CN114177312B - 一种核酸纳米药物载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种核酸纳米药物载体及其制备方法和应用。所述核酸纳米药物载体包括DNA折纸纳米结构、胆固醇‑二硫键‑DNA复合物、肿瘤靶向肽‑DNA复合物和药物，且所述折纸结构中含有修饰有二硫键的响应元件DNA分子锁。本发明提供的核酸纳米药物载体可以将化疗药物靶向递送至肿瘤部位，响应肿瘤环境打开载体释放化疗药物，降低化疗药物对正常组织器官的毒副作用，并引发肿瘤细胞免疫原性细胞死亡，激活抗肿瘤免疫。与免疫检查点抗体联合使用，达到更好治疗肿瘤的目的。

Description

一种核酸纳米药物载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米医学技术领域，具体涉及一种核酸纳米药物载体及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是威胁人类生命健康、在全球范围内造成人类死亡的重大疾病之一。化疗通过应用具有细胞毒性的化学药物抑制癌细胞增殖、浸润和转移，最终消灭癌细胞，是治疗癌症的主要方法之一。然而传统的化疗药物水溶性差、肿瘤特异性低并且血液循环时间短，这会造成化疗药物的毒副作用大、使用剂量高和治疗周期长。另外，研究表明，一些化疗药物会促使肿瘤免疫逃逸机制，这也会增大癌症复发和转移的风险。
纳米药物载体的出现为抗肿瘤化学药物的发展提供了新的契机。纳米药物载体可以有效地装载化疗药物，改善化疗药物的溶解性，延长药物在血液内的循环时间，提高药物在肿瘤部位的滞留和富集。此外，纳米材料易于功能化修饰，可以装载靶向基团，增强药物对肿瘤的主动靶向性。基于DNA折纸的核酸纳米结构具有尺寸结构精确可控、天然的可编程性、可寻址性、易于修饰功能基团和良好的生物相容性等优点，被应用作纳米药物载体，可实现化疗药物的靶向肿瘤递送和智能响应释放。
研究表明，一些化疗药物如紫杉醇会引发肿瘤细胞免疫原性细胞死亡，这种死亡方式会促使肿瘤细胞释放肿瘤相关的抗原和一些内源性分子，如钙网蛋白、高迁移族蛋白和ATP，这些信号分子可促进树突细胞的成熟，将肿瘤抗原递呈给免疫细胞，激活抗肿瘤免疫。这种免疫原性死亡介导的化疗与免疫检查点疗法联合使用可以进一步杀死肿瘤细胞，提高抗肿瘤疗效。
CN107488661A公开了一种核酸纳米结构及其制备方法和应用，所述核酸纳米结构为通过DNA折纸技术构建的六个三角形DNA折纸结构组装形成的六边形DNA纳米结构，具体是通过脚手架链与订书钉链和捕获链进行杂交，再通过连接链分别与六个三角形DNA折纸结构的脚手架链杂交而自组装形成的六边形DNA纳米结构。制备得到的金蝴蝶结结构可以产生强烈的电磁场，实现了单分子拉曼检测。
CN111729086A公开了一种核酸纳米器件，所述核酸纳米器件为负载有化疗药物且杂交有小干扰RNA的DNA折纸结构，所述DNA折纸结构上杂交有细胞穿透肽和/或核酸适配体，且可以通过特定DNA序列修饰实现响应性开闭。该发明提供的核酸纳米器件利用小干扰RNA的基因沉默作用敲除多药耐药肿瘤细胞的相关耐药基因，再结合化疗药物阿霉素杀伤肿瘤细胞，并杂交穿膜多肽TAT提高该纳米器件穿透肿瘤细胞膜的效率。在基因治疗和化疗的共同作用下，该核酸纳米器件在细胞和活体水平上显著地降低了耐药基因的表达并抑制了肿瘤细胞的生长，且没有明显的免疫原性和组织毒性。
因此，开发一种能够更好地实现响应性开启和药物释放，引发肿瘤细胞免疫原性细胞死亡，激活抗肿瘤免疫，并降低化疗药物对正常组织器官的毒副作用的核酸纳米药物载体是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种核酸纳米药物载体及其制备方法和应用。所述核酸纳米药物载体作为杂交有疏水小分子胆固醇、肿瘤血管靶向基团的DNA折纸纳米结构，可以负载疏水化疗药物，且可以通过特定DNA序列修饰实现响应性开启和药物释放。本发明提供的核酸纳米药物载体可以将化疗药物靶向递送至肿瘤部位，响应肿瘤环境打开载体释放化疗药物，降低化疗药物对正常组织器官的毒副作用，并引发肿瘤细胞免疫原性细胞死亡，激活抗肿瘤免疫。与免疫检查点抗体联合使用，达到更好治疗肿瘤的目的。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种核酸纳米药物载体，所述核酸纳米药物载体包括DNA折纸纳米结构、胆固醇-二硫键-DNA复合物、肿瘤靶向肽-DNA复合物和药物，且所述折纸结构中含有修饰有二硫键的响应元件DNA分子锁。
在本发明中，通过在DNA折纸纳米结构上修饰疏水基团、靶向肿瘤基团和响应释放基团，从而可以通过疏水作用力装载疏水抗肿瘤化学药物，并将其靶向递送至肿瘤部位，响应肿瘤环境释放药物，从而可以降低化疗药物对正常组织的毒副作用，引发肿瘤细胞免疫原性死亡。进一步联合免疫检查点疗法，实现更好的抗肿瘤效果。
其中，所述胆固醇-二硫键-DNA复合物提供疏水分子胆固醇，利用疏水分子与疏水药物之间的疏水作用力装载药物，从而进一步增加了紫杉醇的溶解性。所述肿瘤靶向肽-DNA复合物和药物，通过多肽靶向肿瘤血管内皮细胞，并通过响应性元件DNA分子锁中的二硫键，从而打开核酸纳米药物载体，释放药物，从而进一步降低紫杉醇对正常组织器官的损伤。药物释放后，引发肿瘤细胞免疫原性死亡，从而激活抗肿瘤免疫。
优选地，所述核酸纳米药物载体的结构为三维管状纳米结构，且所述三维管状纳米结构为添加修饰有二硫键的响应元件DNA分子锁形成的。
在本发明中，本发明的基于化疗-免疫治疗联合治疗肿瘤的核酸纳米药物载体，优选所述核酸纳米药物载体是基于DNA折纸技术制备得到的三维管状纳米结构。
优选地，所述三维管状纳米结构包括矩形管状纳米结构、圆筒管状纳米结构或六边形管状纳米结构中的任意一种或至少两种，优选为矩形管状纳米结构。
优选地，所述三维管状纳米结构的长度为80-100nm，例如可以是80nm、82nm、84nm、86nm、88nm、90nm、92nm、94nm、96nm、98nm、100nm等，宽度为20-40nm，例如可以是20nm、22nm、24nm、26nm、28nm、30nm、32nm、34nm、36nm、38nm、40nm等，高度为3-5nm，例如可以是3nm、3.2nm、3.4nm、3.6nm、3.8nm、4nm、4.2nm、4.4nm、4.6nm、4.8nm、5nm等。
优选地，所述DNA折纸纳米结构由DNA模板链、订书钉DNA短链和捕获DNA链依据碱基互补配对原则杂交自组装而成的纳米结构，优选为矩形纳米结构。
优选地，所述核酸纳米药物载体由DNA模板链、订书钉DNA短链、捕获DNA链、含有修饰有二硫键的响应元件DNA分子锁依据碱基互补配对原则杂交自组装而成的三维管状纳米结构，优选为矩形三维管状纳米结构。
优选地，所述DNA模板链为M13mp18噬菌体单链环状DNA。
优选地，所述胆固醇-二硫键-DNA复合物通过DNA分子杂交的方式装载于所述DNA折纸纳米结构的内部。
优选地，所述肿瘤靶向肽-DNA复合物通过DNA分子杂交的方式装载于所述DNA折纸纳米结构的两端，优选装载于所述DNA折纸纳米结构的两个短边。
优选地，所述肿瘤靶向肽选自RGD、TAT或GPR中的任意一种或至少两种的组合，优选为RGD。
优选地，所述修饰有二硫键的响应元件DNA分子锁通过碱基互补配对原则杂交到所述DNA折纸纳米结构的两端，优选杂交到所述DNA折纸纳米结构的两个长边。
优选地，所述药物为具有疏水性的药物，优选为具有疏水性的化疗药物。
优选地，所述药物通过疏水作用力装载于所述DNA折纸纳米结构的内部。
优选地，所述药物包括紫杉醇、喜树碱或多西他赛中的任意一种或至少两种的组合。
作为本发明优选的技术方案，所述核酸纳米药物载体由DNA折纸结构、胆固醇-二硫键-DNA复合物、修饰二硫键的DNA分子锁、RGD多肽以及化疗药物紫杉醇制备得到。其中，本发明提供的核酸纳米药物载体利用胆固醇和紫杉醇间疏水作用力装载紫杉醇，结合靶向肿瘤多肽RGD实现主动靶向，通过二硫键修饰的DNA分子锁实现化疗药物的响应释放，释放的化疗药物还能引发肿瘤细胞免疫原性死亡，激活机体抗肿瘤免疫，进一步联合免疫检查点抗体，可以显著抑制肿瘤增长。
优选地，为了达到装载和释放疏水药物的目的，其中72条胆固醇-二硫键-DNA链可以通过杂交组装到矩形DNA折纸结构上。
优选地，为了实现纳米药物载体的响应性开启，其中16条修饰有二硫键的DNA分子锁链可以通过杂交的方式，使矩形DNA折纸结构折叠成三维的管状结构，进而在进入到肿瘤细胞后，通过与肿瘤细胞内谷胱甘肽还原反应，还原二硫键响应性打开核酸纳米药物载体，使胆固醇脱落，释放化疗药物紫杉醇。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的核酸纳米药物载体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)通过碱基互补配对原则，将所述胆固醇-二硫键-DNA复合物和肿瘤靶向肽-DNA复合物杂交到DNA折纸纳米结构上，组装得到靶向载疏水分子的DNA折纸结构；
(2)将步骤(1)得到的靶向载疏水分子的DNA折纸结构和药物共孵育，得到载药物的DNA折纸结构；
(3)通过碱基互补配对原则，将修饰有二硫键的DNA分子锁链杂交到所述DNA折纸纳米结构上，组装得到所述核酸纳米药物载体。
优选地，步骤(1)中，所述胆固醇-二硫键-DNA复合物通过DNA分子杂交的方式装载于所述DNA折纸纳米结构的内部，所述肿瘤靶向肽-DNA复合物通过DNA分子杂交的方式装载于所述DNA折纸纳米结构的两个短边。
优选地，步骤(1)中，所述DNA折纸纳米结构和胆固醇-二硫键-DNA复合物的摩尔比为1:(50-100)，例如可以是1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100，优选为1:72。
优选地，步骤(1)中，所述DNA折纸纳米结构和肿瘤靶向肽-DNA复合物的摩尔比为1:(5-24)，例如可以是1:5、1:6、1:8、1:10、1:12、1:14、1:16、1:18、1:20、1:22、1:24等，优选为1:16。
优选地，步骤(1)中，所述杂交的条件为升温至40-50℃(例如可以是40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃等)后，再以4-6℃/min(例如可以是4℃/min、4.5℃/min、5℃/min、5.5℃/min、6℃/min等)梯度降温至20-30℃(例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等)，重复4-6次(例如可以是4次、5次、6次)，完成杂交。
优选地，步骤(1)中，所述DNA折纸纳米结构由以下制备方法制备得到：将DNA模板链、订书钉DNA短链和捕获DNA链混合于缓冲液中，退火，得到所述DNA折纸纳米结构。
优选地，所述DNA模板链、订书钉DNA短链和捕获DNA链的摩尔比为1:(5-15):(5-15)；
其中，第一个“5-15”例如可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等；其中，第二个“5-15”例如可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等。
优选地，所述退火的条件为：从95℃退火至65℃，每4-6℃(例如可以是4℃、4.5℃、5℃、5.5℃、6℃等)为一个梯度，每个梯度停留4-6min(例如可以是4min、4.5min、5min、5.5min、6min等)；从65℃退火至25℃，每0.5-2℃(例如可以是0.5℃、1℃、1.5℃、2℃等)为一个梯度，每个梯度停留9-11min(例如可以是9min、9.5min、10min、10.5min、11min等)，保持总退火时间约为7-9h(例如可以是7h、7.5h、8h、8.5h、9h等)。
优选地，步骤(1)中，所述肿瘤靶向肽-DNA复合物由以下制备方法制备得到：将叠氮修饰的DNA与炔基修饰的肿瘤靶向肽通过点击反应，得到所述肿瘤靶向肽-DNA复合物。
优选地，所述叠氮修饰的DNA与炔基修饰的肿瘤靶向肽的摩尔比为1:(3-5)，例如可以是1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5等。
优选地，所述点击反应在避光下进行，所述点击反应的温度为20-30℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等，所述点击反应的时间为10-20h，例如可以是10h、12h、14h、16h、18h、20h等。
优选地，所述点击反应在抗坏血酸和二价铜催化剂催化下进行。
优选地，所述二价铜催化剂为Cu(II)-TBTA复合物。
优选地，步骤(2)中，所述DNA折纸结构和药物的摩尔比为1:(5000-50000)，例如可以是1:5000、1:6000、1:8000、1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、1:30000、1:35000、1:40000、1:45000、1:50000等，优选为1:10000。
优选地，步骤(2)中，所述共孵育的温度为20-30℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等，共孵育的时间为7-9h，例如可以是7h、7.5h、8h、8.5h、9h等。
优选地，步骤(3)中，所述DNA折纸纳米结构和分子锁链的摩尔比为1:(1-2)，例如可以是1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2等。
优选地，步骤(3)中，所述杂交的条件为升温至40-50℃(例如可以是40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃等)后，再梯度降温至20-30℃(例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等)，重复4-6次(例如可以是4次、5次、6次)，完成杂交。
更为具体地，所述肿瘤靶向肽-DNA复合物由以下制备方法制备得到：
(a)将叠氮修饰的单链DNA和炔基修饰的肿瘤靶向肽分别溶解于PBS缓冲液中，配置得到DNA母液和肿瘤靶向肽母液；将抗坏血酸溶解于水中，配置得到抗坏血酸母液；
其中，DNA母液的浓度为200μM、肿瘤靶向肽母液的浓度为400μM、抗坏血酸的浓度为10mM、二价铜催化剂Cu(II)-TBTA复合物的浓度为10mM；
(b)将步骤(a)得到的DNA母液、肿瘤靶向肽母液、抗坏血酸母液、Cu(II)-TBTA复合物和DMSO混合，于20-30℃下避光反应10-20h后；通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化，得到所述肿瘤靶向肽-DNA复合物，最后使用紫外分光光度计定量。
更为具体地，所述DNA折纸纳米结构由以下制备方法制备得到：
(A)在PCR试管中，将DNA模板链、订书钉DNA短链和捕获DNA链混合于TAE/Mg2+缓冲液中，得到混合溶液；
其中，DNA模板链的浓度为20nM、订书钉DNA短链的浓度为200nM、捕获DNA链的浓度为200nM；
(B)在PCR仪中，使步骤(A)得到混合溶液进行退火，得未纯化矩形DNA折纸纳米结构；
(C)通过超滤柱对步骤(C)得到的未纯化矩形DNA折纸纳米结构进行纯化，除去过量的订书钉链和捕获链，得到矩形DNA折纸纳米结构；
优选地，步骤(C)中，所述纯化的具体步骤为：将未纯化矩形DNA折纸纳米结构加入100kDa的离心柱中，以4000-6000rpm(例如可以是4000rpm、4500rpm、5000rpm、5500rpm、6000rpm等)的转速进行离心1-10min(例如可以是1min、2min、4min、6min、8min、10min等)，超滤3-5次(例如可以是3次、4次、5次)，除掉过量的订书钉链、捕获链，得到矩形DNA折纸纳米结构。
更为具体地，所述核酸纳米药物载体由以下制备方法制备得到：
(1)将DNA折纸纳米结构、胆固醇-二硫键-DNA复合物、肿瘤靶向肽-DNA复合物混合于TAE/Mg2+缓冲液中，得到混合溶液；将该混合溶液升温至40-50℃，再梯度降温至20-30℃，重复4-6次，完成杂交，纯化，得到靶向载疏水分子的DNA折纸结构；
其中，DNA折纸纳米结构的浓度为80nM、胆固醇-二硫键-DNA复合物的浓度为17.28μM、肿瘤靶向肽-DNA复合物的浓度为3.84μM；
(2)将疏水药物溶解于DMSO中得到50mM的疏水药物母液；将疏水药物母液添加至步骤(1)得到的靶向载疏水分子的DNA折纸结构中，于25℃下共孵育8h，得到载药DNA折纸结构；
(3)在步骤(2)得到的载药DNA折纸结构中添加修饰有二硫键的DNA分子锁链，升温至40-50℃后，再梯度降温至20-30℃，重复4-6次，完成分子锁的杂交，纯化，得到所述核酸纳米药物载体。
优选地，步骤(1)中，所述纯化为通过超滤柱除去过量的胆固醇-二硫键-DNA复合物和肿瘤靶向肽-DNA复合物；具体地，该纯化步骤为：将未纯化靶向载疏水分子的DNA折纸结构加入100kDa的离心柱中，以4000-6000rpm(例如可以是4000rpm、4500rpm、5000rpm、5500rpm、6000rpm等)的转速进行离心1-10min(例如可以是1min、2min、4min、6min、8min、10min等)，超滤3-5次(例如可以是3次、4次、5次)，除掉过量的订书钉链、捕获链，得到靶向载疏水分子的DNA折纸结构。
优选地，步骤(3)中，所述纯化为通过高速离心，弃去上清液，洗涤沉淀，除去过量的疏水药物；具体地，该纯化步骤为：通过7000-9000rpm(例如可以是7000rpm、7500rpm、8000rpm、8500rpm、9000rpm等)的转速进行离心5-15min(例如可以是5min、7min、9min、10min、11min、13min、15min等)，弃去上清液，洗涤2-5次(例如可以是2次、3次、4次、5次)沉淀，除去过量的疏水药物。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的核酸纳米药物载体在制备化疗药物中的应用。
在本发明中，所述核酸纳米药物载体可以利用具有疏水分子的DNA折纸结构装载化疗药物、肿瘤靶向多肽和响应性元件，将化疗药物靶向递送到肿瘤部位，响应肿瘤细胞内的谷胱甘肽，打开纳米药物载体，脱落疏水基团，释放化疗药物，引发肿瘤细胞免疫原性死亡，进一步的联用免疫检查点抗体，可以激活抗肿瘤免疫，增强对肿瘤的杀伤和清除。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的核酸纳米药物载体和抗体联用在制备化疗药物中的应用。
在本发明中，所述核酸纳米药物载体进一步联合使用免疫检查点的抗体，可实现更好的杀伤清除肿瘤的效果。
优选地，所述抗体为免疫检查点抗体。
优选地，所述免疫检查点抗体选自CTLA-4抗体、PD-L1抗体或PD-1抗体中的任意一种或至少两种的组合。
名词解释
术语“RGD”是指：整合素受体靶向五元环肽RGD。
术语“TAT”是指：细胞穿透多肽TAT。
术语“GPR”是指：整合素受体靶向的多肽GRP。
术语“ATP”是指：三磷酸腺苷。
术语“PD-L1”是指：细胞程序性死亡-配体1。
术语“PD-1”是指：细胞程序性死亡-受体1。
术语“CTLA-4”是指：细胞毒T淋巴细胞相关抗原4。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过DNA折纸技术构建了一种矩形DNA折纸结构，并通过修饰胆固醇-二硫键-DNA复合物，得到载疏水分子的DNA折纸结构，可以通过疏水作用装载疏水化疗药物；通过修饰肿瘤靶向肽，将疏水化疗药物递送至肿瘤；通过修饰响应性DNA分子锁，可以响应肿瘤胞质内的谷胱甘肽，打开分子锁、响应释放化疗药物，减少化疗药物对正常组织和器官的损伤；
(2)对于三阴性乳腺癌细胞，本发明所述药物载体会进入细胞后释放疏水化疗药物，引发肿瘤细胞免疫原性死亡；在细胞水平上，可引发肿瘤细胞免疫原性死亡标志物的释放，明显抑制细胞活力，且上调肿瘤细胞PD-L1表达。在活体水平上，可促进树突细胞成熟，促进CD8+T细胞的肿瘤浸润，进一步联合免疫检查点抗体，可以更好地杀伤和清除肿瘤。
附图说明
图1为本发明所述核酸纳米药物载体的结构示意图。
图2为实施例1中本发明所述基于化疗-免疫治疗联合治疗肿瘤的核酸纳米药物载体的原子力显微镜表征图。
图3为试验例1中利用CCK8比色实验对本发明所述核酸纳米药物载体及其对照组对4T1细胞杀伤作用的效果分析图。
图4为试验例2中利用流式细胞术对本发明所述核酸纳米药物载体及其对照组对4T1细胞钙网蛋白暴露的效果分析。
图5为试验例3中利用流式细胞术对本发明所述核酸纳米药物载体及其对照组对4T1细胞PD-L1表达的分析。
图6为试验例4中利用小动物光学活体成像系统对本发明所述核酸纳米药物载体及其对照组在荷瘤小鼠体外器官分布成像结果。
图7A为试验例5中孵育甘肽孵育前核酸纳米药物载体的原子力显微镜图。
图7B为试验例5中孵育甘肽孵育前核酸纳米药物载体的原子力显微镜图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中所用的实验原料如下所示：
上述原料中的缓冲液为自制，其中具体成分购于美国Sigma-Aldrich公司。
以下实施例中所用的实验仪器如下所示：
实验仪器 厂家 型号
梯度PCR仪器 Bio-Rad，美国 T100
原子力显微镜 Bruker，德国 MultiMode8
荧光共聚焦荧光显微镜 Zeiss，德国 CaryEclipse
透射电子显微镜 Hitachi，日本 HT7700
小动物荧光活体成像系统 Perkinelmer，美国 IVISSpectrum
流式细胞仪 Agilent，美国 NovoCyte
高效液相色谱仪 SHIMADZU，日本 LC-10AvpPlus
下述实施例仅为示例性地给出核酸纳米药物载体的制备方法，其中捕获DNA链、叠氮修饰的DNA、胆固醇-二硫键-DNA复合物、DNA分子锁等DNA序列包括但不限于实施例1所给出的序列，也可以是其他满足碱基互补配对原则的DNA序列。
实施例1
本实施例提供一种核酸纳米药物载体，所述核酸纳米药物载体由以下制备方法制备得到：
(1)DNA-RGD复合物的制备：
该DNA-RGD复合物通过点击反应得到，其中DNA 5'端修饰叠氮，即N3-TTTTAAACTCTTTGCGCAC；RGD多肽末端修饰炔基，即c(RGDfK)-GG-炔丙基甘氨酸，二者在抗坏血酸和二价铜催化剂Cu(II)-TBTA复合物催化下进行反应；
具体步骤如下：将叠氮修饰的DNA(N3-TTTTAAACTCTTTGCGCAC)与炔基修饰RGD多肽(c(RGDfK)-GG-炔丙基甘氨酸)溶于PBS缓冲液中，分别配成200μM的DNA母液和400μM的RGD多肽母液；将抗坏血酸溶于水配成10mM的母液；；将200μL的DNA母液、400μL的RGD母液、200μL的DMSO、200μL的Cu(II)-TBTA复合物(10mM)和200μL的抗坏血酸混合于1.5mL离心管中，室温下避光孵育12h，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化，得到RGD多肽-DNA复合物，最后使用紫外分光光度计定量；
(2)DNA折纸结构的自组装(组装得到20nM，100μL的DNA折纸结构)：
在组装前，分别将下述各DNA链(包括订书钉DNA短链和捕获DNA链)溶解于水中，使各DNA链的浓度均调整为100μM，并分别等体积的混合(此处的分别等体积的混合指的是：调整为100μM的各订书钉DNA短链以等体积混合，得到订书钉DNA短链集；调整为100μM的各捕获DNA短链以等体积混合，得到捕获DNA短链集)；
具体地，订书钉链序列如表1所示：
表1
/>
/>
具体地，RGD-DNA复合物捕获DNA链序列如表2所示：
表2
/>
具体地，胆固醇-二硫键-DNA复合物捕获DNA链序列如表3所示：
表3
/>
本实施例以组装20nM，100μL的DNA折纸结构为例：在200μL的PCR试管中，将M13mp18噬菌体单链环状DNA、订书钉DNA短链和捕获DNA链按照1:10:10比例(指的是骨架链和DNA链集合里的每一条DNA的摩尔比)混合，通过补充10×TAE/Mg2+和去离子水，使M13噬菌体基因组的终浓度为20nM，终体积为100μL，且体系处于1×TAE/Mg2+缓冲液中；在PCR仪中，使该混合溶液从95℃缓慢梯度退火降温至20℃，并使整个降温过程控制在12h以上，从而获得未纯化矩形DNA折纸纳米结构；利用100kDa的超滤柱，5000rpm，5min离心超滤四次，除掉过量的订书钉链、捕获链，得到矩形DNA折纸纳米结构；
(3)DNA折纸结构负载RGD-DNA复合物和胆固醇-二硫键-DNA复合物：
在步骤(2)得到的DNA折纸结构中添加3倍摩尔数过量的RGD-DNA复合物(即RGD-TTTTAAACTCTTTGCGCAC)和胆固醇-二硫键-DNA复合物(即TTTTTTTTTTTTTTTACGC-ss-TTT-Chol)，再通过添加水和10×TAE/Mg2+使终体积为100μL，将混合物升温至45℃，再梯度降温至25℃，该过程重复5次，完成杂交；通过100kDa的超滤柱，以5000rpm，4min离心洗涤4次，除去过量的RGD-DNA复合物和胆固醇-二硫键-DNA复合物；
(4)DNA折纸结构负载紫杉醇：
将紫杉醇溶解至DMSO中得到50mM的紫杉醇母液，将1μL紫杉醇母液添加至100μL终浓度为50nM的负载RGD和胆固醇的DNA折纸结构中，25℃孵育8h，得到负载有紫杉醇的DNA折纸结构；
(5)DNA折纸结构负载DNA分子锁：
在负载前，分别将下述各DNA链(DNA分子锁链)溶解于水中，使浓度均调整为100μM，并以等体积的混合，得到DNA分子锁链集；
具体地，含二硫键DNA分子锁序列如表4所示：
表4
在步骤(4)得到得到负载有紫杉醇的DNA折纸结构的体系中添加1.5倍摩尔数过量的DNA分子锁链，升温至45℃，再梯度降温至25℃，该过程重复5次，完成分子锁的杂交，得到核酸纳米药物载体；通过8000rpm，10min离心，弃上清，洗涤3次，除去未负载的紫杉醇，得到基于化疗-免疫治疗联合治疗肿瘤的核酸纳米药物载体。
其中，图1为本发明所述核酸纳米药物载体的结构示意图，如图1所示，示出了所示所述基于化疗-免疫治疗联合治疗肿瘤的核酸纳米药物载体的示意图，负载有胆固醇、RGD多肽和紫杉醇，并修饰有DNA分子锁链。
其中，图2是对实施例1制备的核酸纳米药物载体进行的原子力显微镜表征，方法如下：取粘有云母片的铁片，在上边滴加10μL，1nM上述核酸纳米药物载体，沉积10min后。用1mL水小心洗涤云母片，并用洗耳球吹干。通过原子力显微镜对其形貌进行表征，由图2所示该核酸纳米药物载体为长90nm，宽30nm，高4nm的管状结构。
实施例2
本实施例提供一种核酸纳米药物载体，与实施例1的区别仅在于，在合成该核酸纳米药物载体中，将RGD多肽替换为GPR多肽，除此之外，其他组成原料、制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制得基于化疗-免疫治疗联合治疗肿瘤的核酸纳米药物载体。
实施例3
本实施例提供一种核酸纳米药物载体，与实施例1的区别仅在于，在合成该核酸纳米药物载体中，将RGD多肽替换为TAT多肽，除此之外，其他组成原料、制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制得基于化疗-免疫治疗联合治疗肿瘤的核酸纳米药物载体。
实施例4
本实施例提供一种核酸纳米药物载体，与实施例1的区别仅在于，在合成该核酸纳米药物载体中，将疏水药物紫杉醇换为喜树碱，除此之外，其他组成原料、制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制得基于化疗-免疫治疗联合治疗肿瘤的核酸纳米药物载体。
实施例5
本实施例提供一种核酸纳米药物载体，与实施例1的区别仅在于，在合成该核酸纳米药物载体中，将疏水药物紫杉醇换为多西他赛，除此之外，其他组成原料、制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制得基于化疗-免疫治疗联合治疗肿瘤的核酸纳米药物载体。
实施例6
本实施例提供一种核酸纳米药物载体，与实施例1的区别仅在于，所述DNA折纸纳米结构和胆固醇-二硫键-DNA复合物的摩尔比为1:50，除此之外，其他组成原料、制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制得基于化疗-免疫治疗联合治疗肿瘤的核酸纳米药物载体。
实施例7
本实施例提供一种核酸纳米药物载体，与实施例1的区别仅在于，所述DNA折纸纳米结构和胆固醇-二硫键-DNA复合物的摩尔比为1:100，除此之外，其他组成原料、制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制得基于化疗-免疫治疗联合治疗肿瘤的核酸纳米药物载体。
实施例8
本实施例提供一种核酸纳米药物载体，与实施例1的区别仅在于，所述DNA折纸纳米结构和RGD-DNA复合物的摩尔比为1:5，除此之外，其他组成原料、制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制得基于化疗-免疫治疗联合治疗肿瘤的核酸纳米药物载体。
实施例9
本实施例提供一种核酸纳米药物载体，与实施例1的区别仅在于，所述DNA折纸纳米结构和RGD-DNA复合物的摩尔比为1:24，除此之外，其他组成原料、制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制得基于化疗-免疫治疗联合治疗肿瘤的核酸纳米药物载体。
实施例10
本实施例提供一种核酸纳米药物载体，与实施例1的区别仅在于，所述DNA折纸纳米结构和药物紫杉醇的摩尔比为1:5000，除此之外，其他组成原料、制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制得基于化疗-免疫治疗联合治疗肿瘤的核酸纳米药物载体。
实施例11
本实施例提供一种核酸纳米药物载体，与实施例1的区别仅在于，所述DNA折纸纳米结构和药物紫杉醇的摩尔比为1:50000，除此之外，其他组成原料、制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制得基于化疗-免疫治疗联合治疗肿瘤的核酸纳米药物载体。
试验例1
核酸纳米药物载体对肿瘤细胞的抑制作用
测试样品：实施例1提供的核酸纳米药物载体；
测试方法：将鼠源乳腺癌细胞系4T1培养在含有10％胎牛血清和1％双抗的1640培养基中，于37℃，5％CO2条件下培养。当细胞生长密度为90％，通过胰酶消化细胞，以3000细胞/孔接种于96孔板，培养24h。分别用游离疏水药物(4μM)，载疏水药物的核酸纳米药物载体(0.4nM，疏水药物4μM)孵育48h，通过CCK-8细胞增殖与活性检测试剂盒检测细胞存活率；
具体测试结果如下表5所示：
表5
样品 细胞存活率(％)
游离紫杉醇 33
实施例1 30
如表5所示，通过测定得到游离药物和载药物的核酸纳米药物载体对细胞存活率，可得本发明所述药物载体对细胞存活率为30％，说明本发明载药的核酸纳米药物载体可以有效抑制癌细胞的增殖。其中，如图3所示，相对于其他疏水药物，载紫杉醇的核酸纳米药物载体的抑制效果更佳，细胞存活率仅为30％。
试验例2
核酸纳米药物载体引发肿瘤细胞免疫原性细胞死亡
测试样品：实施例1提供的核酸纳米药物载体；
测试原理：钙网蛋白(CRT)是细胞免疫原性细胞死亡的重要标志物，在细胞免疫原性细胞死亡时会暴露在细胞表面，因此可验证核酸纳米药物载体引发肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡；
测试方法：将鼠源乳腺癌细胞系4T1培养在含有10％胎牛血清和1％双抗的1640培养基中，于37℃，5％CO2条件下培养。当细胞生长密度为90％，通过胰酶消化细胞，以10000细胞/孔接种于12孔板，培养24h。分别用疏水药物(4μM)和载疏水药物的核酸纳米药物载体(0.4nM，紫杉醇4μM)孵育24h。细胞通过冷的PBS缓冲液洗涤两次，用4％多聚甲醛固定5min。细胞与CRT抗体孵育30min，用冷的PBS缓冲液洗涤两次。细胞与FITC修饰的羊抗兔二抗孵育30min，细胞表面暴露的CRT通过流式细胞术检测；
表面表达CRT细胞含量具体测试结果如下表6所示：
表6
样品 表面表达CRT细胞含量(％)
游离紫杉醇 12.6
实施例1 18.4
如表6所示，通过测定得到游离药物和载药物的核酸纳米药物载体表面表达CRT细胞含量，可得本发明所述药物载体的表面表达CRT细胞含量为18.4％，说明本发明载药的核酸纳米药物载体可以有效抑制癌细胞的增殖。其中，如图4所示，相对于其他疏水药物，载紫杉醇的核酸纳米药物载体的效果更佳，表面表达CRT细胞含量为18.4％。
试验例3
核酸纳米药物载体引发肿瘤细胞上调PD-L1表达
测试样品：实施例1提供的核酸纳米药物载体；
测试方法：将鼠源乳腺癌细胞系4T1培养在含有10％胎牛血清和1％双抗的1640培养基中，于37℃，5％CO2条件下培养。当细胞生长密度为90％，通过胰酶消化细胞，以10000细胞/孔接种于12孔板，培养24h。分别用疏水药物(4μM)和载疏水药物的核酸纳米药物载体(0.4nM，疏水药物4μM)孵育24h。用冷的PBS缓冲液洗涤两次。细胞与Cy5修饰的PD-L1抗体孵育15min。细胞表面的PD-L1表达量通过流式细胞术检测；
表达PD-L1细胞含量具体测试结果如下表7所示：
表7
样品 表达PD-L1细胞含量(％)
游离紫杉醇 34.6
实施例1 64.9
如表7所示，通过测定得到游离药物和载药物的核酸纳米药物载体表达PD-L1细胞含量，可得本发明所述药物载体的表达PD-L1细胞含量为64.9％，说明本发明所述载药的核酸纳米药物载体会上调细胞表面PD-L1的表达。因此，本发明特别提供了一种核酸纳米药物载体和抗体联用在制备化疗药物中的应用。其中，如图5所示，相对于其他疏水药物，载紫杉醇的核酸纳米药物载体的效果更佳，表达PD-L1细胞含量为64.9％。
试验例4
荷瘤裸鼠模型的构建及核酸纳米药物载体的体外水平的器官分布
测试样品：实施例1提供的核酸纳米药物载体；
测试方法：荷瘤裸鼠模型的构建：裸鼠(雌性，6周，15g)购于北京斯贝福(北京)生物技术有限公司。每只小鼠背部与右腿连接处接种1×106个4T1细胞，7天后，肿瘤的体积约为100mm2，将小鼠平均分为三组，每组三只。三组小鼠分别注射Cy5.5荧光修饰的DNA链(1.05μM，100μL)，Cy5.5标记的核酸纳米药物载体(无RGD修饰，即按照实施例1方法制备，其区别仅在于不加入RGD-DNA复合物和紫杉醇)(50nM，Cy5.51.05μM，100μL)，Cy5.5标记的核酸纳米药物载体(有RGD修饰，即按照实施例1方法制备，其区别仅在于不加入紫杉醇)(50nM，Cy5.51.05μM，100μL)。在24h后，处死小鼠并解剖，取主要器官和肿瘤进行荧光成像。
结果如图6所示，24h后，与游离的Cy5.5修饰的DNA链相比，DNA折纸结构在肿瘤的富集增多。进一步，由于靶向基团RGD多肽靶向肿瘤血管内皮细胞上整合素受体，因此进一步增加了核酸纳米药物载体在肿瘤中的富集，Cy5.5的荧光信号最强。
试验例5
DNA分子锁响应性验证试验
测试样品：实施例1提供的核酸纳米药物载体；
测试方法：将按照实施例1中制备的核酸纳米药物载体在含5mM的谷胱甘肽缓冲液中，于37℃孵育24h，将孵育前后的样品通过原子力显微镜进行表征；
结果如图7A-B所示，在谷胱甘肽缓冲液中孵育后，管状的核酸纳米药物载体恢复至矩形，验证了修饰有二硫键的DNA分子锁中的二硫键被还原，分子锁打开，管状的核酸纳米药物载体被打开。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明所述核酸纳米药物载体及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (32)

1.一种核酸纳米药物载体，其特征在于，所述核酸纳米药物载体包括DNA折纸纳米结构、胆固醇-二硫键-DNA复合物、肿瘤靶向肽-DNA复合物和药物，且所述折纸结构中含有修饰有二硫键的响应元件DNA分子锁；
所述DNA折纸纳米结构由DNA模板链、订书钉DNA短链和捕获DNA链依据碱基互补配对原则杂交自组装而成的纳米结构；
所述核酸纳米药物载体由DNA模板链、订书钉DNA短链、捕获DNA链、含有修饰有二硫键的响应元件DNA分子锁依据碱基互补配对原则杂交自组装而成的三维管状纳米结构；且所述三维管状纳米结构为添加修饰有二硫键的响应元件DNA分子锁形成的；
所述DNA模板链为M13mp18噬菌体单链环状DNA；
所述胆固醇-二硫键-DNA复合物通过DNA分子杂交的方式装载于所述DNA折纸纳米结构的内部；
所述肿瘤靶向肽-DNA复合物通过DNA分子杂交的方式装载于所述DNA折纸纳米结构的两端；
所述肿瘤靶向肽为RGD；
所述药物通过疏水作用力装载于所述DNA折纸纳米结构的内部；
所述药物为紫杉醇；
所述核酸纳米药物载体采用如下方法进行制备，所述方法包括以下步骤：
（1）通过碱基互补配对原则，将所述胆固醇-二硫键-DNA复合物和肿瘤靶向肽-DNA复合物杂交到DNA折纸纳米结构上，组装得到靶向载疏水分子的DNA折纸结构；
（2）将步骤（1）得到的靶向载疏水分子的DNA折纸结构和药物共孵育，得到载药物的DNA折纸结构；
（3）通过碱基互补配对原则，将修饰有二硫键的DNA分子锁链杂交到所述DNA折纸纳米结构上，组装得到所述核酸纳米药物载体。
2.根据权利要求1所述的核酸纳米药物载体，其特征在于，所述三维管状纳米结构包括矩形管状纳米结构、圆筒管状纳米结构或六边形管状纳米结构中的任意一种或至少两种。
3.根据权利要求2所述的核酸纳米药物载体，其特征在于，所述三维管状纳米结构为矩形管状纳米结构，所述三维管状纳米结构的长度为80-100 nm，宽度为20-40 nm，高度为3-5nm。
4.根据权利要求1所述的核酸纳米药物载体，其特征在于，所述DNA折纸纳米结构为矩形纳米结构。
5.根据权利要求1所述的核酸纳米药物载体，其特征在于，所述核酸纳米药物载体为矩形三维管状纳米结构。
6.根据权利要求1所述的核酸纳米药物载体，其特征在于，所述肿瘤靶向肽-DNA复合物装载于所述DNA折纸纳米结构的两个短边。
7.根据权利要求1所述的核酸纳米药物载体，其特征在于，所述修饰有二硫键的响应元件DNA分子锁通过碱基互补配对原则杂交到所述DNA折纸纳米结构的两端。
8.根据权利要求7所述的核酸纳米药物载体，其特征在于，所述修饰有二硫键的响应元件DNA分子锁杂交到所述DNA折纸纳米结构的两个长边。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的核酸纳米药物载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）通过碱基互补配对原则，将所述胆固醇-二硫键-DNA复合物和肿瘤靶向肽-DNA复合物杂交到DNA折纸纳米结构上，组装得到靶向载疏水分子的DNA折纸结构；
（2）将步骤（1）得到的靶向载疏水分子的DNA折纸结构和药物共孵育，得到载药物的DNA折纸结构；
（3）通过碱基互补配对原则，将修饰有二硫键的DNA分子锁链杂交到所述DNA折纸纳米结构上，组装得到所述核酸纳米药物载体。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述胆固醇-二硫键-DNA复合物通过DNA分子杂交的方式装载于所述DNA折纸纳米结构的内部，所述肿瘤靶向肽-DNA复合物通过DNA分子杂交的方式装载于所述DNA折纸纳米结构的两个短边。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述DNA折纸纳米结构和胆固醇-二硫键-DNA复合物的摩尔比为1:(50-100)。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述DNA折纸纳米结构和胆固醇-二硫键-DNA复合物的摩尔比为1:72。
13.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述DNA折纸纳米结构和肿瘤靶向肽-DNA复合物的摩尔比为1:(5-24)。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述DNA折纸纳米结构和肿瘤靶向肽-DNA复合物的摩尔比为1:16。
15.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述杂交的条件为升温至40-50℃后，再以4-6℃/min梯度降温至20-30℃，重复4-6次，完成杂交。
16.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述DNA折纸纳米结构由以下制备方法制备得到：将DNA模板链、订书钉DNA短链和捕获DNA链混合于缓冲液中，退火，得到所述DNA折纸纳米结构。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述DNA模板链、订书钉DNA短链和捕获DNA链的摩尔比为1:(5-15):(5-15)。
18.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述退火的条件为：从95℃退火至65℃，每4-6℃为一个梯度，每个梯度停留4-6 min；从65℃退火至25℃，每0.5-2℃为一个梯度，每个梯度停留9-11 min，保持总退火时间为7-9 h。
19.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述肿瘤靶向肽-DNA复合物由以下制备方法制备得到：将叠氮修饰的DNA与炔基修饰的肿瘤靶向肽通过点击反应，得到所述肿瘤靶向肽-DNA复合物。
20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述叠氮修饰的DNA与炔基修饰的肿瘤靶向肽的摩尔比为1:(3-5)。
21.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述点击反应在避光下进行，所述点击反应的温度为20-30℃，所述点击反应的时间为10-20 h。
22.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述点击反应在抗坏血酸和二价铜催化剂催化下进行。
23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述二价铜催化剂为Cu(II)-TBTA复合物。
24.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述DNA折纸结构和药物的摩尔比为1:(5000-50000)。
25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述DNA折纸结构和药物的摩尔比为1:10000。
26.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述共孵育的温度为20-30℃，共孵育的时间为7-9 h。
27.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述DNA折纸纳米结构和分子锁链的摩尔比为1:(1-2)。
28.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述杂交的条件为升温至40-50℃后，再梯度降温至20-30℃，重复4-6次，完成杂交。
29.一种根据权利要求1-8中任一项所述的核酸纳米药物载体在制备化疗药物中的应用。
30.一种根据权利要求1-8中任一项所述的核酸纳米药物载体和抗体联用在制备化疗药物中的应用。
31.根据权利要求30所述的应用，其特征在于，所述抗体为免疫检查点抗体。
32.根据权利要求31所述的应用，其特征在于，所述免疫检查点抗体选自CTLA-4抗体、PD-L1抗体或PD-1抗体中的任意一种或至少两种的组合。
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