CN103110954A - 胆固醇修饰的生物可降解聚阳离子载体及制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供胆固醇修饰的生物可降解聚阳离子载体及制备方法和用途。该载体材料由平均分子量2kD-20kD的功能化线性聚（酰胺-胺）与胆固醇通过酰胺键或酯键连接形成功能化线性聚（酰胺-胺）-胆固醇梳状嫁接物，可在水相介质中自组装形成纳米颗粒，粒径介于20-200nm，纳米颗粒表面带正电荷，胆固醇接枝率为1％-90％。本发明制备的阳离子聚合物纳米颗粒毒性低，具有快速透过细胞膜、易于溶酶体内降解和逃逸的功能，可作为基因转染试剂。且可利用该纳米颗粒载体结构中疏水区携载脂溶性化学药物，利用正电荷特性携载治疗DNA、RNA等基因药物或多肽蛋白药物。

Description

胆固醇修饰的生物可降解聚阳离子载体及制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种非病毒药物载体材料。特别涉及胆固醇修饰的生物可降解聚阳离子载体及制备方法和用途，具体是由平均分子量2kD-20kD的功能化线性聚（酰胺-胺）与胆固醇通过酰胺键或酯键化学偶联形成功能化线性聚（酰胺-胺）-胆固醇梳状嫁接物，临界胶团浓度>1mg/L，可在水相介质中自组装形成纳米颗粒，粒径介于20-200nm，纳米颗粒表面带正电荷，胆固醇接枝率为10％-90％。该纳米颗粒可用于包载化学药物、基因药物和多肽蛋白药物递送。
技术背景
基因输送的成功依赖于安全有效的输送载体。输送载体包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体具有转染率高的优点，但其因载药量低、不易工业大规模生产、细胞特异性差、存在免疫原性等缺点限制了其在基因输送系统的应用前景。同时，病毒载体输送基因治疗导致婴儿免疫缺陷的临床病例已有报道（Nature,427,779-781，2004），这引起严重的临床用药安全的顾虑。病毒载体的这一缺陷也间接地推动了非病毒载体的发展。
非病毒载体一般包括，阳离子脂质体、阳离子聚合物、无机阳离子载体等。在阳离子聚合物载体中，目前常用的有聚乙烯亚胺（PEI）、树状大分子、聚赖氨酸（PLL）和壳聚糖等材料。
基因药物(如质粒DNA，siRNA等)通常具有分子量大、亲水性强、荷负电且易于被核酸酶降解破坏的性质，在实际应用中，裸基因药物通常表现出较低的细胞转染能力和非常差的基因治疗效果。通常需要与阳离子材料形成纳米级的静电复合物，从而使其具有较好的细胞摄取能力、较高的稳定性以及较好的基因治疗效应。
近年来，许多科学家致力于具有非免疫原性的阳离子聚合物类非病毒基因载体研究。这些聚合物多为通过化学合成的多氨基结构，包括聚氨基酸和多聚乙烯亚胺等。聚乙烯亚胺（PEI）作为输送载体广泛地应用于pDNA，siRNA，ODN等基因的递送。由于其强正电性能够高效的压缩siRNA，形成纳米级的静电复合物。其多氨基结构（伯胺25％，仲胺50％，叔胺25％）产生的“质子海绵效应”能够使复合物逃逸溶酶体的降解，所以PEI被称作是基因输送载体的“金标准”。然而，这些载体材料的主要问题是低浓度时转染效率低，而高浓度时存在明显的细胞毒性，这一缺点限制其在体内外的广泛应用。
具有氨基结构、安全低毒，并具有体内抗核酶作用的聚阳离子可生物降解材料最近颇受人们关注，国内外研究人员已开展了很多创新载体的设计。很多研究表明含有二硫键(s-s)的聚胺化合物因其在细胞内还原性环境二硫键容易断裂，有利于静电复合物的解组装，从而更好地在细胞浆中释放基因药物，由此产生较高的基因输送效率。另外含二硫键(s-s)的聚合物具有可生物降解、生物相容性好、细胞毒性低，并具有氧化-还原敏感释放基因药物的优势。我们课题组也曾合成并利用含二硫键聚酰胺-胺材料来包载和递送siRNA，研究显示这种材料具有良好的氧化还原酶敏感性，在细胞毒性和siRNA包载保护效应等方面，具有其独特的优势，但转染效率不高的问题依然存在[Int J Nanomedicine2012；7：3837-49]。
胆固醇是一种内源性生理物质，具有良好的生物相容性，近年来，有很多学者利用胆固醇化学偶联与亲水性聚合物链段形成两亲性载体材料，并可在水溶液中自组装形成纳米颗粒。如胆固醇修饰的聚乙烯亚胺（PEI2kD）因为形成稳定的胶束而提高载体的细胞摄取，在pDNA的输送系统中取得很高的输送效率（JControl Release2007；118：357-63）。也有学者报道通过形成季铵盐的方式将胆固醇接枝于阳离子载体也能取得了良好的基因输送效率（Biomaterials2007；2835：5358-68）。这些已报道的两亲性载体材料中，亲水聚合链片段多为生物不可降解材料，尽管采用胆固醇修饰，但在利用这些材料递送基因药物时仍然表现出转染效率不高且具有较大毒性的问题。
发明内容
本发明提供了胆固醇修饰的生物可降解聚阳离子载体的制备方法及其用途。本发明的载体，是由平均分子量2kD-20kD的功能化线性聚（酰胺-胺）与胆固醇通过酰胺键或酯键化学偶联形成的。
其中所述线性聚（酰胺-胺）是由N，N′-双(丙稀酰)胱胺（cystaminebisacrylamide，CBA)）与含-NH2单体通过迈克尔加成（Michael addition）反应聚合形成的具有重复单元的线性聚合物，且聚合物中每个单元结构中均含有二硫键。该聚合物属于现有技术，其结构如下：
Figure BDA00002802404100031
该聚合物的结构，特性和应用在[Int J Nanomedicine2012；7：3837-49]中有详细描述。其优选平均分子量为5kD-15kD，更优选的平均分子量为7KD-12kD。
本发明所涉及的含-NH2单体包括：N，N’-二甲基二亚丙基三胺（DMDPTA），组胺（histamine），4-氨基-1-丁醇(ABOL)，多巴胺，半胱胺酸，半胱胺烟酸盐，阿霉素，米托蒽醌以及其他含-NH2的化合物。
本发明所使用的线性聚（酰胺-胺），因其在细胞内还原性环境二硫键容易断裂，有利于静电复合物的解组装，从而更好地在细胞胞浆释放基因药物，由此产生较高的基因输送效率。另外，该聚合物材料具有可生物降解、生物相容性好、细胞毒性低，并具有氧化-还原敏感释放基因药物的优势。
发明人曾合成并利用含二硫键聚酰胺-胺材料来包载和递送siRNA，研究显示这种材料具有良好的氧化还原酶敏感性，在细胞毒性和siRNA包载保护效应等方面，具有其独特的优势。
其中所述胆固醇，因其含有酰氯基团，可以和线性聚（酰胺-胺）的胺基偶联形成稳定的梳状嫁接物，即本发明的载体物质。
本发明的载体，其临界胶团浓度>1mg/L，可在水相介质中自组装形成纳米颗粒，粒径介于20-200nm，纳米颗粒表面带正电荷，胆固醇接枝率为10％-90％。优选为10％-70％，更优选为30％-60％。
该纳米颗粒可用于包载化学药物、基因药物和多肽蛋白药物递送。
本发明所述载体是由平均分子量2kD-20kD的功能化线性聚（酰胺-胺）与胆固醇形成的。胆固醇的化学偶联可以使亲水性聚合物链段形成两亲性载体材料，在水溶液中可自组装形成纳米颗粒。研究结果显示这些两亲性载体材料的临界胶团浓度均>1mg/L，可在水相介质中自组装形成粒径介于20-200nm的纳米颗粒，且纳米颗粒表面带正电荷（40-60mV）。
本发明所述的载体，其中的功能化线性聚（酰胺-胺）和胆固醇的连接方式可以通过胆固醇酰氯直接或间接（连接臂）与线性聚（酰胺-胺）母链上的-NH2或-NH-通过酰胺键连接。在采用连接臂间接连接时，可以选用的连接臂包括：-(CH2)n-，-S-S-，以及其他基团，其中n=1-10。
本发明所述的功能化线性聚（酰胺-胺）是由N，N′-双(丙稀酰)胱胺（cystamine bisacrylamide，CBA)）与含-NH2单体通过迈克尔加成（Michaeladdition）反应聚合形成的具有重复单元的线性聚合物，其制备方法举例如下：
精密量取等摩尔比的DMDPTA单体和N，N’-双（丙烯酰）胱胺(CBA)，溶解于适量的溶剂中，在37℃氩气保护条件下，避光反应，待反应溶液变粘稠后，产物用无水乙醇透析(分子量截留3.5KDa)，旋蒸除去乙醇溶剂，产物真空干燥24小时，最终得到功能化线性聚酰胺-胺(rPAA)。得到的产物采用1H-NMR和凝胶渗透色谱(GPC)分析检测其结构和分子量。通过改变反应条件（如反应时间，单体的浓度等）可以调节产物的分子量，从而得到具有不同分子量的线性rPAA聚合物。本发明所涉及的功能化线性聚（酰胺-胺）的平均分子量为2kD-20kD，优选平均分子量为5kD-12kD。
本发明所涉及的胆固醇修饰的生物可降解聚阳离子载体，其制备方法举例如下：
在冰水浴的条件下，将100mg的上述线性rPAA溶解于一定量的无水二氯甲烷溶剂中，然后依次加入一定量的胆固醇酰氯和适量的三乙胺，反应进行24小时。反应结束后，旋蒸除去反应溶剂，然后将产物溶解于适量的乙醇/去离子水混合溶剂中，用盐酸调节产物溶液的pH值至4.0，产物用无水乙醇透析(分子量截留3.5KDa)3天后，冷冻干燥得到胆固醇修饰（酰胺键直接连接）的聚酰胺-胺（rPAA-Ch）。通过调整胆固醇的不同投料量，可获得不同胆固醇接枝率的生物可降解聚阳离子载体。
本发明所述的载体可以和基因药物形成纳米级的静电复合物粒子，且该粒子的大小和电荷的密度可控。粒子的大小和表面电荷对基因药物递送系统的优化极其重要。粒子的大小和表面电荷通常影响体内外的转染效率，也可影响粒子在体内的组织分布。例如胆固醇修饰的rPAA（rPAA-Ch）与siRNA形成结构紧密的纳米粒。在N/P为30或40时，粒径约为100nm左右，电位约为40mV。通过调节胆固醇的修饰程度，粒子可以小于100nm，电位可以调整到20mV左右。这样的粒径有利于体内给药时利用增强渗透滞留（EPR）效应改善肿瘤组织内药物蓄积，并且也有利于通过细胞内吞作用进入细胞内。另外，带正电的粒子表面提供了与带负电的细胞膜表面充足的接触机会，其随后通过增强内吞作用进入细胞。
在本研究中，我们测定了各种不同分子量和不同胆固醇接枝率的聚合物的临界胶束浓度(CMC)，研究结果发现，所合成的各种聚合物的CMC均大于1mg/L。以接支率为29％的rPAA-Ch29聚合物为例，CMC值为8.9mg/L（表1），说明该聚合物材料具有较强的耐稀释能力，在较低的浓度仍然能保持较优的粒子形态。采用酸碱滴定试验测试了聚合物的质子缓冲能力，结果表明本发明的聚合物与PEI25KDa的缓冲能力相似（表1）。使用凝胶电泳检验了共聚物对siRNA的压缩保留能力，胆固醇修饰的聚酰胺-胺(rPAA-Ch)在N/P=20时siRNA完全保留，没有看见游离的siRNA。同时在此时粒子的粒径小于200nm，适于细胞的摄取。
在体外肿瘤细胞转染试验中发现，本发明的阳离子共聚物具有较高的转染siRNA的能力。在MCF-7细胞系，胆固醇修饰的rPAA载体/siRNA的摄取明显高于siRNA/PEI静电复合物，并与市售LipofectaminTM2000转染试剂的摄取程度相当。当使用本发明的聚合物进行含有绿色荧光蛋白的质粒DNA的转染时，可以得到类似的结果：胆固醇修饰的rPAA载体/DNA复合物能够显著增强细胞对绿色荧光蛋白的表达，表达程度优于DNA/PEI静电复合物，且与市售LipofectaminTM2000的转染程度相当。
当确定基因载体的有效性时，细胞生存能力或细胞毒性是重要参数。如前所述，阳离子聚合物的高转染效率通常伴有高的细胞毒性。与市售的PEI25KDa相比，本发明的生物降解阳离子聚合物与基因药物一起转染时仅产生了微小的细胞毒性。这些数据说明本发明的生物降解阳离子聚合物能明显的降低载体的毒性，同时具有较高的转染效率。这种现象可归因于本发明所涉及阳离子聚合物结构中还有大量的二硫键（Proc Natl Acad Sci USA2007；104：14454-14459），该聚合物可在细胞外环境中有效包载和保护siRNA/共聚物复合物稳定存在，而在进入细胞内还原性环境(GSH浓度为mM)时，二硫键容易断裂，有利于增强siRNA/rPAA-Ch复合物的解组装能力，从而在胞浆内更有效地释载物siRNA，这对siRNA的递送是十分有利的。
本发明涉及的生物可降解阳离子聚合物用于递送siRNA时，在MCF-7细胞中表现出来的VEGF基因沉默效率显著优于市售的支化PEI25KDa（图6）。这一结果表明本发明所述的聚合物具有更好的递送效率。根据DNA或其它核酸药物相似性质，本发明所述的聚合物也适合将大分子如DNA，siRNA获得良好的细胞转染效果。
从结构上来看，本发明所述的载体具有亲水和亲油基团，具有较好的两亲性。实验结果证实，其可在较低浓度情况下就可以在水相介质中自组装形成粒径为20-200nm的纳米颗粒。其疏水胆固醇区域可以有效包载脂溶性化学药物，如阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、替尼泊苷、考博他汀、拉帕替尼等脂溶性较强的化合物。另外，其中所含胆固醇分子有利于促进载药纳米粒子与细胞膜的结合。我们还尝试了利用脂质体进一步包裹由该阳离子聚合物形成的纳米粒子。研究结果表明，在胆固醇修饰的rPAA材料与siRNA形成纳米复合物粒子后，仍可与脂质体进一步形成脂质复合物，这一现象可归因于胆固醇分子与脂质体结构中磷脂双分子层的亲和力。
为此，本发明还提供含有本发明载体并用本发明载体包载的药物组合物，所述药物选自任何一种适合本发明载体的药物，优选基因药物，以及抗肿瘤药物。如：治疗性DNA、siRNA、miRNA、多肽蛋白药物、紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素。
本发明的药物组合物（载运siRNA纳米复合物）的制备方法举例如下：
精密称取一定量的胆固醇修饰的rPAA载体材料，加入适量的乙醇溶解，在37℃条件下旋蒸15min成膜，然后加入适量的5％的葡萄糖溶液，37°C水浴超声20min得到空白纳米颗粒混悬液（浓度为1mg/mL）。通过5％的葡萄糖溶液将空白纳米颗粒混悬液稀释到适宜的浓度，然后将一定量的siRNA与适量的空白纳米颗粒混合，室温条件下孵育15min即得到所需的不同(氮/磷酸盐，N/P)比的siRNA静电复合物。
综上所述，我们认为本发明所涉及的胆固醇修饰的生物可降解聚阳离子载体具有以下特点：
1.功能化线性聚（酰胺-胺）-胆固醇梳状嫁接物可在水相介质中自组装形成表面荷正电的纳米粒子，可以通过静电相互作用有效结合带负电荷的DNA、RNA或多肽蛋白药物。
2.含有二硫键的聚酰胺-胺母链(rPAA)，具有氧化还原酶敏感生物降解功能。在细胞外输送途径中，二硫键未发生断裂，siRNA/共聚物复合物稳定存在，可有效保护siRNA的胞外稳定性；经摄取进入细胞后，由于胞内还原性环境(较高的GSH浓度)导致二硫键容易断裂，从而有利于增强siRNA复合物的解组装，使得siRNA易于被释放进入胞浆而有效发挥基因沉默效应。
3.胆固醇的修饰为阳离子聚合物提供了亲水和亲油两重性，可在水相介质中自组装形成20-200nm尺寸的纳米颗粒结构，同时提供了更好的生物相容性。
另外，嫁接物结构中的胆固醇疏水区域可用来包载脂溶性化学药物，将有利于化学药物与基因药物的联合递送。
附图说明
图1胆固醇修饰（溴代季铵盐连接）的聚酰胺-胺的合成示意图；
图2胆固醇修饰（溴代季铵盐连接）的聚酰胺-胺的1H NMR谱图；
图3胆固醇修饰（酰胺键直接连接）的聚酰胺-胺的合成示意图；
图4胆固醇修饰（酰胺键直接连接）的聚酰胺-胺的1H NMR谱图；
图5不同比例胆固醇修饰（酰胺键直接连接）的聚酰胺-胺材料的性质比较。
A图为粒径和表面电荷；B和C图分别为接枝率27％和57％的两种rPAA-Ch材料在水溶液中自组装形成纳米颗粒的粒径分布和形态；D图为4种rPAA-Ch材料对人乳腺癌MCF-7细胞的毒性结果。
图6不同比例胆固醇修饰（酰胺键直接连接）的聚酰胺-胺材料在体外MCF-7细胞转染VEGF-siRNA基因沉默后的药效学比较结果。
具体实施方式：
下列实施例使得本领域的技术人员能够更清楚的理解如何实践本发明。应当理解的是，尽管本发明与其优选的具体实施方案一起描述，下列所述实施方案意在说明而不是限制本发明的范围。
实施例1胆固醇修饰（溴代季铵盐连接）的聚酰胺-胺的合成
rPAA的合成精密量取等摩尔比的两种市售单体N，N’-二甲基二亚丙基三胺（DMDPTA）和N，N’-双（丙烯酰）胱胺(CBA)，溶解于适量的甲醇与水的混合溶剂中，每种单体的浓度为2mmol/3.5mL，在37℃氩气保护条件下，避光反应3天待反应溶液变粘稠后，加入过量的(10mol％)DMDPTA继续反应2天，产物用无水乙醇透析(分子量截留3.5KDa)，旋蒸除去乙醇溶剂，产物真空干燥24小时，最终得到聚酰胺-胺阳离子聚合物(rPAA)（图1）。
溴化胆固醇(CH-Br)的合成本物质的合成使用了文献报道的（Nat Mater2006；5：791-796，Biomaterials2007；28：5358-5368.）方法。即将干燥过的氯仿50mL加入100mL的圆底烧瓶中，低温反应器控温（-30℃）的条件下依次加入胆固醇酰氯4.34g(0.0097mol)，溴乙胺2.18g(0.0106mol)，搅拌，然后加入3mL除水的三乙胺，30min后将100mL的圆底烧瓶移至室温进行反应12小时，有机相用20mL1N盐酸的NaCl饱和溶液洗3次，30mL的NaCl饱和溶液洗1次。收集有机相，用5g的无水硫酸钠干燥。溶液过滤，蒸馏得到粗产物，粗产物用无水乙醇重结晶1次，无水丙酮重结晶2次，真空干燥24小时后得产物（图1）。
胆固醇修饰（溴代季铵盐连接）的聚酰胺-胺的合成将20mg的CH-Br与100mg的rPAA溶解于一定量的乙醇中，在83℃乙醇冷凝回流的条件下，反应3天，待反应结束后加入一定量的水，调节溶液的pH值至4.0，乙醇透析(分子量截留3.5kDa)除去未反应的CH-Br，37℃低压旋干乙醇溶剂，得到胆固醇修饰的rPAA季铵盐产物（图1）。通过调整CH-Br与rPAA的投料比例，可以得到不同接枝程度的季铵盐产物。产物的1H NMR的图谱参见图2，表明了胆固醇修饰的rPAA季铵盐的成功合成。
实施例2胆固醇修饰（酰胺键直接连接）的聚酰胺-胺（rPAA-Ch）的合成
P(CBA-DMDPTA)聚合物的合成精密量取等摩尔比的两种市售单体N，N’-二甲基二亚丙基三胺（DMDPTA）和N，N’-双（丙烯酰）胱胺(CBA)，溶解于适量的甲醇与水的混合溶剂中，每种单体的浓度为2mmol/3.5mL，在37℃氩气保护条件下，避光反应3天待反应溶液变粘稠后，加入过量的(10mol％)DMDPTA继续反应2天，产物用无水乙醇透析(分子量截留3.5KDa)，旋蒸除去乙醇溶剂，产物真空干燥24小时，最终得到聚酰胺-胺聚合物(rPAA)。
胆固醇修饰（酰胺键直接连接）的聚酰胺-胺（rPAA-Ch）的合成在冰水浴的条件下，将100mg的rPAA溶解于一定量的无水二氯甲烷溶剂中，然后依次加入16mg的胆固醇酰氯和适量的三乙胺，反应进行24小时。反应结束后，旋蒸除去反应溶剂，然后将产物溶解与适量的乙醇/去离子水混合溶剂中，用盐酸调节产物溶液的pH值至4.0，用无水乙醇透析(分子量截留3.5KDa)3天后，冷冻干燥得到产物（图3）。通过调整胆固醇酰氯的加入量，可以得到不同接枝程度的胆固醇接枝的rPAA。产物的1H NMR的图谱见图4，表明了胆固醇修饰（酰胺键直接连接）的聚酰胺-胺（rPAA-Ch）的成功合成。
实施例3rPAA-Ch聚合物体外理化性质评价
临界胶束浓度(CMC)的测定此实施例举例说明了本发明的胆固醇修饰的rPAA的临界胶束浓度(CMC)的测定。根据参考文献（Biomaterials2007；28：4132-42.），采用荧光探针法测定聚合物的CMC。简而言之，依次向10mL的玻璃管加入等体积芘的丙酮溶液，待丙酮挥发后，每管加入6mL不同浓度的(0.01-1000μg/mL)聚合物的水溶液，芘的终浓度为6.0×10-7M。将聚合物的水溶液在避光条件下，37℃浴超声2小时，然后37℃摇床振摇20小时.。采用荧光分光光度计测定溶液的荧光光谱，固定散射波长为395nm，狭缝宽度为5nm，测定300-360nm溶液的激发光光谱，记录333nm与338nm溶液的峰强度。按照l338/l333的比值依据溶液的浓度作图，曲线与水平线的交点（曲线突变点）所对应的浓度即为聚合物的CMC。
缓冲能力(Buffer capacity)评价此实施例举例说明了本发明的胆固醇修饰的rPAA缓冲能力的测定。采用酸碱滴定法进行胆固醇修饰的rPAA的缓冲能力测定（J Control Release2008；126：166-74）。具体来说，将含有0.025mmol氨基的rPAA聚合物溶解于5mL的150nM氯化钠水溶液中，用0.1M盐酸调节溶液的pH值等于4，然后用0.01M氢氧化钠（NaOH）进行滴定，每次滴加50μL并测定溶液的pH值。支化PEI作为阳性对照，以同样的方式进行滴定。缓冲能力定义为在pH7.4至5.1质子化的胺基的百分比，根据以下公式计算：
Figure BDA00002802404100121
ΔVNaOH是指pH从5.1到7.4所需要的0.01M NaOH的体积；N为0.025mmol，是指质子化氨基的总摩尔数。
粒径和电位的测定精密称取一定量的胆固醇修饰的rPAA载体材料，加入适量的乙醇溶解，在37℃条件下旋蒸15min成膜，然后加入适量的5％的葡萄糖溶液，37°C水浴超声20min得到空白纳米颗粒混悬液（浓度为1mg/mL）。采用激光散射粒度仪（Malven Zetasizer Nano仪器）测定各纳米颗粒的粒径分布及表面电荷。
通过改变反应条件（如反应时间，单体的浓度等）可以调节产物的分子量，从而得到具有不同分子量的线性rPAA聚合物。各种不同分子量和不同胆固醇接支率的rPAA-Ch体外性质评价结果见表1。从表中数据可知，本发明所涉及的功能化线性聚（酰胺-胺）(rPAA)的平均分子量为2kD-20kD。通过改变rPAA/胆固醇摩尔投料比可以调节产物的胆固醇接枝率，从而得到不同胆固醇接枝率的rPAA-Ch聚合材料。不同比例胆固醇修饰（酰胺键直接连接）的聚酰胺-胺材料的性质比较情况见图5，图5A为粒径和表面电荷；5B和5C图分别为接枝率27％和57％的两种rPAA-Ch材料在水溶液中自组装形成纳米颗粒的粒径分布和形态。从表1数据可知，本发明所涉及的功能化线性聚（酰胺-胺）-胆固醇嫁接物的胆固醇接枝率为1％-90％。从粒径分布数据来看，当分子量较小时，多以形成粒径25nm左右纳米胶束为主，当分子量增加时，形成100-200nm的纳米颗粒，从冷冻扫描电镜结果来看，多以球形颗粒为主。另外，随着胆固醇接枝率的增加，纳米颗粒的粒径逐渐减小，电荷也随之减小。
表1不同分子量和不同胆固醇接支率的rPAA-Ch体外性质比较
Figure BDA00002802404100131
Figure BDA00002802404100141
实施例5rPAA-Ch/siRNA静电复合物的制备
此实施例说明了本发明的聚阳离子材料与基因药物静电复合物的制备。精密称取一定量的胆固醇修饰的rPAA载体材料，加入适量的乙醇溶解，在37℃条件下旋蒸15min成膜，然后加入适量的5％的葡萄糖溶液，37°C水浴超声20min得到空白纳米颗粒混悬液（浓度为1mg/mL）。通过5％的葡萄糖溶液将空白纳米颗粒混悬液稀释到适宜的浓度，然后将一定量的siRNA与适量的空白纳米颗粒混合，室温条件下孵育15min即得到所需的不同(氮/磷酸盐，N/P)比的siRNA静电复合物。将制备得到的rPAA-Ch/siRNA静电复合物用5％的葡萄糖溶液稀释至1mL，然后使用Malvern Zetasizer Nano粒径仪测定其粒径和电位。研究结果表明，随着胆固醇接枝率增加，纳米复合物粒径有减小趋势，且所形成纳米复合物仍为球形；在荷正电的条件下，各种rPAA-Ch/siRNA复合物纳米粒子的粒径随N/P比的不同，有所差异，但粒径均在20-200nm之间。
采用葡聚糖凝胶电泳实验证实，未经胆固醇修饰的rPAA/siRNA复合物在N/P=15时，siRNA完全保留，未见游离的siRNA；而经胆固醇修饰的rPAA(rPAA-Ch)在N/P=20时siRNA完全保留，未见游离的siRNA。
实施例6体外细胞毒性评价
本实施例主要对rPAA-Ch材料毒性进行描述，并与市售的PEI25KDa进行比较分析。
人乳腺癌细胞MCF-7在补充了10％胎牛血清、1％青霉素、1％链霉素的RPMI1640培养基中培养。将细胞放置在37°C湿润的5％CO2培养箱中。
人乳腺癌细胞MCF-7以每孔4000个接种于96孔板中，并置于培养皿中在孵箱中培养，24小时后加入含有不同弄度载体材料的OPTI-MEM培养基。转染4小时后，更换OPTI-MEM培养基为含10％胎牛血清的完全RPMI1640培养基，继续培养48小时，用SRB方法处理分析。体外细胞毒性评价结果见图5D，从研究结果来看，本发明的胆固醇修饰的rPAA（rPAA-Ch）材料毒性显著低于市售的PEI25KDa。这一结果表明本发明所涉及聚合物在生物安全性方面具有较好的优势。
实施例7体外转染VEGF-siRNA基因沉默效应评价
此实施例主要说明使用本发明所涉及的生物可降解聚阳离子材料与siRNA形成静电复合物后在体外细胞水平上转染的基因沉默效应。将MCF-7细胞以每孔20万接种于6孔板。培养24小时后，磷酸盐缓冲液（PBS）洗净细胞，然后给予含有OPTI-MEM培养基血管内皮生长因子导向的siRNA(VEGF-siRNA)复合物转染。4小时后更换完全培养基，8小时后将培养基替换为含有肝素钠的完全培养基。18小时后收集培养基，根据酶联免疫分析（ELISA）说明书方法测定培养基中血管内皮生长因子(VEGF)的含量。实验结果表明本发明所涉及的生物可降解阳离子聚合物在体外细胞转染时能产生有效的基因沉默效率，尤其是在胆固醇接枝率为57%和87%时，rPAA-Ch基因转染效率要显著高于市售支化PEI25KDa（图6）。
实施例9胆固醇修饰（酰胺键直接连接）的p(CBA-HIS)的合成
P(CBA-HIS)聚合物的合成精密量取等摩尔比的两种市售单体组胺（Histamine）和N，N’-双（丙烯酰）胱胺(CBA)，溶解于适量的甲醇与水的混合溶剂中，每种单体的浓度为2mmol/3.5mL，在37℃氩气保护条件下，避光反应3天，产物用无水乙醇透析(分子量截留3.5KDa)，旋蒸除去乙醇溶剂，产物真空干燥24小时，最终得到P(CBA-HIS)聚合物。
胆固醇修饰（酰胺键直接连接）的P(CBA-HIS)聚合物的合成在冰水浴的条件下，将100mg的P(CBA-HIS)聚合物溶解于一定量的无水二氯甲烷溶剂中，然后依次加入16mg的胆固醇酰氯和适量的三乙胺，反应进行24小时。反应结束后，旋蒸除去反应溶剂，然后将产物溶解与适量的乙醇/去离子水混合溶剂中，用盐酸调节产物溶液的pH值至4.0，产物用无水乙醇透析(分子量截留3.5KDa)3天。通过调整胆固醇酰氯的加入量，可以得到不同接枝程度的胆固醇接枝的产物。
实施例10胆固醇修饰（酰胺键直接连接）的p(CBA-ABOL)的合成
P(CBA-ABOL)聚合物的合成精密量取等摩尔比的两种市售单体4-氨基-1-丁醇(ABOL)和N，N’-双（丙烯酰）胱胺(CBA)，溶解于适量的甲醇与水的混合溶剂中，每种单体的浓度为2mmol/3.5mL，在37℃氩气保护条件下，避光反应3天，产物用无水乙醇透析(分子量截留3.5KDa)，旋蒸除去乙醇溶剂，产物真空干燥24小时，最终得到P(CBA-ABOL)聚合物。
胆固醇修饰（酰胺键直接连接）的P(CBA-ABOL)聚合物的合成在冰水浴的条件下，将200mg的P(CBA-ABOL)聚合物溶解于一定量的无水二氯甲烷溶剂中，然后依次加入8mg的胆固醇酰氯和适量的三乙胺，反应进行24小时。反应结束后，旋蒸除去反应溶剂，然后将产物溶解与适量的乙醇/去离子水混合溶剂中，用盐酸调节产物溶液的pH值至4.0，产物用无水乙醇透析(分子量截留3.5KDa)3天。通过调整胆固醇酰氯的加入量，可以得到不同接枝程度的胆固醇接枝的产物。
实施例11胆固醇修饰（酰胺键直接连接）的p(CBA-DOPA)的合成
P(CBA-DOPA)聚合物的合成精密量取等摩尔比的两种市售单体多巴胺(DOPA)和N，N’-双（丙烯酰）胱胺(CBA)，溶解于适量的甲醇与水的混合溶剂中，每种单体的浓度为2mmol/3.5mL，在37℃氩气保护条件下，避光反应3天，产物用无水乙醇透析(分子量截留3.5KDa)，旋蒸除去乙醇溶剂，产物真空干燥24小时，最终得到P(CBA-DOPA)聚合物。
胆固醇修饰（酰胺键直接连接）的P(CBA-DOPA)聚合物的合成在冰水浴的条件下，将100mg的P(CBA-DOPA)聚合物溶解于一定量的无水二氯甲烷溶剂中，然后先后加入20mg的胆固醇酰氯和适量的三乙胺，反应进行24小时。反应结束后，旋蒸除去反应溶剂，然后将产物溶解与适量的乙醇/去离子水混合溶剂中，用盐酸调节产物溶液的pH值至4.0，产物用无水乙醇透析(分子量截留3.5KDa)3天。通过调整巯基胆固醇的加入量，可以得到不同接枝程度的胆固醇接枝的产物。
实施例12胆固醇修饰（二硫键连接）的p(CBA-CYS)的合成
P(CBA-CYS)聚合物的合成精密量取等摩尔比的两种市售单体半胱氨酸(Cysteine)和N，N’-双（丙烯酰）胱胺(CBA)，溶解于适量的甲醇与水的混合溶剂中，每种单体的浓度为2mmol/3.5mL，在37°C氩气保护条件下，避光反应3天，产物用无水乙醇透析(分子量截留3.5KDa)，旋蒸除去乙醇溶剂，产物真空干燥24小时，最终得到P(CBA-CYS)聚合物。
胆固醇修饰（二硫键连接）的P(CBA-CYS)聚合物的合成在冰水浴的条件下，将100mg的P(CBA-CYS)聚合物溶解于一定量的无水二氯甲烷溶剂中，然后加入10mg的巯基胆固醇，反应进行24小时。反应结束后，旋蒸除去反应溶剂，然后将产物溶解与适量的乙醇/去离子水混合溶剂中，用盐酸调节产物溶液的pH值至4.0，产物用无水乙醇透析(分子量截留3.5KDa)3天。通过调整巯基胆固醇的加入量，可以得到不同接枝程度的胆固醇接枝的产物。
实施例13胆固醇修饰（二硫键连接）的p(CBA-CYT)的合成
P(CBA-CYT)聚合物的合成精密量取等摩尔比的两种市售单体半胱氨盐酸盐(Cysteamine)和N，N’-双（丙烯酰）胱胺(CBA)，溶解于适量的甲醇与水的混合溶剂中，每种单体的浓度为2mmol/3.5mL，在37℃氩气保护条件下，避光反应3天，产物用无水乙醇透析(分子量截留3.5KDa)，旋蒸除去乙醇溶剂，产物真空干燥24小时，最终得到P(CBA-CYT)聚合物。
胆固醇修饰（二硫键连接）的P(CBA-CYT)聚合物的合成在冰水浴的条件下，将100mg的P(CBA-CYT)聚合物溶解于一定量的无水二氯甲烷溶剂中，然后加入15mg的巯基胆固醇，反应进行24小时。反应结束后，旋蒸除去反应溶剂，然后将产物溶解与适量的乙醇/去离子水混合溶剂中，用盐酸调节产物溶液的pH值至4.0，产物用无水乙醇透析(分子量截留3.5KDa)3天。通过调整巯基胆固醇的加入量，可以得到不同接枝程度的胆固醇接枝的产物。
实施例14包载DNA或反义寡核苷酸的纳米颗粒制备
此实施例说明了本发明的聚阳离子材料与基因药物DNA或反义寡核苷酸静电复合物的制备。精密称取一定量的胆固醇修饰的rPAA载体材料，加入适量的乙醇溶解，在37℃条件下旋蒸15min成膜，然后加入适量的5％的葡萄糖溶液，37°C水浴超声20min得到空白纳米颗粒混悬液（浓度为1mg/mL）。通过5％的葡萄糖溶液将空白纳米颗粒混悬液稀释到适宜的浓度，然后将一定量的DNA或反义寡核苷酸与适量的空白纳米颗粒混合，室温条件下孵育15min即得到所需的不同(氮/磷酸盐，N/P)比的静电复合物。
实施例15包载脂溶性化学药物的纳米颗粒制备
此实施例说明了本发明的聚阳离子材料通过物理包载脂溶性化学药物形成载药纳米颗粒。精密称取一定量的胆固醇修饰的rPAA载体材料和脂溶性化学药物（阿霉素或紫杉醇或多西紫杉醇），加入适量的乙醇溶解，在37℃条件下旋蒸15min成膜，然后加入适量的5％的葡萄糖溶液，37°C水浴超声20min得到载药纳米颗粒混悬液。
实施例16联合包载基因药物和化学药物的纳米颗粒制备
此实施例说明了本发明的聚阳离子材料联合包载基因药物和化学药物形成载药纳米颗粒。精密称取一定量的胆固醇修饰的rPAA载体材料脂溶性化学药物（阿霉素或紫杉醇或多西紫杉醇），加入适量的氯仿溶解，在45℃条件下旋蒸15min成膜，然后加入适量的5％的葡萄糖溶液，45C水浴超声20min得到载药纳米颗粒混悬液。然后，通过5％的葡萄糖溶液将载药纳米颗粒混悬液稀释到适宜的浓度，然后将一定量的基因药物（siRNA或DNA）加入混合，室温条件下孵育15min即得到所需的不同(氮/磷酸盐，N/P)比的联合载药的静电复合物。
实施例17包载多肽蛋白药物的纳米颗粒制备
此实施例说明了本发明的聚阳离子材料与多肽蛋白药物静电复合物的制备。精密称取一定量的胆固醇修饰的rPAA载体材料，加入适量的乙醇溶解，在37℃条件下旋蒸15min成膜，然后加入适量的5％的葡萄糖溶液，37°C水浴超声20min得到空白纳米颗粒混悬液（浓度为1mg/mL）。通过5％的葡萄糖溶液将空白纳米颗粒混悬液稀释到适宜的浓度，然后将一定量的多肽蛋白药物（神经生长因子或胰岛素或降钙素）与适量的空白纳米颗粒混合，室温条件下孵育15min即得到所需的静电复合物。
实施例18脂质复合纳米颗粒制备
此实施例说明了本发明的聚阳离子材料与脂质体形成纳米颗粒。精密称取一定量的胆固醇修饰的rPAA载体材料和脂质材料（磷脂与胆固醇），加入适量的氯仿溶解，在45℃条件下旋蒸15min成膜，然后加入适量的含siRNA葡萄糖溶液，水浴超声30min得到载siRNA脂质复合纳米颗粒混悬液。

Claims (10)

1.一种胆固醇修饰的生物可降解聚阳离子载体，其特征在于，是由平均分子量2kD-20kD的功能化线性聚（酰胺-胺）与胆固醇通过酰胺键或酯键化学偶联形成的；其中所述线性聚（酰胺-胺）是由N，N'-双(丙稀酰)胱胺与含-NH2单体通过迈克尔加成反应聚合形成的具有重复单元的线性聚合物，且聚合物中每个单元结构中均含有二硫键。
2.根据权利要求1的载体，其特征在于，其临界胶团浓度>1mg/L，在水相介质中自组装形成纳米颗粒，粒径介于20-200nm，纳米颗粒表面带正电荷，胆固醇接枝率为1％-90％。
3.根据权利要求1的载体，其特征在于，所述的含-NH2单体选自：N，N’-二甲基二亚丙基三胺，组胺，4-氨基-1-丁醇，多巴胺，半胱胺酸，半胱胺盐酸盐，阿霉素，米托蒽醌。
4.根据权利要求1的载体，其特征在于，其中的功能化线性聚（酰胺-胺）和胆固醇的连接方式通过胆固醇酰氯直接或间接与线性聚（酰胺-胺）母链上的-NH2或-NH-通过酰胺键连接，在采用间接连接时，可以选用的连接臂包括：-(CH2)n-，-S-S-,以及其他基团，其中n=1-10。
5.根据权利要求1的载体，其特征在于，可利用其结构中疏水区携载脂溶性化学药物，利用其表面正电荷特性携载治疗性DNA、siRNA、miRNA等基因药物或多肽蛋白药物。
6.一种含有权利要求1所述载体的药物组合物，其特征在于，所述药物选自任何适合该载体的药物。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，其中所述药物选自：治疗性DNA、siRNA、miRNA、多肽蛋白药物以及抗肿瘤药物。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，包括被脂质体包裹形成的脂质复合纳米粒。
9.权利要求1所述载体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
精密量取等摩尔比的N，N’-双（丙烯酰）胱胺和含-NH2单体，溶解于溶剂中，在37℃氩气保护条件下，避光反应，待反应溶液变粘稠后，产物用无水乙醇透析，旋蒸除去乙醇溶剂，产物真空干燥24小时，最终得到功能化线性聚酰胺-胺，然后，在冰水浴的条件下，将100mg的上述线性聚酰胺-胺溶解于无水二氯甲烷溶剂中，然后依次加入胆固醇酰氯和三乙胺，反应进行24小时，反应结束后，旋蒸除去反应溶剂，然后将产物溶解在乙醇/去离子水混合溶剂中，用盐酸调节产物溶液的pH值至4.0，产物用无水乙醇透析3天后，冷冻干燥得到胆固醇修饰的聚酰胺-胺。
10.权利要求6所述药物组合物的制备方法，其特征在于，步骤如下：
精密称取一定量的胆固醇修饰的载体材料，加入无水乙醇溶解，旋转蒸发成膜，然后加入5％的葡萄糖溶液，水浴超声得到空白纳米颗粒混悬液，然后将siRNA与空白纳米颗粒混合，室温条件下孵育15min即得。
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