CN102174184B - 一种生物可降解的聚合物及其制备方法以及核酸药物运输载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物可降解的聚合物及其制备方法，它为聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物共聚形成的聚合物，其结构通式I为：[A；B/L]，其中：A来源于聚羟基脂肪酸酯、B来源于阳离子化合物、L为连接体部分；所述阳离子化合物为阳离子肽、阳离子酯质、阳离子聚合物。本发明还公开了一种核酸药物运输载体，其是活性成分为上述生物可降解的聚合物的带正电荷的纳米颗粒，所述纳米颗粒的粒径为30-600nm，其zeta电势为2-60mV。本发明所述的聚合物具有可生物降解；生物相容；相对疏水性，因此通过聚合物链之间的亲水-疏水相互作用可促进共聚物自组装；原料廉价，节约成本等优点。

Description

一种生物可降解的聚合物及其制备方法以及核酸药物运输载体

技术领域

本发明涉及以一种生物可降解的聚合物及其制备方法以及相关的核酸药物运输载体，属于生命医学领域。

背景技术

核酸类药物因其独有的高效性、特异性，已逐渐被发展成为新型的治疗遗传性或获得性疾病包括病毒感染和癌症等的基因治疗手段，此外，其在基因功能研究方面也发挥着重要作用。但由于核酸类药物巨大的分子量及自身所携带的大量负电荷使其不能自主穿越细胞膜进入细胞发挥作用，在系统运输时易引起非特异性的脱靶效应和免疫应答，同时还面临被核酸酶降解等障碍，所以核酸类药物的转染问题成为限制其应用的主要瓶颈。设计和合成安全有效的核酸药物载体已经成为目前核酸药物研发的重要方向。虽然病毒载体具有较高的转染效率，但其潜在的安全性问题及高成本等缺点，使其应用受到极大的限制。所以安全性高、副作用小、生产成本低的非病毒载体越来越受到人们的青睐。目前用于核酸药物非病毒载体递送的手段主要有以下两种：化学修饰法和合成载体法。第一，对其进行化学修饰，如：核糖2位甲基化、用磷硫酰键连接链的3末端和5末端、用氟原子取代核糖的2位羟基等；或链接一些功能性基团如：胆固醇、脂质体、细胞敏感多肽(CPP)等改善其转染效果。第二是化学合成一些转染试剂作为载体与核酸药物自组装形成纳米颗粒从而提高其转染效果。

合成型的转染试剂主要包括两大类。第一类是脂质体和类脂，如稳定的核酸脂肪微滴(SNALP)、Oligofectamine、脂醇和脂醇98N12-5(1)，其运输效果已得到证实。虽然脂质体和某些阳离子类脂在体内和体外的安全性和毒性已有报道，但将脂质体用于临床还是很有希望，因为FDA已经批准将聚乙二醇修饰的脂质体用于阿霉素和两性霉素B的运输。第二类是阳离子聚合物。阳离子聚合物因能与大量的核酸分子自组装成稳定的纳米粒子而成为有效的转染试剂。简而言之，负载核酸药物分子的纳米粒子通过核酸分子磷酸基团的负电荷与阳离子聚合物的正电荷之间的静电相互作用结合形成聚合电解质络合物，然后该络合物通过刺激非特异性的细胞内吞和“质子海绵”效应介导的内涵体逃逸而发挥作用。

目前用于自组装的材料如：聚乙烯亚胺(PEI)、聚左旋赖氨酸(PLL)、树状分子，壳聚糖等，他们形成的聚合物类型主要有以下几种：聚合物丛(Polyplexes)、聚合物胶束(Polymermicelles)、纳米丛(Nanoplexes)、纳米胶囊(Nanocapsules)、藻酸盐纳米粒子(Alginatenanogels)、水凝胶(hydrogel)。聚合物丛是由核酸药物与一些合成和天然的聚合物阳离子(如：聚乙烯亚胺、壳聚糖、胶原、环糊精等)自组装形成，虽然其对核酸药物有较高的负载率，高转染效率，但也有较高的细胞毒性。聚合物胶束是由两嵌段(AB)或三嵌段(ABC或ABA)的共聚物组成，其中A部分是阳离子聚合物，如：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸等；B部分是高亲水聚合物，如：聚乙二醇、葡聚糖、或聚氮-(2-羟丙基)异丁烯酰胺(PHPMA)等。这些胶束的内核能提供不同的环境，如胶状的、非晶的和晶状的；此外，他们的这种核壳结构和尺寸与天然病毒的非常相似，又因其尺寸比聚合物丛的小而比聚合物丛更稳定。但它仍摆脱不了由阳离子聚合物带来的潜在毒性，所以其应用仍受到限制。纳米丛是由相关单体通过乳液聚合、阴离子聚合、或自由基聚合反应，然后经表面活性剂(如：溴代十六烷基三甲基铵硝酸盐DTAB、CTAB)或壳聚糖等改变其表面电荷形成(如：聚烷基氰酸丙烯酸酯PACA)；或是用戊二醛将去溶剂化处理的明胶纳米粒子网状化，然后再用乙醇胺等季胺分子锚定在其表面形成，最后通过离子之间相互作用或抗生素与生物素相互作用与核酸分子结合；由于戊二醛及阳离子聚合物带来的毒性，要将该类型载体应用于临床还必须开发新型的网状化试剂并减少阳离子聚合物的使用。纳米胶囊作为一种囊泡状聚合物载体是由一层薄的阳离子聚合物外膜包裹一个水溶性的内核形成。核酸药物被包入内核中直到外膜降解后才释放出来，因此这种方式能较好的保护核酸药物抵抗机体的代谢，但因共包封的阳离子聚合物的毒性及其制备过程中需使用有毒的氯化试剂，而且制备困难，大大限制了该类载体的临床运用。藻酸盐纳米胶是新近出现的一种，它是在藻酸盐水溶液中用氯化钙(CaCl₂)使多糖链之间发生离子交联而凝胶化形成的。尽管藻酸盐具有较多负电荷、低毒、低致免役性，藻酸盐纳米胶对核酸药物具有较高的负载率，但这类载体因其在与核酸分子结合过程中涉及到阳离子聚合物(如：聚赖氨酸等)的使用而使其临床应用仍受限制。水凝胶是新近报道的一种运载工具，它是一种可注射、可生物降解的生物聚合物结构，可实现核酸药物的可控递送，允许长期抑制特定位点基因的表达，而且核酸药物被释放6天后仍能保持其生物活性并具有较强的干扰效应；又因其可注射，使得其可以最低限度侵害机体的方式给药；而且由于它的高亲水性及高气体通透性可以把多种细胞掺合其中，从而可实现它递送核酸药物和细胞移植的双重功能。尽管针对核酸药物的载体研究取得了一定的突破和进展，但要使核酸药物成功应用于生物体内，并成为常规途径，仍有一些关键性问题需要解决，如：毒性、特异性、靶向性、免疫刺激、转染效率低等。由此，具有较好生物相容性、快速去质子化能力的可生物降解的高分子载体因具有靶向传递的潜能、具有更好的稳定性、能增强细胞对运输分子的吸收、能提高核酸药物对生理环境的耐受性并能使核酸药物有效释放，实现治疗目的，而使得这类载体在核酸药物给药中具有更好的优势和应用前景。

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是原核生物在碳、氮营养失衡的情况下，作为碳源和能源贮存而合成的一类热塑性聚酯，是一种天然的高分子生物材料。脂肪酸可以是丁酸、戊酸或己酸等，其具有的数均分子量(Mn)范围是约50,000道尔顿至约20,000,000道尔顿。因其同时具有良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的热加工性能，并同时可作为生物医用材料和生物可降解包装材料，已经成为近年来生物材料领域最为活跃的研究热点，在药物缓释体系中也发挥着越来越重要的作用，而且已经被FDA批准用作手术的缝合线。目前已经商品化生产的PHA产品如聚羟基丁酸酯(PHB)、聚羟基戊酸酯(PHV)、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯(PHBV)、聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯(P3/4HB)、聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚酯(PHBHHx)，均已经证明具有生物相容性和生物可降解性。

在理想情况下，最佳的非病毒载体应该是具有低毒性和高基因递送效率的聚合物。本发明将这种具有良好的生物相容性和生物可降解性的聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物聚合，作为核酸药物的运输载体，结合两者的优势，希望在实现有效运输核酸药物的同时，可降低载体的毒副作用，并且选用这种可生物降解的材料作为载体，还可实现核酸药物的缓慢释放，达到长效的目的，从而减少用药剂量。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种生物可降解的聚合物。

实现上述目的的技术方案如下：

一种生物可降解的聚合物，其为聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物共聚形成的聚合物，其结构通式I为：[A；B/L]，其中：A来源于聚羟基脂肪酸酯、B来源于阳离子化合物、L为连接体部分；所述阳离子化合物为阳离子肽、阳离子酯质、阳离子聚合物或其组合。

本发明的另一目的是提供一种转染效率高、靶向性强、低毒、安全性好的核酸药物运输载体。

实现上述目的的技术方案如下：一种核酸药物的运输载体，其是活性成分为上述生物可降解的聚合物的带正电荷的纳米颗粒，所述纳米颗粒的粒径可为30-600nm(优选的粒径为30-500nm)，其表面电势(即zeta电势)可为2-60mV。“A”或式I的聚羟基脂肪酸酯(PHA)的结构通式如下：

其中n＝1，2，3，或4；当n＝1，即为PHB。m表示聚合度，决定分子量的大小。R是可变基团，可为饱和或不饱和、直链或含侧链即取代基的烷基。

进一步地，聚羟基脂肪酸酯(PHA)包括：聚羟基丁酸酯(PHB)、聚羟基戊酸酯(PHV)、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯(PHBV)、聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯(P3/4HB)、聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(PHBHHx)。实施方案中，式I化合物中的聚羟基脂肪酸酯可以是以上的任一类，不同分子量、不同组成的聚酯。最优选的是聚羟基丁酸酯(PHB)。

上述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量(Mn)范围可以是是约200道尔顿至约2,000,000道尔顿，更优选是约200道尔顿至约60,000道尔顿，更优选200道尔顿至5000道尔顿。

“B”或式I化合物中的阳离子化合物包括阳离子肽、阳离子酯质、阳离子聚合物或其组合，但不限于此。所述阳离子肽包括但不限于赖氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸(KALA)、聚左旋赖氨酸(PLL)、或鱼精蛋白；所述阳离子脂质包括但不限于二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、胆固醇二油酰卵磷脂、或胺乙基胺基甲酰基胆固醇(CAEC)；所述阳离子聚合物包括但不限于聚乙烯亚胺(PEI)、精胺、亚精胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、壳聚糖、聚丙烯亚胺树状分子、或聚甲基丙烯酸N，N-二甲氨基乙酯树状分子。

更优选的式I化合物中的阳离子肽是聚左旋赖氨酸(PLL)；优选的式I的阳离子酯质是胺乙基胺基甲酰基胆固醇(CAEC)；优选的式I的阳离子聚合物是聚乙烯亚胺(PEI)，且更优选式I的阳离子聚合物是低分子量的聚乙烯亚胺(PEI)。式I的阳离子化合物可以任选具有相同重复单元或不同重复单元组合的阳离子化合物。

“L”或式I的连接体部分包括但不限于酰氨基连接体部分、氨基甲酸酯连接体部分、脲连接体部分、醚连接体部分、琥珀酰氨基连接体部分、氨基酯连接体部分、酯连接体部分及其组合。L优选是脲连接体部分或氨基酯连接体部分。连接体部分结合到阳离子化合物的氨基和聚羟基脂肪酸酯的羟基、羧基或丙烯基上。主要包括酰胺键、酯键、酐键、双键、二硫键、生物可降解的连接或酶可裂解的连接。

本发明的另一目的是提供了上述生物可降解的聚合物的合成方法。

实现上述目的的技术方案具体如下.

一种上述生物可降解的聚合物的合成方法，

所述式I化合物的合成方法是：一端或两端为羟基、羧基或丙烯基的聚羟基脂肪酸酯在催化剂和连接剂的作用下，与阳离子化合物反应得到；所述连接剂为能活化氨基、羟基或羧基的试剂或丙烯酸酯单体、或甲基丙烯酸酯单体。

在优选的实施方案中，连接剂是能活化氨基、羟基或羧基的试剂如：六亚甲基二异氰酸酯(HDI)、羰基二咪唑(CDI)、异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)等，在另一实施方案中是用丙烯酸酯单体、甲基丙烯酸酯单体为连接剂，包含但不限于丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酸酯、丙烯酰氯等将聚羟基脂肪酸酯的端羟基转变为双键，然后通过迈克尔加成与阳离子化合物的氨基反应，优选的是丙烯酰氯。

聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的反应可以发生在阳离子化合物的伯胺或仲胺上面。聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的质量比是1-50，优选的是1-30，更优选是1-10，同时聚羟基脂肪酸酯与连接试剂的摩尔比可以根据所用试剂而变化，并可以从100-1。

在一优选的实施方案中式I化合物是通过一端或两端为羟基的聚羟基脂肪酸酯，以辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)为催化剂，HDI/CDI/IPDI为连接剂，与阳离子化合物上的氨基聚合得到；

上述聚合反应可以发生在阳离子化合物的伯胺或仲胺上面。

在另一优选的实施方案中式I化合物是通过一端或两端为羧基的聚羟基脂肪酸酯，以4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂，DCC/EDC为缩合剂，与阳离子化合物的氨基缩合得到；

另一优选的实施方案中式I化合物是通过一端或两端为丙烯基的聚羟基脂肪酸酯的末端双键与阳离子化合物的氨基通过迈克尔加成反应得到；

本发明提供的式I化合物包括三大类：聚羟基脂肪酸酯与阳离子肽的共聚物、聚羟基脂肪酸酯与阳离子脂质的共聚物、聚羟基脂肪酸酯与阳离子聚合物的共聚物。

本发明得到的核酸药物运输载体(共聚物载体)具有良好的生物相容性和生物可降解性，其物理、化学性能可以通过调节聚合物的分子量或各组分的组成而调节。本发明提供的生物相容性共聚物，在水溶液中自组装成纳米颗粒，具有良好的稳定性、制备方法简单、可重复性高，作为载体能很好的保护核酸药物。

本发明提供的聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的共聚物可以形成带有正电荷的纳米颗粒，这种纳米颗粒的粒径可为30-600nm，优选是30-500nm，表面电势可为2-60mV。本发明中各共聚物制备的纳米颗粒能够与siRNA完全结合形成稳定的负载siRNA分子的纳米颗粒。

使用聚羟基脂肪酸酯作为本发明聚合物的一部分，具有如下优点与作用：①：可生物降解；②：生物相容；③：相对疏水性，因此通过聚合物链之间的亲水-疏水相互作用可促进共聚物自组装；④：原料廉价，节约成本。

使用阳离子化合物作为本发明聚合物的阳离子部分，主要是利用其氨基官能团，在略酸或略碱性环境下带有的大量正电荷可以与带负电荷的核酸药物静电结合，实现对核酸药物的运输。同时其具有的亲水性或靶向性可增强共聚物在水溶液中的溶解度，更利于核酸药物的运输。

附图说明

图1是实施例1、2中相关化合物的合成示意图，其中A-F为mPHA-OH和PHA-diol的合成及相应端基修饰路线、G-J为各类材料的合成示意图。

图2是实施例1、2中相关化合物的核磁共振氢谱(¹H NMR)图，其中A、B、C分别为mP3/4HB-OH、PHB-diol和材料24的¹H NMR谱。

图3是实施例3中纳米颗粒的物理表征及稳定性测试结果，其中图A、B分别为纳米颗粒的粒径及表面电势(zeta电势)的结果；图C为材料的血清稳定性测试结果，其中T表示时间、N和F分别代表材料9、15的纳米颗粒与siRNA的复合物。

图4是实施例4中纳米颗粒与siRNA复合物的物理表征结果，其中图A、B分别为纳米颗粒与siRNA复合物的粒径及Zeta电势的结果。

图5是实施例5中凝胶电泳阻滞实验结果，其中A-D分别为材料3、9、15、24的凝胶电泳阻滞实验结果，图中每一条泳道下方标记的数字表示该泳道中复合物的载体/siRNA质量比。

图6是实施例6中，材料3、9、15、24在Hela细胞中转染质粒DNA后，绿色荧光蛋白(GFP)的表达结果，其中纵坐标是GFP蛋白表达百分率，横坐标是材料的编号。

图7是实施例7中材料9纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬实验结果，其中图A为DAPI染色，显示的是细胞核；B为荧光染料CY3标记的siRNA；C为A、B的叠加图；D为对照组。

图8是实施例7中材料15纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬实验结果。其中图A为DAPI染色，显示的是细胞核；B为CY3标记的siRNA；C为A、B的叠加图；D为对照组。

图9是实施例7中材料24纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬实验结果。其中图A为DAPI染色，显示的是细胞核；B为CY3标记的siRNA；C为A、B的叠加图；D为对照组。

图10是实施例8中体外转染细胞实验以及荧光素酶活性检测实验结果。其中A、B分别为材料3和材料12在A549-luc细胞中转染条件优化的结果；C、D分别为各载体材料在A549-luc细胞和MCF-7-luc细胞中的实验结果；1-27为材料编号；28为阳性对照组；29为对照1。

图11是实施例9相关实验的激光共聚焦结果，显示的是不同条件下SD大鼠关节腔不同部位的荧光信号分布情况。其中A和B、C和D分别为对照1和阳性对照组的膝关节不同部位的荧光分布情况；E和F、G和H分别为材料24转染24h和96h后膝关节不同部位的荧光分布情况；其中图1-1、2-1、3-1、4-1、5-1、6-1、7-1、8-1为在488nm激发光下激光共聚焦的照片，显示的是荧光标记的Cy3-siRNA；图1-2、2-2、3-2、4-2、5-2、6-2、7-2、8-2为在346nm激发光下激光共聚焦的照片，显示的是细胞核；图1-3、2-3、3-3、4-3、5-3、6-3、7-3、8-3分别为图1-1、2-1、3-1、4-1、5-1、6-1、7-1、8-1和对应的图1-2、2-2、3-2、4-2、5-2、6-2、7-2、8-2的叠加结果。

具体实施方式

本发明提供了一类核酸药物的运输载体，它的活性成分是聚合物形成的，可生物降解的带正电荷的纳米颗粒。上述聚合物(以下或称为共聚物)为聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物反应而成。

1、与式I化合物结合的核酸药物

本发明提供的式I化合物可以与核酸药物结合形成复合物，因此可作为载体将核酸药物运输进细胞。核酸药物的实例包括DNA药物、反义核酸antisense、核酶ribozymes、三链核酸、DECOY核酸/aptamers、干扰RNA(siRNA)。优选的是DNA和siRNA。式I化合物与核酸药物形成的复合物，可以通过将共聚物溶液与核酸药物的溶液混合形成，也可通过将共聚物制备成纳米颗粒，然后再与核酸药物结合形成，更优选是通过以下实施事例中的方法形成。

2、式I化合物与核酸药物的结合方式

本发明提供的具有较好生物相容性和生物可降解性的式I化合物，在水溶液中通过自组装形成纳米颗粒，这类纳米颗粒在水溶液中具有疏水的聚羟基脂肪酸酯内核和亲水的阳离子聚合物外壳，而且颗粒的尺寸与共聚物的组成有关，可以调控。在略酸性或略碱性的环境中形成的纳米颗粒表面带有可观的正电荷，在合适的电荷比(N/P)情况下，通过静电作用可与带负电荷的核酸药物完全结合形成稳定的复合物，起到运输核酸药物的作用。采用这种纳米颗粒作为载体可实现载体/核酸药物复合物的细胞内吞，纳米颗粒将核酸药物运输进病灶部位后，并与核酸药物分离，将核酸药物释放出来，使其发挥作用以达到治疗的目的。由于该共聚物载体具有两亲性，还可将其制备成不同结构的纳米颗粒，既可以将核酸药物包裹在其中，也可以将核酸药物锚定在其表面。

3、式I化合物纳米颗粒的制备及其稳定性测试

可通过常规方法将两亲性的共聚物在水溶液中制备成纳米颗粒，比如溶剂挥发法和透析法。

溶剂挥发法：将共聚物溶于四氢呋喃中，于搅拌下滴入超纯水得到相应的终浓度，搅拌两小时后，于减压下除去有机溶剂，再定容至合适的体积。

透析法：将共聚物溶于良溶剂如二甲基亚砜(DMSO)中，于搅拌下滴入超纯水得到相应的终浓度，搅拌两小时后，于透析袋中透析除去有机溶剂。

本发明提供的各载体材料的纳米颗粒是采用溶剂挥发法制备，同时测定了纳米颗粒的粒径分布及其表面电势大小，结果表明，各载体材料的纳米颗粒因其种类和组成的不同，导致其粒径分布和表面电势大小不同。然后将纳米颗粒与核酸药物结合后，在25％牛血清中，对其稳定性进行了测定。优选的核酸药物是siRNA，实验结果表明：载体材料的纳米颗粒与siRNA结合后，未发现纳米颗粒聚集现象，siRNA与之结合一定时间后，经检测siRNA能保持其完整性未被降解。由此说明载体材料的纳米颗粒能提高siRNA在牛血清中的稳定性。此外，将纳米颗粒与siRNA结合形成复合物后，通过动态光散射和Zeta电势测定了复合物的粒径分布及表面电势(即zeta电势)大小，结果表明，各载体材料因所含阳离子化合物的种类及含量不同，导致他们与siRNA形成的复合物的粒径分布与表面电势大小有差异，与未结合siRNA之前的纳米颗粒相比，有的材料与siRNA形成的复合物其粒径变大，电势变小，这说明siRNA可能是通过静电作用结合在纳米颗粒的表面；而有的材料与siRNA形成的复合物其粒径变小，电势变大，这说明siRNA可能被纳米颗粒通过静电作用包裹在其内部，同时原处于纳米颗粒内部的部分正电荷被暴露了出来，所以导致表面电势变大。由此证明，本发明的载体材料可制备成不同结构的纳米颗粒，既可实现对siRNA的包裹，也可将siRNA锚定在其表面。

4、式I化合物对核酸药物运输的应用研究

本发明提供了式I化合物作为载体对核酸药物运输的应用研究，包括其对核酸药物的包装能力测定、转染能力的测定、以及其对核酸药物治疗效果的影响。

基因治疗的效果取决于多种因素。一般而言，在基因转染实验中，没有被有效包装起来的核酸药物，基本不具备转染效果。而利用非病毒运输载体时，只有当核酸药物与载体材料结合，形成的复合物颗粒才可能具有较高的转染活性。因此，能否将核酸药物有效包装是运输载体的重要性能之一。所以必须通过实验获知，载体/核酸药物的比例为多少时，核酸药物能够被充分包装起来。这一比例，可以是载体/核酸药物的质量比，也可以是电荷比，即氮/磷(N/P)比，其中N代表载体中的氨基，可以产生一单位正电荷；P为核酸药物分子中的磷酸基团，可以产生一单位负电荷。N/P比反应了载体与核酸药物的电荷比情况，一般认为用于核酸药物转染的载体材料，与核酸药物都是通过正负电荷相互吸引而组装在一起。在本发明中，我们采用了较为简单和直观的质量比来表示载体/核酸药物的比例，这种方式也在实际应用中更为精确，文中若没有特殊说明，载体/核酸药物的比例均指两者的质量比。

在优选的实施方案中，本发明通过凝胶阻滞实验测定了本发明制备的各种载体材料对siRNA的包载能力，实验结果表明：每种载体材料均能与siRNA完全结合，而且由于每种载体材料中阳离子化合物含量的不同而导致每种载体材料与siRNA完全结合时两者的比例各异。

另一方面，核酸药物能否发挥疗效，其中最主要的一个原因是运输载体能否将核酸药物转染进细胞并发挥作用，本发明通过细胞转染实验测定了自制的各类载体材料对核酸药物的转染能力及其对核酸药物治疗效果的影响。其中，优选的核酸药物是质粒DNA，实验结果表明，本发明的各类载体材料能将质粒DNA成功转进细胞，但各类载体材料对质粒DNA的转染效率因其分子量，组成比例，所带电荷的不同而有差异。而当载体材料相同，其与DNA的比例不同时，转染效果的差异也因材料种类的不同而呈现出不同的趋势。

在一优选的实施方案中，本发明通过细胞吞噬实验测定了自制的各种载体材料对siRNA的转染能力。实验结果表明：各种材料均能将带荧光的siRNA转进细胞，而且每个细胞的细胞核周围都分布着siRNA，但转染效果因材料不同而有所差异。

在另一优选的实施方案中，本发明用体外转染细胞实验以及荧光素酶活性检测实验，在能稳定表达萤火虫荧光素酶的细胞即人肺腺癌细胞(A549-luc细胞)中测定了自制的各种载体材料在不同缓冲条件、不同转染时间下对siRNA的转染效果及沉默效果的影响，以此优化各载体材料的最佳转染条件。优选的两种载体材料是材料3和材料12。实验结果表明：在不同PH值、不同种类的缓冲盐、不同缓冲盐浓度、不同转染时间下，各载体材料因组成的不同，而对siRNA的转染效果及沉默效果的影响有所不同，材料3在50毫摩尔每升(mM)N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)(PH＝6.5)的缓冲液中能有效降低siRNA的表达，而材料12在HBG(20mM HEPES+5％葡萄糖(glucose)PH＝7.4)的缓冲液中能有效降低siRNA的表达。此外，在不同的缓冲条件下，各载体材料对siRNA的沉默效果都随着转染时间的延长而明显增加。

在进一步的实施方案中，本发明用体外转染细胞实验以及荧光素酶活性检测实验，结合各载体材料的转染条件优化结果，在两种不同的能稳定表达萤火虫荧光素酶的细胞中测定了自制的各种载体材料对siRNA的转染效果及沉默效果的影响。优选的两种细胞是：人肺腺癌细胞(A549-luc细胞)和人乳腺癌细胞(MCF-7-luc细胞)。实验结果表明：在两种细胞中不同载体材料对siRNA的转染效果及沉默效果影响不同，有的材料能显著增加siRNA的沉默效果，降低荧光素酶的表达，有的材料却对siRNA的沉默效果影响不大。而且各载体材料在两种细胞中对siRNA的转染效果及沉默效果的影响趋势基本相同，由此说明：各载体材料对siRNA的转染效果及沉默效果的影响几乎没有细胞特异性，不会因细胞种类的不同而有所差异。

进一步的实施方案中，本发明通过动物实验测定了不同时间段，各载体材料对核酸药物的缓慢释放能力。优选的实施方案中，选用本实验室自建的SD大鼠关节炎模型为动物模型，优选的载体材料为材料24，优选的核酸药物为带Cy3荧光标记的干扰RNA(Cy3-siRNA)，优选的时间段为24h和96h。具体实验内容见实施例9。实验结果表明：与对照组1和lipo2000转染Cy3-siRNA对照组相比，用材料24制备的纳米颗粒包裹Cy3-siRNA形成的复合物局部注射24h后，朝向关节腔的滑膜层及网状结缔组织有明显的荧光信号，但滑膜下的关节软骨层基本无红色荧光；而局部注射96h后，表面滑膜层荧光较24h时略减弱，关节软骨层、近髓质区域均出现明显核染，显示了复合物由表面向内部骨组织的扩散。由此说明，材料24将Cy3-siRNA成功转进了大鼠的关节腔内，而且随着转染时间的延长，复合物逐步的从表面滑膜层向内部骨组织扩散，Cy3-siRNA被逐渐的释放出来，从而实现了载体材料对核酸药物的缓慢释放。

本发明通过细胞和动物实验证明本发明提供的这类载体材料对核酸药物具有较高的包载能力和转染效率，基本不影响核酸药物的疗效，而且毒副作用小，具有良好的生物相容性和生物可降解性，可实现核酸药物的缓释，同时其纳米颗粒具有很好的稳定性和易于制备等特点，使得这类载体在siRNA运输和其他核酸药物的运输中具有很好的应用前景。

本发明中的聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)中，羟基丁酸(HB)所占的比例范围是5-95％，优选是5-60％。

本发明中的聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯(P3/4HB)中，4-羟基丁酸(4HB)所占的比例范围是3-70％，优选是3-40％。

本发明中的聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(PHBHHx)中，3-羟基丁酸(HB)所占的比例范围是2-90％，优选是2-70％。

下述实施例旨在更好的理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1、单/双羟基聚羟基脂肪酸酯的合成及其端基修饰

a、单/双羟基聚羟基脂肪酸酯(mPHA-OH/PHA-diol)的合成与表征

各类单/双羟基聚羟基脂肪酸酯(mPHA-OH/PHA-diol)的合成，均是在对甲苯磺酸(PTSA)的催化下，与甲醇或二醇通过酯交换反应制备，其中二醇可以是乙二醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、1，6-己二醇。本发明中的各类聚羟基脂肪酸酯原料均是购自于深圳意可曼生物科技有限公司。下面以单甲基聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯(mP3/4HB-OH)和聚羟基丁酸酯的二醇(PHB-diol)为例说明此类反应的操作步骤。

mP3/4HB-OH的合成路线如图1(A)所示。mP3/4HB-OH是在对甲苯磺酸的催化下，将P3/4HB与甲醇通过酯交换反应制备。具体步骤为：将原料P3/4HB(10g)溶于250ml氯仿中回流30min后，再加入2g对甲苯磺酸和5ml甲醇回流，通过控制反应时间可得到不同分子量的mP3/4HB-OH。反应完毕，用水萃取3次，收集有机相，将其浓缩后倒入大量水中沉淀；过滤后，真空干燥，及得产物(产率83％)。

PHB-diol的合成路线如图1(B)所示。PHB-diol是在对甲苯磺酸的催化下，将PHB与1，4丁二醇通过酯交换反应制备。具体步骤为：将原料PHB(10g)溶于250ml氯仿中回流30min后，再加入3g对甲苯磺酸和10ml 1，4丁二醇回流，通过控制反应时间可得到不同分子量的PHB-diol。反应完毕，用水萃取3次，收集有机相，将其浓缩后倒入大量水中沉淀；过滤后，真空干燥，及得产物(产率80％)。

对mP3/4HB-OH和PHB-diol进行核磁共振氢谱分析(¹H NMR)分析，¹H NMR见图2(A)和(B)。

由图2(A)和(B)可见，各种质子均得到相应归属，积分比例吻合。

b、对单/双羟基聚羟基脂肪酸酯(mPHA-OH/PHA-diol)的端基修饰

1)羧基修饰(mPHA-COOH/PHA-diacid)

各类单/双羟基聚羟基脂肪酸酯均可通过适当方法如：将单/双羟基聚羟基脂肪酸酯(mPHA-OH/PHA-diol)与丁二酸/丁二酸酐、DCC、DMAP反应，可得到相应的单/双羧基聚羟基脂肪酸酯(mPHA-COOH/PHA-diacid)。合成路线如图1(C)、(D)。

2)丙烯基修饰(mPHA-mA/PHA-DA)

各类单/双丙烯基聚羟基脂肪酸酯(mPHA-mA/PHA-DA)均可通过mPHA-OH/PHA-diol与三乙胺和丙烯酰氯/丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯/乙二醇二丙烯酸酯/乙二醇二甲基丙烯酸酯/1，6-己二醇二丙烯酸酯反应得到。合成路线如图1(E)、(F)。

上述方法，本领域的技术人员可根据现有技术实现。

实施例2、聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物共聚物的合成与表征

各种不同种类、不同分子量的聚羟基脂肪酸酯与阳离子肽、阳离子脂质、阳离子聚合物的共聚物是以相应种类及相应分子量的单/双羟基、单/双羧基、单/双丙烯基的聚羟基脂肪酸酯与阳离子肽、阳离子酯质、阳离子聚合物，以HDI/CDI/IPDI/DCC/EDC为连接剂或缩合剂，在辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)或4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化下，采用溶液聚合、缩合或迈克尔加成等方法合成；通过调节聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的分子量及两者的投料比例可以得到不同分子量、不同组成的共聚物。辛酸亚锡因其高催化活性及无毒性，是被最广泛应用的聚合反应催化剂，已被FDA批准用作食品添加剂。

a、聚羟基脂肪酸酯与阳离子肽共聚物的合成与表征

以聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)与阳离子肽聚左旋赖氨酸(PLL)聚合制备mPHBV-PLL共聚物为例，说明各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子肽类共聚物的合成步骤。

合成路线如图1(G)所示：以单羧基的聚羟基丁酸戊酸共聚酯(mPHBV-COOH)为预聚体，4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂，双环己基碳酰亚胺(DCC)为缩合剂(即连接剂)，与聚左旋赖氨酸(PLL)以不同投料比通过缩合反应制备不同分子量、不同组成的mPHBV-PLL共聚物。缩合剂还可以是EDC、HOBt。

具体操作步骤如下：

将0.2-1g mPHBV-COOH与0.05-6g PLL置于250ml圆底烧瓶中，加入5-110ml CHCl₃溶解，然后加入计算量DCC和DMAP，于25℃-90℃反应6-48小时。反应完毕，透析，冷冻干燥，即得产物(产率51％-85％)。

不同分子量、不同投料比可得到不同的产物，如此得到了一系列mPHBV-PLL共聚物载体材料1-9，见表1。

表1不同分子量、不同投料比(质量比)合成mPHBV-PLL共聚物

b、聚羟基脂肪酸酯与阳离子脂质共聚物的合成与表征

以聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(PHBHHx)与阳离子脂质胺乙基胺基甲酰基胆固醇(CAEC)聚合制备PHBHHx-CAEC共聚物为例，说明各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子脂质类共聚物的合成步骤。

合成路线如图1(H)所示：以两端为丙烯基的聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(PHBHHx-DA)为引发剂，与胺乙基胺基甲酰基胆固醇(CAEC)以不同投料比通过迈克尔加成反应，制备不同分子量、不同组成的PHBHHx-CAEC聚合物。

具体操作步骤如下：将0.2-1g PHBHHx-DA与0.05-4g CAEC置于250ml圆底烧瓶中，加入5-110ml DMSO溶解，于25℃-50℃反应4-48小时。反应完毕，透析，冷冻干燥，即得产物(产率45％-85％)。

按照以上方法，不同分子量、不同投料比可得到不同的产物，如此得到了一系列PHBHHx-CAEC共聚物载体材料10-18，见表2。

表2不同分子量、不同投料比(质量比)合成PHBHHx-CAEC共聚物

c、聚羟基脂肪酸酯与阳离子聚合物共聚物的合成与表征

以聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯(P3/4HB)与阳离子聚合物PEI(其具有的重均分子量范围是423道尔顿至25,000道尔顿，本领域的技术人员可根据具体需要，在实际中应用中具体选择)聚合制备P3/4HB-PEI共聚物为例，说明各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子聚合物类共聚物的合成步骤。

合成路线如图1(J)所示：以两端为羟基的聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯(P3/4HB-diol)为引发剂，辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)为催化剂，HDI为连接剂，制备不同分子量、不同组成的PHB-PEI聚合物。连接剂还可以是CDI、IPDI。

具体操作步骤如下：

先将0.2-1g P3/4HB-diol与0.05-3g PEI置于250ml干燥后的双口瓶中，真空干燥30min，用干燥的Ar气交换3次以除去微量的水分和空气；然后加入2-100ml重蒸的1，2-二氯乙烷溶解，加入1-10滴Sn(Oct)₂(大约0.1ml)，及计算量的HDI，然后于40℃-90℃反应8-48小时。反应完毕后，将滤液倒入大量乙醚中沉淀。然后将沉淀溶于50-1500ml水中，过滤除去不溶物，将滤液浓缩后冷冻干燥，及得最终产物(产率43％-75％)。

按照以上方法，不同分子量、不同投料比可得到不同的产物，如此得到了一系列P3/4HB-PEI共聚物载体材料19-27，见表3。

表3不同分子量、不同投料比(质量比)合成P3/4HB-PEI共聚物

以材料24的核磁共振氢谱(¹H NMR)见图2(C)为例，说明材料的结构。图中显示的是材料24分别在氘代氯仿(CDCl₃)和重水(D₂O)中的¹H NMR谱，其中标注的是共聚物中的PEI部分。因共聚物具有两亲性，所以在CDCl₃中，PEI被亲脂性的P3/4HB包裹在里面，而在D₂O中，PEI因其亲水性显露在外面，而把P3/4HB包裹在里面。由此说明，本发明制备的共聚物在水溶液中可形成不同的纳米结构。由此，共聚物与核酸药物结合时既可以把核酸药物包裹在其中，也可以将核酸药物锚定在其表面。

实施例3、用聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的共聚物制备纳米颗粒

a、纳米颗粒的制备

两亲性共聚物在水溶液中存在疏水、亲水相互作用，只要共聚物浓度高于临界胶束浓度即可形成纳米颗粒。本发明制备的各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的共聚物均由亲水部分的阳离子化合物与疏水部分的聚羟基脂肪酸酯组成，所以在水溶液中都能自组装形成纳米颗粒。下面以材料1纳米颗粒的制备为例说明本发明中各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物共聚物纳米颗粒的制备方法。

制备纳米颗粒的方法有多种，最简单常见的是溶剂挥发法，具体方法为：将20mg材料1溶于2ml四氢呋喃中，室温下搅拌2h，然后在搅拌下以60ml/h的速度滴入20ml超纯水，再搅拌3h后，减压抽掉有机溶剂，得到2mg/ml的纳米颗粒溶液。纳米颗粒的粒径主要为30-600nm。通过上述方法制备了2mg/ml的材料2-材料27的纳米颗粒溶液。

b、纳米颗粒的粒径和zeta电势

通过型号为Malvern Zetasizer Nanao ZS90的动态光散射仪检测浓度为0.1mg/ml的材料1-材料27纳米颗粒的粒径和粒径分布及zeta电势大小。图3(A)和图3(B)分别表示材料3、9、12、15、24、27共聚物的粒径和zeta电势的结果。从图可见，自制的各种载体材料纳米颗粒因种类及组成不同，使得其所带正电荷量各异，最终导致各材料纳米颗粒的粒径、粒径分布和zeta电势大小不同。各材料纳米颗粒的平均直径及zeta电势见表4。

表4自制的各载体材料纳米颗粒的平均直径及zeta电势

c、纳米颗粒与核酸药物复合物的稳定性测试

各载体材料纳米颗粒与核酸药物复合物的稳定性测试操作均相同。优选的实施方案中以材料9和材料15的纳米颗粒与核酸药物复合物的体外稳定性测试实验为例说明操作步骤。更优选的核酸药物是能抑制萤火虫荧光素酶表达的siRNA(luciferase siRNA)。操作步骤如下：首先制备材料9和材料15的纳米颗粒与luciferase siRNA的复合物溶液，然后将此复合物溶液与牛血清混合后(混合溶液中牛血清浓度为25％(v/v))于pH＝7.4，37℃下孵育，分别在第0、2、4、8、12、24、48小时取样，经质量分数为20％的聚丙烯酰胺(PAGE)胶和凝胶成像系统照相分析(图3(C))。实验结果表明：材料9和材料15的纳米颗粒与luciferase siRNA形成的复合物在25％牛血清中孵育48小时后，复合物中luciferase siRNA的含量基本不变，说明luciferase siRNA与纳米颗粒结合后其在血清中的稳定性显著提高。由此说明此类纳米颗粒与luciferase siRNA结合后，可使luciferase siRNA避免被血清中的相关蛋白结合，避免被血清中的相关酶降解。因此，此类纳米颗粒有望解决siRNA在血清中的稳定性问题。

其它材料制备的纳米颗粒结合luciferase siRNA后，luciferase siRNA在血清中的稳定性也显著提高，具体图像省略。

实施例4、聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的共聚物与siRNA复合物的制备及表征

按照实施例3的方法制备浓度为5mg/ml的各载体材料纳米颗粒溶液。荧光素酶pGL4luciferase siRNA，购自广州锐博生物科技有限公司，将5nm pGL4 luciferase siRNA溶解在250ul DEPC处理的水中，得到浓度为20微摩尔每升(uM)luciferase siRNA溶液。上述纳米颗粒与上述siRNA溶液按相应质量比混合，制备不同载体材料纳米颗粒与siRNA复合物。

通过动态光散射测量以上纳米颗粒与siRNA复合物的粒径和粒径分布，通过zeta电势测定仪测量以上纳米颗粒与siRNA复合物的zeta电势。图4(A)表示材料3、9、12、15、24、27载体材料纳米颗粒与siRNA复合物的粒径结果，其中，纵坐标表示纳米颗粒粒径大小(nm)，横坐标为平均强度；图4(B)表示材料3、9、12、15、24、27载体材料纳米颗粒与siRNA复合物的zeta电势结果，其中纵坐标表示电势大小(毫伏mV)，横坐标表示材料编号。从图可见，因材料的种类及组成不同，他们与siRNA形成的复合物的粒径和粒径分布不同，zeta电势大小也各异。对比各载体材料纳米颗粒与siRNA结合前后其粒径和zeta电势变化，可知，有的载体材料与siRNA结合后其粒径变小、zeta电势变大，说明载体材料可能是通过静电作用把siRNA包裹在其中，并且之前处于纳米颗粒内部的部分正电荷被暴露了出来；而有的载体材料与siRNA结合后其粒径变大、zeta电势变小，这说明siRNA是通过静电作用锚定在载体材料纳米颗粒的表面。由此也证明，本发明的载体材料既可实现对siRNA的包裹也可实现对其的锚定，以此可满足不同的实验需要。

各材料纳米颗粒与siRNA复合物的平均直径及zeta电势见表5。

表5自制的各载体材料纳米颗粒与siRNA复合物的平均直径及zeta电势

实施例5、聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的共聚物对核酸药物包装能力的测定

以下以测定各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的共聚物对siRNA的包装能力为例，研究各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的共聚物对核酸药物的包装情况。

siRNA是一种由长21～23个核苷酸(nt)组成的双链小分子RNA，其磷酸骨架所携带的大量负电荷可与带正电荷的共聚物通过静电相互作用形成稳定的复合物。本发明中我们采用凝胶电泳阻滞实验研究了本发明自制的所有载体材料对siRNA的包装能力。凝胶电泳阻滞实验的原理是：电泳缓冲体系中siRNA分子带负电荷，因此在电泳过程中往正极方向迁移；而与载体材料复合的siRNA由于负电荷被载体中和，同时体积排阻变大，在凝胶中迁移变得困难，甚至无法向正极迁移。由此可以检验载体对siRNA的包装能力，获知在多大载体/siRNA质量比的情况下siRNA能够被载体完全包装起来。实施例中考察了8个不同载体/siRNA质量比(w/w)，分别是0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10。

a、聚羟基脂肪酸酯与阳离子肽的共聚物对siRNA包装能力的测定

本发明中各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子肽形成的共聚物对siRNA的包装能力均是通过凝胶阻滞实验测定，因实验操作类似，下面以此类材料中的材料3、9为例说明具体操作步骤。

首先，精确称取材料3、9溶于超纯水中配制成母液(终浓度为22微克每微升(ug/ul))，使用前按设定的不同质量比稀释成不同浓度，将浓度为2.5μg/μl的siRNA稀释后与不同浓度的载体材料水溶液等体积混合均匀，然后在室温下孵育30分钟，形成一系列不同载体/siRNA质量比(w/w)分别为0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10的复合物溶液。随后取18μl复合物与2μl上样缓冲液(10x Loading buffer含SYBR荧光染料)充分混合后，进行琼脂糖凝胶电泳。电泳条件为：2％琼脂糖凝胶，1倍稀释的Tris硼酸(1×TBE)缓冲液，电压120V，时间为10min。紫外灯下观察电泳情况。SYBR荧光染料特异性地掺入siRNA双链后，随siRNA分子一同在电泳中迁移，并在紫外下发光，使siRNA能够被观察到。实验结果如图5(A)、(B)。

通过以上方法，测定了本发明中所有聚羟基脂肪酸酯与阳离子肽类共聚物载体材料1-9对siRNA的包装能力，由于这类材料的凝胶阻滞实验结果类似，本发明以材料3、9的实验结果图5(A)、(B)，为例说明这类材料对siRNA的包装情况。图5(A)、(B)所示凝胶电泳阻滞实验的结果。图中每一条泳道下方标记的数字表示该泳道中复合物的载体/siRNA质量比，其中0∶1泳道表示没有加入载体材料的裸siRNA。从图中可以发现，裸siRNA的迁移程度最大，随着载体/siRNA质量比的增大，迁移的siRNA逐渐减少。当质量比达到2.0或者4.0时，泳道中正极方向完全没有siRNA的亮色条带出现，siRNA完全留在琼脂糖凝胶的加样孔中。这表明当材料3/siRNA质量比为2.0、材料9/siRNA质量比为4.0时，材料3和材料9就能够与siRNA完全结合，将其完全包装。这两种材料与siRNA完全结合时的质量比不同，是由于两材料中阳离子肽的含量不同引起的。由此说明，共聚物中阳离子化合物的含量会影响共聚物对siRNA的包装能力。

b、聚羟基脂肪酸酯与阳离子脂质的共聚物对siRNA包装能力的测定

本发明中各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子脂质形成的共聚物对siRNA的包装能力均是通过凝胶阻滞实验测定，因实验操作类似，下面仅以此类材料中的材料15为例说明具体操作步骤。

首先，精确称取材料15溶于超纯水中配制成母液(终浓度为22ug/ul)，使用前按设定的不同质量比稀释成不同浓度，将浓度为2.5μg/μl的siRNA稀释后与不同浓度的载体材料水溶液等体积混合均匀，然后在室温下孵育30分钟，形成一系列不同载体/siRNA质量比(w/w)分别为0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10的复合物溶液。随后取18μl复合物与2μl上样缓冲液(Loading buffer含SYBR荧光染料)充分混合后，进行琼脂糖凝胶电泳。电泳条件为：2％琼脂糖凝胶，1×TBE缓冲液，电压120V，时间为10min。紫外灯下观察电泳情况。SYBR荧光染料特异性地掺入siRNA双链后，随siRNA分子一同在电泳中迁移，并在紫外下发光，使siRNA能够被观察到。实验结果如图5(C)。

通过以上方法，测定了本发明中所有聚羟基脂肪酸酯与阳离子脂质类共聚物载体材料10-18对siRNA的包装能力，由于这类材料的凝胶阻滞实验结果类似，本发明仅以材料15的实验结果图5(C)，为例说明这类材料对siRNA的包装情况。图5(C)所示为凝胶电泳阻滞实验的结果。图中每一条泳道下方标记的数字表示该泳道中复合物的载体/siRNA质量比，其中0∶1泳道表示没有加入载体材料的裸siRNA。从图中可以发现，裸siRNA的迁移程度最大，随着载体/siRNA质量比的增大，迁移的siRNA逐渐减少。当载体/siRNA的质量比达到2.0时，泳道中正极方向完全没有siRNA的亮色条带出现，siRNA完全留在琼脂糖凝胶的加样孔中。这表明当载体/siRNA质量比为2.0时，载体材料15即可实现对siRNA的完全包装。

c、聚羟基脂肪酸酯与阳离子聚合物的共聚物对siRNA包装能力的测定

本发明中各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子聚合物形成的共聚物对siRNA的包装能力均是通过凝胶阻滞实验测定，因实验操作类似，下面仅以此类材料中的材料24为例说明具体操作步骤。首先，精确称取材料24溶于超纯水中配制成母液(终浓度为22ug/ul)，使用前按设定的不同质量比稀释成不同浓度，将浓度为2.5μg/μl的siRNA稀释后与不同浓度的载体材料水溶液等体积混合均匀，然后在室温下孵育30分钟，形成一系列不同载体/siRNA质量比(w/w)分别为0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10的复合物溶液。随后取18μl复合物与2μl上样缓冲液(Loading buffer含SYBR荧光染料)充分混合后，进行琼脂糖凝胶电泳。电泳条件为：2％琼脂糖凝胶，1×TBE缓冲液，电压120V，时间为10min。紫外灯下观察电泳情况。SYBR荧光染料特异性地掺入siRNA双链后，随siRNA分子一同在电泳中迁移，并在紫外下发光，使siRNA能够被观察到。实验结果如图5(D)。

通过以上方法，测定了本发明中所有聚羟基脂肪酸酯与阳离子聚合物类共聚物载体材料19-27对siRNA的包装能力，由于这类材料的凝胶阻滞实验结果类似，本发明仅以材料24的实验结果图5(D)，为例说明这类材料对siRNA的包装情况。图5(D)所示为凝胶电泳阻滞实验的结果。图中每一条泳道下方标记的数字表示该泳道中复合物的载体/siRNA质量比，其中0∶1泳道表示没有加入载体材料的裸siRNA。从图中可以发现，裸siRNA的迁移程度最大，随着载体/siRNA质量比的增大，迁移的siRNA逐渐减少。当载体/siRNA的质量比达到0.5时，泳道中正极方向完全没有siRNA的亮色条带出现，siRNA完全留在琼脂糖凝胶的加样孔中。这表明当载体/siRNA质量比为0.5时，载体材料24就能实现对siRNA的完全包装。

通过以上凝胶阻滞实验测定了本发明制备的各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的共聚物载体材料对siRNA的包装能力，结果表明每种材料均能与siRNA完全结合，而且由于每种材料中阳离子化合物含量的不同引起每种材料的结构及其所带正电荷不同，而最终导致每种材料与siRNA完全结合时两者的质量比各异。

实施例6、聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的共聚物对质粒DNA的转染能力测定

转染成功是指质粒DNA能够进入细胞核，然后能被转录成RNA，RNA被翻译，从而表达出质粒DNA中报告基因编码的蛋白，通过测定细胞中相关蛋白的表达水平定量地评估各载体材料的转染效果。在本发明中，我们以各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的共聚物材料为载体，常用蛋白报告基因的表达质粒作为转染的DNA，其中质粒pEGFP-N1报告基因编码的蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)，它能够在多种生物体内表达并发出荧光。通过用高内涵筛选仪拍照统计分析细胞内绿色荧光蛋白的表达水平定量地评估各载体材料的转染效果。

以下以各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子肽类共聚物载体中的材料3和材料9、各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子脂质类共聚物载体中的材料15和各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子脂质类共聚物载体中的材料24在Hela细胞中转染含pEGFP-N1报告基因的质粒DNA为例评价各类材料对DNA的转染能力。因实验操作相同，以材料3为例说明具体操作步骤。

具体实验步骤如下：HeLa细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃及5％二氧化碳条件下培养。转染前，将细胞(6×10⁵细胞/孔)接种于六孔板中，培养24h后用于转染，细胞密度为70％～90％。以商业化的转染试剂lipo2000为对照组。转染前换加2mL新鲜培养基，2μg DNA(1μg pEGFP2N1+1μg pRK5)与材料3(终浓度为22ug/ul)，各用50μL载体/DNA反应缓冲液稀释，将材料3按载体/DNA的质量比为2、4、6、8稀释，将稀释后的材料3逐滴加入DNA溶液中，立即振荡混匀。室温静置30min后，将混合液加到铺有细胞的六孔板中，摇动混匀后于含有5％二氧化碳(CO₂)的37℃培养箱中培养，24h后换加新鲜培养基，转染48h后吸去培养液，经PBS清洗后加入细胞裂解缓冲液(10mmol/L HEPES(pH＝7.9)，1.5mmol/L MgCl₂，10mmol/L KCl，0.5mmol/L PMSF，0.5％NP40)以制备全细胞裂解液，使用高内涵筛选仪在激发光为485nm，发射光为533nm的条件下检测样品的荧光强度。对照组为不含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的全细胞裂解液。样品的荧光蛋白相对表达量根据公式计算：相对荧光蛋白表达量＝(转染组荧光强度-非转染组荧光强度)/非转染组荧光强度。

通过上述实验方法，本发明测定了材料3、9、15、24对质粒DNA的转染能力，并比较了各材料与DNA不同质量比时，材料转染能力的差异。结果如图6。

图6给出了用材料3、9、15、24在Hela细胞中转染质粒DNA后，绿色荧光蛋白(GFP)的表达结果。图中纵坐标是GFP蛋白表达百分率，横坐标是材料的编号。第1栏是lipo2000对照，2-5对应的是材料3与DNA的质量比为2、4、6、8；6-9对应的是材料9与DNA的质量比为2、4、6、8；10-13对应的是材料15与DNA的质量比为2、4、6、8；14-17对应的是材料24与DNA的质量比为2、4、6、8；由图可见，对照组GFP表达水平为99.3％；当DNA与材料9、材料15的质量比为8、与材料24的质量比为6和8时细胞内GFP表达水平相当，均接近80％；而当DNA与材料3质量比为6和8、与材料9的质量比为6时GFP表达水平均接近70％；DNA与材料3、材料24的质量比为4，与材料15的质量比为6时GFP表达水平均接近60％；DNA与材料3、材料24的质量比为2时GFP表达水平均大于40％；DNA与材料9、材料15的质量比为2、4两个比例时，GFP表达水平差异不大。由图5还可看出：材料15、材料24转染的DNA，GFP在细胞内的表达量随着载体材料与DNA的质量比的增加而增加；而材料3与DNA的质量比为6和8时GFP表达量基本相同、材料9与DNA的质量比为2和4、以及材料24与DNA的质量比为6和8时GFP表达量也基本不受比例的影响。

由此说明，各类聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的共聚物，能将质粒DNA成功转进细胞，而各类载体对质粒DNA的转染效率因其分子量，组成比例，结构，所带电荷的不同有差异。而当载体材料相同，其与DNA的比例不同时，转染效果的差异也因材料种类的不同而有不同的趋势。

实施例7、聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的共聚物与siRNA复合物的细胞吞噬

各类载体材料形成的纳米颗粒与siRNA形成复合物后，需通过内吞途径进入细胞，才能发挥作用。本发明通过细胞吞噬实验，测定各类载体材料与siRNA形成复合物的细胞吞噬情况。

a、聚羟基脂肪酸酯与阳离子肽共聚物的纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬

此类载体形成的纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬实验，操作类似，下面以材料9纳米颗粒在人关节滑膜细胞(hFLS)中转染荧光染料Cy3标记的siRNA(Cy3-siRNA)为例说明操作步骤。

具体操作步骤如下：

转染前一天，将hFLS细胞接种至96孔细胞培养板(5,000细胞/孔)中，每孔加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30-50％。转染时将5nm Cy3-siRNA溶解在250ul焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水中，得到浓度为20uM的Cy3-siRNA溶液，将上述制备的材料9纳米颗粒稀释后与上述Cy3-siRNA溶液按载体/siRNA质量比4.0混合，制备材料9纳米颗粒与Cy3-siRNA复合物。将上述材料9纳米颗粒与Cy3-siRNA复合物加入含有细胞及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混合均匀。将培养板于37℃的二氧化碳(CO₂)培养箱中培养24h后，用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核染色，最后用4％甲醛-PBS溶液室温下固定细胞30min，然后用高内涵筛选仪拍照观察细胞吞噬纳米颗粒的情况。结果见图7。

由于此类纳米颗粒的细胞吞噬结果相差不大，所以以材料9纳米颗粒的实验为例说明细胞吞噬结果。

图7给出了hFLS细胞吞噬材料9纳米颗粒的高内涵筛选仪观察的结果。其中，细胞内蓝色的部分是细胞核，细胞内红色的部分是Cy3标记的siRNA。通过两种颜色的叠加结果可以看出，纳米颗粒与Cy3-siRNA复合物已经被细胞吞噬，而且没有进入细胞核，纳米颗粒已经与siRNA分离，siRNA均匀分布在细胞核的周围即胞质部分。

图7中，图7(A)为在346nm激发光下高内涵筛选仪的照片，显示的是细胞核；图7(B)为在488nm激发光下高内涵筛选仪的照片，显示的是Cy3标记的siRNA；图6(C)为图7(A)、图7(B)的叠加结果，图7(D)为对照组。由图可以看出纳米颗粒与siRNA在细胞内发生了分离，而且没有进入细胞核。表明材料9纳米颗粒能够有效的将siRNA运输到细胞内，并能与siRNA分离，使siRNA发挥基因沉默的作用。

b、聚羟基脂肪酸酯与阳离子脂质共聚物的纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬

此类载体形成的纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬实验，操作类似，下面以材料15纳米颗粒在人关节滑膜细胞(hFLS)中转染荧光染料Cy3标记的siRNA为例说明操作步骤。

具体操作步骤如下：

转染前一天，将hFLS细胞接种至96孔细胞培养板(5,000细胞/孔)中，每孔加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30-50％。转染时将5nm Cy3-siRNA溶解在250ul DEPC处理过的水中，得到浓度为20uM的Cy3-siRNA溶液，将上述制备的材料15纳米颗粒稀释后与上述Cy3-siRNA溶液按载体/siRNA质量比2.0混合，制备材料15纳米颗粒与Cy3-siRNA复合物。将上述材料15纳米颗粒与Cy3-siRNA复合物加入含有细胞及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混合。将培养板于37℃的CO₂培养箱中培养24h后，用DAPI对细胞核染色，最后用4％甲醛-PBS溶液室温下固定细胞30min，然后用高内涵筛选仪拍照观察细胞吞噬纳米颗粒的情况。结果见图8。

由于此类纳米颗粒的细胞吞噬结果相差不大，所以以材料15纳米颗粒的实验为例说明细胞吞噬结果。

图8中，图8(A)为在346nm激发光下高内涵筛选仪的照片，显示的是细胞核；图8(B)为在488nm激发光下高内涵筛选仪的照片，显示的是Cy3标记的siRNA；图8(C)为图8(A)、图8(B)的叠加结果，图8(D)对照组。

图8显示的结果与图7显示的材料9纳米颗粒的细胞吞噬结果相似。

c、聚羟基脂肪酸酯与阳离子聚合物共聚物的纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬

此类载体形成的纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬实验，操作类似，下面以材料24纳米颗粒在人关节滑膜细胞(hFLS)中转染荧光染料Cy3标记的siRNA为例说明操作步骤。

具体操作步骤如下：

转染前一天，将hFLS细胞接种至96孔细胞培养板(5,000细胞/孔)中，每孔加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30-50％。转染时将5nm Cy3-siRNA溶解在250ul DEPC处理过的水中，得到浓度为20uM的Cy3-siRNA溶液，将上述制备的材料24纳米颗粒稀释后与上述Cy3-siRNA溶液按载体/siRNA质量比0.5混合，制备材料24纳米颗粒与Cy3-siRNA复合物。将上述材料24纳米颗粒与Cy3-siRNA复合物加入含有细胞及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混合。将培养板于37℃的CO₂培养箱中培养24h后，用DAPI对细胞核染色，最后用4％甲醛-PBS溶液室温下固定细胞30min，用高内涵筛选仪拍照观察细胞吞噬纳米颗粒的情况，结果见图9。

由于此类纳米颗粒的细胞吞噬结果相差不大，所以仅以材料24纳米颗粒的实验为例说明细胞吞噬结果。

图9中，图9(A)为在346nm激发光下高内涵筛选仪的照片，显示的是细胞核；图9(B)为在488nm激发光下高内涵筛选仪的照片，显示的是Cy3标记的siRNA；图9(C)为图9(A)、图9(B)的叠加结果，图9(D)为对照组。

图9显示的结果比图7、8显示的材料9、材料15纳米颗粒的细胞吞噬结果更好，这与材料24纳米颗粒与siRNA复合物所带的正电荷较前两者多有关，由此说明纳米颗粒与siRNA复合物所带的电荷量会影响siRNA的细胞吞噬结果。

实施例8、聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的共聚物对siRNA的转染效果及沉默效果测定

通过上述纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬实验，表明各类材料能将siRNA转入细胞，并与siRNA分离，但转入的siRNA能否发挥沉默作用，本发明通过下面的相关实施例进行论证。

在本发明中，我们选用了两种能稳定表达萤火虫荧光素酶(Luciferase)的细胞人肺腺癌细胞(A549-luc细胞)和人乳腺癌细胞(MCF-7-luc细胞)，测定了各载体材料对萤火虫荧光素酶siRNA(Luciferase siRNA)的转染效果和沉默效果的影响。一分子荧光素酶可以在一定条件下与一分子专一性底物发生反应，放出一个荧光光子。因此，我们可以通过检测转染细胞中荧光素酶的活性，也就是荧光素酶与底物反应后释放出的光子数量来定量评估运输载体的转染效果。

a、聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物共聚物载体的体外转染细胞实验条件优化

由于制备转染复合物的缓冲液种类、缓冲盐浓度、PH值、转染时间都会影响最终的转染效果，而且不同材料因其种类和组成的不同，其要求的最佳转染条件也不一样，所以在测定各载体材料对Luciferase siRNA的转染效果前，本发明在A549-luc细胞中对各类载体材料的细胞转染条件进行了优化。由于聚羟基脂肪酸酯与阳离子肽共聚物载体、聚羟基脂肪酸酯与阳离子聚合物共聚物载体转染条件相似，所以以聚羟基脂肪酸酯与阳离子肽类共聚物载体材料3、聚羟基脂肪酸酯与阳离子脂质共聚物载体12为例，说明操作步骤。

具体操作步骤如下(材料3)：

转染前24h于96孔细胞培养板中接种A549-luc细胞(5,000细胞/孔)，按材料3/siRNA质量比2.0在50mM HEPES(PH＝6.5)、20mM HEPES(PH＝6.5)、20mM HEPES(PH＝7.4)、HBS(20mM HEPES+150mM NaCl PH＝7.4)、HBG(20mM HEPES+5％gulcose PH＝7.4)、H₂O缓冲液中制备材料3和siRNA的复合物溶液(20ul)并于室温下静置20min，转染时用80ul RPMI 1640新鲜培养基(含10％FBS)替换原有的培养基，然后将制备的复合物溶液加入96孔板。分别转染6h和24h后，用新鲜培养基换掉转染溶液，48h后加入荧光素酶检测试剂，用荧光照度计Veritas Microplate Luminometer检测荧光素酶的相对表达量。每个样品3个复孔，以lipo2000转染Luciferase siRNA为阳性对照，未加Luciferase siRNA的载体材料为对照1。实验结果见图10(A)。

具体操作步骤如下(材料12)：

转染前24h于96孔细胞培养板中接种A549-luc细胞(5,000细胞/孔)，按材料12/siRNA质量比5.0在50mM HEPES(PH＝6.5)、20mM HEPES(PH＝6.5)、20mM HEPES(PH＝7.4)、HBS(20mM HEPES+150mM NaCl PH＝7.4)、HBG(20mM HEPES+5％gulcose PH＝7.4)、H₂O缓冲液中制备材料12和Luciferase siRNA的复合物溶液(20ul)并于室温下静置20min，转染时用80ulRPMI 1640新鲜培养基(含10％FBS)替换原有的培养基，然后将制备的复合物溶液加入96孔板。分别转染6h和24h后，用新鲜培养基换掉转染溶液，48h后加入荧光素酶检测试剂，用Veritas Microplate Luminometer检测荧光素酶的相对表达量。每个样品3个复孔，以lipo2000转染Luciferase siRNA为阳性对照，未加Luciferase siRNA的载体材料为对照1。实验结果见图10(B)。

图10(A)和(B)分别为材料3和材料12在A549-luc细胞中的转染实验条件优化结果，图中纵坐标表示荧光素酶的相对表达量，横坐标表示不同缓冲条件及转染时间。由图10(A)和图10(B)可知，这两种载体材料在不同的转染缓冲液浓度、PH值、缓冲液种类、转染时间下，其对Luciferase siRNA的转染效果和沉默效果都不同，而且随着转染时间的延长，转染效果也明显增加。此外，由于这两种材料的种类和组成不同，他们的最佳转染条件也不一样，材料3在50mM HEPES(PH＝6.5)条件下，转染24h能使Luciferase siRNA的沉默效果达到60％，而材料12在HBG(20mM HEPES+5％gulcose PH＝7.4)条件下，转染24h能使Luciferase siRNA的沉默效果达到80％。

b、体外转染细胞实验以及荧光素酶活性检测

结合上述各类载体材料的最佳细胞转染条件，本发明用自制的载体材料1-27将Luciferase siRNA，转入稳定表达萤火虫荧光素酶基因的不同细胞株人肺腺癌细胞(A549-luc)细胞和人乳腺癌细胞(MCF-7-luc)细胞(本实验室自行筛选得到)，转染48小时后，检测luciferase荧光的强弱，从而评估不同载体材料对Luciferase siRNA的转染效果和沉默效果。由于聚羟基脂肪酸酯与阳离子肽共聚物载体、聚羟基脂肪酸酯与阳离子聚合物共聚物载体的体外转染细胞实验以及荧光素酶活性检测实验条件和操作类似，所以以聚羟基脂肪酸酯与阳离子肽类共聚物载体材料3、聚羟基脂肪酸酯与阳离子脂质共聚物载体12为例，说明各类载体材料细胞转染实验的操作步骤。

1)体外转染A549-luc细胞实验以及荧光素酶活性检测

具体操作步骤如下(以材料3为例)：

转染前24h于96孔细胞培养板中接种A549-luc细胞(5,000细胞/孔)，按材料3/siRNA质量比2.0在50mM HEPES(PH＝6.5)缓冲液中制备材料3和Luciferase siRNA的复合物溶液(20ul)并于室温下静置20min，转染时用80ul RPMI 1640新鲜培养基(含10％FBS)替换原有的培养基，然后将制备的复合物溶液加入96孔板。转染24h后，用新鲜培养基换掉转染溶液，再过24h后加入荧光素酶检测试剂，用Veritas Microplate Luminometer检测荧光素酶的相对表达量。每个样品3个复孔，以lipo 2000转染Luciferase siRNA为阳性对照，未加Luciferase siRNA的载体材料为对照1。实验结果见图10(C)。

具体操作步骤如下(以材料12为例)：

转染前24h于96孔细胞培养板中接种A549-luc细胞(5,000细胞/孔)，按材料12/siRNA质量比5.0比在HBG(20mM HEPES+5％gulcose PH＝7.4)缓冲液中制备材料12和LuciferasesiRNA的复合物溶液(20ul)并于室温下静置20min，转染时用80ul RPMI 1640新鲜培养基(含10％FBS)替换原有的培养基，然后将制备的复合物溶液加入96孔板。转染24h后，用新鲜培养基换掉转染溶液，再过24h后加入荧光素酶检测试剂，用Veritas Microplate Luminometer检测荧光素酶的相对表达量。每个样品3个复孔，以lipo 2000转染Luciferase siRNA为阳性对照，未加Luciferase siRNA的载体材料为对照1。实验结果见图10(C)。

2)体外转染MCF-7-luc细胞实验以及荧光素酶活性检测

具体操作步骤如下(以材料3为例)：

转染前24h于96孔细胞培养板中接种MCF-7-luc细胞(6,000细胞/孔)，按材料3/siRNA质量比2.0在50mM HEPES(PH＝6.5)缓冲液中制备材料3和Luciferase siRNA的复合物溶液(20ul)并于室温下静置20min，转染时用80ul RPMI 1640新鲜培养基(含10％FBS)替换原有的培养基，然后将制备的复合物溶液加入96孔板。转染24h后，用新鲜培养基换掉转染溶液，再过24h后加入荧光素酶检测试剂，用Veritas Microplate Luminometer检测荧光素酶的相对表达量。每个样品3个复孔，以lipo 2000转染Luciferase siRNA为阳性对照，未加Luciferase siRNA的载体材料为对照1。实验结果见图10(D)。

具体操作步骤如下(以材料12为例)：

转染前24h于96孔细胞培养板中接种MCF-7-luc细胞(6,000细胞/孔)，按材料12/siRNA质量比5.0在HBG(20mM HEPES+5％gulcose PH＝7.4)缓冲液中制备材料12和LuciferasesiRNA的复合物溶液(20ul)并于室温下静置20min，转染时用80ul RPMI 1640新鲜培养基(含10％FBS)替换原有的培养基，然后将制备的复合物溶液加入96孔板。转染24h后，用新鲜培养基换掉转染溶液，再过24h后加入荧光素酶检测试剂，用Veritas Microplate Luminometer检测荧光素酶的相对表达量。每个样品3个复孔，以lipo 2000转染Luciferase siRNA为阳性对照，PEI转染Luciferase siRNA为对照1，未加Luciferase siRNA的载体材料为对照1。实验结果见图10(D)。

图10中，图10(C)和图10(D)分别为材料1-27在A549-luc和MCF-7-luc细胞中的转染效果图，其中纵坐标表示荧光素酶的相对表达量，横坐标的数字1-27表示材料编号。由图10(C)和图10(D)可见，在A549-luc和MCF-7-luc细胞中，不同材料转染LuciferasesiRNA后细胞内荧光素酶的表达情况都因材料的种类不同而有所差异，有的材料转染Luciferase siRNA后在两种细胞中都能显著降低荧光素酶的表达，Luciferase siRNA的沉默效果在70％左右，如材料9、20、22；材料24在两种细胞中，都使Luciferase siRNA的沉默效果达到80％；有的材料在两种细胞中转染Luciferase siRNA后，Luciferase siRNA的沉默效果在60％左右，如材料3、12、14、16、18；有的材料在两种细胞中转染Luciferase siRNA后，Luciferase siRNA的沉默效果在40％-50％，如材料2、19、21、22；而有的材料转染Luciferase siRNA后在两种细胞中对荧光素酶的表达量影响都不明显，如：材料1、4、5、7、17；而有的材料如材料6、8、10、11、13、15、23、25、26、28转染Luciferase siRNA后在两种细胞中，对荧光素酶的表达量基本没影响，由此说明这些材料对Luciferase siRNA基本无转染效果。

从10(C)、图10(D)对比可知，各种载体材料在两种细胞中对Luciferase siRNA的转染效果及沉默效果的影响基本相同，无细胞特异性差异。

以上结果表明，不同载体材料因其种类和组成不同，导致其对Luciferase siRNA的转染效果及沉默效果影响不同，有的材料能显著增加Luciferase siRNA的沉默效果，大大降低荧光素酶的表达；有的材料对Luciferase siRNA的沉默效果影响不大，而有的材料对LuciferasesiRNA基本无转染效果。此外，各载体材料在两种细胞系中对Luciferase siRNA的转染效果及沉默效果的影响趋势基本相同，由此说明：各载体材料对Luciferase siRNA的转染效果及沉默效果的影响几乎没有细胞特异性，不会因细胞种类的不同而有所差异。

实施例9、大鼠模型中测定载体材料对核酸药物控制释放的影响

通过以上实施例证明，本发明自制的载体材料在细胞水平上，对核酸药物的运输效果较好，实施例中优选的核酸药物是DNA和siRNA。以下本发明将通过动物实验测定载体材料对核酸药物在治疗过程中的缓慢释放的影响。优选的实施方案中，选用本实验室自制的SD大鼠关节炎模型为动物模型，优选的载体材料为实施例3中的材料24制备的纳米颗粒，优选的核酸药物为荧光标记的Cy3-siRNA。

以材料24的纳米颗粒为例，用本实验室自制的SD大鼠关节炎模型为动物模型。操作如下：

雌性250g SD大鼠麻药麻醉后，以1ml注射器在膝关节部位注射用载体材料24纳米颗粒包裹的荧光标记的siRNA(50nm/ml 100ul)于膝关节腔内，并于转染后24h和96h分别取整个膝关节浸泡于福尔马林溶液中固定。固定后的切片以甲醇洗脱15min，用1∶3000的DAPI染色5min，再以甲醇洗脱15min一次，随后以PBS洗脱3次，每次10min，甘油封片备用。激光共聚焦成像，观察不同时间段关节腔内的荧光分布情况。以lipo转染的Cy3-siRNA为阳性对照，无任何试剂包裹的Cy3-siRNA为对照1。实验结果见图11。

图11中，图11(A)和(B)分别为转染对照1即裸露的Cy3-siRNA 96h后膝关节不同部位的荧光分布情况；图11(C)和(D)分别为阳性对照组即lipo转染Cy3-siRNA 96h后膝关节不同部位的荧光分布情况；图11(E)和(F)分别为材料24转染Cy3-siRNA 24h后膝关节不同部位的荧光分布情况；图11(G)和(H)分别为材料24转染Cy3-siRNA 96h后膝关节不同部位的荧光分布情况；其中图1-1、2-1、3-1、4-1、5-1、6-1、7-1、8-1为在488nm激发光下激光共聚焦的照片，显示的是荧光标记的Cy3-siRNA；图1-2、2-2、3-2、4-2、5-2、6-2、7-2、8-2为在346nm激发光下激光共聚焦的照片，显示的是细胞核；图1-3、2-3、3-3、4-3、5-3、6-3、7-3、8-3分别为图1-1、2-1、3-1、4-1、5-1、6-1、7-1、8-1和对应的图1-2、2-2、3-2、4-2、5-2、6-2、7-2、8-2的叠加结果。

由图11(A)和(B)可知，局部注射裸露的Cy3-siRNA 96h后，关节腔内几乎无荧光信号，而图11(C)和(D)表明lipo转染Cy3-siRNA 96h后，滑膜下的关节软骨层、近髓质区域有荧光信号，但朝向关节腔的滑膜层及网状结缔组织无明显的荧光信号，由此说明，局部注射lipo包裹的Cy3-siRNA后，该包裹颗粒迅速向关节腔内部骨组织扩散，无缓慢释放Cy3-siRNA的过程。由图11(E)和(F)可知，局部注射24h后，朝向关节腔的滑膜层及网状结缔组织有明显的荧光信号，但滑膜下的关节软骨层基本无红色荧光。而图11(G)和(H)说明，局部注射96h后，表面滑膜层荧光较24h时略减弱，关节软骨层、近髓质区域均出现明显核染，显示了药物由表面向内部骨组织的扩散。由此说明，载体24材料将Cy3-siRNA转进了关节表面，而且随着时间的延长，载体材料将Cy3-siRNA逐步释放出来，使之从关节表面滑膜层逐步向内部骨组织扩散。由此证明，本发明的载体材料可实现对核酸药物的缓慢释放，从而在疾病治疗时可减少给药次数，为病患减轻多次给药所带来的痛苦。

尽管对本发明的优选实施方式已经进行描述，但是本领域技术人员可以理解的是本发明不应该仅限于所述的优选实施方式，在所附权利要求书所限定的本分明范围内，所作的各种改变和修改，都在本发明专利申请的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种生物可降解的聚合物，其特征是，它为聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物共聚形成的聚合物，其结构通式I为：[A；B/L]，其中：A来源于聚羟基脂肪酸酯、B来源于阳离子化合物、L为连接聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的连接体部分；所述阳离子化合物为阳离子肽、阳离子酯质、阳离子聚合物；

所述聚羟基脂肪酸酯的结构通式如下：

其中n＝1，2，3，或4；m表示聚合度；R是饱和或不饱和、直链或含侧链的烷基。

2.根据权利要求1所述的生物可降解的聚合物，其特征是，所述聚羟基脂肪酸酯是聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯、聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯、聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯。

3.根据权利要求2所述的生物可降解的聚合物，其特征是，所述聚羟基脂肪酸酯是聚羟基丁酸酯。

4.根据权利要求1所述的生物可降解的聚合物，其特征是，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量范围是200道尔顿至600,000道尔顿。

5.根据权利要求1所述的生物可降解的聚合物，其特征是，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量范围是200道尔顿至5000道尔顿。

6.根据权利要求1所述的生物可降解的聚合物，其特征是，所述阳离子肽为赖氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸、聚左旋赖氨酸、或鱼精蛋白；所述阳离子脂质为二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇二油酰卵磷脂、或胺乙基胺基甲酰基胆固醇；所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、精胺、亚精胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、壳聚糖、聚丙烯亚胺树状分子、或聚甲基丙烯酸N，N-二甲氨基乙酯树状分子。

7.根据权利要求1所述的生物可降解的聚合物，其特征是，所述阳离子肽是聚左旋赖氨酸；所述阳离子脂质是胺乙基胺基甲酰基胆固醇；所述阳离子聚合物是聚乙烯亚胺。

8.根据权利要求1所述的生物可降解的聚合物，其特征是，所述连接体部分为酰氨基连接体部分、氨基甲酸酯连接体部分、脲连接体部分、醚连接体部分、琥珀酰氨基连接体部分、氨基酯连接体部分、或酯连接体部分。

9.一种权利要求1-8任一项所述生物可降解的聚合物的合成方法，其特征是，一端或两端为羟基、羧基的聚羟基脂肪酸酯在催化剂和连接剂的作用下，与阳离子化合物反应；所述连 接剂为能活化氨基、羟基或羧基的试剂或丙烯酸酯单体、或甲基丙烯酸酯单体；或一端或两端为丙烯基的聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物通过迈克尔加成反应，得到生物可降解的聚合物；

上述能活化氨基、羟基或羧基的试剂为六亚甲基二异氰酸酯、羰基二咪唑、异佛尔酮二异氰酸酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、或N，N’-二环己基碳二亚胺；

上述阳离子化合物为阳离子肽、阳离子酯质、或阳离子聚合物。

10.根据权利要求9所述的合成方法，其特征是，所述聚羟基脂肪酸酯与阳离子化合物的质量比是1-30。

11.根据权利要求9所述的合成方法，其特征是，所述丙烯酸酯单体为丙烯酰氯。

12.根据权利要求9所述的合成方法，其特征是，一端或两端为羟基的聚羟基脂肪酸酯，以辛酸亚锡为催化剂，六亚甲基二异氰酸酯、羰基二咪唑、或异佛尔酮二异氰酸酯为连接剂，与阳离子化合物上的氨基聚合，得到生物可降解的聚合物。

13.根据权利要求9所述的合成方法，其特征是，一端或两端为羧基的聚羟基脂肪酸酯，以4-二甲氨基吡啶为催化剂，N，N’-二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺为连接剂，与阳离子化合物的氨基缩合，得到生物可降解的聚合物。

14.一种核酸药物运输载体，其特征是，其是活性成分为权利要求1-8任一项所述生物可降解的聚合物的带正电荷的纳米颗粒，所述纳米颗粒的粒径为30-600nm，其zeta电势为2-60mV。

15.根据权利要求14所述核酸药物运输载体，其特征是，所述生物可降解的聚合物为聚羟基丁酸酯与聚乙烯亚胺按质量比为1∶6的反应得到。 

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