CN115317619A - 一种核酸纳米载药体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核酸纳米载药体，可用于小分子抗癌药物铂类药物递送和药效增强，经试验验证，本发明的核酸纳米载药体具有高度增敏性质，可以快速进入真核细胞。该载体可将小分子药物铂类药物，精确靶向递送到肿瘤细胞中，有效杀伤肿瘤细胞并且调控肿瘤细胞中的抗药基因表达。该纳米载体安全无毒、载药量高，并能实时监控与传统的药物载体相比具有更广泛的应用前景。

Description

一种核酸纳米载药体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种核酸纳米载药体及其应用。
背景技术
癌症是威胁人类健康的最主要的疾病之一，化学治疗是目前肿瘤治疗的主要手段之一，目前已有6种铂类抗肿瘤药物被批准用于多种实体瘤的临床抗肿瘤治疗。但铂类药物都有明显的全身毒性，临床应用时面临严重的剂量毒性，药物失活以及耐药性等主要问题。借助于脂质体、胶束、树状分子和聚合物等构建的纳米递送系统虽然克服了传统铂类药物制剂的缺陷，有效控制药物体内递送和释放，从而增强治疗效果并降低毒副作用，但是这大多存在毒性高、靶向性弱、合成复杂等因素的限制，阻碍了其在临床治疗中的广泛应用。与合成材料相比，内源性材料衍生的载体对纳米医学的发展非常有利。随着DNA纳米结构的发展，DNA由于其高生物相容性和独特的优点被认为是一种良好的药物传递载体。人们可以通过控制合成不同大小，形状不同的DNA纳米结构作为生物传感器，药物靶向运输载体等。如DNA四面体具有尺寸可控、结构稳定、易修饰等优点，广泛应用小分子药物的递送。
多种抗癌药物，包括铂类药物在内，都会引起DNA损伤，癌细胞通过碱基切除修复途径(BER)对DNA损伤进行修复，从而产生抗药性。在这个途径中脱嘌呤嘧啶核酸内切酶(APE1)起了重要作用。在损伤的部位较易形成脱嘌呤嘧啶位点(AP位点)，APE1能够特异性识别并切割位点，从而进行DNA的修复。通过使肿瘤细胞BER途径失活，抑制APE1酶的表达，有望实现增强铂类抗癌药物的治疗效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何在靶向高效递送小分子药物铂类药物到肿瘤细胞中的同时敏化铂类药物，增强药效。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种核酸纳米载药体。
本发明提供的核酸纳米载药体，其由顶点带有若干延长链的DNA四面体主体结构，以及与延长链通过碱基互补配对连接的5条短链构成；所述5短链分别为：含有AS1411适配体的DNA单链、含有抑制脱嘌呤嘧啶核酸内切酶APE1酶的siRNA单链、含有与所述siRNA单链反向互补区域的RNA单链、含有检测脱嘌呤嘧啶核酸内切酶APE1酶抑制情况的两条核酸探针DNA单链；所述含有检测脱嘌呤嘧啶核酸内切酶APE1酶抑制情况的两条核酸探针DNA单链，其中一条的5'端修饰有荧光基团，另一条的3'端修饰有淬灭基团，且与淬灭基团相邻8-10bp的位置具有一个AP位点；两条核酸探针DNA单链与同一条延长链互补结合，互补结合后荧光基团和淬灭基团位置相邻。
本发明提供的核酸纳米载药体工作原理如下：铂类药物通过DNA四面体进行细胞递送，DNA四面体纳米结构上分别负载了AS1411核酸适配体、APE1酶的siRNA、以及表征APE1活性的DNA探针。利用AS1411适配体靶向肿瘤细胞膜表面核仁素蛋白，将铂类药物精准精准靶向递送至肿瘤细胞；利用含有抑制APE1酶的siRNA抑制肿瘤细胞碱基切除修复途径(BER)；利用表征APE1酶抑制情况的DNA探针实时监测APE1酶抑制情况。
上述核酸纳米载药体中，所述荧光基团为J0E、HEX、VIC、R0X、CY3或CY5，所述淬灭基团为BHQ2或BHQ3。
上述核酸纳米载药体中，所述顶点带有若干延长链的DNA四面体主体结构由4条DNA长单链自组装构成，四面体的3个顶点带有延长链，4条DNA长单链的核苷酸序列可具体如表1中的P1(如序列表序列1所示)，P2(如序列表序列2所示)，P3(如序列表序列3所示)，P4(如序列表序列4所示)。
上述核酸纳米载药体中，所述含有检测脱嘌呤嘧啶核酸内切酶APE1酶抑制情况的两条核酸探针DNA单链，可具体如表1中的P5(如序列表序列5所示)和P6所示(如序列表序列6所示)，均具有和P1互补配对的序列(P5与P1互补配对的序列以下划线指示，P6与P1互补配对的序列以波浪线指示)：其中P5的5'端修饰有荧光基团；P6的3'端修饰有淬灭基团，与淬灭基团相邻8-10bp的位置具有一个AP位点；P5和P6的荧光基团和淬灭基团位置相邻。
上述核酸纳米载药体中，所述含有AS14111适配体的DNA单链可具体如表1中的P7(如序列表序列7所示，其中第1-23位为AS14111适配体序列)，具有和P3互补配对的序列(序列表序列7的第24至41位，其与序列表序列3的第62至84位互补配对)。
上述核酸纳米载药体中，所述含有抑制脱嘌呤嘧啶核酸内切酶APE1酶的siRNA单链可具体如表1中的P8(如序列表序列8所示)的RNA单链中，具有和P2互补配对的序列(序列表序列8的第1至20位，其与序列表序列P2的第1至20位互补配对)，以及和P9互补配对的序列(序列表序列8的第26至44位，其与序列表序列9的第1至19位互补配对)。P8与P9互补形成APE1 siRNA。
上述核酸纳米载药体中，所述含有与所述siRNA单链反向互补区域的RNA单链如序列表序列9所示，其第1至19位与序列表序列8的第26至44位互补配对。
本发明还提供使用上述核酸纳米载药体的制备方法，包括将各DNA单链退火组装DTN、各siRNA单链退火组装siRNA，将DTN和siRNA混合后退火组装得到核酸纳米载药体。
本发明的核酸纳米载药体使用方法，包括以所述的核酸纳米载药体装载铂类药物的步骤。
本发明还提供一种产品，其由上述核酸纳米载药体装载药物得到。
上述产品中，所述药物为癌症治疗药物。
上述产品中，所述癌症治疗药物可为铂类药物。在本发明的一个实施例中，所述铂类药物为顺铂或C8-顺铂。
上述产品中，所述产品可为药物。所述产品可用于治疗疾病，如癌症。所述癌症可为肺癌，如非小细胞肺癌。
为解决上述技术问题，本发明还提供了如下W1-W5的任一应用：
W1、上述核酸纳米载药体在制备增强癌症治疗药物药效产品中的应用；
W2、上述核酸纳米载药体在制备癌症治疗药物中的应用；
W3、上述产品在制备癌症治疗药物中的应用；
W4、上述产品在制备抑制癌细胞生长产品中的应用；
W5、上述产品在制备降低癌细胞细胞活力产品中的应用。
上述应用中，所述癌症治疗药物可为肺癌治疗药物。所述肺癌治疗药物可为非小细胞肺癌治疗药物。具体的，所述癌症治疗药物可为顺铂或C8-顺铂。
上述应用中，所述癌症可为肺癌，如非小细胞肺癌。所述癌细胞可为肺癌细胞，如非小细胞肺癌细胞。
本发明公开的用于小分子抗癌药物铂类药物递送的核酸纳米载药体，有以下特点：(1)通过DNA四面体骨架主体部分携带顺铂分子进入细胞；(2)通过APE1 siRNA抑制基因修复过程中的脱嘌呤嘧啶核酸内切酶APE1的表达，抑制肿瘤细胞损伤修复途径，增强铂类药物的药效；(3)设计有核酸探针可探测评价APE1酶的抑制效果(4)AS1411适配体的装载可以精确靶向肿瘤细胞，避免对正常细胞的损伤。经实验验证，本发明的核酸纳米载药体具有高度增敏性质，可以快速进入肿瘤细胞。该载体可将小分子药物铂类药物，精确靶向递送到肿瘤细胞中，有效杀伤肿瘤细胞并且调控肿瘤细胞中的基因表达。该纳米载体安全无毒、载药量高，并能实时监控与传统的药物载体相比具有更广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1核酸纳米载药体的结构示意图。
图2为本发明实施例1的核酸骨架结构和核酸纳米载药体的电泳表征示意图。其中“+”表示添加有该链，“-”表示不添加该链。图2的A图为核酸骨架结构逐步组装的电泳表征示意图，图2的B图为核酸纳米载药体组装的电泳表征示意图。
图3为本发明实施例1的核酸纳米载药体原子力显微镜表征示意图。图3的A图为核酸纳米载药体，图3的B图为载药后的核酸纳米载药体。
图4为本发明实施例1核酸纳米载药体对肿瘤细胞A549的细胞摄入图。其中，cy3为激发波长520nm的激光发射源下的细胞，cy5为激发波长620nm的激光发射源下的细胞，nucleus(细胞核)染色为Hoechst 33342为激发波长350nm的汞灯发射源下的细胞，merge为荧光重叠组合图。虚线部分为APE1的含量。
图5为本发明实施例1核酸纳米载药体负载顺铂和四价铂类药物C8-顺铂对肿瘤细胞A549的细胞存活率图。所示数据为平均值±标准差，重复数为3。
图6为本发明实施例1中PTX模型小鼠抑瘤实验中小鼠的体重随治疗时间的变化图。所示数据为平均值±标准差，重复数为5。
图7为本发明实施例1中PTX模型小鼠抑瘤实验中小鼠肿瘤的体积随治疗时间的变化图。所示数据为平均值±标准差，重复数为5。
图8为本发明实施例1中PTX模型小鼠抑瘤实验中小鼠离体肿瘤的变化图片。
图9为本发明实施例1中PTX模型小鼠抑瘤实验中小鼠离体肿瘤的重量柱状图。所示数据为平均值±标准差，重复数为5。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验例1
一、基于DNA纳米载体负载铂类抗癌药物的核酸纳米载药体的制备
发明人构建了一种基于DNA纳米载体负载铂类抗癌药物的核酸纳米载药体，其结构示意图如图1所示：由顶点带有若干延长链的DNA四面体主体结构，以及与延长链通过碱基互补配对连接的5条短链构成；所述5短链分别为：含有AS1411适配体的DNA单链、含有抑制脱嘌呤嘧啶核酸内切酶APE1酶的siRNA单链、含有与所述siRNA单链反向互补区域的RNA单链、含有检测脱嘌呤嘧啶核酸内切酶APE1酶抑制情况的两条核酸探针DNA单链。
上述核酸纳米载药体中，所述顶点带有若干延长链的DNA四面体主体结构由4条DNA长单链自组装构成，四面体的3个顶点带有延长链，4条DNA长单链的核苷酸序列可具体如表1中的P1(如序列表序列1所示)，P2(如序列表序列2所示)，P3(如序列表序列3所示)，P4(如序列表序列4所示)。
上述核酸纳米载药体中，所述含有检测脱嘌呤嘧啶核酸内切酶APE1酶抑制情况的两条核酸探针DNA单链，可具体如表1中的P5和P6所示，均具有和P1互补配对的序列(P5与P1互补配对的序列以下划线指示，P6与P1互补配对的序列以波浪线指示)：其中P5的5'端修饰有荧光基团；P6的3'端修饰有淬灭基团，与淬灭基团相邻8-10bp的位置具有一个AP位点；P5和P6的荧光基团和淬灭基团位置相邻；荧光基团选自J0E、HEX、VIC、R0X、CY3或CY5，淬灭基团选自BHQ2或BHQ3；优选地，所述荧光基团为CY5，所述淬灭基团为BHQ3。
上述核酸纳米载药体中，所述含有AS14111适配体的DNA单链可具体如表1中的P7(如序列表序列7所示，其中第1-23位为AS14111适配体序列)，具有和P3互补配对的序列(序列表序列7的第24至41位，其与序列表序列3的第62至84位互补配对)。
上述核酸纳米载药体中，所述含有抑制脱嘌呤嘧啶核酸内切酶APE1酶的siRNA单链可具体如表1中的P8(如序列表序列8所示)的RNA单链中，具有和P2互补配对的序列(序列表序列8的第1至20位，其与序列表序列P2的第1至20位互补配对)，以及和P9互补配对的序列(序列表序列8的第26至44位，其与序列表序列9的第1至19位互补配对)。P8与P9互补形成APE1 siRNA。
上述核酸纳米载药体中，所述含有与所述siRNA单链反向互补区域的RNA单链如序列表序列9所示，其第1至19位与序列表序列8的第26至44位互补配对。
表1序列
Figure BDA0003057804430000051
Figure BDA0003057804430000061
上述核酸纳米载药体的制备方法包括以下步骤：在50μL的体系中分别加入浓度为2.5μM的P1-P7，以10×TM buffer为缓冲液，通过PCR退火自组装形成初步核酸纳米载药体。10×TM buffer的配制方法如下：精密称取968.8mg三羟甲基氨基甲烷，1.072g醋酸镁，将其倒入50ml离心管中，加入40ml去离子水使其溶解，用冰醋酸调到pH值为8.0即可。所述PCR程序为：80℃10min，4℃30min。制备完成的初步核酸纳米载药体即为DTN，放置于4℃冰箱保存。
进一步的制备siRNA双链，将P8、P9两条RNA从冰箱中取出冻干粉状，置于高速离心机中，配平，设置参数为4℃，12,000r/min，2min；参考siRNA管外包装上信息在无菌操作试验台上加入所需DEPC水的量，配制成浓度为20μM的siRNA溶液。将配制好的浓度为1μM的DTN溶液放入超净台中，取一200μL无酶PCR管，先后分别加入17.5μL DEPC水，5μL配置好的10×TM buffer(用DEPC水配置，并且已灭菌)，25μL浓度为1μM的DTN溶液，2.5μL浓度为20μM的siRNA溶液，共50μL体系。退火。所述PCR退火程序为：75℃2min，65℃1min，55℃1min，45℃1min，37℃1min。制备完成得到核酸纳米载药体，放置于4℃冰箱保存。
使用聚丙烯酰胺凝胶电泳对本实施例合成的核酸纳米载药体进行表征，结果如图2所示，表明合成的核酸骨架结构和核酸纳米载药体(DTN)，实验结果如图2所示。如图2的A图为核酸骨架结构逐步组装的示意图。从图2的A图可以清晰地看到DNA四面体的逐步组装过程，四面体由P1-P7七条核酸链组成，由于Native-page中核酸分子量越大在泳道中的迁移速度越慢，随着核酸链的不断加入，分子量增大，电泳条带迁移减缓，最终呈现一个明显的梯度，条带清晰并无杂带出现。图2的B图为DTN组装示意图。连接了APE1 siRNA核酸纳米载药体如图2的B图中泳道3所示，与图2的B图中泳道2未加siRNA双链结构对比，分子量增大表明siRNA双链成功组装，并且没有出现降解现象，制备完成。
核酸纳米载药体(DTN)与携带小分子铂药的核酸纳米载药体的AFM表征：将1μM的核酸纳米结构稀释为5nM，将5μL 5nM的DTN和5μL C8-cis-DTN滴至云母片上，烘干。使用布鲁克轻敲模式探针OTESPA-R3扫描和成像。结果表明：图3的A图中核酸纳米载药体尺寸为15nm，图3的B图中负载小分子铂药后核酸纳米载药体尺寸略有增加，约为20nm。
二、核酸纳米载药体对A549细胞摄入情况
选用A549细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0016)，从培养箱中取出汇合度达到80％的A549细胞，加入1ml胰酶进行消化。离心之后向细胞中加入RPMI-1640培养基，吹打均匀，用移液枪吸取200ml加入至共聚焦培养皿中，所吸取细胞约为10万个，在37℃5％CO2细胞培养箱中培养12h，使细胞贴壁；取出共聚焦培养皿，两种核酸纳米探针的浓度均为200μL×200nM/皿。每皿180μLRPMI-1640培养基，20μL 50μL X 2μM核酸纳米结构，1μLHoechst 33342(2.5μg/mL)。放入37℃，5％CO2培养箱孵育数小时后进行拍摄，在共聚焦培养皿中加入不同核酸纳米载药体，具体设置完整的核酸纳米载药体处理，以未加上APE1siRNA的核酸纳米载药体处理作为对照，具体如下：
完整的核酸纳米载药体处理：加入200μL培养体系终浓度为200nM完整的核酸纳米载药体，完整的核酸纳米载药体的制备方法见本实施例第一部分，所用的原料核苷酸链为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9。
未加上APE1 siRNA的核酸纳米载药体处理对照：加入200μL培养体系终浓度为200nM未加上APE1 siRNA的核酸纳米载药体，所用的原料核苷酸链为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7(所用原料核苷酸连没有P8、P9)，其它参数保持和本实施例第一部分完全一致。
上述两种处理分别放入37℃恒温培养箱孵育4h后，放在全内反射荧光显微镜下拍摄，打开激光以及汞灯，调整焦距，找到形态较好的细胞，拍摄明场下的细胞、激光发射源下的细胞，汞灯发射源下的细胞。镜头为40×油镜，cy5激发波长620nm，发射波长为640-720nm，cy3激发波长为520nm，发射波长为540-640nm。Hoechst 33342激发波长350nm，发射波长460nm。
结果如图4所示，图4中(上排图片)表示未加上APE1 siRNA的核酸纳米载药体中-cy5进入细胞，但细胞荧光非常强，说明检测到的APE1蛋白较多；图4中(图4中的下排图片)表示同一时间完整的核酸纳米载药体进入细胞后，cy5与cy3的荧光叠加图，可以看到智能核酸纳米载体组装成功，同时观察到虚线部分cy5荧光部分减弱，说明加上APE1 siRNA后核酸纳米探针一定程度上抑制了APE1蛋白的表达。
三、核酸纳米载药体对A549细胞毒性情况
1：负载顺铂的核酸纳米载药体对A549细胞毒性情况
1.1首先配制顺铂溶液，顺铂为水溶性铂药，所用顺铂为阿拉丁公司产品，货号为D109812。使用分析电子天平称取顺铂粉末0.3mg，溶于1ml无霉无菌水中，制备成1mM的顺铂溶液，使用无霉无菌水稀释成不同浓度，注意避光4℃保存。
1.2进一步的将制备好的核酸纳米载药体与顺铂分子连接，得到负载顺铂分子的核酸纳米载药体：
1.2.1将按照本发明第一部分制备好的完整的核酸纳米载药体与顺铂溶液混合避光4℃匀速震荡60min。通过0.5mL 30K的超滤离心管以5min 6000rpm的要求超滤3次，得到顺铂-核酸纳米载药体。
1.2.2将按照本发明第一部分制备好的未加上APE1 siRNA的核酸纳米载药体与顺铂溶液混合避光4℃匀速震荡60min。通过0.5mL 30K的超滤离心管以5min 6000rpm的要求超滤3次，得到顺铂-核酸纳米载药体(未连接siRNA)。
1.3将A549细胞从恒温培养箱中取出测检测细胞，取细胞状态良好，汇合度达到80％的A549细胞，培养至在显微镜下计数的细胞密度为6.5×104/mL；将密度为6.5×104/mL的细胞混合液加到96孔板中，每个孔中加100μL，96孔板的四周每孔加100μL PBS(防止细胞混合液挥发)。将种好细胞的96孔板放入CO2培养箱中培养12h。将种了A549细胞的96孔板从CO2培养箱中取出，放在倒置显微镜上观察，若96孔板中细胞密度均匀并且细胞形态良好，可以加样，每个孔中加入10μl样品。核酸纳米载药体终浓度设置为200nM；顺铂、顺铂-核酸纳米载药体(未连接siRNA)、顺铂-核酸纳米载药体药物终浓度设置为：0.005，0.05，0.5，5，10，20μM。加完样后将96孔板放入CO2培养箱中孵育，48h后将细胞取出，在细胞加样孔中分别加入10μL CCK-8，轻轻摇晃96孔板，使其混合均匀。随后，将96孔板放入CO2培养箱培养2～4h，使96孔板中的细胞混合液变为黄色。使用多功能酶标仪测A549细胞各个样品的OD450的值。计算细胞活性，结果如图5所示，从图中可以得出此智能纳米载药体系能够敏化顺铂，降低细胞活力，增强其药效，且药效的增强强度与浓度相关。
2：负载四价铂药C8-顺铂的核酸纳米载药体对A549细胞毒性情况
2.1首先配制四价铂药C8-顺铂溶液，C8-顺铂为油溶性铂药，所用C8-顺铂为中国科学院化学研究所制备，合成文献为:Near-Infrared Light Irradiation Induced MildHyperthermia Enhances Glutathione Depletion and DNA Interstrand Cross-LinkFormation for Effiffifficient Chemotherapy。使用分析电子天平称取顺铂粉末0.7mg，溶于1mlDMSO中，制备成8mM的C8-顺铂溶液，使用无霉无菌水稀释成不同浓度，注意避光4℃保存。
2.2进一步的将制备好的核酸纳米载药体与C8-顺铂分子连接得到负载C8-顺铂的核酸纳米载药体：
2.2.1将按照本发明第一部分制备好的完整的核酸纳米载药体与C8-顺铂溶液混合避光4℃匀速震荡60min，通过0.5mL 30K的超滤离心管以5min 6000rpm的要求超滤3次，得到C8-顺铂-核酸纳米载药体。
2.2.2将按照本发明第一部分制备好的未加上APE1 siRNA的核酸纳米载药体与C8-顺铂溶液混合避光4℃匀速震荡60min，通过0.5mL 30K的超滤离心管以5min6000rpm的要求超滤3次，得到C8-顺铂-核酸纳米载药体(未连接siRNA)。
2.3将A549细胞从恒温培养箱中取出测检测细胞，取细胞状态良好，汇合度达到80％的A549细胞，培养至在显微镜下计数的细胞密度为6.5×104/mL；将密度为6.5×104/mL的细胞混合液加到96孔板中，每个孔中加100μL，96孔板的四周每孔加100μL PBS(防止细胞混合液挥发)。将种好细胞的96孔板放入CO2培养箱中培养12h。将种了A549细胞的96孔板从CO2培养箱中取出，放在倒置显微镜上观察，若96孔板中细胞密度均匀并且细胞形态良好，可以加样，每个孔中加入10μL样品。核酸纳米载药体终浓度设置为200nM；C8-顺铂、C8-顺铂-核酸纳米载药体(未连接siRNA)、C8-顺铂-核酸纳米载药体药物终浓度设置为：0.005μM，0.05μM，0.5μM，5μM，10μM，20μM。加完样后将96孔板放入CO2培养箱中孵育，48h后将细胞取出，在细胞加样孔中分别加入10μL CCK-8，轻轻摇晃96孔板，使其混合均匀。随后，将96孔板放入CO2培养箱培养2～4h，使96孔板中的细胞混合液变为黄色。使用多功能酶标仪测A549细胞各个样品的OD450的值。计算细胞活性，结果如图5所示，从图中可以得出此纳核酸纳米载药体能够敏化C8-顺铂，增强其药效。
四、小鼠肿瘤抑瘤实验
选用8至9周龄的雌性BALB/c-Nude小鼠(南模生物产品，货号NM-NSG-008)，饲养至体重约为20g后，构建裸鼠PDX模型，所有实验均符合伦理要求。具体过程如下：
在饲养过程中，要求实验室为25℃的恒温，空气的相对湿度达到50％左右，24h监控。同时保证实验小鼠自由进食饮水，所选食物为高压灭菌的SPF级别的鼠粮，饮用水为超纯水。构建裸鼠PDX模型的方法为瘤块包埋法。实验小鼠经过7天的适应性饲养后确认到达预期建模体重(20g左右)，每天进行动物观察确认生理状态正常。进行PDX模型的构建：用酒精擦拭小鼠左腋下消毒，使用无血清的RMIP 1640培养基清洗保存的肿瘤组织。肿瘤组织的保存在-80℃冰箱中，并且大小均为1mm3左右。将清洗后的肿瘤组织用注射器注射接种至皮下，以上操作均在无菌超净台内完成。每天定时观察肿瘤的生长状态及小鼠的生理状态。每日测量构建的PDX模型裸鼠的肿瘤生长的状态，肿瘤体积(mm3)＝1/2×长径，选用构建成功的PDX模型小鼠，即小鼠的肿瘤体积大于90mm3后，选择肿瘤尺寸相似，状态较好的小鼠随机分成4组，每一组为5只小鼠。4组分别进行如下处理：
阴性对照PBS缓冲液组：所用药剂为PBS缓冲液。
阳性对照顺铂组：所用药剂为顺铂溶液，1mM的顺铂溶液(溶剂为PBS缓冲液)配制方法参见本实施例第三部分步骤2中2.1的方法。
没有抑制APE1蛋白的核酸纳米载药体+C8-顺铂组：所用药剂为浓度为3μM的C8-顺铂-核酸纳米载药体(未连接siRNA)溶液(溶剂是PBS缓冲液)，C8-顺铂-核酸纳米载药体(未连接siRNA)配制方法参见本实施例第三部分步骤2中2.2.2的方法。
抑制APE1蛋白的核酸纳米载药体+C8-顺铂组：所用药剂为浓度为3μM的C8-顺铂-核酸纳米载药体溶液(溶剂是PBS缓冲液)，C8-顺铂-核酸纳米载药体溶液配制方法参见本实施例第三部分步骤2中2.2.1的方法。
给药方式选择尾静脉注射，给药剂量为固定体积150μl，保证药品的相对浓度一致(以铂含量为标准，2mg铂/kg小鼠)，一共给药5次。
图6为小鼠的体重随治疗时间的变化，从其曲线变化趋势可以得出，相较于注射PBS组而言，使用核酸纳米载药体(抑制APE1蛋白的核酸纳米载药体+C8-顺铂组以及没有抑制APE1蛋白的核酸纳米载药体+C8-顺铂组)的小鼠体重无较大变化，阳性对照顺铂组小鼠体重下降较快，没有抑制APE1蛋白的核酸纳米载药体+C8-顺铂以及抑制APE1蛋白的核酸纳米载药体+C8-顺铂组的体重稍有下降。
图7为小鼠肿瘤的体积随治疗时间的变化折线，图中可清晰地看出抑制APE1蛋白的核酸纳米载药体+C8-顺铂组小鼠的肿瘤体积增长幅度最小速度最慢，而其他给药组的小鼠肿瘤体积增长较快。同时，可以从图8和图9中肿瘤离体(最后一次测量肿瘤体积的24h后，将小鼠处死，得到肿瘤组织)的图片也可以得出相同的结论。说明本发明制备的核酸纳米载药体因为AS1411适配体的被动靶向能够快速到达肿瘤部位，并富集在肿瘤部位；负载了四价铂前药C8-Cispt的核酸纳米载药体在高还原剂的浓度下迅速释放发挥作用；进入细胞后APE1的siRNA被释放出来，抑制APE1蛋白的表达，抑制肿瘤细胞的自我修复，一定程度上克服铂药耐药问题，达到最显著的疗效。
这些结果说明本发明公开的用于小分子抗癌药物铂类药物递送的核酸纳米载药体，具有高度增敏性质，可以快速进入真核细胞。该载体可将小分子药物铂类药物，精确靶向递送到肿瘤细胞中，有效杀伤肿瘤细胞并且调控肿瘤细胞中的基因表达。该纳米载体安全无毒、载药量高，并能实时监控与传统的药物载体相比具有更广泛的应用前景。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 北京化工大学
<120> 一种核酸纳米载药体及其应用
<130> GNCSY211258
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttggacaaa atggcagcgt catatcaggg agggggtacc tgggtagtca gcgctaccac 60
acacagaact ccctacgaca ttggcatgag atactcggag acc 103
<210> 2
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcgatccgg atcgatcgat atttgtgcct agggtatcac gctttatctg tagctcgccc 60
ccgtctccga gtatctcatg ccc 83
<210> 3
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgataccct aggcacaaat gatgtcgtag ggagttctgt gcttggatca cgcgtcggtt 60
gttttttttt tttttttttt tttt 84
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtggtagcgc tgactaccca cggggcgagc tacagataaa gaacaaccga cgcgtgatcc 60
aat 63
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgctgccat tttgtccaaa 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtaccccct cctgatatg 19
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtggtggtg gttgtggtgg tggaaaaaaa aaaaaaaaaa a 41
<210> 8
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aucgaucgau ccggaucgcg uuuccgucug guacgacugg aguacc 46
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
uacuccaguc guaccagacc u 21

Claims (9)

1.一种核酸纳米载药体，其特征在于，其由顶点带有若干延长链的DNA四面体主体结构，以及与延长链通过碱基互补配对连接的5条短链构成；所述5短链分别为：含有AS1411适配体的DNA单链、含有抑制脱嘌呤嘧啶核酸内切酶APE1酶的siRNA单链、含有与所述siRNA单链反向互补区域的RNA单链、含有检测脱嘌呤嘧啶核酸内切酶APE1酶抑制情况的两条核酸探针DNA单链；所述含有检测脱嘌呤嘧啶核酸内切酶APE1酶抑制情况的两条核酸探针DNA单链，其中一条的5'端修饰有荧光基团，另一条的3'端修饰有淬灭基团，且与淬灭基团相邻8-10bp的位置具有一个AP位点；两条核酸探针DNA单链与同一条延长链互补结合，互补结合后荧光基团和淬灭基团位置相邻。
2.根据权利要求1所述的核酸纳米载药体，其特征在于：所述荧光基团为J0E、HEX、VIC、R0X、CY3或CY5，所述淬灭基团为BHQ2或BHQ3。
3.根据权利要求1或2所述的核酸纳米载药体，其特征在于：所述顶点带有若干延长链的DNA四面体主体结构由4条DNA长单链自组装构成，四面体的3个顶点带有延长链。
4.根据权利要求3所述的核酸纳米载药体，其特征在于：所述4条DNA长单链的序列分别如序列表序列1、序列表序列2、序列表序列3、序列表序列4所示；所述含有检测脱嘌呤嘧啶核酸内切酶APE1酶抑制情况的两条核酸探针DNA单链的序列分别如序列表序列5、序列表序列6所示；所述含有AS14111适配体的DNA单链的序列如序列表序列7所示；所述含有抑制脱嘌呤嘧啶核酸内切酶APE1酶的siRNA单链的序列如序列表序列8所示；所述含有与所述siRNA单链反向互补区域的RNA单链的序列如序列表序列9所示。
5.制备权利要求1-4任一所述的核酸纳米载药体的方法，其特征在于：包括将各DNA单链退火组装DTN、各siRNA单链退火组装siRNA，将DTN和siRNA混合后退火组装得到核酸纳米载药体。
6.使用权利要求1-4任一所述的核酸纳米载药体的方法，其特征在于：包括以所述的核酸纳米载药体装载铂类药物的步骤。
7.一种产品，其由权利要求1-4任一所述的核酸纳米载药体装载药物得到。
8.根据权利要求7所述产品，其特征在于：所述药物为癌症治疗药物。
9.如下W1-W5的任一应用：
W1、权利要求1-4任一所述核酸纳米载药体在制备增强癌症治疗药物药效产品中的应用；
W2、权利要求1-4任一所述核酸纳米载药体在制备癌症治疗药物中的应用；
W3、权利要求7或8所述产品在制备癌症治疗药物中的应用；
W4、权利要求7或8所述产品在制备抑制癌细胞生长产品中的应用；
W5、权利要求7或8所述产品在制备降低癌细胞细胞活力产品中的应用。
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