CN102786695B - 两亲性三嵌段聚合物及其制备方法和siRNA药物载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种两亲性三嵌段聚合物及其制备方法，它为聚羟基脂肪酸酯、亲水性聚合物及阳离子化合物共聚形成的聚合物，其结构通式I为：[mA-B-C]或[mB-A-C]，其中：A来源于聚羟基脂肪酸酯，mA表示聚羟基脂肪酸酯的单甲醚；B来源于亲水性聚合物，mB表示亲水性聚合物的单甲醚；C来源于阳离子化合物；所述阳离子化合物为阳离子肽、阳离子酯质、阳离子聚合物。本发明还公开了一种siRNA药物运输载体，其是活性成分为上述两亲性三嵌段聚合物的带正电荷的纳米颗粒，所述纳米颗粒的粒径在50-400nm，其zeta电势为5-60mV。本发明所述的聚合物具有生物相容；相对疏水性；其形成的纳米颗粒具有良好的稳定性，制备方法简单，可重复性高；原料廉价，节约成本等优点。

Description

两亲性三嵌段聚合物及其制备方法和siRNA药物载体

技术领域

本发明涉及一种基于聚羟基脂肪酸酯的两亲性三嵌段聚合物及其制备方法和siRNA药物载体，属于生命医学领域。

背景技术

RNA干扰是一种由21-23个核苷酸组成的双链小分子干扰RNA（siRNA）介导的、序列特异性的、转录后基因沉默技术。由于RNA干扰技术能高效、特异的沉默疾病相关基因，使其已逐渐被发展成为新型的治疗遗传性或获得性疾病包括病毒感染和癌症等的基因治疗手段，到目前为止已经开展了大量利用siRNA进行疾病治疗的动物实验和临床实验。这其中主要包括针对乙型和丙型肝炎病毒、艾滋病毒等的病毒实验，与神经退化性疾病相关的研究以及以表达端粒酶或表皮生长因子等基因为靶基因的癌症治疗。其中以siRNA治疗由视网膜退化引起的老年黄斑病变研究已经进入临床三期试验阶段。虽然siRNA在体外应用研究中及细胞水平上显示出良好的沉默效果，但由于其巨大的分子量及自身所携带的大量负电荷使其不能自主穿越细胞膜进入细胞发挥作用，在系统运输时易引起非特异性的脱靶效应和免疫应答，同时还面临被核酸酶降解等障碍，导致在以治疗人类疾病为目的的siRNA体内系统运输面临着巨大的挑战。所以siRNA的转染问题成为限制其应用的主要瓶颈。如何增强siRNA穿透细胞膜的能力，提高其在体内的稳定性和靶向性等都是siRNA药物载体急需解决的问题。因此设计和合成安全有效的siRNA药物载体已成为目前siRNA药物研发的重要方向。

病毒载体因潜在的安全性问题及高成本等缺点使其广泛的临床应用受到极大的限制。而非病毒的阳离子脂质和类脂及阳离子聚合物载体因安全性高、副作用小、生产成本低等特点越来越受到人们的青睐。已报道的阳离子脂质体和类脂，如稳定的核酸脂肪微滴（SNALP）、Oligofectamine、脂醇、i-FECT和脂醇98N12-5(1)，其对siRNA的运输效果已得到证实；阳离子聚合物能通过静电相互作用与siRNA分子磷酸基团所带的负电荷结合形成聚合电解质络合物，该络合物通过刺激非特异性的细胞内吞将siRNA运输进细胞，然后经“质子海绵”效应介导的内涵体逃逸将siRNA分子从运输载体上解离，从而实现对siRNA的运输。传统方法采用水溶性的阳离子聚合物与siRNA分子互混得到两者的复合物或纳米颗粒，虽然可以实现对siRNA的运输目的，但该方法重复性差，而且工艺难以放大，而两亲性的阳离子聚合物能自组装成稳定的纳米颗粒，该纳米颗粒具有实体瘤的高通透性和滞留效应（EPR效应，Enhancedpermeability and retention），可促进siRNA药物在肿瘤组织的聚集，并能有效的被肿瘤细胞吸收。目前用于siRNA运输的阳离子聚合物材料包括聚乙烯亚胺（PEI）、聚左旋赖氨酸（PLL）、树状分子，壳聚糖等，他们与不同的疏水性材料结合后，能自组装形成不同结构的纳米颗粒，既可实现对siRNA的包裹，也可将siRNA锚定在其表面；对这些纳米颗粒进行适当的化学修饰或配体修饰还可增强siRNA在体内的稳定性和靶向性。尽管针对siRNA药物运输载体的研究取得了一定的突破和发展，但要使siRNA药物成功用于治疗人类疾病，仍有一些关键性问题需要解决，如：毒性、特异性、靶向性、免疫刺激、转染效率低等。由此，生物相容性好、能快速去质子化的可生物降解的两亲性的阳离子高分子聚合物载体因能有效结合和保护siRNA分子，增强细胞对siRNA分子的吸收，提高其稳定性和靶向性，并能使siRNA分子有效释放，实现治疗目的，而使得这类载体在siRNA药物给药中具有更好的优势和应用前景。

聚羟基脂肪酸酯（PHA）是一种天然的高分子生物材料，分子量多为50,000到20,000,000道尔顿，其中的脂肪酸可以是丁酸、戊酸或己酸等；它是由原核生物在碳、氮营养失衡的情况下合成，并作为碳源和能源贮存的一类热塑性聚酯，是一类β-羟基脂肪酸族聚酯的总称。通过改变菌种、给料、发酵过程可以很方便地改变PHA的组成，PHA的结构变化几乎是无限的。另外，不同的单体还可以形成不同的共聚物，这些共聚物包括二元共聚物，如：聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯（P3/4HB）、聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚酯（PHBHHx），或者三元共聚物如：聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸-3-羟基己酸共聚酯（PHBVHHx。同时单体在共聚物中比例的变化也带来共聚物性能的许多变化。其中PHA的亲疏水性就与其组分及各组分所占比例有关。PHA具有良好的生物相容性和生物可降解性，可作为生物医用材料和生物可降解包装材料，因此已成为近年来生物材料领域最为活跃的研究热点。在药物缓释体系研究中也因其独有的性能而备受青睐，而且该类材料已经被FDA批准用作手术的缝合线。目前已经证明商品化生产的PHA产品都具有生物相容性和生物可降解性。

理想的非病毒载体应该是具有高效、低毒的聚合物。本发明将这种具有良好的生物相容性和生物可降解性的疏水性聚羟基脂肪酸酯与亲水性聚合物和阳离子化合物聚合，制备成可自组装的两亲性聚合物作为siRNA药物的运输载体，结合三者的优势，希望在实现siRNA药物有效运输的同时，可降低载体本身的毒副作用，并且选用这种可生物降解的材料作为载体，还可实现siRNA药物的缓慢释放，减少给药剂量，从而达到长效治疗的目的。

发明内容：

本发明的目的之一在于提供一种基于聚羟基脂肪酸酯的两亲性三嵌段聚合物。

实现上述目的的技术方案如下：

一种两亲性三嵌段聚合物，其为聚羟基脂肪酸酯、亲水性聚合物及阳离子化合物共聚形成的聚合物，其结构通式Ⅰ为：[mA-B-C]或[mB-A-C]；其中：A来源于聚羟基脂肪酸酯，mA表示聚羟基脂肪酸酯的单甲醚；B来源于亲水性聚合物，mB表示亲水性聚合物的单甲醚；C来源于阳离子化合物；所述阳离子化合物为阳离子肽、阳离子酯质、阳离子聚合物或其组合。

本发明的另一目的是提供一种转染效率高、靶向性强、低毒、安全性好的siRNA药物运输载体。

实现上述目的的技术方案如下：

一种siRNA药物的运输载体，其是活性成分为上述两亲性三嵌段聚合物的带正电荷的纳米颗粒，所述纳米颗粒的粒径可为50-400nm，其表面电荷可为5-60mV。

在其中一些实施例中，“A”或式Ⅰ的聚羟基脂肪酸酯（PHA）的结构通式如下：

其中n=1,2,3,或4；当n=1，即为PHB；m表示聚合度，决定分子量的大小，R为侧链，是C₁-C₇的烷基，或由苯氧基、卤素、苯基或取代的苯基取代的C₁-C₇烷基，或是C₂-C₅的烯基。

进一步地，在其中一些实施例中，聚羟基脂肪酸酯（PHA）包括：聚羟基丁酸酯（PHB）、聚羟基戊酸酯（PHV）、聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯（P3/4HB）、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯（PHBV）、聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯（PHBHHx）。实施方案中，式Ⅰ化合物中的聚羟基脂肪酸酯可以是以上的任一类，不同分子量、不同组成的聚酯。最优选的是聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯（P3/4HB）。

上述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量(Mn)范围可以是200-2,000,000道尔顿（Da），优选是500-10,000道尔顿，更优选是500-4,000道尔顿。

“B”或式Ⅰ化合物中的亲水性聚合物可优选数均分子量（Mn）为100-10,000的非离子聚合物。所述亲水性聚合物的例子包括但不限于非离子亲水聚合物，例如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚恶唑啉。优选的式Ⅰ化合物中的亲水性聚合物是聚乙二醇。所述聚乙二醇的数均分子量为400-8,000道尔顿。

“C”或式Ⅰ化合物中的阳离子化合物包括阳离子肽、阳离子酯质、阳离子聚合物或其组合，但不限于此。所述阳离子肽包括但不限于赖氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸(KALA)、聚左旋赖氨酸（PLL）或鱼精蛋白；所述阳离子脂质包括但不限于二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）、胆固醇二油酰卵磷脂或胺乙基胺基甲酰基胆固醇（CAEC）；所述阳离子聚合物包括但不限于聚乙烯亚胺（PEI）、精胺、亚精胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、壳聚糖等。

更优选的式Ⅰ化合物中的阳离子肽是聚左旋赖氨酸（PLL）；优选的式Ⅰ的阳离子酯质是胺乙基胺基甲酰基胆固醇（CAEC）；优选的式Ⅰ的阳离子聚合物是聚乙烯亚胺（PEI），且更优选式Ⅰ的阳离子聚合物是线性的聚乙烯亚胺（lPEI），其重均分子量（Mw）范围是600-22,000道尔顿。式Ⅰ的阳离子化合物可以任选具有相同重复单元或不同重复单元组合的阳离子化合物。

式Ⅰ化合物的分子量范围可以是800-1,000,000道尔顿，优选是800-200,000道尔顿，更优选是800-40,000道尔顿。

本发明的另一目的是提供了上述两亲性三嵌段聚合物的合成方法。

实现上述目的的技术方案具体如下.

一种上述两亲性三嵌段聚合物的合成方法，包括以下步骤：

端丙烯基聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇大分子引发剂（mA-B-acrylated）或端丙烯基聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯大分子引发剂（mB-A-acrylated），通过迈克尔加成与阳离子化合物的氨基反应得到两亲性三嵌段共聚物。

在其中一些实施例中，上述端丙烯基聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇大分子引发剂（mA-B-acrylated）是由端羟基聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇前体（mA-B-OH）在活化剂的作用下，将其末端羟基转变为丙烯基得到。所述活化剂为能活化羟基的试剂或丙烯酸酯单体、或甲基丙烯酸酯单体。

在其中一些实施例中，上述端丙烯基聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯大分子引发剂（mB-A-acrylated）是由端羟基聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯前体（mB-A-OH）在活化剂的作用下，将其末端羟基转变为丙烯基得到。所述活化剂为能活化羟基的试剂、丙烯酸酯单体或甲基丙烯酸酯单体。

在其中一些实施例中，上述端羟基聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇前体（mA-B-OH）是由端羟基聚羟基脂肪酸酯单甲醚（mA-OH）在催化剂和连接剂的作用下，与聚乙二醇（B-diol）反应得到。

在其中一些实施例中，上述端羟基聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯前体（mB-A-OH）是由端羟基聚乙二醇单甲醚（mB-OH）在催化剂和连接剂的作用下，与聚羟基脂肪酸酯的二醇（A-diol）反应得到。所述连接剂为能活化羟基的试剂。

在其中一些实施例中，上述端羟基聚羟基脂肪酸酯单甲醚（mA-OH）或聚羟基脂肪酸酯的二醇（A-diol）是在对甲苯磺酸（PTSA）催化下，与甲醇或二醇通过酯交换反应制备得到，其中二醇可以是乙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、1,6-己二醇。优选是1,4-丁二醇。

在一些优选的实施方案中，连接剂是能活化羟基的试剂如：六亚甲基二异氰酸酯（HDI）、羰基二咪唑（CDI）、异佛尔酮二异氰酸酯（IPDI）等，活化剂是丙烯酸酯单体、甲基丙烯酸酯单体，包含但不限于丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酸酯、丙烯酰氯，优选的是丙烯酰氯。

在一优选的实施方案中式Ⅰ化合物是通过端羟基聚羟基脂肪酸酯单甲醚(mA-OH)，以辛酸亚锡（Sn(Oct)₂）为催化剂，HDI/CDI/IPDI为连接剂，与聚乙二醇(B-diol)反应后得到前体mA-B-OH；然后在三乙胺（Et₃N）催化下，用丙烯酰氯做活化剂将前体mA-B-OH的端羟基转变为烯丙基，得到活化后的前体mA-B-acrylated，然后该前体通过迈克尔加成与阳离子化合物的氨基反应得到；

在另一优选的实施方案中式Ⅰ化合物是通过聚乙二醇单甲醚(mB-OH)，以辛酸亚锡（Sn(Oct)₂）为催化剂，HDI/CDI/IPDI为连接剂，与聚羟基脂肪酸酯的二醇（A-diol）反应后，得到前体mB-A-OH；然后在三乙胺催化下，用丙烯酰氯做活化剂将前体mB-A-OH的端羟基转变为烯丙基，得到活化后的前体mB-A-acrylated，然后该前体通过迈克尔加成与阳离子化合物的氨基反应得到；

迈克尔加成反应可以发生在阳离子化合物的伯胺或仲胺上面。

上述本发明提供的式Ⅰ化合物包括六大类：聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇-阳离子肽的共聚物、聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇-阳离子脂质的共聚物、聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇-阳离子聚合物的共聚物；聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯-阳离子肽的共聚物、聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯-阳离子脂质的共聚物、聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯-阳离子聚合物的共聚物。

本发明得到的两亲性三嵌段共聚物载体具有良好的生物相容性和生物可降解性，其物理、化学性能可以通过调节聚合物的分子量及各组分的组成而调节。本发明提供生物相容性的两亲性三嵌段共聚物，在水溶液中能自组装成纳米颗粒，具有良好的稳定性、制备方法简单、可重复性高，作为载体既能保护siRNA免于降解，又能结合纳米颗粒本身的EPR效应。

本发明提供的两亲性三嵌段共聚物可以形成带有正电荷的纳米颗粒，这种纳米颗粒的粒径在50-400nm，表面电荷在5-60mV。在合适的电荷比（N/P比）或质量比的情况下，纳米颗粒能够与siRNA完全结合形成稳定的负载siRNA分子的纳米颗粒。各纳米颗粒与siRNA结合后，可以提高siRNA在血清中的稳定性，减缓其被血清中的相关酶降解的速度。

本发明利用mA-B-C或mB-A-C纳米颗粒输送针对萤火虫荧光素酶（Luciferase）的siRNA，并和商业化的转染试剂Lipofectamine2000比较沉默Luciferase在两种不同的能稳定表达Luciferase的细胞：人肺腺癌细胞（A549-luc细胞）和人乳腺癌细胞（MCF-7-luc细胞）中的表达，证明了纳米颗粒能够将siRNA运输到细胞内并能沉默外源性基因的表达；而且随着纳米颗粒/siRNA质量比的增加，上述两种细胞中Luciferase的表达量下降。此外，以Lipofectamine2000为阳性对照，用mA-B-C或mB-A-C纳米颗粒分别输送针对细胞核转录因子（NF-κBp65）的siRNA和No target siRNA，比较沉默p65在人肺腺癌细胞（A549）中的表达，证明了纳米颗粒能将siRNA转入细胞并对内源性基因也能发挥沉默作用。

本发明通过细胞毒性实验证明这种纳米颗粒具有良好的生物容性，同时该纳米颗粒具有很好的稳定性和方便制备等特点，使得这类生物相容性的纳米颗粒在siRNA运输和基于RNA干扰的疾病治疗中具有良好的应用前景。

附图说明

图1是实施例1、2中相关化合物的合成示意图，其中A、B为mP3/4HB-OH和P3/4HB-diol的合成路线，C为两类大分子引发剂（mA-B-acrylated、mB-A-acrylated）的合成示意图、D为载体材料的合成示意图。

图2是实施例1、2中相关化合物的核磁共振氢谱（¹H NMR）图，其中A、B、C、D、E、F分别为mP3/4HB-OH、P3/4HB-diol、mPEG-P3/4HB-acrylated、mP3/4HB-PEG-acrylated和材料mP3/4HB-PEG-lPEI（材料1）、mPEG-P3/4HB-lPEI（材料4）的¹H NMR谱。

图3是实施例3中纳米颗粒的物理表征及生物相容性测试结果，其中图A、B分别为纳米颗粒的粒径及表面电势（zeta电势）的结果；图C为各材料纳米颗粒的生物相容性测试结果。

图4是实施例4中纳米颗粒与siRNA复合物的物理表征结果，其中图A、B分别为纳米颗粒与siRNA复合物的粒径及Zeta电势的结果；

图5是实施例4中纳米颗粒与siRNA复合物的凝胶电泳实验结果，其中图A为纳米颗粒对siRNA药物包裹能力测定的结果，图片中的数字表示材料编号，图片下方的数字表示材料与siRNA的质量比（w_c:w_s）；图B为纳米颗粒对siRNA药物保护能力测定的结果，图片下方的数字表示复合物在血清中的孵育时间。

图6是实施例4中纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬实验结果，其中A-F分别为材料1-6的细胞吞噬结果。其中图1-1、2-1、3-1、4-1、5-1、6-1为荧光染料Cy3标记的siRNA；图1-2、2-2、3-2、4-2、5-2、6-2为DAPI染色，显示的是细胞核；图1-3、2-3、3-3、4-3、5-3、6-3分别为1-1和1-2、2-1和2-2、3-1和3-2、4-1和4-2、5-1和5-2、6-1和6-2的叠加图，“control”为对照组。

图7是实施例4中体外转染细胞实验及荧光素酶活性检测实验结果。其中A、B分别为材料1-材料6在A549-luc细胞和MCF-7-luc细胞中的实验结果；纵坐标为荧光素酶的相对表达量，横坐标为样品编号。

图8是实施例4中体外转染细胞实验及细胞核转录因子沉默实验结果；其中A-F分别为材料1-材料6，G为lipo在A549细胞中的实验结果；其中图1-1-1、1-2-1、2-1-1、2-2-1、3-1-1、3-2-1、4-1-1、4-2-1、5-1-1、5-2-1、6-1-1、6-2-1、7-1-1、7-2-1为DAPI染色，显示的是细胞核；图1-1-2、1-2-2、2-1-2、2-2-2、3-1-2、3-2-2、4-1-2、4-2-2、5-1-2、5-2-2、6-1-2、6-2-2、7-1-2、7-2-2为抗体标记，显示的是p65；图1-1-3、1-2-3、2-1-3、2-2-3、3-1-3、3-2-3、4-1-3、4-2-3、5-1-3、5-2-3、6-1-3、6-2-3、7-1-3、7-2-3分别为1-1-1和1-1-2、1-2-1和1-2-2、2-1-1和2-1-2、2-2-1和2-2-2、3-1-1和3-1-2、3-2-1和3-2-2、4-1-1和4-1-2、4-2-1和4-2-2、5-1-1和5-1-2、5-2-1和5-2-2、6-1-1和6-1-2、6-2-1和6-2-2、7-1-1和7-1-2、7-2-1和7-2-2的叠加图。

具体实施方式

本发明提供了一类siRNA药物的运输载体，它的活性成分是由两亲性三嵌段聚合物形成的带正电荷的纳米颗粒。上述聚合物（以下或称为共聚物）为聚羟基脂肪酸酯、亲水性聚合物和阳离子化合物反应而成。

上述聚合物为mA-B-C或mB-A-C型三嵌段共聚物，包括聚羟基脂肪酸酯单甲醚（mA段）、聚乙二醇单甲醚（mB段）、聚羟基脂肪酸酯（A段）、聚乙二醇（B段）和阳离子化合物（C段），该三嵌段共聚物可表示为mA-B-C或mB-A-C。

使用聚羟基脂肪酸酯作为本发明两亲性三嵌段共聚物的疏水部分，具有如下优点与作用：①：可生物降解；②：生物相容；③：相对疏水性，因此通过聚合物链之间的亲水-疏水相互作用可促进共聚物自组装；④：原料廉价，节约成本。

使用聚乙二醇作为本发明两亲性三嵌段共聚物的亲水部分，具有如下优点和作用：①：增加共聚物的水溶性；②：保护siRNA免被核酸酶降解，延长其在血液中的半衰期。

使用阳离子化合物作为本发明两亲性三嵌段共聚物的阳离子部分，主要是利用其氨基官能团，在弱酸性环境下带有的大量正电荷可以与带负电荷的siRNA药物静电结合，为运输siRNA药物奠定基础。同时其具有的亲水性或靶向性可增强共聚物在水溶液中的溶解度，更利于siRNA药物的运输。

下述实施例提供了由大分子聚酯引发的合成两亲性三嵌段共聚物的合成方法。该方法是：合成不同种类、不同分子量的端烯丙基聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇或端烯丙基聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯大分子引发剂（以下或称为预聚物）；以端烯丙基聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇或端烯丙基聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯为预聚物，通过迈克尔加成与阳离子化合物的氨基反应得到三嵌段的式Ⅰ化合物。

式Ⅰ化合物具有两亲性的特征，在水溶液中通过自组装形成纳米颗粒，这类纳米颗粒在水溶液中具有疏水的聚羟基脂肪酸酯内核、亲水聚合物和阳离子聚合物外壳，而且颗粒的尺寸与共聚物的组成有关，可以调控。在弱酸性环境中形成的纳米颗粒表面带有可观的正电荷，在合适的电荷比（N/P）情况下，通过静电作用可与带负电荷的siRNA药物完全结合形成稳定的复合物，起到运输siRNA药物的作用。采用这种纳米颗粒作为载体实现了载体/siRNA药物复合物的细胞内吞，纳米颗粒将siRNA药物运输进病灶部位后，与siRNA药物分离，并将siRNA药物释放出来，达到其基因沉默的效果，最终实现疾病治疗的目的。

可通过常规方法将两亲性三嵌段共聚物在水中制备成纳米颗粒，比如溶剂挥发法和透析法。

溶剂挥发法：将共聚物溶于四氢呋喃（THF）中，于搅拌下滴入超纯水得到相应的终浓度，搅拌两小时后，于减压下除去有机溶剂，再定容至合适的体积。

透析法：将共聚物溶于良溶剂如二甲基亚砜（DMSO）中，于搅拌下滴入超纯水得到相应的终浓度，搅拌两小时后，于透析袋中透析除去有机溶剂。

本发明中的聚羟基丁酸戊酸共聚酯（PHBV）中，羟基丁酸（HB）所占的比例范围是3-85%，优选是约3-50%。

本发明中的聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯（P3/4HB）中，4-羟基丁酸（4HB）所占的比例范围是5-80%，优选是约5-40%。

本发明中的聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯（PHBHHx）中，3-羟基丁酸（HB）所占的比例范围是6-90%，优选是约6-80%。

下述实施例还提供了将制备好的纳米颗粒与siRNA溶液互混制备成的纳米颗粒与siRNA的复合物。

下述实施例旨在更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1、预聚物mA-B-acrylated和mB-A-acrylated的合成及表征

一、端丙烯基聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇（mA-B-acrylated）的合成及表征

（一）单/双羟基聚羟基脂肪酸酯（mPHA-OH/PHA-diol）的合成与表征

各类单/双羟基聚羟基脂肪酸酯（mPHA-OH/PHA-diol）的合成，均是在对甲苯磺酸（PTSA）的催化下，与甲醇或二醇通过酯交换反应制备，其中二醇可以是乙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、1,6-己二醇。本发明中的各类聚羟基脂肪酸酯原料均是购自于深圳意可曼生物科技有限公司。下面以端羟基聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯单甲醚(mP3/4HB-OH)和聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯的二醇（P3/4HB-diol）为例说明此类反应的操作步骤。

mP3/4HB-OH的合成路线如图1（A）所示。mP3/4HB-OH是在对甲苯磺酸的催化下，将P3/4HB与甲醇通过酯交换反应制备。具体步骤为：将原料P3/4HB（10g）溶于250ml氯仿中回流30min后，再加入2g对甲苯磺酸和5ml甲醇回流，通过控制反应时间可得到不同分子量的mP3/4HB-OH。反应完毕，用水萃取3次，收集有机相，将其浓缩后倒入大量水中沉淀；过滤后，真空干燥，及得产物（产率82%）。

P3/4HB-diol的合成路线如图1（B）所示。P3/4HB-diol是在对甲苯磺酸的催化下，将P3/4HB与1,4丁二醇通过酯交换反应制备。具体步骤为：将原料P3/4HB（10g）溶于250ml氯仿中回流30min后，再加入3g对甲苯磺酸和10ml1,4丁二醇回流，通过控制反应时间可得到不同分子量的P3/4HB-diol。反应完毕，用水萃取3次，收集有机相，将其浓缩后倒入大量水中沉淀；过滤后，真空干燥，及得产物（产率81%）。

对mP3/4HB-OH和P3/4HB-diol进行核磁共振氢谱分析（¹H NMR）分析，¹H NMR见图2（A）和（B）。

由图2（A）和（B）可见，各种质子均得到相应归属，积分比例吻合。

（二）端丙烯基聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇（mA-B-acrylated）的合成与表征各种不同种类、不同分子量的端丙烯基聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇（mA-B-acrylated）预聚物是通过相应种类及相应分子量的端羟基聚羟基脂肪酸酯单甲醚(mA-OH)，以辛酸亚锡（Sn(Oct)₂）为催化剂，HDI/CDI/IPDI为连接剂，与聚乙二醇(B-diol)反应后得到前体端羟基聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇（mA-B-OH）；然后在三乙胺（Et₃N）催化下，用丙烯酰氯做活化剂将前体mA-B-OH的端羟基转变为烯丙基，即得到mA-B-acrylated。通过调节mA-OH和B-diol的分子量，可以得到不同分子量的mA-B-acrylated预聚物。辛酸亚锡因其高催化效率及无毒性，是被广泛应用的聚合反应的催化剂，已被美国FDA批准作为食品的添加剂。合成示意图如图1（C）所示：以mA-OH为预聚体，Sn(Oct)₂为催化剂，HDI为连接剂，与B-diol聚合后得到mA-B-OH；然后在Et₃N催化下，与丙烯酰氯反应，即得到mA-B-acrylated。

以端羟基聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯单甲醚(mP3/4HB-OH)与聚乙二醇(PEG-diol)反应制备mP3/4HB-PEG-acrylated预聚物为例，说明合成各类端丙烯基聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇预聚物的具体实验步骤。

具体操作步骤如下：

将0.2-1.5gmP3/4HB-OH置于250ml圆底烧瓶中，加入5-120ml1,2-二氯乙烷溶解，然后加入计算量HDI和Sn(Oct)₂，于0-90℃反应30min-1d(天)后，加入计算量PEG-diol，在相同温度下继续反应1d得到mP3/4HB-PEG-OH；然后再加入三倍当量Et₃N和丙烯酰氯，于相同温度下反应过夜。反应完毕，抽虑除掉三乙胺盐酸盐（Et₃N.HCl），在室温下将滤液于水中透析3d后，冷冻干燥，即得产物（产率62%-87%）。

不同种类，不同分子量可得到不同的产物，如此得到了一系列mA-B-acrylated预聚物，其中优选的预聚物及其组成见表1。

表1优选的mA-B-acrylated预聚物及其组成

^a预聚物右下角的数字代表预聚物中各组分的分子量(以1000为单位)

对上述mP3/4HB-PEG-acrylated预聚物进行核磁共振氢谱分析（¹H NMR）分析，¹H NMR见图2（C）。

由图2（C）可见，各种质子均得到相应归属，积分比例吻合。

二、端丙烯基聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯（mB-A-acrylated）的合成及表征

各类不同分子量的端丙烯基聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯（mB-A-acrylated）预聚物是通过端羟基聚乙二醇单甲醚(mB-OH)，以辛酸亚锡（Sn(Oct)₂）为催化剂，HDI/CDI/IPDI为连接剂，与相应种类的聚羟基脂肪酸酯(A-diol)反应后得到前体端羟基聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯（mB-A-OH）；然后在三乙胺（Et₃N）催化下，用丙烯酰氯做活化剂将前体mB-A-OH的端羟基转变为丙烯基，即得到mB-A-acrylated。通过调节mB-OH和A-diol的分子量，可以得到不同分子量的mB-A-acrylated预聚物。

合成示意图如图1（C）所示：以mB-OH为预聚体，Sn(Oct)₂为催化剂，HDI为连接剂，与A-diol聚合后得到mB-A-OH；然后在Et₃N催化下，与丙烯酰氯反应，即得到mB-A-acrylated。

以端羟基聚乙二醇单甲醚(mPEG-OH)和聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯二醇(P3/4HB-diol)反应制备mPEG-P3/4HB-acrylated预聚物为例，说明合成各类端丙烯基聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯预聚物的具体实验步骤。

将0.5-2gmPEG-OH置于250ml圆底烧瓶中，加入10-150ml1,2-二氯乙烷溶解，然后加入计算量HDI和Sn(Oct)₂，于0-90℃反应30min-1d(天)后，加入计算量P3/4HB-diol，在相同温度下继续反应1d得到mPEG-P3/4HB-OH；然后再加入三倍当量Et₃N和丙烯酰氯，于相同温度下反应过夜。反应完毕，抽虑除掉三乙胺盐酸盐（Et₃N.HCl），在室温下将滤液于水中透析3d后，冷冻干燥，即得产物（产率60%-85%）。

不同种类，不同分子量可得到不同的产物，如此得到了一系列mB-A-acrylated预聚物，其中优选的预聚物及其组成见表2。

表2优选的mB-A-acrylated预聚物及其组成

^a预聚物右下角的数字代表预聚物中各组分的分子量(以1000为单位)

对上述mPEG-P3/4HB-acrylated预聚物进行核磁共振氢谱分析（¹H NMR）分析，¹H NMR见图2（D）。

由图2（D）可见，各种质子均得到相应归属，积分比例吻合。

上述方法，本领域的技术人员可根据现有技术实现。

实施例2、式Ⅰ化合物mA-B-C或mB-A-C的合成及表征

各类不同分子量的mA-B-C或mB-A-C共聚物是以相应种类及相应分子量的mA-B-acrylated或mB-A-acrylated为预聚物，通过迈克尔加成与阳离子化合物的氨基反应而成。

合成示意图如图1（D）所示：将预聚物mA-B-acrylated或mB-A-acrylated的末端丙烯基与与阳离子化合物的氨基在一定条件下反应，即得到式Ⅰ化合物。

以mP3/4HB-PEG-acrylated或mPEG-P3/4HB-acrylated与阳离子聚合物lPEI（其具有的重均分子量范围是600至22,000道尔顿，本领域的技术人员可根据具体需要，在实际中应用中具体选择）聚合制备mP3/4HB-PEG-lPEI或mPEG-P3/4HB-lPEI共聚物为例，说明各类式Ⅰ化合物的合成步骤。

具体操作步骤如下：

将0.5-2gmP3/4HB-PEG-acrylated或mPEG-P3/4HB-acrylated与0.75-3glPEI置于250ml圆底烧瓶中，加入15-120ml甲醇（MeOH）溶解，于25℃-50℃反应4-48小时。反应完毕，透析，冷冻干燥，即得产物mP3/4HB-PEG-lPEI和mPEG-P3/4HB-lPEI（产率45%-75%）。

不同种类、不同分子量可得到不同的产物，如此得到了一系列结构通式为mA-B-C或mB-A-C的共聚物，其中优选的共聚物及其组成见表3和表4。

表3优选的mA-B-C共聚物及其组成（即以下所述材料1－3）

^a共聚物右下角的数字代表共聚物中各组分的分子量(以1000为单位)

以上述表3中的材料1和表4中的材料4为例，对共聚物进行核磁共振氢谱（¹HNMR）分析，¹HNMR见分别图2（E）和（F）。

由图2（E）和（F）可见，各种质子均得到相应归属，积分比例吻合。

实施例3、用式Ⅰ化合物mA-B-C或mB-A-C制备纳米颗粒

1、纳米颗粒的制备

两亲性三嵌段共聚物在水溶液中存在疏水、亲水相互作用，只要共聚物浓度高于临界胶束浓度即可形成纳米颗粒。本发明制备的各类式Ⅰ化合物均由亲水部分的阳离子化合物、亲水聚合物与疏水部分的聚羟基脂肪酸酯组成，所以在水溶液中都能自组装形成纳米颗粒。下面以材料1纳米颗粒的制备为例说明本发明中各类式Ⅰ化合物纳米颗粒的制备方法。

制备纳米颗粒的方法有多种，最常见的是溶剂挥发法，具体方法为：将20mg材料1溶于2ml四氢呋喃中，室温下搅拌2h，然后在搅拌下以60ml/h的速度滴入20ml超纯水，再搅拌3h后，减压抽掉有机溶剂，得到2mg/ml的纳米颗粒溶液。纳米颗粒的粒径主要为50-400nm。通过上述方法制备了2mg/ml的材料1-材料6的纳米颗粒溶液。

2、纳米颗粒的粒径和zeta电势

通过型号为Malvern Zetasizer NanaoZS90的动态光散射仪检测浓度为0.1mg/ml的材料1-材料6纳米颗粒的粒径和粒径分布，Zeta电势测量上述纳米颗粒的表面电势（zeta电势）。图3(A)和图3(B)分别是材料1-材料6的粒径和zeta电势的结果。由图可见，各种载体材料纳米颗粒都具有均匀的粒径分布，但因种类及组成不同，使得其所带正电荷量各异，最终导致各材料纳米颗粒的粒径、粒径分布和zeta电势大小不同。各材料纳米颗粒的平均直径及zeta电势见表5。

表5自制的各载体材料纳米颗粒的平均直径及zeta电势

3、式Ⅰ化合物纳米颗粒的生物相容性

将上述配置的2mg/ml的纳米颗粒溶液稀释为0.25-150ug/mL。通过Cell Counting Kit-8（CCK8试剂盒）测定不同浓度式Ⅰ化合物纳米颗粒的细胞毒性。各类聚合物的细胞毒性实验操作类似，以材料1为例说明此类实验的操作步骤。具体实验步骤为：将不同浓度的材料1聚合物纳米颗粒溶液与A549-luc细胞共培养24小时后，加入CCK8试剂，于37℃细胞培养箱中孵育1h后，检测细胞的存活率，以PEI作为对照实验。不同处理下细胞的存活率见图3(C)。

由图3(C)可见，当聚合物浓度从0.25ug/mL增大到20ug/mL，各材料的纳米颗粒处理细胞后，细胞活力一直维持在80%左右，而当聚合物浓度从20ug/mL增大到150ug/mL时，细胞活力下降，表明上述材料的纳米颗粒在一定浓度范围类具有良好的生物相容性。

实施例4、mA-B-C或mB-A-C纳米颗粒作为siRNA载体的应用

siRNA是一种由长21～23个核苷酸（nt）组成的双链小分子RNA，其磷酸骨架所携带的大量负电荷可与带正电荷的共聚物通过静电相互作用形成稳定的复合物。氮/磷（N/P）是指纳米颗粒胺基上的正电荷与siRNA磷酸基团上的负电荷的比值，其反应了载体与siRNA药物的电荷比情况。在本发明中，我们采用较为简单和直观的质量比来表示载体/siRNA药物的比例，这种方式在实际应用中更为精确，文中若没有特殊说明，载体/siRNA药物的比例均指两者的质量比。

1、纳米颗粒与siRNA复合物的制备及表征

按照实施例3的方法制备浓度为4mg/ml的各载体材料纳米颗粒溶液。荧光素酶pGL4luciferase siRNA，购自广州锐博生物科技有限公司，将5nm pGL4luciferase siRNA溶解在250ul焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中，得到浓度为20微摩尔每升（uM）luciferase siRNA溶液。上述纳米颗粒与上述siRNA溶液按不同质量比混合，制备不同载体材料纳米颗粒与siRNA复合物。

通过动态光散射测量以上纳米颗粒与siRNA复合物的粒径和粒径分布，通过zeta电势测定仪测量以上纳米颗粒与siRNA复合物的zeta电势。图4(A)是材料1-材料6纳米颗粒与siRNA复合物的粒径结果。图4(B)是材料1-材料6纳米颗粒与siRNA复合物的zeta电势结果。

由图可见，各材料纳米颗粒与siRNA的复合物都具有均匀的粒径分布，因材料的种类及组成不同，他们与siRNA复合物的粒径和粒径分布不同，zeta电势大小也各异。对比各材料纳米颗粒与siRNA结合前后其粒径和zeta电势变化，可知，材料2、材料3、材料4、材料6与siRNA结合后，其纳米颗粒粒径和zeta电势都变小，表明上述材料的纳米颗粒通过静电作用与siRNA结合形成了复合物；而材料1与siRNA结合后其粒径变小、zeta电势变大，说明材料1可能是通过静电作用与siRNA结合后将其包裹在材料纳米颗粒的内部，而之前处于纳米颗粒内部的部分正电荷被暴露了出来；材料5与siRNA结合后其粒径变大、zeta电势变小，这说明siRNA是通过静电作用锚定在材料5纳米颗粒的表面。由此证明，本发明的材料既可以将siRNA包裹在其中，也可以将siRNA锚定在其纳米颗粒的表面，以此可实现不同实验的需要。各材料纳米颗粒与siRNA复合物的平均直径及zeta电势见表6。

表6自制的各载体材料纳米颗粒与siRNA复合物的平均直径及zeta电势

2、纳米颗粒对siRNA药物包裹能力的测定

本发明中我们采用凝胶电泳阻滞实验研究了本发明自制的所有载体材料对siRNA的包裹能力。实施例中考察了8个不同载体/siRNA质量比(w_c/w_s)，分别是0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0。因实验操作类似，下面以材料1为例说明具体操作步骤。

首先，精确称取材料1溶于超纯水中配制成母液（终浓度为22微克每微升(ug/ul)），使用前按设定的不同质量比稀释成不同浓度，将浓度为2.5μg/μl的siRNA稀释后与不同浓度的载体材料水溶液等体积混合均匀，然后在室温下孵育30分钟，形成一系列不同载体/siRNA质量比（w_c/w_s）分别为0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0的复合物溶液。随后取18μl复合物与2μl上样缓冲液（10x Loading buffer含SYBR荧光染料）充分混合后，进行琼脂糖凝胶电泳。电泳条件为：2%琼脂糖凝胶，1倍稀释的Tris硼酸（1×TBE）缓冲液，电压120V，时间为10min。紫外灯下观察电泳情况。SYBR荧光染料特异性地掺入siRNA双链后，随siRNA分子一同在电泳中迁移，并在紫外下发光，使siRNA能够被观察到。实验结果如图5（A）。

通过以上方法，测定了本发明中材料1-材料6对siRNA的包裹能力，实验结果见图5（A）。

图5（A）中每个小图片左上角的数字表示材料编号，图片下方的数字从左至右依次对应每条泳道中复合物的载体/siRNA质量比（w_c:w_s），其中0泳道表示没有加入载体材料的裸siRNA。由图可见，裸siRNA的迁移程度最大，随着载体/siRNA质量比的增大，迁移的siRNA逐渐减少。当质量比达到16:1、32:1或64:1时，泳道中正极方向完全没有siRNA的亮色条带出现，siRNA完全留在琼脂糖凝胶的加样孔中。这表明当材料4/siRNA质量比为16:1、材料4/siRNA质量比为32:1，材料2、材料3、材料5和材料6与siRNA的质量比为64:1时，各材料就能够与siRNA完全结合，将siRNA完全包裹。各材料与siRNA完全结合时的质量比不同，是由于各材料中的组成不同引起的。由此说明，共聚物中各组分的组成会影响共聚物对siRNA的包裹能力。

3、纳米颗粒对siRNA药物保护能力的测定

各载体材料纳米颗粒对siRNA药物保护能力的测定操作均相同。优选的实施方案中以材料1和材料4的纳米颗粒对siRNA药物保护能力测定实验为例说明操作步骤。更优选的siRNA药物是能抑制萤火虫荧光素酶表达的siRNA（luciferase siRNA）。操作步骤如下：首先制备材料1和材料4的纳米颗粒与luciferase siRNA的复合物溶液，然后将此复合物溶液与牛血清混合后（混合溶液中牛血清浓度为25%（v/v））于pH＝7.4，37℃下孵育，分别在第0、2、4、8、12、24、48小时取样（10μl）。随后将10μl样品与2μl上样缓冲液（10x Loadingbuffer含SYBR荧光染料）充分混合后，进行琼脂糖凝胶电泳。电泳条件为：4%琼脂糖凝胶，1倍稀释的Tris硼酸（1×TBE）缓冲液，电压110V，时间为25min。紫外灯下观察电泳情况。实验结果如图5(B)。

实验结果表明：材料1和材料4的纳米颗粒与luciferase siRNA形成的复合物在25%牛血清中孵育不同时间后，复合物中luciferase siRNA的含量比复合物材料2/siRNA、材料3/siRNA、材料5/siRNA、材料6/siRNA、LPEI/siRNA中luciferase siRNA的含量多，说明材料1和材料4对luciferase siRNA的保护能力比其他的材料对siRNA的保护能力强。此外，随着纳米颗粒与luciferasesiRNA的复合物在25%牛血清中孵育时间的延长，复合物中luciferase siRNA均被逐渐降解，但与对照组裸露的luciferase siRNA和LPEI/siRNA复合物相比，各复合物中luciferasesiRNA的含量都比对照组中的多，说明纳米颗粒与luciferasesiRNA结合后能保护其被血清中的相关酶降解，从而提高了siRNA在血清中的稳定性。

4、纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬

各类载体材料形成的纳米颗粒与siRNA形成复合物后，需通过内吞途径进入细胞，才能发挥基因沉默作用。本发明通过细胞吞噬实验，测定各类载体材料与siRNA形成复合物的细胞吞噬情况。以材料1为例说明该类实验的具体操作步骤。

具体操作步骤如下：

转染前一天，将A549-luc细胞接种至96孔细胞培养板（5,000细胞/孔）中，每孔加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到40-60%。转染时将5nmCy3-siRNA溶解在250ulDEPC处理过的水中，得到浓度为20uM的Cy3-siRNA溶液，将上述制备的材料1纳米颗粒稀释后与上述Cy3-siRNA溶液按载体/siRNA质量比32:1混合，制备材料1纳米颗粒与Cy3-siRNA复合物。

将上面制备好的材料1纳米颗粒与Cy3-siRNA复合物与A549-luc细胞在37℃的二氧化碳（CO₂）培养箱中共同培养24h，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核染色，最后用4%甲醛-PBS溶液室温下固定细胞30min，用激光共聚焦显微镜观察细胞吞噬纳米颗粒的情况。按照上述步骤，测定了材料1-6的纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬结果，见图6。

图6给出了A549-luc细胞吞噬材料1-6纳米颗粒激光共聚焦显微镜观察的结果，细胞内红色的部分是Cy3标记的siRNA，细胞内蓝色的部分是细胞核。通过两种颜色叠加的结果可以看出纳米颗粒将Cy3-siRNA转进细胞，复合物在细胞内发生分离，在此期间，纳米颗粒并没有进入细胞核，而siRNA主要分布在细胞核的周围即胞质部分。

图6中，图6（A）、图6（B）、图6（C）、图6（D）、图6（E）和图6（F）分别为材料1-6的细胞吞噬结果。其中1-1、2-1、3-1、4-1、5-1、6-1为在488nm激发光下的激光共聚焦显微镜照片，显示的是Cy3标记的siRNA；1-2、2-2、3-2、4-2、5-2、6-2为在346nm激发光下的激光共聚焦显微镜照片，显示的是细胞核；1-3、2-3、3-3、4-3、5-3、6-3分别为1-1和1-2、2-1和2-2、3-1和3-2、4-1和4-2、5-1和5-2、6-1和6-2的叠加结果，“control”为对照组实验结果。由图可以看出材料1-4的纳米颗粒与siRNA的复合物被细胞吞噬后，在细胞内分离，而且纳米颗粒并没有进入细胞核，siRNA主要分布在细胞胞质中；材料5的纳米颗粒与siRNA的复合物几乎未被细胞吞噬；材料6的纳米颗粒与siRNA的复合物进入细胞较少。由此表明材料1-4、材料6的纳米颗粒能够有效的将siRNA运输到细胞内，并能够与siRNA分离，使siRNA发挥基因沉默的作用。各材料纳米颗粒因其种类及组成不同，导致其与siRNA复合物的细胞吞噬情况各异。

4、纳米颗粒与siRNA复合物对外源性基因（萤火虫荧光素酶基因）的沉默

Luciferase是萤火虫荧光素酶，能够催化反应底物发出可见光，一分子荧光素酶可以在一定条件下与一分子专一性底物发生反应，放出一个荧光光子。通过检测荧光素酶与底物反应后释放出的光子数量可以定量测定Luciferase基因的表达水平，以此可评估运输载体对siRNA的转染效果。

在本发明中，我们选用了两种能稳定表达萤火虫荧光素酶（Luciferase）的细胞：人肺腺癌细胞（A549-luc细胞）和人乳腺癌细胞（MCF-7-luc细胞）（由本实验室自行筛选得到），测定了载体/siRNA质量比（w_c:w_s）为16:1和32:1（分别表示为：1x和2x）时，优选的材料1-6对萤火虫荧光素酶siRNA（Luciferase siRNA）的转染效果。以材料1为例，说明各材料细胞转染实验的操作步骤。

1）体外转染A549-luc细胞实验及萤火虫荧光素酶活性检测

具体操作步骤如下（以材料1为例）：

转染前24h于96孔细胞培养板中接种A549-luc细胞（5,000细胞/孔），按材料1/siRNA质量比32:1在50mMHEPES(pH=6.5)缓冲液中制备材料1和Luciferase siRNA的复合物溶液（20ul）并于室温下静置20min，转染时用80ulRPMI1640新鲜培养基(含10%FBS)替换原有的培养基，然后将制备好的复合物溶液加入96孔板。每个样品3个复孔，以A549-luc细胞作为对照1（MOCK）；用lipofectamine2000转染的LuciferasesiRNA为阳性对照；用游离的Luciferase siRNA转染A549-luc细胞，作为对照2(nakedsiRNA)。转染24h后，用新鲜培养基替换转染溶液，再过24h后加入荧光素酶检测试剂，用Veritas MicroplateLuminometer检测荧光素酶的相对表达量。实验结果见图7（A）。

2）体外转染MCF-7-luc细胞实验及萤火虫荧光素酶活性检测

具体操作步骤如下（以材料4为例）：

转染前24h于96孔细胞培养板中接种MCF-7-luc细胞（6,000细胞/孔），按材料4/siRNA质量比16:1在50mMHEPES(pH=6.5)缓冲液中制备材料4和Luciferase siRNA的复合物溶液（20ul）并于室温下静置20min，转染时用80ul RPMI1640新鲜培养基(含10%FBS)替换原有的培养基，然后将制备的复合物溶液加入96孔板。每个样品3个复孔，以MCF-7-luc细胞作为对照1（MOCK）；用lipofectamine2000转染的Luciferase siRNA为阳性对照；用游离的Luciferase siRNA转染MCF-7-luc细胞，作为对照2。转染24h后，用新鲜培养基替换转染溶液，再过24h后加入荧光素酶检测试剂，用Veritas Microplate Luminometer检测荧光素酶的相对表达量。实验结果见图7（B）。

图7中，图7（A）和图7（B）分别为材料1-6在A549-luc和MCF-7-luc细胞中的转染效果图，其中纵坐标表示荧光素酶的相对表达量，横坐标表示材料编号，图例表示材料与siRNA的质量比。

由图7（A）和图7（B）可见，在A549-luc和MCF-7-luc细胞中，不同材料转染LuciferasesiRNA后细胞内荧光素酶的表达情况都因材料的结构不同而有所差异。如：材料1、材料4转染Luciferase siRNA后在两种细胞中荧光素酶的表达量都显著降低，Luciferase siRNA的沉默效果在80%左右，当w_c:w_s=32:1时，两材料转染siRNA与lipofectamine2000转染siRNA相比，细胞内Luciferase的表达量更低；材料2在两种细胞中转染Luciferase siRNA后，Luciferase siRNA的沉默效果在70%左右；材料3和材料6在两种细胞中转染LuciferasesiRNA后，Luciferase siRNA的沉默效果在30%-50%；而材料5转染Luciferase siRNA后在两种细胞中对荧光素酶表达量的影响都不明显；此外，同一材料随着其与siRNA的质量比增加，上述两种细胞中Luciferase的表达量都降低。

从7（A）、图7（B）对比可知，在上述两种细胞中材料3、5、6对Luciferase siRNA的转染效果及沉默效果的影响基本相同；材料1、2、4因两细胞种类不同而略有差异。

5、纳米颗粒与siRNA复合物对内源性基因（细胞核转录因子）的沉默

细胞核转录因子(Nuclear factor kappa B,NF-κB)是一类广泛存在于真核细胞质中的核转录因子,能使某些控制细胞转化靶基因转录增强，并引发肿瘤，由两个亚单位组成,即p50和p65。通过免疫荧光可以测定p65蛋白的表达水平，以此可评估运输载体与siRNA复合物对内源性基因的沉默效果。

在本发明中，我们选用人肺腺癌细胞（A549细胞），测定了载体/siRNA质量比（w_c:w_s）为24:1时，优选的材料1-6对p65siRNA的转染效果。以材料1为例，说明各材料细胞转染实验的操作步骤。

具体操作步骤如下（以材料1为例）：

转染前24h于96孔细胞培养板中接种A549细胞（5,000细胞/孔），按材料1/siRNA质量比24:1在50mM HEPES(pH=6.5)缓冲液中分别制备材料1和p65siRNA，材料1和No targetsiRNA的复合物溶液（20ul）室温静置20min，转染时用80ul RPMI1640新鲜培养基(含10%FBS)替换原有的培养基，然后将制备好的复合物溶液分别加入96孔板。每个样品3个复孔，以No target siRNA处理组作为阴性对照；用lipofectamine2000转染的p65siRNA和Notarget siRNA为阳性对照。转染24h后，用新鲜培养基替换转染溶液，再过24h后进行免疫荧光检测。方法是：转染48h后弃去细胞培养基，用4%多聚甲醛固定细胞30min后用2mg/mL的甘氨酸洗5min，然后用0.2%Trion-100透化10min，10%羊血清封闭1h后加入2%羊血清配的Smad-4兔抗体（一抗）于4℃孵育过夜；次日弃掉一抗，用清洗液（1gBSA+100mL PBS+500uL Tween）洗涤5次后加入2%羊血清配的二抗于室温下避光孵育1.5h；用清洗液洗涤5次，每次5min，然后加入DAPI染色10min，PBS洗两遍后用高内涵筛选仪拍照检测p65的表达情况。实验结果见图8。

图8给出了A549细胞中各材料与p65siRNA或与No target siRNA复合物对p65蛋白的沉默结果。细胞内蓝色的部分是细胞核，细胞内绿色的部分是抗体标记的p65（若p65的表达量下降，绿光就变暗），通过两种颜色叠加的结果可以比较各材料对p65siRNA的转染效果。

图8中，图8（A）、图8（B）、图8（C）、图8（D）、图8（E）、图8（F）和图8（G）分别为材料1-6和lipo2000的实验结果。其中图1-1-1、1-2-1、2-1-1、2-2-1、3-1-1、3-2-1、4-1-1、4-2-1、5-1-1、5-2-1、6-1-1、6-2-1、7-1-1、7-2-1为DAPI染色，显示的是细胞核；图1-1-2、1-2-2、2-1-2、2-2-2、3-1-2、3-2-2、4-1-2、4-2-2、5-1-2、5-2-2、6-1-2、6-2-2、7-1-2、7-2-2为抗体标记，显示的是p65。图1-1-3、1-2-3、2-1-3、2-2-3、3-1-3、3-2-3、4-1-3、4-2-3、5-1-3、5-2-3、6-1-3、6-2-3、7-1-3、7-2-3分别为1-1-1和1-1-2、1-2-1和1-2-2、2-1-1和2-1-2、2-2-1和2-2-2、3-1-1和3-1-2、3-2-1和3-2-2、4-1-1和4-1-2、4-2-1和4-2-2、5-1-1和5-1-2、5-2-1和5-2-2、6-1-1和6-1-2、6-2-1和6-2-2、7-1-1和7-1-2、7-2-1和7-2-2的叠加图。

由图可知，分别与相应材料的No target siRNA处理组对照，材料1-4转染p65siRNA后能显著降低A549细胞内p65蛋白的表达，而且沉默效果与lipo2000相当。材料5和材料6转染p65siRNA后，细胞内p65蛋白的表达量与No target siRNA处理组的无显著性差异。

结合萤火虫荧光素酶基因的沉默实验，比较材料1与材料2可知，当材料结构为mA-B-C时，采用小分子量的mA的共聚物其转染效果比采用大分子量的转染效果好；比较材料2与材料5可知，当材料组成相同，B部分为大分子量的共聚物时，材料结构mA-B-C的转染效果优于结构mB-A-C的转染效果；比较材料1和材料4可知，虽然前者的结构为mA-B-C属于疏水-亲水-亲水性聚合物，后者的结构为mB-A-C属于亲水-疏水-亲水性聚合物，但在上述两种细胞中，两者都能显著降低细胞内荧光素酶的表达，说明这两种结构的载体材料对siRNA的转染效果都较好。

以上结果表明，本发明的载体材料能将siRNA成功运输进细胞，并且对外源性基因和内源性基因都能发挥沉默作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.一种两亲性三嵌段聚合物，其特征是，它为聚羟基脂肪酸酯、亲水性聚合物及阳离子化合物共聚形成的聚合物，其结构通式Ⅰ为：[mA-B-C]或[mB-A-C]，其中：A来源于聚羟基脂肪酸酯，mA表示聚羟基脂肪酸酯的单甲醚；B来源于亲水性聚合物，mB表示亲水性聚合物的单甲醚；C来源于阳离子肽、阳离子脂质、或阳离子聚合物；所述聚羟基脂肪酸酯的结构通式如下： 

其中n=1,2,3,或4；m表示聚合度；R为侧链，是C₁-C₇的烷基，或由苯氧基、卤素、苯基或取代的苯基取代的C₁-C₇烷基，或是C₂-C₅的烯基；所述聚羟基脂肪酸酯是聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯、聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯、聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量范围是500至10,000道尔顿；所述阳离子肽为赖氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸、聚左旋赖氨酸或鱼精蛋白；所述阳离子脂质为二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇二油酰卵磷脂或胺乙基胺基甲酰基胆固醇；所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、精胺、亚精胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺或壳聚糖。 

2.根据权利要求1所述的两亲性三嵌段聚合物，其特征是，所述聚羟基脂肪酸酯是聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯。 

3.根据权利要求1所述的两亲性三嵌段聚合物，其特征是，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量范围是500至4000道尔顿。 

4.根据权利要求1所述的两亲性三嵌段聚合物，其特征是，所述阳离子肽是聚左旋赖氨酸；所述阳离子脂质是胺乙基胺基甲酰基胆固醇；所述阳离子聚合物是聚乙烯亚胺。 

5.根据权利要求1所述的两亲性三嵌段聚合物，其特征是，所述亲水性聚合物是聚乙二醇，其具有的数均分子量是400至8,000道尔顿。 

6.一种权利要求1－5任一项所述的两亲性三嵌段聚合物的合成方法，其特征是，包括以下步骤：以端丙烯基聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇为大分子引发剂或端丙烯基聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯为大分子引发剂，通过迈克尔加成与阳离子化合物的氨基反应得到两亲性三嵌段聚合物。 

7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征是，所述端丙烯基聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇大分子引发剂是由端羟基聚羟基脂肪酸酯单甲醚-聚乙二醇在活化剂的作用下，将其末端羟基转变为丙烯基得到；所述活化剂为能活化羟基的试剂、丙烯酸酯单体或甲基丙烯酸酯单体。 

8.根据权利要求7所述的合成方法，其特征是，所述端丙烯基聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯大分子引发剂是由端羟基聚乙二醇单甲醚-聚羟基脂肪酸酯在活化剂的作用下，将其末端羟基转变为丙烯基得到；上述活化剂为能活化羟基的试剂、丙烯酸酯单体或甲基丙烯酸酯单体。 

9.根据权利要求8所述的合成方法，其特征是，所述能活化羟基的试剂为六亚甲基二异氰酸酯、羰基二咪唑、异佛尔酮二异氰酸酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、或N,N'-二环己基碳二亚胺；所述丙烯酸酯单体为丙烯酰氯。 

10.一种siRNA药物运输载体，其特征是，其是活性成分为权利要求1－5任一项所述两亲性三嵌段聚合物的带正电荷的纳米颗粒，所述纳米颗粒的粒径为50-400nm，其zeta电势为 

5-60mV。 

11.根据权利要求10所述的siRNA药物运输载体，其特征是，所述两亲性三嵌段聚合物为mP3/4HB_0.5-PEG₂-lPEI_1.8或mPEG_0.4-P3/4HB_0.5-lPEI_1.8。 

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