺癌的治疗有着非常积极的效果。
本发明提供了上述抑制AFAP1-AS1表达的干扰RNA在增加乳腺癌放射治疗敏感性中的应用。
本发明还提供了一种用于携带上述的抑制AFAP1-AS1表达的干扰RNA的载体。实际上，该载体可以使用现有的很多种材料，可以采用酸响应、乏氧响应、酶响应等高分子材料。
优选地，所述载体采用还原响应的高分子聚合物。采用还原响应的高分子聚合物有助于消耗放疗抵抗肿瘤细胞中过量的GSH，打破胞内氧化还原平衡，提高胞内反应活性氧的比率，进一步提高肿瘤细胞的放疗敏感性。
优选地，所述载体采用降解速度更快的含二硫键的高分子聚合物，有助于实现被载物质的快速释放。进一步地，所述载体采用聚酯二硫酰胺(poly(disulfide amide),PDSA)，其合成方法简单，采用“一锅法”即能大批量制备，易于转化，应用成本低。
本发明还提供了一种乳腺癌放射治疗增敏药物，包括上述的抑制AFAP1-AS1表达的干扰RNA。
上述的乳腺癌放射治疗增敏药物，还包括上述的携带抑制AFAP1-AS1表达的干扰RNA 的载体。
进一步地，所述增敏药物为所述载体包载这所述干扰RNA形成的纳米颗粒，所述纳米颗粒的粒径为10～200nm。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明通过实验发现长链非编码RNA(lncRNA)AFAP1-AS1在放射抵抗的乳腺癌细胞中高表达，可以作为治疗乳腺癌细胞放疗抵抗性的靶点。本发明提供了一种抑制AFAP1-AS1表达的干扰RNA，通过抑制lncRNAAFAP1-AS1在乳腺癌细胞中的表达，可以增加乳腺癌细胞的放疗敏感性，对于乳腺癌的治疗有着非常积极的效果。
(2)本发明还提供了一种用于携带上述的抑制AFAP1-AS1表达的干扰RNA的载体，可通过采用还原响应的高分子聚合物有助于消耗放疗抵抗肿瘤细胞中过量的GSH，打破胞内氧化还原平衡，提高胞内反应活性氧的比率，进一步提高肿瘤细胞的放疗敏感性。
(3)本发明还提供了一种乳腺癌放射治疗增敏药物，通过载体包载干扰RNA，转染乳腺癌细胞时，可以显著抑制AFAP1-AS1在乳腺癌细胞中的表达；该增敏药物联合放疗一起，对于乳腺癌细胞治疗的效果更加明显。
附图说明
图1为经不同剂量放疗后，NC组、si1组、si2组的细胞克隆形成情况图。
图2为经不同剂量放疗后，NC组、si1组、si2组的细胞存活分数的曲线图。
图3为经不同剂量放疗后，NC组、si1组、si2组的细胞凋亡率。
图4为经不同剂量放疗后，NC组、si1组、si2组的细胞凋亡率统计图。
图5为经不同剂量放疗后，NC组、si1组、si2组的细胞周期流式检测图(流式图中第二个峰为G2期)。
图6为经不同剂量放疗后，NC组、si1组、si2组的细胞周期分布。
图7为未行放疗时，shCTL组、shAFAP1-AS1-1组及shAFAP1--AS1-2组小鼠的成瘤体积随着时间的变化图。
图8为行放疗时，shCTL组、shAFAP1-AS1-1组及shAFAP1--AS1-2组小鼠的成瘤体积随着时间的变化图。
图9为shCTL组、shAFAP1-AS-1-1组及shAFAP1-AS-1-2组小鼠的免疫组化结果。
图10为MDA-MB-231细胞经不同剂量放疗后24、48、72小时，行PCR实验检测GSH 的表达量。
图11为MDA-MB-231细胞经不同剂量放疗后24小时，检测GSH/GSSH的比例。
图12为PDSA NPs携载si AFAP1-AS1的浓度的不同对AFAP1-AS1的敲低效率的影响。
图13为经不同剂量放疗后，siNC组、转染纳米材料PDSA NPs组、转染携载siNC的PDSA NPs组、转染siAFAP1-AS1组及转染携载siAFAP1-AS1的PDSA NPs组的剂量存活曲线。
图14为经不同剂量放疗后，siNC组、转染纳米材料PDSA NPs组、转染携载siNC的PDSA NPs组、转染si AFAP1-AS1组、转染携载si AFAP1-AS1的PDSA NPs组的细胞凋亡流式检测图。
图15为经不同剂量放疗后，siNC组、转染纳米材料PDSA NPs组、转染携载siNC的PDSANPs组、转染si AFAP1-AS1组、转染携载si AFAP1-AS1的PDSA NPs组的细胞凋亡率统计图。
图16为经不同剂量放疗后，siNC组、转染纳米材料PDSA NPs组、转染携载siNC的PDSANPs组、转染si AFAP1-AS1组、转染携载si AFAP1-AS1的PDSA NPs组的细胞周期流式检测图(流式图中第二个峰为G2期)。
图17为经不同剂量放疗后，siNC组、转染纳米材料PDSA NPs组、转染携载siNC的PDSANPs组、转染si AFAP1-AS1组、转染携载si AFAP1-AS1的PDSA NPs组的细胞周期分布。
图18为载有荧光标记si AFAP1-AS1的PDSA NPs尾静脉注射到小鼠体内后，小鼠荧光照片。
图19为载有荧光标记si AFAP1-AS1的PDSA NPs尾静脉注射到小鼠体内后，纳米粒子在肿瘤和其他器官分布图。
图20为6组小鼠的肿瘤体积随着时间的变化图。
图21为6组小鼠的各脏器相关指标及组织病理切片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施方式。
实施例
本实施例提供了两种抑制AFAP1-AS1表达的干扰RNA(siAFAP1-AS1) ——siAFAP1-AS1-1和siAFAP1-AS1-2。其中，siAFAP1-AS1-1的基因序列为：正义链为GCACAGGUUCUCCAAACAATT(SEQ No.1)；反义链为UUGUUUGGAGAACCUGUGCTT (SEQNo.2)；siAFAP1-AS1-2的基因序列为：正义链为GCUACUUCUGUCUCAUUAATT (SEQ No.3)；反义链序列为UUAAUGAGACAGAAGUAGCTT(SEQ No.4)。这两种抑制 AFAP1-AS1表达的干扰RNA都能够显著抑制lncRNAAFAP1-AS1在乳腺癌细胞中的表达，可以增加乳腺癌细胞的放疗敏感性，对于乳腺癌的治疗有着非常积极的效果。
一种乳腺癌放射治疗增敏药物，包括上述的抑制AFAP1-AS1表达的干扰RNA(siAFAP1-AS1)和携带siAFAP1-AS1的载体。其中，所述增敏药物为所述载体包载着所述干扰RNA形成的纳米颗粒，纳米颗粒的粒径为10～200nm。
在本实施例中，该载体为聚酯二硫酰胺(poly(disulfide amide),PDSA)，具体合成方法为：在冰盐浴条件下，将胱氨酸二甲酯盐酸盐(Cystine dimethyl esterdihydrochloride)逐滴加入到脂肪二酸(包括丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十一碳二酸、十二碳二酸、十三碳二酸等所有脂肪二酸)和三乙胺的混合溶液中(溶剂可以为二甲亚砜、二甲基甲酰胺等强极性溶剂)。在室温下搅拌反应15分钟至4小时后，除去反应体系中沉淀物，浓缩滤液，使用乙酸乙酯沉淀出产品。粗产品溶于二甲亚砜、二甲基甲酰胺等强极性溶剂，在乙酸乙酯中反复沉淀三次，真空干燥获得纯化的PDSA。合成线路如下所示：
Figure BDA0003272529280000061
上述增敏药物纳米颗粒的制备方法具体为：
使用纳米沉淀法制备载有siRNA的纳米粒子。选取二甲基甲酰胺作为溶剂，分别配置 PDSA和聚乙二醇修饰的磷脂(PEG-lipid)溶液。随后取PDSA溶液、PEG-lipid溶液、siRNA水溶液以及阳离子脂质体混合，在搅拌条件下，逐滴加入到去离子水中。随后将纳米溶液转移至超滤膜中(EMD Millipore,MWCO 100K)，离心分离纳米粒子，使用1去离子水洗涤两次后，收集纳米粒子并将其分散到1mL PBS缓冲溶液中备用。所得到的纳米颗粒的粒径为 10～200nm。
(1)单击多靶模型验证沉默AFAP1-AS1可恢复三阴性乳腺癌的放射敏感性
在MDA-MB-231细胞中，与未处理组(siNC组)相比，转染siAFAP1-AS1-1组(si1组)及转染siAFAP1-AS1-2组(si2组)在每个照射剂量的细胞克隆形成率(图1)及细胞存活分数(图2)都明显减少，分别将si1组、si2组与siNC组比较，差异均达统计学意义(P＜0.05)，并构建单击多靶模型拟合剂量存活曲线(见图2)。从模型可见，si1组及si2组的剂量存活曲线与siNC组相比明显下移，证明si1组、si2组与siNC组对比，细胞存活率和放射抵抗性均明显降低。根据单击多靶模型拟合剂量存活曲线后计算2Gy照射后的细胞存活分数(SF2)、平均致死剂量(D0)、准域剂量(Dq)，结果显示，si1组、si2组的SF2、D0、Dq值与siNC 组对比均显著降低，分别将si1组、si2组与siNC组比较，证明si1组、si2组的放射敏感性更强，差异均达显著统计学意义(P＜0.01)(见表1)。以上结果均证明在沉默AFAP1-AS1 的表达后，三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的放射敏感性明显恢复，从而证明AFAP1-AS1 高表达可以增加三阴性乳腺癌细胞的放射抵抗性。
表1
Figure BDA0003272529280000071
(2)沉默AFAP1-AS1的表达后，三阴性乳腺癌细胞放疗后凋亡增加
将siAFAP1-AS1-1及siAFAP1-AS1-2转染入MDA-MB-231细胞中，待细胞贴壁后24小时行放疗，放疗剂量分别为0、6、10Gy，放疗后24～48小时后按Annexin V法处理细胞，然后通过流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。
图3和图4的结果显示：与未处理组(siNC组)相比，转染siAFAP1-AS1-1组(si1组)及转染siAFAP1-AS1-2组(si2组)在相同放射剂量照射后，MDA-MB-231细胞的凋亡率均明显增加，放射敏感性逐步恢复，从而证明AFAP1-AS1可以增加三阴性乳腺癌细胞的放射抵抗性。
(3)沉默AFAP1-AS1的表达后，三阴性乳腺癌细胞放疗后的的G2期阻滞更加明显
将siAFAP1-AS1-1及siAFAP1-AS1-2转染入MDA-MB-231细胞中，待细胞贴壁后24小时行放疗，放疗剂量分别为0、6、10Gy，放疗后24～48小时后通过流式细胞仪检测细胞周期的变化。
图5和6的结果显示：与未处理组(siNC组)相比，转染siAFAP1-AS1-1组(si1组) 及转染siAFAP1-AS1-2组(si2组)在相同放射剂量照射后，MDA-MB-231细胞的G2期阻滞更为明显。细胞在准备进入有丝分裂期和处于有丝分裂期时对电离辐射最为敏感，即在细胞周期中当细胞处于G2/M期时对放射治疗最为敏感，因此细胞周期阻滞于G2期，对放射治疗的敏感性明显增加。因此，沉默AFAP1-AS1的表达后，三阴性乳腺癌细胞的放射敏感性逐步恢复，从而证明AFAP1-AS1可以增加三阴性乳腺癌细胞的放射抵抗性。
(4)AFAP1-AS1对三阴性乳腺癌裸鼠原位移植瘤生长的作用
本实验在活体中输送“小干扰RNA”(siRNA)所采用的办法是，将siRNA序列作为“短发夹RNA”克隆进质粒载体中，当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”(dsRNA)，并被RNAi通道处理。
本实验中所采用的慢病毒干扰载体是于广州艾基生物技术有限公司构建，首先针对 lncRNA AFAP1-AS1设计shRNA干扰片段，将该干扰片段插入慢病毒载体pLKO-Tet-ON中。pLKO-Tet-ON载体的关键功能为四环素诱导RNA干扰，当缺乏四环素时，shRNA的表达会被TetR蛋白抑制。当往培养基中加入四环素后，shRNA的表达则会引起靶基因的敲低，因此该质粒需要在四环素的作用下才能起作用。另外，该质粒具有嘌呤霉素抗性基因Puro，可用嘌呤霉素进行筛选。最后构建好的慢病毒介导的shRNA分别为 pLKO-Tet-On-AFAP1-AS1-914(简称为shRNA 1)、pLKO-Tet-On-AFAP1-AS1-1547(简称为 shRNA 2)以及pLKO-Tet-On-NC(简称shRNA NC)。
实验共分为6组，每组5只裸鼠。其中2组以转染慢病毒shRNA NC构建的稳转株行乳腺脂肪垫注射法建立乳腺癌原位移植瘤模型，构建成功后1组不予特殊处理，1组行放疗(简称为shCTL组)；2组以shRNA1沉默lncRNAAFAP1-AS1表达的稳转株建立乳腺癌原位移植瘤模型，构建成功后1组不予特殊处理，1组行放疗(简称为shAFAP1-AS-1-1组)；2组以 shRNA2沉默lncRNAAFAP1-AS1表达的稳转株建立乳腺癌原位移植瘤模型，构建成功后1 组不予特殊处理，1组行放疗(简称为shAFAP1-AS-1-2组)。接种三种稳转株的30只裸鼠均成瘤，通过游标卡尺定期测量裸鼠原位移植瘤的长径及短径，成瘤时间平均为10天。移植瘤长出后，根据瘤体体积绘制生长曲线，待肿瘤体积达到150cm3时，不予放疗组予以裸鼠喂养配制好的四环素；放疗组除了予以裸鼠喂养配制好的四环素外，并予以行放疗，放疗方案为予以原位移植瘤单次照射10Gy，待小鼠自然死亡或成瘤后30天断颈处理小鼠，取瘤称重。
结果如图7和图8所示，结果表明，在不予放疗组，沉默lncRNA AFAP1-AS1的表达后，小鼠肿瘤的体积明显小于未处理组；在放疗组，沉默lncRNA AFAP1-AS1的表达后，小鼠肿瘤的体积明显小于未处理组，而且差异较不予放疗组更为明显。由此证明AFAP1-AS1可以增加三阴性乳腺癌的成瘤能力，并且在放疗组，沉默AFAP1-AS1的表达后，小鼠肿瘤的体积明显小于未处理组，而且差异较不予放疗组更为明显，证明AFAP1-AS1可以增加小鼠原位移植瘤的放射抵抗性。
(5)免疫组化检测三阴性乳腺癌裸鼠原位移植瘤中相关蛋白的表达
从石蜡包埋的三阴性乳腺癌裸鼠原位移植瘤标本中，每组随机选取三个标本，分别进行免疫组化实验。图9结果表明，沉默lncRNAAFAP1-AS1的表达后，增殖相关指标ki67的表达明显减少，凋亡相关指标Caspase-3的表达明显增加，放射敏感性相关指标γH2AX的表达明显增加，β-catenin的表达明显减少。由此可以证明，沉默lncRNAAFAP1-AS1的表达后，三阴性乳腺癌的增殖减少，凋亡增加、放射敏感性增加，而且β-catenin表达减少，Wnt通路被抑制。因此证明AFAP1-AS1高表达可以促进三阴性乳腺癌增殖，减少三阴性乳腺癌细胞凋亡，并增强三阴性乳腺癌放射抵抗性，同时可使β-catenin活化激活Wnt通路。
通过体内外研究，证实AFAP1-AS1高表达可以促进三阴性乳腺癌增殖，减少三阴性乳腺癌细胞发生凋亡，并增加三阴性乳腺癌的放射抵抗性。
(6)三阴性乳腺癌细胞株中放疗后行氧化还原平衡检测
MDA-MB-231细胞放疗后24、48、72小时，行PCR实验检测GSH的表达量，结果表明随着时间递增及剂量递增，GSH的表达量相应增加(见图10)。
MDA-MB-231细胞放疗后24小时，检测GSH/GSSH的比例，结果表明随着剂量递增，GSH/GSSH的比例相应增加，但加入PDSA NPs后，该种差异明显缩小(见图11)。
上述实验结果表明，MDA-MB-231细胞在放疗后随着时间及剂量递增，GSH以及GSH/GSSH比例均明显增加，从而表明三阴性乳腺癌细胞的放射敏感性随着时间及剂量的递增逐渐下降，但在三阴性乳腺癌细胞放疗后加入PDSANPs，随着剂量递增，检测的GSH/GSSH比例则无明显变化，表明GSH被PDSANPs消耗，三阴性乳腺癌细胞的放射敏感性逐步恢复。
(7)纳米粒子敲降与放疗抵抗相关基因的效率
携载si AFAP1-AS1的PDSANPs纳米颗粒稀释为携载不同浓度siRNA(0-50nM)后与MDA-MB-231细胞共培养48小时，然后提取RNA行PCR实验以明确PDSA NPs携载不同浓度siAFAP1-AS1的敲低效率。结果提示在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中，随着PDSA NPs携载siAFAP1-AS1的浓度逐步增加，AFAP1-AS1的敲低效率逐步增加，遂后续实验选用PDSA NPs携载si AFAP1-AS1 50nM的浓度继续进行(见图12)。
(8)单击多靶模型证实携载si AFAP1-AS 1的PDSA NPs可以增加三阴性乳腺癌细胞的放射敏感性
将三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞分为5组，1组转染siNC，1组转染纳米材料PDSA NPs，1组转染携载siNC的PDSA NPs，1组转染si AFAP1-AS1，1组转染携载si AFAP1-AS1的PDSA NPs，构建单击多靶模型的方法同实验(1)。
结果提示，与转染siNC组、转染纳米材料PDSA NPs组及转染携载siNC的PDSA NPs组相比，转染si AFAP1-AS1组及转染携载si AFAP1-AS1的PDSA NPs组的细胞克隆形成率及细胞存活分数均明显下降，而且以转染携载si AFAP1-AS1的PDSA NPs组更明显，差异达统计学意义(P＜0.05)。构建单击多靶模型，拟合剂量存活曲线，并计算SF2、D0、Dq值。从模型可见，转染si AFAP1-AS1组及携载si AFAP1-AS1的PDSA NPs组的剂量存活曲线明显下移，SF2、D0、Dq值均明显减低，而且以携载si AFAP1-AS1的PDSA NPs组的剂量存活曲线下降更为明显，SF2、D0、Dq值降低也更为明显。证明携载si AFAP1-AS1的PDSA NPs 组细胞放疗后的细胞存活率更低，放射敏感性更高。因此可以证明纳米材料PDSA NPs和si AFAP1-AS1可以协同增加三阴性乳腺癌的放射敏感性(见图13、表2)。
表2
Figure BDA0003272529280000101
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※注释：P1为si AFAP1-AS1组与携载siNC的PDSA NPs组比较，P2为携载si AFAP1-AS1的PDSA NPs 组与携载siNC的PDSA NPs组比较
(9)用细胞凋亡实验证实携载si AFAP1-AS1的PDSA NPs可以增加三阴性乳腺癌细胞的放射敏感性
将三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞分为5组，1组转染siNC，1组转染纳米材料PDSA NPs，1组转染携载siNC的PDSA NPs，1组转染siAFAP1-AS1，1组转染携载 siAFAP1-AS1的PDSA NPs。待细胞贴壁后24小时行放疗，放疗剂量分别为0、6、10Gy，放疗后24～48小时后按Annexin V法处理细胞，然后通过流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。
结果显示，与转染siNC组、转染纳米材料PDSA NPs组及转染携载siNC的PDSANPs组相比，转染siAFAP1-AS1组及转染携载siAFAP1-AS1的PDSA NPs组的细胞凋亡率明显升高，而且以转染携载siAFAP1-AS1的PDSA NPs组更为明显，证明该组细胞放疗后的细胞凋亡更多，对放射线的敏感性更高。因此可以证明纳米材料PDSA NPs和siAFAP1-AS1可以协同增加三阴性乳腺癌的放射敏感性(见图14和15)。
(10)用细胞周期实验证实携载si AFAP1-AS1的PDSA NPs可以增加三阴性乳腺癌细胞的放射敏感性
将三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞分为5组，1组转染siNC，1组转染纳米材料PDSANPs，1组转染携载siNC的PDSA NPs，1组转染siAFAP1-AS1，1组转染携载siAFAP1-AS1 的PDSA NPs。待细胞贴壁后24小时行放疗，放疗剂量分别为0、6、10Gy，放疗后24-48 小时后通过流式细胞仪检测细胞周期的变化。
结果显示，与转染siNC组、转染纳米材料PDSA NPs组及转染携载siNC的PDSANPs组相比，转染siAFAP1-AS1组及转染携载siAFAP1-AS1的PDSA NPs组的细胞周期检测明显呈G2周期阻滞，而且以转染携载siAFAP1-AS1的PDSA NPs组更为明显，证明该组细胞对放射线的敏感性更高。因此可以证明纳米材料PDSA NPs和siAFAP1-AS1可以协同增加三阴性乳腺癌的放射敏感性(见图16和17)。
前期体内外研究均证明AFAP1-AS1高表达可以促进三阴性乳腺癌的增殖、转移并增加三阴性乳腺癌的放射抵抗性。因此，AFAP1-AS1很可能可以成为三阴性乳腺癌的治疗靶点。本部分实验通过体内研究证实新型纳米材料PDSA NPs携载si AFAP1-AS1可以增加三阴性乳腺癌细胞的放射敏感性，作用较单纯使用si AFAP1-AS1更为明显。
(11)纳米粒子的肿瘤富集能力评估
将三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞接种到雌性裸鼠皮下，构建皮下肿瘤模型。待肿瘤体积达100mm3左右，将载有荧光标记si AFAP1-AS1的PDSA NPs尾静脉注射到小鼠体内，使用小动物活体成像仪观测纳米粒子在小鼠体内分布和肿瘤富集情况。图18和19结果显示，载有si AFAP1-AS1的PDSA NPs在肿瘤组织富集量明显高于鼠尾静脉单纯注射PDSA NPs组及注射PBS组。
(12)纳米粒子体内抑制肿瘤生长效果
对30只雌性BALB/C裸鼠予以三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231行乳腺脂肪垫注射法建立乳腺癌原位移植瘤模型。30只裸鼠均成瘤，通过游标卡尺定期测量裸鼠原位移植瘤的长径及短径，成瘤时间平均为10天。待原位移植瘤长出后，根据瘤体体积绘制生长曲线，待肿瘤体积达到150cm2时，将30只荷瘤小鼠分为6组，每组5只小鼠，其中两组鼠尾静脉注射PBS，然后取其中一组行放疗；两组鼠尾静脉注射PDSA NPs纳米材料，然后取其中一组行放疗；两组鼠尾静脉注射PDSA NPs材料携载si AFAP1-AS1，然后取其中一组行放疗。放疗方案为予以原位移植瘤单次照射10Gy。待小鼠自然死亡或成瘤后30天断颈处理小鼠，取瘤称重。
结果表明，取六组小鼠的瘤体称重，进行体积对比，并根据生长曲线的结果，六组小鼠尤其以鼠尾静脉注射PDSA NPs材料携载si AFAP1-AS1组及PDSA NPs材料携载siAFAP1-AS1联合放疗组小鼠的肿瘤体积缩小最为明显。由此经过体内研究证实AFAP1-AS1联合PDSA NPs治疗可以恢复三阴性乳腺癌的放射敏感性，因此以PDSA NPs材料携载siAFAP1-AS1-l联合放射治疗可以有效治疗三阴性乳腺癌(见图20)。
(13)纳米粒子的体内毒性测试
将载有si AFAP1-AS1的PDSA NPs尾静脉注射到小鼠体内(n＝3)，注射剂量为每只小鼠1nmol siRNA。每天注射一次，连续注射3天后，处死小鼠，收集小鼠外周血，进行血常规检测；同时收集不同脏器，使用多聚甲醛固定。随后切片并H&E染色，进行组织学分析。图21结果显示，携载siAFAP1-AS1的PDSA NPs对于小鼠无明显毒副作用。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种抑制AFAP1-AS1表达以增加乳腺癌放射治疗敏感性的干扰RNA在制备增加乳腺癌放射治疗敏感性的药物中的用途，其特征在于，所述干扰RNA的正义链序列为GCUACUUCUGUCUCAUUAATT；反义链序列为UUAAUGAGACAGAAGUAGCTT。
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