CN101766817A - 一种药物载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种药物载体及其应用。本发明提供的药物载体，活性成分是聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物形成的带正电荷的纳米颗粒。本发明还提供了治疗癌症的药物，它的活性成分是由聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯负载抗癌药物形成的纳米颗粒。聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物是生物相容性的阳离子型两亲性嵌段共聚物，在水溶液中自组装形成具有疏水性核并带有正电荷的纳米颗粒，具有良好的稳定性，制备方法简单，可重复性高，可将疏水性抗癌药物包载进其疏水性内核中，可和带负电的siRNA结合；从而形成同时输运抗癌药物和siRNA的给药体系。本发明的药物载体和本发明的药物具有巨大的社会效益和经济效益，也具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物载体及其应用。
背景技术
据世界卫生组织(WHO)统计，每年世界有1000万人患上癌症，约6万人死于癌症，人数占全球死亡人数的12％。我国每年新增癌症患者180万，死亡140万，平均每3分钟就有1.3人死于癌症，而且癌症的发病率呈急剧上升到的趋势。据《文汇报》报道，在过去不到20年的时间内，我国癌症发病率上升69％，死亡率增长了29.4％，癌症已经严重危害了我国人民健康。
传统的放射疗法和化疗是目前常用的癌症治疗法，主要通过应用有毒药物来对付肿瘤组织，杀死癌细胞，但这同时也会对人体健康细胞造成很大的损害，因此发展一种毒副作用较小的基于纳米技术和新型生物技术的特异性治疗方法十分重要。化疗是利用化学药物杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞生长繁殖和促进肿瘤细胞分化的一种治疗方式，它是一种全身性治疗手段，对原发灶、转移灶和亚临床转移灶均有治疗作用。但是化学药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会影响机体的正常细胞，在取得治疗效果的同时，常出现不同程度的毒副作用。化疗过程中，身体衰弱、精神萎靡、出虚汗，白细胞和血小板、红细胞、血色素下降接踵而来，甚至出现胸闷心悸、肝肾功能损害等，迫使患者停止治疗。降低化疗药物的剂量可以有效减小或者消除毒副作用，但是对癌细胞的作用效果也大大降低了。
紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物，也是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。同位素示踪表明，紫杉醇只结合到聚合的微管上，不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能，特别是使细胞分裂停止于有丝分裂的G2/M期，阻断了细胞的正常分裂，还可诱导细胞凋亡。通过II-III期临床研究，紫杉醇主要适用于乳腺癌和卵巢癌的治疗，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。虽然紫杉醇的抗肿瘤作用早已被人们所认识，但直到1988年才完成I期临床试验，至1992年才被美国FDA正式批准用于治疗卵巢癌。究其原因，除了紫杉醇本身来源困难外，其复杂的临床毒副反应也是限制其开发和应用的重要原因。紫杉醇的临床毒副作用主要表现在：1)对造血系统产生影响；2)过敏反应；3)神经系统毒性；4)胃肠道粘膜炎；5)其他毒副作用。限制紫杉醇应用的另外一个因素是紫杉醇是疏水性物质，在水溶液中的溶解性非常差，其在临床治疗应用时需使用一些增溶剂来溶解紫杉醇以达到治疗的剂量要求。因此，开发设计一种能够包载紫杉醇以增加其水溶性的传输体系也就成为开发紫杉醇药物的一个关键因素。
RNA干扰是一种由大约二十多个核苷酸组成的双链小分子干扰RNA(siRNA)介导的基因沉默技术，它具有序列特异性而且发生在遗传信息的转录之后。癌症细胞对一些蛋白质分子的特异性表达或过度表达逐渐成为癌症治疗在分子水平的新靶点，可以针对这些靶点发展新型RNAi干扰疗法。比如可以使细胞周期停滞在G2期或者M期的基因PLK1被发现在人类各种肿瘤组织癌细胞中均高表达。研究表明，PLK1可在多种转化细胞系中表达，并见于所有人类最常见的肿瘤组织，包括肺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌，胃癌组织也有不同程度的阳性表达。因此如果能用RNA干扰的办法将PLK基因″关闭″，从而阻止癌细胞的自由分裂和复制，就有可能发展出治疗癌症的特异性新疗法。然而，尽管目前在大多数研究中，siRNA显示出抑制基因的良好潜质，但是siRNA的合成费用较高，只能瞬时沉默基因，并且在传输方面也面临着巨大挑战。由于siRNA分子本身穿透细胞膜的能力极差，而且极不稳定，因此siRNA药物开发的一个重要关键是siRNA的传输体系。目前所采用的载体体系大多是阳离子脂质体或水溶性的阳离子聚合物，将这些载体分子与siRNA溶液互混得到二者的复合物，从而实现传递siRNA的目的，这类方法的不足就是不容易放大规模并且重复性较差。
对一些癌细胞中存在的原癌基因表达的沉默，可以导致对一些化疗药物的敏感性增强。已经有研究结果指出，将乳腺癌细胞中的PLK1表达水平下调，可以显著增强乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性，从而可以用较低浓度的紫杉醇获得很好的治疗效果。因此发展能同时将RNAi药物和化疗药物输送到癌细胞、癌组织的载体有可能在沉默一些原癌基因表达的同时，用低剂量的化疗药物彻底杀死癌细胞。
通过药物可控释放和靶向药物输送系统能够减少药物降解与损失，降低副作用，提高生物利用度和疗效。如何使药物能够到达病灶部位，并在病灶部位和病灶细胞内释放药物，是现今药物制剂学的热点和难点。聚合物纳米颗粒载药范围广、结构稳定、具有优良的组织渗透性，体内滞留时间长，能使药物有效地到达靶点。它可以提高药物稳定性，延缓释放，提高药效，降低毒副作用。大量的研究证明，纳米尺度的聚合物药物载体可促进药物在肿瘤组织的富集，用纳米药物载体输送药物，在癌症治疗中显示出良好的效果，具有广阔的应用前景。由于肿瘤组织的微环境与正常组织存在显著的差别，不利于小分子药物通过血管输送到肿瘤组织的深部及肿瘤细胞内药物作用的靶位。然而，由于肿瘤新生血管内皮细胞的不连续性，允许粒径小于200nm的粒子通过血管壁进入组织间隙，因此，将药物装载到纳米粒中可通过渗透和滞留增强效应(enhanced permeability retention，EPR)在肿瘤组织中富集进而实现被动靶向。
聚合物纳米颗粒可用两亲性嵌段共聚物在选择性溶剂通过组装形成。两亲性AB两嵌段共聚物指的是这样一种聚合物，它包括由化学键连接的两种不同的聚合物链段，即A嵌段与B嵌段，典型的如聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物。两亲性ABA三嵌段共聚物指的是这样一种聚合物，它包括第一聚合物的中心链段，称作B嵌段，和第二聚合物作为两端链段，称为A嵌段。典型的实例如，聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)(PEO-PPO-PEO，PluronicTM)三嵌段共聚物。小分子药物如化疗药物紫杉醇、阿霉素可以在两亲性嵌段共聚物组装形成纳米颗粒的过程中被包载到疏水性的内核中。
生物可降解高分子在药物输运中具有更好的应用前景，原因是生物可降解高分子可以在生物体内降解，其降解产物或被排除体外，或参与生命体代谢，从而可以减少副作用。合成生物可降解高分子包括脂肪族聚酯、聚原酸酯、聚酸酐等在内的大量可降解高分子，这些高分子在药物输运、基因传递、细胞培养和组织工程等生物医用领域获得了广泛应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种药物载体及其应用。
本发明提供的药物载体，它的活性成分是聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物形成的带正电荷的纳米颗粒。
所述纳米颗粒可进行化学修饰或配体修饰。
所述药物载体负载的药物的活性成分可为化学物质，如紫杉醇、siRNA等。
所述siRNA是指针对不同靶点，可以抑制疾病相关基因表达的双链小分子干扰RNA。
所述三嵌段共聚物中，中间嵌段是所述聚己内酯，一个末端嵌段是聚乙二醇单甲醚，另一个末端嵌段是所述聚磷酸酯；所述聚乙二醇嵌段的聚合度为45，对应的数均分子量为2000g/mol；所述聚己内酯嵌段的聚合度为45-100，对应的数均分子量为5,130-11,400g/mol；所述聚磷酸酯嵌段的聚合度为7-12，对应的数均分子量为1,420-2,430g/mol。
所述聚己内酯为具体可为聚ε-己内酯。
所述三嵌段共聚物具体可为mPEG45-PCL45-PPEEA7或mPEG45-PCL100-PPEEA12。mPEG45-PCL100-PPEEA12的化学结构如(I)所示：
当所述纳米颗粒同时负载紫杉醇和siRNA时，所述纳米颗粒与紫杉醇的质量比为375000∶1-3750∶1；所述纳米颗粒与siRNA的正负电荷比(N/P比)为50∶1。
本发明还保护一种治疗癌症的药物，它的活性成分是由聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯负载抗癌药物形成的纳米颗粒。本发明还保护一种抑制肿瘤细胞增殖的药物，它的活性成分是由聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯负载抗癌药物形成的纳米颗粒。
所述纳米颗粒可进行化学修饰或配体修饰。
所述抗癌药物可为化学物质，如紫杉醇和/或siRNA。
所述siRNA是指针对不同靶点，可以抑制疾病相关基因表达的双链小分子干扰RNA。
所述三嵌段共聚物中，中间嵌段是所述聚己内酯，一个末端嵌段是聚乙二醇单甲醚，另一个末端嵌段是所述聚磷酸酯；所述聚乙二醇嵌段的聚合度为45，对应的数均分子量为2000g/mol；所述聚己内酯嵌段的聚合度为45-100，对应的数均分子量为5,130-11,400g/mol；所述聚磷酸酯嵌段的聚合度为7-12，对应的数均分子量为1,420-2,430g/mol。
所述聚己内酯为具体可为聚ε-己内酯。
所述三嵌段共聚物具体可为mPEG45-PCL45-PPEEA7或mPEG45-PCL100-PPEEA12。mPEG45-PCL100-PPEEA12的化学结构如(I)所示。
所述癌症具体可为乳腺癌。所述肿瘤细胞具体可为乳腺癌细胞。当所述癌症为乳腺癌或所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞时，所述siRNA可为针对PLK1基因的siRNA。
当所述纳米颗粒同时负载紫杉醇和siRNA时，所述纳米颗粒与紫杉醇的质量比为375000∶1-3750∶1；所述纳米颗粒与siRNA的正负电荷比(N/P比)为50∶1。
聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物是生物相容性的阳离子型两亲性嵌段共聚物，在水溶液中自组装形成具有疏水性核并带有正电荷的纳米颗粒，具有良好的稳定性，制备方法简单，可重复性高。共聚物在水溶液中形成胶束纳米颗粒的同时，可将疏水性抗癌药物包载进其疏水性内核中；利用纳米颗粒聚磷酸酯壳层的正电荷，可以和带负电的siRNA结合；从而形成可以同时输运抗癌药物和siRNA的给药体系。通过改变加入的疏水性药物的量，可以改变纳米颗粒的载药率。通过改变纳米颗粒和siRNA的N/P比，可以改变纳米颗粒负载siRNA的量。
PLK1在乳腺癌细胞中过量表达，将其表达水平下调后可以显著提高细胞对紫杉醇的药物敏感性，从而可以使用较低浓度的紫杉醇达到较好的治疗效果。用聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物形成的纳米颗粒负载紫杉醇和针对PLK1的siRNA(见图9)，作为乳腺癌的治疗药物进行给药，实现了抗癌药物与siRNA的协同作用，在较低药物浓度条件下，可以有效地抑制乳腺癌细胞的增殖和乳腺癌肿瘤的生长。
本发明的药物载体和本发明的药物具有巨大的社会效益和经济效益，也具有良好的应用前景。
附图说明
图1为mPEG-PCL-PPEEABoc的合成路线图。
图2为EABoc和PEEABoc的核磁共振谱。
图3为mPEG-PCL大分子引发剂和mPEG-PCL-PPEEABoc的GPC谱。
图4为mPEG-PCL大分子引发剂的的1H NMR谱。
图5为mPEG-PCL-PPEEABoc和mPEG-PCL-PPEEA的1H NMR谱。
图6为芘在不同浓度mPEG-PCL-PPEEA聚合物溶液中的激发光谱。
图7为mPEG-PCL-PPEEA共聚物所形成的纳米颗粒的表征。
图8为mPEG-PCL-PPEEA共聚物所形成的纳米颗粒的细胞毒性。
图9为负载紫杉醇和siRNA的纳米颗粒的示意图。
图10为负载siRNA的纳米颗粒对细胞中PLK1蛋白表达量的影响。
图11为负载紫杉醇和siRNA的纳米颗粒对癌细胞增殖的影响。
图12为负载紫杉醇和siRNA的纳米颗粒对裸鼠乳腺癌肿瘤的生长抑制效果。
图13为不同处理后的裸鼠的肿瘤切片TURNEL染色的照片。
图14为不同处理后的裸鼠的肿瘤切片H&E染色的照片。
图15为不同处理后的裸鼠的器脏与体重相比的结果。
图16为不同处理后的裸鼠的血液中谷丙转氨酶水平的检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
N/P指的是纳米颗粒的胺基正电荷与siRNA磷酸基团的负电荷的比值。
实施例中所用原料来源及处理方法：
PLK1 siRNA的序列如下：
正义序列：5’-UgAAgAAgAUCACCCUCCUUAdTdT-3’
反义序列：5’-UAAggAgggUgAUCUUCUUCAdTdT-3’
N.C.siRNA的序列如下：
正义序列：5’-UUCUCCgAACgUgUCACgUdTdT-3’
反义序列：5’-ACgUgACACgUUCggAgAAdTdT-3’
ε-己内酯(CL，Acros)，纯度≥99％，在N2气氛下用CaH2回流24h，使用前减压蒸出。
聚乙二醇单甲醚(Mn＝2000g/mol，mPEG45)，购于Aldrich公司，纯度≥99.5％，使用前用甲苯共沸除水。
异辛酸亚锡(国药集团化学试剂有限公司)，先用对二甲苯共沸两次，然后再减压蒸馏，收集152℃(20～40Pa)的馏分用于聚合反应。
三氯化磷、乙二醇，使用前重蒸。
二氯甲烷，用五氧化二磷回流24h，使用前蒸出。
三乙胺，先后用邻苯二甲酸酐，NaOH和CaH2分别回流24h，使用前蒸出。
四氢呋喃，用钠钾合金回流，使用前蒸出。
乙醚、甲苯用钠砂回流干燥，均在使用前蒸出。
未经说明的其他试剂直接使用。
实施例1、mPEG-PCL-PPEEA的合成和表征
一、2-(N-叔丁氧羰基胺基)乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(PEEABoc)环状磷酸酯单体的合成与表征
(一)2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(COP)的合成
COP合成路线如图1(A)所示。合成COP的具体步骤为：在300mL 3.26mol/L三氯化磷的二氯甲烷溶液中，缓慢加入301mL 3.25mol/L乙二醇的二氯甲烷溶液。待滴完后，继续反应0.5小时，减压蒸去溶剂。再连续两次减压蒸出产物后，溶解在苯中，通3天O2直到反应完全，减压蒸馏(20Pa)，收集72℃的馏分，得到COP。
(二)N-叔丁氧羰基胺基乙醇(EABoc)的合成和表征
合成路线如图1(B)所示。合成EABoc的具体步骤为：在250毫升三口瓶中依次加入6.1克(0.10mol)乙醇胺、100mL四氢呋喃、100mL超纯水，搅拌待其完全溶解后，连续加入8.4g(0.1mol)碳酸氢钠和21.8g(0.1mol)二碳酸二叔丁酯。在0℃下反应30分钟后，自然升至室温反应过夜。反应液用100mL乙醚萃取2次，有机相用无水硫酸钠干燥。减压下除去溶剂，得到EABoc，产率为95％。
对EABoc进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析，1H NMR谱见图2(A)。
由图2(A)可见，各种质子均得到相应归属，积分比例吻合。
(三)2-(N-叔丁氧羰基胺基)乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(PEEABoc)的合成和表征
合成路线如图1(C)所示。合成PEEABoc的具体步骤为：在-5℃的低温反应浴下，将制得的COP(14.25g，0.1mol)的四氢呋喃(30ml)溶液滴加到EABoc(16.10g，0.1mol)和三乙胺(10.12g，0.1mol)的四氢呋喃(120ml)溶液中，反应过夜。然后在N2保护下，过滤以上溶液，将滤液浓缩后，用400mL干燥的冷乙醚沉淀，移去上清液，沉淀物用油泵抽干，即为PEEABoc。
对PEEABoc进行核磁共振氢谱(1H NMR)和核磁共振碳谱(13C-NMR)分析，1H NMR谱见图2(B)，13C-NMR谱见图2(C)。
从图2(B)可以观察到，1.43ppm的单峰为叔丁基的9个氢核，3.36ppm和4.12ppm的三重峰分别为-OCH2CH2NH-和-OCH2CH2NH-片段上的2个氢核，4.36ppm的多重峰为磷酸酯环-OCH2CH2O-上的4个氢核。在图2(C)中，各种碳的化学位移已在图中标明。以上的核磁共振谱证明了单体的结构。
二、聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物(mPEG-PCL-PPEEA)的合成和表征
(一)聚乙二醇单甲醚-聚己内酯(mPEG-PCL)大分子引发剂的合成和表征
各种分子量的端羟基聚乙二醇单甲醚-聚己内酯大分子引发剂是以聚乙二醇单甲醚为引发剂，在本体条件下引发己内酯单体聚合而成。通过调节聚乙二醇单甲醚的分子量以及己内酯与聚乙二醇单甲醚的投料比，可以得到不同分子量的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯聚合物。异辛酸亚锡因其高催化效率及无毒性，是被最广泛应用的内酯及交酯环状单体开环聚合反应的催化剂，已被美国FDA批准作为食品添加剂。
以mPEG45为引发剂，异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)为催化剂制备聚合物，聚合反应在手套箱中进行，mPEG-PCL合成的具体实验步骤如下：
1)将进行反应的圆底烧瓶经多次的抽真空火焰干燥和充氮气的处理后，放入手套箱。
2)按表1的配比进行投料：向烧瓶中加入mPEG45、CL单体和Sn(Oct)2，在120℃搅拌下反应。
3)反应24小时后，将产物移出手套箱，用少量的CH2Cl2溶解，将溶液沉淀到冷的乙醚中，反复两次，收集沉淀物，用油泵抽干至恒重为止，即得产物。
不同投料比可得到不同的产物，如此得到了一系列mPEG-PCL共聚物，见表1。
表1不同投料比(摩尔比)合成mPEG-PCL
a聚合物右下角的数字代表聚合物根据1H NMR得到的聚合度
对上述mPEG-PCL共聚物进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析，测定其聚合度和数均分子量。用凝胶渗透色谱(GPC〕法以聚苯乙烯为标准分析mPEG-PCL共聚物的数均分子量和分子量分布PDI(分子量分布宽度指数)。聚合度、数均分子量和分子量分布PDI见表2。
GPC谱见图3(A)和图3(B)。1H NMR谱见图4。
表2mPEG-PCL聚合物的表征
aGPC测定；b1H NMR测定。
由表2可见，根据1H NMR计算结果，mPEG45-PCL45的数均分子量为7130g/mol，对应的嵌段PCL45的数均分子量为5130g/mol；mPEG45-PCL100的数均分子量为13400g/mol，对应的嵌段PCL100的数均分子量为11400g/mol。
图3(A)对应mPEG45-PCL45；图3(B)对应mPEG45-PCL100。从图中可以看到两种聚合物呈现的都是规整的单峰，并具有相对较窄的分子量分布。
图4(A)对应mPEG45-PCL45；图4(B)对应mPEG45-PCL100。经过对比可以看到mPEG45-PCL45和mPEG45-PCL100具有相似的谱，分析如下：字母a到f标记了归属mPEG-PCL的所有质子信号，聚ε-己内酯的聚合度通过4.02ppm的三重峰(归属于聚己内酯的-C(O)OCH2)与3.63ppm的单峰(归属于聚乙二醇单甲醚的-CH2CH2-)的积分面积比计算得到。
(二)聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物(mPEG-PCL-PPEEA)的合成和表征
以mPEG-PCL为引发剂，异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)为催化剂制备聚合物，聚合反应在手套箱中进行。在反应前，mPEG-PCL大分子引发剂用干燥的甲苯共沸两次，减压抽干。合成路线如图1(D)。合成mPEG-b-PCL-b-PPEEABoc的具体步骤如下：
1)将进行反应的圆底烧瓶经多次的抽真空火焰干燥和充氮气的处理后，放入手套箱。
2)按表2的比例进行投料：往25mL烧瓶中加入mPEG-PCL、PEEABoc和THF，保证PEEABoc的起始浓度为1mol/L。在30℃下搅拌30分钟后，加入Sn(Oct)2。
3)反应3小时后，将反应液浓缩，在0℃下沉淀到10∶1(v/v)的乙醚/甲醇混合溶剂中，过滤，将固体抽干，即得到mPEG-b-PCL-b-PPEEABoc。
4)取1g上述聚合物溶于10mL无水THF，加入20mL的6M HCl/THF溶液使得HCl最终的浓度为4M。在0℃下搅拌反应2小时后，将反应液浓缩，用冷的乙醚沉淀，过滤，抽干固体，即得到mPEG-b-PCL-b-PPEEA聚合物。
表3不同投料比(摩尔比)合成mPEG-PCL-PPEEABoc聚合物
a聚合物右下角的数字代表聚合物根据1H NMR得到的聚合度
用凝胶渗透色谱(GPC〕法以聚苯乙烯为标准分析mPEG-PCL-PPEEABoc共聚物的数均分子量和分子量分布PDI(分子量分布宽度指数)。需要指出，由于脱保护后的mPEG-PCL-PPEEA很难用GPC表征，所以所列的分子量及分子量分布都是指脱保护前的mPEG-PCL-PPEEABoc。对mPEG-PCL-PPEEABoc和mPEG-PCL-PPEEA进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析，测定其聚合度和数均分子量。mPEG-PCL-PPEEABoc的聚合度、数均分子量和分子量分布PDI见表4。mPEG-PCL-PPEEABoc的GPC谱见图3(C)和图3(D)。
mPEG45-b-PCL-b-PPEEABoc和mPEG45-b-PCL-b-PPEEA的1H NMR谱见图5。
表4聚合物的表征
aGPC测定；b1H NMR测定。
由表4可见，根据1H NMR计算结果，mPEG45-PCL45-PPEEABoc7的数均分子量为9000g/mol，对应的嵌段PPEEABoc7的数均分子量为1870g/mol；脱保护后对应的mPEG45-PCL45-PPEEA7的数均分子量为6550g/mol，对应的嵌段PPEEA7的数均分子量为1，420g/mol；mPEG45-PCL100-PPEEABoc12的数均分子量为16600g/mol，对应的嵌段PPEEABoc12的数均分子量为3200g/mol；脱保护后对应的mPEG45-PCL100-PPEEA12的数均分子量为15840g/mol，对应的嵌段PPEEA12的数均分子量为2430g/mol。
图3(C)对应mPEG45-b-PCL45-b-PPEEABoc7；图3(D)对应mPEG45-b-PCL100-PPEEABoc12。从图中可以看到聚合物呈现的都是规整的单峰，并具有相对较窄的分子量分布。与mPEG-PCL大分子引发剂(图3(A)和图3(B))比较可以看到mPEG-PCL-PPEEABoc聚合物的分子量向高分子量方向移动。
图5(A)对应脱保护前的mPEG45-b-PCL45-b-PPEEABoc7；图5(B)对应脱保护后的mPEG45-b-PCL45-b-PPEEA7；图5(C)对应脱保护前的mPEG45-b-PCL100-b-PPEEABoc12；图5(D)对应脱保护后的mPEG45-b-PCL100-b-PPEEA12。与图4(A)相比较，图5(A)和图5(C)出现了几个新的信号，如在1.40～1.48ppm处的多峰对应的除PCL链段上的e处的亚甲基的质子信号外，明显多出了聚磷酸酯侧基Boc保护基团上甲基的9个氢核(j)的质子信号，在4.35ppm处出现的信号对应于聚磷酸酯主链段上-O-CH2-CH2-O-的4个氢核(g)的峰，在4.20ppm和3.41ppm出现的质子峰则归属于聚磷酸酯链段侧基上的-O-CH2(h)-CH2(i)-NH-的信号。聚磷酸酯链段的聚合度是根据HNMR图中在4.35ppm处的聚磷酸酯主链上的质子(g)积分面积与在3.63ppm处的聚乙二醇主链上的质子(b)积分面积之比计算的。这些聚磷酸酯链段上特征信号峰的出现证明了嵌段聚合物的生成。将mPEG45-PCL100-PPEEABoc12三嵌段聚合物在无水的HCl/THF溶液中反应脱去Boc的保护基团，图5(B)和图5(D)给出了脱保护后1H-NMR谱图的变化。从中可以发现，Boc基团上的1.48ppm处的强峰消失，而在8.42ppm处出现了一个钝峰，对应于侧链胺基的活泼氢，从而证明了脱保护的成功进行，并且从图中相应峰的积分面积计算己内酯和磷酸酯链段保持完整，没有发生降解等副反应，相应链段的聚合物均没有变化。
实施例2、用mPEG-PCL-PPEEA共聚物制备纳米颗粒
用实施例1制备的两种mPEG-PCL-PPEEA共聚物制备纳米颗粒。
一、纳米颗粒的制备
两亲性嵌段共聚物在水溶液中存在疏水嵌段的疏水相互作用，只要共聚物浓度高于临界聚集浓度即可形成纳米颗粒。
制备纳米颗粒的方法有多种，最简单常见的就是溶剂挥发法，具体方法为：将10mgmPEG-PCL-PPEEA三嵌段共聚物溶于1mL四氢呋喃中，室温下搅拌1小时，然后在搅拌下以60mL/h的速度滴入10mL超纯水，再搅拌两小时后，于减压下抽掉有机溶剂，定容到10mL，得到1mg/mL的纳米颗粒溶液。
通过上述方法分别制备1mg/mL的mPEG45-PCL45-PPEEA7纳米颗粒溶液和1mg/mL的mPEG45-PCL100-PPEEA12纳米颗粒溶液。
二、临界聚集浓度(CAC)的测定
以芘为荧光探针表征两亲性聚合物的聚集体的临界聚集浓度是最为常见和有效的方法。
将上述配制的1mg/mL的纳米颗粒溶液稀释成一系列浓度，同时保证每一浓度下芘的浓度保持6×10-7mol/L不变。固定最大发射波长在390nm，扫描芘的激发光谱。见图6(A)和(B)。
图6为芘在不同浓度mPEG-PCL-PPEEA聚合物溶液中的激发光谱。图6(A)为mPEG45-PCL45-PPEEABoc7；图6(B)为mPEG45-PCL100-PPEEABoc12。由图可见，两图的变化趋势一致。随着聚合物浓度的增加，芘探针的荧光光谱发生了显著的变化，首先是峰的强度逐渐增强，其次是其(0，0)吸收谱带从336nm红移到339nm，这些变化是由于芘由水环境转移至疏水环境，意味着核壳结构的纳米颗粒的形成。
结合上述的激发光谱，计算每个聚合物浓度下339nm和336nm时峰的强度比，即I339/I336，将一系列的I339/I336对相应的浓度的对数作图，见图6(C)，图中的Log特指Log10。
由图6(C)可见，两条曲线均呈S型，在低浓度下，聚合物的荧光强度基本稳定，当达到一定浓度后，其比值开始迅速增大，表明芘选择性的由水环境进入疏水核中，此时纳米颗粒形成。继续增大聚合物浓度时，荧光强度到达一个平台，不再增大，这表明共聚物在水中已完全自组装形成了以聚己内酯为疏水核的纳米颗粒。CAC值可由水平线与斜线切线的交点确定。
利用上述方法求得mPEG45-PCL45-PPEEA7和mPEG45-PCL100-PPEEA12的CAC值分别为3.57×10-3和2.68×10-3mg/mL。可以发现，随着疏水链段聚己内酯的增加，聚合物的CMC值减小，表明随疏水相互作用的增强，聚合物胶束更易形成。CAC的大小直接反应了聚合物颗粒在水溶液中的稳定性，其值愈小表明组装颗粒的稳定性愈高。本发明中的聚合物的CAC值与一般的小分子表面活性剂相比，低了近两个数量级，表明此聚合物较好的稳定性。
三、纳米颗粒的形态
利用透射电子显微镜观察mPEG-PCL-PPEEA共聚物所形成的纳米颗粒的形态。如图7(A)和图7(B)所示，图7(A)对应mPEG45-PCL45-PPEEA7；图7(B)对应mPEG45-PCL100-PPEEA12。
由图可见，两种mPEG-PCL-PPEEA共聚物所形成的纳米颗粒都呈现规整的球形结构，粒径约为20nm和60nm且大小分布均一。
四、纳米颗粒的粒径和zeta电势
通过型号为Malvern Zetasizer Nanao ZS90的动态光散射仪检测浓度为0.1mg/mL的mPEG-PCL-PPEEA纳米颗粒的粒径与粒径分布。图7(C)和图7(D)分别是聚合物mPEG45-PCL45-PPEEA7的粒径和zeta电势的结果，图7(E)和图7(F)分别是聚合物mPEG45-PCL100-PPEEA12的粒径和zeta电势的结果。
mPEG45-PCL45-PPEEA7纳米颗粒的平均直径为27.7nm，粒径分散度(PDI)为0.20，zeta电势为32.3mV。mPEG45-PCL100-PPEEA12颗粒的平均直径在121nm，粒径分散度(PDI)为0.09，zeta电势为45mV。需要指明的是，利用动态光散射测量的粒径比透射电子显微镜的结果偏大，这主要是因为动态光散射测量的是纳米颗粒在水溶液中的流体动力学半径，而透射电镜测量的是纳米颗粒在脱水状态的粒径。但是不管哪种测量方法均显示上述三嵌段聚合物的纳米颗粒都具有均匀的粒径分布。这些正电荷除了可以稳定纳米颗粒外，更主要的作用是可以结合siRNA，起到传输siRNA的作用。
五、mPEG-PCL-PPEEA纳米颗粒的生物相容性
将上述配制的1mg/mL的纳米颗粒溶液稀释为1.95-500μg/mL。通过MTT方法测定不同浓度mPEG-PCL-PPEEA共聚物纳米颗粒的细胞毒性。具体试验为：将不同浓度的mPEG45-PCL45-PEEP7纳米颗粒溶液和不同浓度的mPEG45-PCL100-PEEP12纳米颗粒溶液分别与HEK293细胞共培养24小时后，分别测细胞存活率，以PEI作为对照实验。不同处理下细胞的存活率见图8。
由图可见，当聚合物浓度从1.95μg/mL增大到500μg/mL，两种纳米颗粒对细胞活力都没有明显的影响，细胞活力一直维持在100％左右，表明上述纳米颗粒具有良好的生物相容性。
实施例3、mPEG45-PCL100-PPEEA12纳米颗粒作为siRNA载体的应用
负载siRNA药物的纳米颗粒的制备方法如下：用实施例1制备的mPEG45-PCL100-PPEEA12共聚物制备纳米颗粒溶液，方法同实施例2。将一定量的siRNA溶液加入50μL Opti-MEM中，得到siRNA溶液。将纳米颗粒溶液与siRNA溶液混合，室温静置20分钟，得到负载siRNA药物的纳米颗粒。
负载siRNA药物的Lipofectamine 2000的制备方法如下：将一定量的siRNA溶液加入50μL Opti-MEM中，得到siRNA溶液。将一定量的Lipofectamine 2000加入到适量Opti-MEM中，混匀。将Lipofectamine 2000溶液与siRNA溶液混合，室温静置20分钟，得到负载siRNA药物的Lipofectamine 2000。
一、对乳腺癌细胞内基因表达的作用
将MDA-MB-435s细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，TCHu 35)以5×105的密度接种于六孔板中24小时后，分别进行如下处理，每个处理设置三次重复：
处理一：用负载PLK1 siRNA药物的纳米颗粒溶液处理细胞，PLK1 siRNA的终浓度为12.5nM，固定N/P为50。
处理二：用负载PLK1 siRNA药物的纳米颗粒溶液处理细胞，PLK1 siRNA的终浓度为25nM，固定N/P为50。
处理三：用负载PLK1 siRNA药物的纳米颗粒溶液处理细胞，PLK1 siRNA的终浓度为62.5nM，固定N/P为50。
处理四：用负载PLK1 siRNA药物的纳米颗粒溶液处理细胞，PLK1 siRNA的终浓度为125nM，固定N/P为50。
对照一：用负载PLK1 siRNA药物的Lipofectamine 2000溶液处理细胞，PLK1 siRNA的终浓度为50nM，Lipofectamine 2000与PLK1 siRNA的质量比为3.75。
对照二：用PLK1 siRNA溶液处理细胞，PLK1 siRNA的终浓度为125nM。
对照三：用N.C.siRNA溶液处理细胞，N.C.siRNA的终浓度为125nM。
对照四：用负载N.C.siRNA的纳米颗粒溶液处理细胞，N.C.siRNA的终浓度为125nM，固定N/P为50。
对照五：用负载N.C.siRNA的Lipofectamine 2000溶液处理细胞，N.C.siRNA的终浓度为50nM，Lipofectamine 2000与N.C.siRNA的质量比为3.75。
对照六：用无菌水处理细胞。
在转染培养48小时后，用RNAsimple总RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取细胞中的总RNA。用紫外分光光度计测定提取的RNA样品的浓度，然后反转录获得cDNA后进行PCR反应，PCR的产物用1％琼脂糖凝胶电泳检验，
结果表明：对照六的细胞内的PLK1 mRNA表达量很高；对照一的细胞内PLK1 mRNA表达量有所降低；四个处理组中，细胞中的PLK1 mRNA表达量与对照六相比有明显的降低，并且随着siRNA的用量增加而减少。
二、对乳腺癌细胞内蛋白表达的作用
将MDA-MB-435s细胞以5×105的密度接种于六孔板中24小时后，分别进行如下处理，每个处理设置三次重复：
处理一：用负载PLK1 siRNA药物的纳米颗粒溶液处理细胞，PLK1 siRNA的终浓度为25nM，固定N/P为50。
处理二：用负载PLK1 siRNA药物的纳米颗粒溶液处理细胞，PLK1 siRNA的终浓度为62.5nM，固定N/P为50。
处理三：用负载PLK1 siRNA药物的纳米颗粒溶液处理细胞，PLK1 siRNA的终浓度为125nM，固定N/P为50。
对照一：用负载PLK1 siRNA药物的Lipofectamine2000溶液处理细胞，PLK1 siRNA的终浓度为50nM，Lipofectamine2000与PLK1 siRNA的质量比为3.75。
对照二：用无菌水处理细胞。
细胞处理48小时后，用细胞裂解液处理细胞，将细胞裂解液收集后用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各样品的蛋白浓度。每个样品取50μg蛋白，进行10％SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS PAGE)电泳，然后将蛋白转移到PVDF膜上。用5％牛血清白蛋白封闭PVDF膜2小时后，用膜清洗液(溶解0.05％Tween 20的PBS)清洗膜两次，然后用β-actin(Santacruz，Cat：sc-47778)的一抗或者PLK1的一抗(Santa cruz，Cat：sc-17783)孵育PVDF膜2小时，然后用膜清洗液清洗膜两次后用带有HRP标记的二抗(Santa cruz，Cat：sc-2031)孵育膜1小时。通过ECL显色反应将蛋白条带曝光在底片上。
结果见图10。图10中，1：对照二；2：对照一；3：处理一；4：处理二；5：处理三。结果显示：对照二的细胞中的PLK1蛋白表达量最高；对照一的细胞中的PLK1蛋白表达量有明显的下降；处理一、处理二和处理三中的细胞中的PLK1蛋白表达量有明显的下降，并且能够随着siRNA的剂量的增加，细胞中PLK1蛋白的表达量降低。
mPEG45-PCL45-PPEEABoc7作为siRNA载体具有与mPEG45-PCL100-PPEEA12相同的效果。
实施例4、mPEG45-PCL100-PPEEA12纳米颗粒作为紫杉醇载体的应用
一、负载紫杉醇的纳米颗粒的制备
紫杉醇通过溶剂挥发法包载进胶束纳米颗粒中，具体操作为：将10mg实施例1制备的mPEG45-PCL100-PPEEA12共聚物溶解在1.0mL四氢呋喃中，然后再向其中加入一定体积的事先溶解于四氢呋喃的紫杉醇溶液(聚合物质量∶紫杉醇质量＝50～1000)。将10mL超纯水逐滴加入上述溶液中，在室温下搅拌1小时后用真空泵将四氢呋喃除掉并且抽去一部分水，当剩余2mL液体时停止抽真空。取出胶束纳米颗粒溶液，然后以5000rpm离心除去游离的紫杉醇。
二、载药量和包封率的测定
将包载有紫杉醇的纳米颗粒取1mL冻干后用乙腈∶水＝50∶50(体积比)的混合溶剂溶解，紫杉醇的包载量通过HPLC测定。紫杉醇的载药量(DLC)和包封率(DLE)由以下公式计算：
试验设置三次重复，结果为平均值。结果见表5。当嵌段共聚物与紫杉醇的投料质量比在50比1与1000比1之间，紫杉醇几乎没有沉淀，包封率(DLE)基本上都在90％以上，如表5所示。在聚合物与紫杉醇的投料比是50∶1时，包封率(DLE)是92.5％，载药量(DLC)是1.85％；当投料比降低到200∶1时，包封率(DLE)提高到94.2％，但载药量(DLC)下降到0.47％。进一步提高投料比到1000∶1，包封率(DLE)达到了95.1％，而载药量(DLC)只有0.059％。
表5负载紫杉醇的纳米颗粒的载药量和包封率
通过动态光散射测量以上负载紫杉醇的纳米颗粒的粒径。通过Zeta电势测量以上负载紫杉醇的纳米颗粒的表面的电势。试验设置三次重复，结果为平均值±标准差。结果见表6。当只有聚合物形成胶束纳米颗粒时，其粒径在75nm左右，表面电位为51mV左右，当聚合物与紫杉醇按照投料比是50∶1或者更低时，所形成的纳米颗粒的粒径为60～70nm之间；表面电位在42～50mV之间。这说明这种嵌段共聚物在包载疏水性药物时，对胶束纳米颗粒的粒径和表面电位性质基本上没有影响。
表6负载紫杉醇的纳米颗粒的粒径和表面电势
mPEG45-PCL45-PPEEABoc7作为紫杉醇载体具有与mPEG45-PCL100-PPEEA12相同的效果。
实施例5、mPEG45-PCL100-PPEEA12纳米颗粒作为紫杉醇和siRNA载体的应用
一、负载紫杉醇和siRNA的纳米颗粒的制备
1、纳米颗粒的制备
用实施例1制备的mPEG45-PCL100-PPEEA12共聚物制备纳米颗粒溶液，方法同实施例2。
2、负载紫杉醇的纳米颗粒的制备
紫杉醇通过溶剂挥发法包载进胶束纳米颗粒中，具体操作为：将10mg实施例1制备的mPEG45-PCL100-PPEEA12共聚物溶解在1.0mL四氢呋喃中，然后再向其中加入一定体积的事先溶解于四氢呋喃的紫杉醇溶液。将10mL超纯水逐滴加入上述溶液中，在室温下搅拌1小时后用真空泵将四氢呋喃除掉并且抽去一部分水，当剩余2mL液体时停止抽真空。取出胶束纳米颗粒溶液，然后以5000rpm离心除去游离的紫杉醇。
3、负载紫杉醇和siRNA的纳米颗粒的制备
将一定量的siRNA溶液加入50μL Opti-MEM中，得到siRNA溶液。将步骤1制备的负载紫杉醇的纳米颗粒溶液与siRNA溶液混合，室温静置20分钟，得到负载紫杉醇和siRNA的纳米颗粒。
二、对癌细胞增殖的影响
采用3H标记的胸腺嘧啶检测细胞增殖。将MDA-MB-435s细胞以5×105的密度接种于六孔板中24小时后，分别进行如下处理，每个处理组设置三个重复，结果取平均值：
处理一：用负载紫杉醇和PLK1 siRNA的纳米颗粒溶液处理细胞，紫杉醇的终浓度为0.1μg/mL，PLK1 siRNA的终浓度为125nM，固定N/P为50(即纳米颗粒的浓度为375μg/mL)。
处理二：用负载紫杉醇和PLK1 siRNA的纳米颗粒溶液处理细胞，紫杉醇的终浓度为0.01μg/mL，PLK1 siRNA的终浓度为125nM，固定N/P为50(即纳米颗粒的浓度为375μg/mL)。
处理三：用负载紫杉醇和PLK1 siRNA的纳米颗粒溶液处理细胞，紫杉醇的终浓度为0.005μg/mL，PLK1 siRNA的终浓度为125nM，固定N/P为50(即纳米颗粒的浓度为375μg/mL)。
处理四：用负载紫杉醇和PLK1 siRNA的纳米颗粒溶液处理细胞，紫杉醇的终浓度为0.001μg/mL，PLK1 siRNA的终浓度为125nM，固定N/P为50(即纳米颗粒的浓度为375μg/mL)。
对照一：用负载紫杉醇的纳米颗粒溶液处理细胞，紫杉醇的终浓度为0.1μg/mL，纳米颗粒溶液的终浓度为375μg/mL。
对照二：用负载紫杉醇的纳米颗粒溶液处理细胞，紫杉醇的终浓度为0.01μg/mL，纳米颗粒溶液的终浓度为375μg/mL。
对照三：用负载紫杉醇的纳米颗粒溶液处理细胞，紫杉醇的终浓度为0.005μg/mL，纳米颗粒溶液的终浓度为375μg/mL。
对照四：用负载紫杉醇的纳米颗粒溶液处理细胞，紫杉醇的终浓度为0.001μg/mL，纳米颗粒溶液的终浓度为375μg/mL。。
对照五：用DMSO溶解的紫杉醇处理细胞，紫杉醇的终浓度为0.1μg/mL。
对照六：用DMSO溶解的紫杉醇处理细胞，紫杉醇的终浓度为0.01μg/mL。
对照七：用DMSO溶解的紫杉醇处理细胞，紫杉醇的终浓度为0.005μg/mL。
对照八：用DMSO溶解的紫杉醇处理细胞，紫杉醇的终浓度为0.001μg/mL。
对照九：用纳米颗粒溶液处理细胞，纳米颗粒溶液的终浓度为375μg/mL。
对照十：用负载PLK1 siRNA的纳米颗粒溶液处理细胞，PLK1 siRNA终浓度为125nM。
对照十一：用负载PLK1 siRNA的Lipofectamine 2000溶液处理细胞，PLK1 siRNA终浓度为50nM，Lipofectamine 2000与N.C.siRNA的质量比为3.75。
对照十二：用负载N.C.siRNA的Lipofectamine 2000溶液处理细胞，N.C.siRNA终浓度为50nM，Lipofectamine 2000与N.C.siRNA的质量比为3.75。
对照十三：用无菌水处理细胞。
经上述处理的MDA-MB-435s细胞在37℃5％培养箱中培养42小时，然后每孔中加入20μL含有0.5μCi 3H-TdR(GE Healthcare，Cat：25007364)的PBS，再继续培养6小时后，用多头细胞收集器将每孔培养物分别吸收于直径24mm的玻璃纤维滤纸上，抽气过滤并用蒸馏水充分洗涤。将滤纸片放在80℃烘干约1h，然后将滤纸片浸于加了10ml脂溶性闪烁液(5.0g 2，5-二苯基恶唑(PPO)，0.3g 1，4-双-2-15-苯基恶唑苯(POPOP)溶解于200mL无水乙醇和800mL甲苯中)的闪烁杯中，置于β-液体闪烁计数器中测定每个样品的每分钟脉冲数(cpm值)。将各组数据取平均值，然后以对照十三的数值为100％，其他各组对其做归一化处理。实验结果如图11所示。可以看出用Lipofectamine 2000输运PLK1 siRNA能够显著降低MDA-MB-435s细胞的增殖能力，而用Lipofectamine 2000输运N.C.siRNA对细胞的增殖能力没有影响。用胶束纳米颗粒输运PLK1 siRNA能够抑制MDA-MB-435s细胞的增殖能力，而胶束纳米颗粒对细胞的增殖能力没有影响。当胶束纳米颗粒共输运紫杉醇和PLK1 siRNA与胶束纳米颗粒输运紫杉醇和单独的紫杉醇相比，能够非常显著的降低MDA-MB-435s细胞的增殖能力。
三、对肿瘤生长的抑制
1、原位乳腺癌小鼠肿瘤模型建立
大量培养MDA-MB-435s细胞，在准备注射细胞前用无血清DMEM培养细胞6小时，然后用胰酶消化，经过1000rpm离心收集细胞，用PBS重悬细胞使密度达到2.5×107cells/mL，然后将200μL细胞悬液注射在裸鼠右侧第二个乳腺中。原位注射乳腺癌细胞的裸鼠在SPF级动物房中饲养约10天左右可以形成可见肿瘤。
肿瘤的体积按照公式：
计算，其中a是指肿瘤较长的直径，b是指肿瘤较短的直径。
2、载药纳米颗粒对肿瘤的生长的抑制作用研究
在裸鼠的肿瘤体积达到50mm3左右开始进行治疗，将接种了MDA-MB-435s肿瘤的裸鼠按照下述处理方式分为8组，每组6只裸鼠。
处理一：注射45μL PBS。
处理二：注射45μL溶解60μg泰素
的PBS溶液，作为对照。
处理三：注射45μL纳米颗粒的PBS溶液，纳米颗粒的浓度为5mg/mL。
处理四：注射45μL负载PLK1 siRNA的纳米颗粒的PBS溶液，PLK1 siRNA的量为80pmol，纳米颗粒溶液的浓度为5mg/mL(即N/P为50)。
处理五：注射45μL结合N.C.siRNA的纳米颗粒的PBS溶液，N.C.siRNA的量为80pmol，纳米颗粒溶液的浓度为5mg/mL(即N/P为50)。
处理六：注射45μL溶解3.2ng紫杉醇的PBS溶液。
处理七：注射45μL包载紫杉醇的纳米颗粒的PBS溶液，紫杉醇的浓度为0.0667μg/mL，纳米颗粒溶液的浓度为5mg/mL。
处理八：注射45μL负载紫杉醇和PLK1 siRNA的纳米颗粒的PBS溶液，PLK1 siRNA的量为80pmol，紫杉醇的浓度为0.067μg/mL，纳米颗粒溶液的浓度为5mg/mL。
自裸鼠分组当天起，开始对裸鼠进行治疗，各组溶液注射在肿瘤内部。每4天为一个治疗周期，其中前3天进行各组注射治疗，总共进行7个治疗周期。在治疗开始后，每隔一天对肿瘤体积测量一次。图12显示了肿瘤体积的变化，图中的纵坐标为测量得到的肿瘤体积与治疗前模型的平均肿瘤体积的比值。从图中可以看出，PBS、纳米颗粒的PBS溶液和结合N.C.siRNA的纳米颗粒PBS溶液对肿瘤的生长没有抑制作用。泰素
作为现在应用广泛的癌症化疗药物有非常明显的肿瘤生长抑制作用。纳米颗粒输送PLK1 siRNA也能比较有效的抑制肿瘤生长。溶解紫杉醇的PBS溶液和包载紫杉醇的纳米颗粒溶液对肿瘤生长的抑制作用相当，但都没有PLK1 siRNA作用明显。抑制肿瘤生长作用最明显的是同时输送紫杉醇和PLK1 siRNA的纳米颗粒。这证明这种共输送的体系能够在很低的化疗药物浓度和siRNA浓度的情况下很好的抑制肿瘤的生长。
完成4个治疗周期的治疗后，将裸鼠处死，首先取裸鼠的血以进行谷丙转氨酶的测量；然后每组中取一只裸鼠进行拍照；将肿瘤从裸鼠体内取出后先进行拍照然后用4％多聚甲醛对组织进行固定，切片后用H&E染色和TUNEL染色。测量裸鼠体内各个器脏重量和裸鼠重量。
从裸鼠肿瘤大小可以明显地看出经纳米颗粒同时输送紫杉醇和PLK1 siRNA的治疗组的肿瘤体积明显小于其他处理组的肿瘤体积。图13表示各处理组肿瘤组织切片经TUNEL染色的结果。图13中，A为处理一；B为处理六；C为处理七；D为处理八。可以清楚的看出经PBS处理的肿瘤组织中癌细胞生长正常没有出现凋亡的癌细胞，而经紫杉醇、纳米颗粒输送的紫杉醇和纳米颗粒共同输送紫杉醇和PLK1 siRNA处理的肿瘤组织中都出现了明确的凋亡的癌细胞区域，并且经纳米颗粒共输运紫杉醇和PLK1 siRNA处理的肿瘤组织中凋亡癌细胞面积最大，治疗效果最好。图14表示各处理组肿瘤组织切片经H&E染色的结果。图14中，A为处理一；B为处理二；C为处理三；D为处理四；E为处理六；F为处理七；G为处理八。可以很清楚的看出经PBS处理的肿瘤组织中癌细胞生长正常，经泰素处理的肿瘤组织中癌细胞已经消失，经纳米颗粒处理的肿瘤组织中癌细胞生长也正常，但是其余各处理组的肿瘤组织中均出现不同于正常癌细胞组织的区域，为凋亡的癌细胞区域，并且经纳米颗粒共输运紫杉醇和PLK1 siRNA处理的肿瘤组织中凋亡癌细胞面积最大，说明治疗效果最好。图15表示各种处理组的裸鼠的体内器脏重量与裸鼠体重的比值，可以看出各种条件的处理对裸鼠的重要器官没有影响。图16表示各种处理组的裸鼠的谷丙转氨酶的浓度变化，经过纳米颗粒共同输送紫杉醇和PLK1 siRNA处理的裸鼠的谷丙转氨酶浓度与PBS处理组相比，没有明显的升高，在正常的范围内。以上实验表明本发明中的共同给药体系具有很好的肿瘤治疗效果，并且没有显示出动物体内的毒副作用，具有很好的生物相容性和生物安全性。
mPEG45-PCL45-PPEEABoc7作为紫杉醇和siRNA载体具有与mPEG45-PCL100-PPEEA12相同的效果。
Claims (10)
1.一种药物载体，它的活性成分是聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物形成的带正电荷的纳米颗粒。
2.如权利要求1所述的药物载体，其特征为：所述药物的活性成分为化学物质。
3.如权利要求2所述的药物载体，其特征在于：所述化学物质包括紫杉醇。
4.如权利要求3所述的药物载体，其特征在于：所述化学物质还包括siRNA。
5.如权利要求1至4中任一所述的药物载体，其特征在于：所述三嵌段共聚物中，中间嵌段是所述聚己内酯，一个末端嵌段是聚乙二醇单甲醚，另一个末端嵌段是所述聚磷酸酯；所述聚乙二醇嵌段的聚合度为45，对应的数均分子量为2000g/mol；所述聚己内酯嵌段的聚合度为45-100，对应的数均分子量为5,130-11,400g/mol；所述聚磷酸酯嵌段的聚合度为7-12，对应的数均分子量为1,420-2,430g/mol。
6.如权利要求5所述的药物载体，其特征为：所述三嵌段共聚物为mPEG45-PCL45-PPEEA7或mPEG45-PCL100-PPEEA12。
7.一种治疗癌症的药物，它的活性成分是由聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯负载抗癌药物形成的纳米颗粒。
8.如权利要求7所述的药物，其特征在于：所述抗癌药物为化学物质；所述化学物质包括紫杉醇和/或siRNA。
9.如权利要求7或8所述的药物，其特征在于：所述三嵌段共聚物中，中间嵌段是所述聚己内酯，一个末端嵌段是聚乙二醇单甲醚，另一个末端嵌段是所述聚磷酸酯；所述聚乙二醇嵌段的聚合度为45，对应的数均分子量为2000g/mol；所述聚己内酯嵌段的聚合度为45-100，对应的数均分子量为5,130-11,400g/mol；所述聚磷酸酯嵌段的聚合度为7-12，对应的数均分子量为1,420-2,430g/mol。
10.如权利要求9所述的药物，其特征为：所述三嵌段共聚物为mPEG45-PCL45-PPEEA7或mPEG45-PCL100-PPEEA12；所述癌症为乳腺癌。
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