CN101768276B - 聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物及其应用 - Google Patents
聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101768276B CN101768276B CN2008102467198A CN200810246719A CN101768276B CN 101768276 B CN101768276 B CN 101768276B CN 2008102467198 A CN2008102467198 A CN 2008102467198A CN 200810246719 A CN200810246719 A CN 200810246719A CN 101768276 B CN101768276 B CN 101768276B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sirna
- nano particle
- polycaprolactone
- triblock copolymer
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明公开了一种聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物及其应用。本发明提供的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物,具有良好的生物相容性和可降解性,可在水溶液中自组装形成纳米颗粒,包载用于癌症治疗的小分子化疗药物,同时形成的纳米颗粒带正电荷,能高效结合带负电荷的小干扰RNA,同时将小干扰RNA和化疗药物输送到癌细胞。其优势在于它输送小干扰RNA药物进入细胞沉默癌基因的表达的同时,也携载大大低于正常给药剂量的化疗药物进入癌细胞,而低剂量的化疗药物对正常细胞只有极低的副作用。本发明有可能解决临床上化疗药物毒性高选择性低带来的副作用,同时提高治疗效率,改善癌症治疗的功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物及其应用。
背景技术
癌症是危害人类健康的重大疾病,发病率逐年上升。目前,癌症治疗的手段包括手术、放疗、化疗等,为了最大限度地减少复发转移、提高生存率,积极进行癌症新型疗法的探索十分必要。癌症的靶向治疗是提高癌症治疗效果的一条重要途径,而癌细胞中一些蛋白质分子的特异性表达或过度表达为癌症治疗提供了分子水平的新靶点。乳腺癌为我国女性最常见的恶性肿瘤病之一,居女性恶性肿瘤死亡率的首位,以大中城市的发病率最高。手术治疗仍为乳腺癌的主要治疗手段之一,但是手术治疗会破坏乳房的外形。放射治疗是治疗乳腺癌的主要组成部分,是局部治疗手段之一,不过放射治疗效果受着射线的生物学效应的影响,用目前常用的放疗设施较难达到“完全杀灭”肿瘤的目的。
化疗不同于手术治疗和放射治疗,它是整体性治疗,通过口服及静脉给药在全身起作用。化学治疗能消灭某种癌症的转移或复发,是癌症治疗方法中不可缺少的组成部分,在肿瘤治疗中的应用越来越广泛。目前,约20余种肿瘤单用化疗可以得到缓解,尤其对于一些全身性肿瘤如白血病、多发性骨髓瘤等。化疗与其他治疗方法相配合,大大提高了恶性肿瘤的治疗效果,并有效地控制了癌肿的扩散和转移。但是化疗药物常“是非不清”、“敌我不分”,在杀伤肿瘤细胞的同时,也杀伤了人体正常细胞。因此,化疗可能出现毒性作用和不良反应。如果降低药物浓度以减少这些副作用,就会同时降低对肿瘤的控制效果;反之如增加剂量,在增加疗效的同时也会增加副作用。为了打破这一僵局,人们正在不断尝试新的靶向给药途径。
正常组织中微血管内皮间隙致密、结构完整,大分子和脂质粒不易透过血管壁,而实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差,淋巴回流缺失,造成大分子类物质和脂质粒具有选择性,高通透性和滞留性,这种现象就是实体瘤组织的高通透性和滞留效应,简称EPR效应(enhanced permeability and retentioneffect)。实体瘤组织的病理结构,使得大分子抗癌药对实体瘤具有被动的靶向性或者选择性,全身给药后在肿瘤组织中有较多的分布,又称为实体瘤的被动靶向性;而小分子抗癌药能够自由通过正常组织和肿瘤组织的血管壁,在正常组织和肿瘤组织中的药物分布一致,是造成抗癌效应选择性差、毒副作用较强的重要原因之一,不具备被动靶向作用。
阿霉素(Doxorubicin,简称Dox)是一种常用的小分子抗肿瘤药,具有较强的细胞毒性作用,临床上广泛应用于恶性肿瘤的治疗。但该药具有较强的心脏毒性及骨髓抑制作用,在临床应用上受到一定程度的限制。但是把阿霉素包载于纳米粒和聚合物胶束等一系列药物载体系统后既提高药效又减小毒副作用。目前,临床上应用的是水溶性的阿霉素的盐酸盐,但是有些纳米粒和聚合物胶束要靠疏水相互作用才能把药物包载,故需要先将阿霉素变为疏水性的药物。这样更有利于其在细胞中以及体内实现缓释。
Bcl2基因是一原癌基因,能抑制细胞凋亡。它编码分子量为26×103的蛋白,该蛋白定位于线粒体膜、内质网膜及核膜上,具有离子通道和停靠蛋白的双重功能,通过维持线粒体的完整性阻止细胞凋亡。高表达Bcl2蛋白不仅与许多肿瘤的发生有关,而且在肿瘤化疗耐药的形成中起主要作用。由于Bcl2蛋白的生物功能在正常细胞中并不是绝对需要的,抑制Bcl2蛋白表达可能不会对机体产生较大的影响,因此,将Bcl2作为抗肿瘤药物的新靶点,发展其小分子抑制物无疑是肿瘤治疗的一个极具前景的切入点。RNA干扰用于抑制细胞内Bcl2的表达,但存在结果不稳定、成本高、导入的siRNA易降解等缺点。
RNA干扰(RNAi)是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种生物学现象,是在特定酶参与下,由双链RNA(dsRNA)介导的特异性基因沉默现象。利用RNA干扰技术通过siRNA给药能特异性抑制致病基因的表达,具有高效和多样化的特征,在包括癌症在内的人类疾病治疗中极具潜力。尽管目前在大多数细胞培养和体外应用研究中,siRNA显示出抑制基因的良好潜质,体外siRNA的传输结果也比较满意,但在以治疗人类疾病为目的的体内siRNA传输方面却面临着巨大挑战。由于siRNA分子本身穿透细胞膜的能力极差,也不具备靶向功能,而且在生理环境中极不稳定,因此siRNA药物开发的一个重要关键是siRNA传输体系。
寻找合适的载体材料,能够有效地将siRNA药物分子输送到靶细胞,而且可以在一段时间内维持其功效十分关键。高分子纳米粒已经广泛用于从小分子到生物活性DNA分子的传递的研究,其中很多成果已经用于临床或临床试验。高分子纳米粒传递体系的生物相容性好,具有靶向传递的潜能,具有更好的稳定性,能有效保护生物活性分子对生理环境的耐受性,并增强细胞对被传递分子的吸收。特别值得指出的是高分子自组装的纳米粒具有EPR效应,可促进药物在肿瘤组织的富集,并能有效地被肿瘤部位细胞吸收,进入细胞质和各种细胞器,因此高分子纳米粒是极具潜能的siRNA传递系统的候选者。而具有良好生物相容性的可降解高分子载体,特别是具有快速去质子化能力的可降解阳离子型高分子载体能有效结合和保护siRNA分子,又能使siRNA在细胞质中迅速释放,实现阻断基因表达的目的,这将使这类载体在siRNA给药中具有更好的优势和应用前景。传统的方式均采用水溶性的阳离子聚合物,将这些载体分子与siRNA互混得到二者的复合物或纳米粒,从而实现传递siRNA的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物及其应用。
本发明提供了一种聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物。
所述聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物具体可为mPEG45-PCL100-PEI12。
mPEG45-PCL100-PEI12中,中间嵌段是所述聚己内酯,一个末端嵌段是所述聚乙二醇单甲醚,另一个末端嵌段是所述聚乙烯亚胺;所述聚乙二醇单甲醚嵌段中,聚乙二醇的聚合度为45,对应的数均分子量为2000g/mol;所述聚己内酯嵌段中,聚己内酯的聚合度为100,对应的数均分子量为11400g/mol;所述聚乙烯亚胺嵌段中,聚乙烯亚胺的聚合度为12,对应的数均分子量为520g/mol。
所述数均分子量为核磁共振氢谱(1H NMR)分析结果。
本发明还提供了一种合成聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物的方法,是将聚乙二醇单甲醚-聚己内酯两嵌段聚合物与低分子量聚乙烯亚胺偶联得到三嵌段共聚物;
所述聚乙二醇单甲醚-聚己内酯两嵌段聚合物是以聚乙二醇单甲醚作为引发剂,以异辛酸亚锡为催化剂,引发己内酯单体聚合得到的;
所述低分子量聚乙烯亚胺是以对甲基苯磺酸甲酯作为引发剂,引发2-甲基-2-噁唑啉经阳离子开环聚合,再在酸性条件下脱去乙酰基得到的。
所述酸性条件具体可为大于10%(质量百分比)的盐酸水溶液。
所述的三嵌段共聚物制成的纳米颗粒也属于本发明的保护范围。
所述纳米颗粒还可进行化学修饰或配体修饰。
纳米颗粒可以采用任何常规方法制备,例如如下溶剂挥发法:将三嵌段共聚物溶于四氢呋喃中,于搅拌下滴入超纯水,搅拌两小时后,于减压下除去有机溶剂,再定容至合适的体积。
本发明还保护一种药物载体,它的活性成分为所述纳米颗粒。
载药纳米颗粒可以采用任何常规方法制备,例如如下溶剂挥发法:将三嵌段共聚物和疏水性药物溶于四氢呋喃中,于搅拌下滴入超纯水,搅拌两小时后,于减压下除去有机溶剂,再定容至合适的体积。
所述药物载体可应用于输送siRNA和/或化疗药物。
所述化疗药物具体可为疏水性药物,如阿霉素。
所述药物载体还可应用于制备抑制肿瘤细胞增殖和/或治疗癌症的药物。
可根据预期目的,用所述药物载体负载不同的siRNA和/或化疗药物。比如当所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞和/或所述癌症为乳腺癌时,可用所述药物载体负载Bcl2基因的siRNA和/或阿霉素。
本发明还保护一种抑制肿瘤细胞增殖和/或治疗癌症的药物,它的活性成分是所述共聚物负载siRNA药物和/或化疗药物形成的纳米颗粒。
所述化疗药物具体可为疏水性药物,如阿霉素。
可根据预期目的制备不同功能的药物。比如当预期制备抑制乳腺癌细胞增殖和/或治疗乳腺癌的药物时,可用所述药物载体负载Bcl2基因的siRNA和/或阿霉素形成的纳米颗粒作为活性成分。
具体可将制备好的载药纳米颗粒与siRNA溶液互混来制备负载siRNA药物和化疗药物的纳米颗粒。
本发明提供的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物具有两亲性的特征,在水溶液中自组装形成纳米尺度的颗粒,具有疏水的聚己内酯内核和亲水性的聚乙二醇单甲醚和聚乙烯亚胺外壳。聚乙烯亚胺部分带有可质子化的胺基,在略酸性环境中形成的纳米颗粒表面带有可观的正电荷,通过静电作用可以结合带有负电的siRNA,起到传输siRNA的作用。聚己内酯可以包载疏水性抗癌药物。本发明的共聚物作为药物载体具有如下优点:1、相对疏水性,因此在聚合物链之间的疏水-疏水相互作用促进共聚物自组装;2、可生物降解;3、生物相容的;4、合成方法简单可控;5、原料较为廉价,节约成本。
本发明提供的三嵌段共聚物,具有良好的生物相容性和可降解性,可以在水溶液中自组装形成纳米颗粒,并包载用于癌症治疗的小分子化疗药物,同时这种载体自组装形成的纳米颗粒带有正电荷,能高效结合带有负电荷的小干扰RNA药物,是一种能同时将小干扰RNA药物和小分子化疗药物输送到癌细胞的载体纳米颗粒。这种载体的优势在于它输送小干扰RNA药物进入细胞沉默癌基因的表达的同时,也携载大大低于正常给药剂量的小分子化疗药物进入癌细胞,并进一步高效杀死癌细胞,而这一低剂量的化疗药物对正常细胞只有极低的副作用。这种结合输送小干扰RNA和化疗药物的载体有可能解决临床上化疗药物毒性高选择性低带来的副作用,同时提高治疗效率,改善癌症治疗的功效。
本发明首次利用聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺嵌段共聚物形成的纳米颗粒输送针对Bcl2基因的siRNA和抗肿瘤药物阿霉素,证明了纳米颗粒能够将siRNA和阿霉素运输到细胞内并发挥增强的沉默基因的作用,以及增强的抑制肿瘤细胞生长的作用。本发明提供的纳米颗粒具有良好的生物相容性,同时纳米颗粒具有很好的稳定性和方便制备等特点,使得这类生物可降解的纳米颗粒在化疗药物输送、RNA干扰药物输送,以及二者的同时输送,以治疗疾病中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物的合成流程。
图2为聚合物的1H NMR谱图;(A)聚乙二醇单甲醚-聚己内酯,(B)聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺。
图3为mPEG45-b-PCL100-b-PEI12纳米颗粒的表征;(A)荧光激发光谱图,(B)I339/I336强度比与mPEG45-b-PCL100-b-PEI12浓度对数(Log C)的关系,Log特指Log10。
图4为mPEG45-b-PCL100-b-PEI12纳米颗粒的透射电子显微镜照片。
图5为不同浓度的纳米颗粒的细胞毒性。
图6为0.1mg/mL浓度的纳米颗粒的粒径和表面Zeta电势;(A)粒径,(B)表面Zeta电势。
图7为纳米颗粒与siRNA结合形成的复合物在不同N/P比条件下的粒径和表面电位;(A)粒径,(B)表面电位。
图8为纳米颗粒与siRNA结合形成的复合物的非变性SDS-PAGE电泳结果。
图9为载药载siRNA纳米颗粒进入细胞后的激光共聚焦显微镜照片;(A)培养时间为0.5小时,(B)培养时间为4小时。
图10为载药载siRNA纳米颗粒进入细胞的FACS结果;(A)培养时间为0.5小时,(B)培养时间为4小时。
图11为载药载siRNA纳米颗粒在乳腺癌细胞系MCF-7沉默Bcl2效果的WesternBlot分析结果。
图12为载药载siRNA纳米颗粒对乳腺癌MCF-7细胞系增殖影响的3H标记胸腺嘧啶掺入结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试剂,如无特殊说明,均是可以从常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中的Log特指Log10。
siRNA是一种由二十多个核苷酸组成的双链小分子RNA,带有负电荷,可与带正电的mPEG45-PCL100-PEI12纳米颗粒通过正负电荷作用形成稳定的复合物。
以下试验中的Bcl2 siRNA序列为
正义序列:5’-gUACAUCCAUUAUAAgCUgdTdT-3’;
反义序列:5’-CAgCUUAUAAUggAUgUACdTdT-3’。
杂序siRNA序列为
正义序列:5’-UUCUCCgAACgUgUCACgUdTdT-3’;
反义序列:5’-ACgUgACACgUUCggAgAAdTdT-3’。
实验中所用siRNA的浓度均为20μM,由上海吉玛公司合成。
实施例1、聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物的合成与表征聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物的合成流程见图1。
1、聚乙二醇单甲醚-聚己内酯(mPEG-PCL)两嵌段聚合物的合成和表征
本实验中的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯两嵌段聚合物是由聚乙二醇单甲醚作为引发剂引发己内酯(CL)的聚合而制备得到的。制备中使用异辛酸亚锡作为催化剂,异辛酸亚锡因其高催化效率及无毒性,是被最广泛应用的内酯及交酯环状单体开环聚合反应的催化剂,已被美国FDA批准作为食品添加剂。
具体实验步骤如下:以市售聚乙二醇单甲醚(mPEG45,分子量2000)为引发剂,异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)为催化剂制备聚合物,聚合反应在手套箱中进行。将进行反应的圆底烧瓶经多次的抽真空火焰干燥和充氮气的处理后,放入手套箱,向烧瓶中加入1.20g(0.6mmol)mPEG、7.52g(66mmol)CL单体和0.006g(0.015mmol)Sn(Oct)2,在120℃搅拌下反应。待反应24小时后,将产物移出手套箱,用少量的CH2Cl2溶解,将溶液沉淀到冷的乙醚中,反复两次,收集沉淀物,用油泵抽干至恒重为止,得到聚乙二醇单甲醚-聚己内酯(mPEG-PCL)两嵌段聚合物。mPEG-PCL聚合物的表征见表1,1H NMR谱见图2(A)。
表1 mPEG-PCL聚合物的表征
a聚合物右下角的数字代表聚合物根据核磁计算的得到的聚合度;b表示投料时各物质的摩尔比;cGPC测定的数均分子量和分散度;
2、低分子量聚乙烯亚胺的合成与表征
低分子量的聚乙烯亚胺是由对甲基苯磺酸甲酯(阿法埃莎(天津)化学有限公司)作为引发剂,引发2-甲基-2-噁唑啉(阿法埃莎(天津)化学有限公司)经阳离子开环聚合,然后再在酸性条件下脱去乙酰基而得到。具体实施方法如下:
在手套箱中,将对甲基苯磺酸甲酯(0.44g,2.37mmol),2-甲基-2-噁唑(6.06g,71.30mmol)和溶剂乙腈(11mL)加入到单口烧瓶中。温度恒定在70℃,反应48小时。将反应体系冷却至0℃,加入0.12M NH3/CH3CN溶液,搅拌1小时。过硅胶柱后,将溶液浓缩,沉淀在冷的乙醚中,过滤得到产物:聚(2-甲基-2-噁唑啉)。得到产物2.84g(产率43.7%)。1H NMR(CDCl3,ppm):3.45(s,-CH2CH2N-),3.03(s,CH3N-),2.07~2.13(m,-C(O)CH3)。根据1HNMR谱图计算,其聚合度约为12。
取出上述产物1.5g,溶解于15mL 10%(质量百分比)的盐酸水溶液中,在105℃回流过夜。加入NaOH将反应体系的pH值调节至10,聚合物沉淀出来。将沉淀经离心后分离,并用冷的蒸馏水洗涤三次,冻干后得到低分子量聚乙烯亚胺,产率90.2%。对低分子量聚乙烯亚胺进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析,1H NMR(d6-DMSO,ppm):2.57(s,-CH2CH2NH-),2.90(s,CH3NH-)。
3、聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物的合成与表征
聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物是将步骤1制备的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯两嵌段聚合物与步骤2制备的低分子量的聚乙烯亚胺偶联得到的。具体的反应步骤如下:取2.5g聚乙二醇单甲醚-聚己内酯两嵌段聚合物溶于20mL无水四氢呋喃(THF)中,加入羰基二咪唑(CDI)0.3g,室温下反应12小时。浓缩后,沉淀到冷的乙醚中,过滤后得到固体颗粒,真空抽干。将其再溶解于20mL的DMSO中,并加入低分子量聚乙烯亚胺0.28g,在45℃反应24小时。浓缩后,将聚合物沉淀到冷的6∶1(体积比)的乙醚/甲醇中,过滤后得到聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物。
对聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物(mPEG45-PCL100-PEI12)进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析,氢谱见图2(B)。聚乙二醇的聚合度为45,对应的数均分子量为2000g/mol;聚己内酯嵌段的聚合度为100,对应的数均分子量为11400g/mol;聚乙烯亚胺嵌段的聚合度为12,对应的数均分子量为520g/mol。
实施例2、纳米颗粒的制备和表征
用实施例1制备的mPEG45-PCL100-PEI12三嵌段共聚物进行如下试验。
一、纳米颗粒的制备和表征
1、纳米颗粒(以下简称NP)的制备
两亲性嵌段共聚物在水溶液中会由于疏水段的疏水相互作用,自组装形成纳米颗粒。制备纳米颗粒的方法有多种,最简单常见的是溶剂挥发法。
通过溶剂挥发法制备纳米颗粒:将10mg实施例1制备的mPEG45-PCL100-PEI12三嵌段共聚物溶于1mL四氢呋喃中,室温下搅拌1小时,然后在搅拌下以60mL/h的速度滴入10mL超纯水,再搅拌两小时后,于负压下除去有机溶剂,最后定容到2mL,得到浓度为5mg/mL的纳米颗粒溶液。
2、临界胶束浓度(CMC)的测定
以芘为荧光探针表征两亲性聚合物的聚集体的临界聚集浓度是最为常见和有效的方法。将步骤1配制的浓度为5mg/mL的纳米颗粒溶液先稀释至1mg/mL,然后再逐步稀释成一系列浓度(按照1×(1/2)n-1梯度稀释,其中n=1-21,),同时保证每一浓度下芘的浓度保持6×10-7mol/L不变。固定最大发射波长在390nm,扫描芘的激发光谱。试验设置三次重复,结果取平均值。图3(A)为芘在不同浓度mPEG45-PCL100-PEI12聚合物溶液中(取n=1、3、5、6、7、9、13的浓度)的激发光谱谱图。随着聚合物浓度的增加,芘探针的荧光光谱发生了显著的变化,首先是峰的强度逐渐增强,其次是其(0,0)吸收谱带从336nm红移到339nm,这些变化是由于芘由水环境转移至疏水环境,意味着核壳结构的纳米颗粒的形成。
结合上述激发光谱,计算每个浓度下339nm和336nm时峰的强度比,即I339/I336,将一系列的I339/I336对相应的浓度的对数作图,可以得到如图3(B)所示的S型曲线,图中的Log特指Log10。由图可见,曲线呈S型,在低浓度下,聚合物的荧光强度基本稳定,当达到一定浓度后,其比值开始迅速增大,表明芘选择性的由水环境进入疏水核中,此时纳米颗粒形成。继续增大聚合物浓度时,荧光强度到达一个平台,不再增大,这表明共聚物在水中已完全自组装形成了以聚己内酯为疏水核的纳米颗粒。CMC值可由水平线与斜线切线的交点确定,CMC值为2.45×103mg/mL。
3、纳米颗粒的形态
利用透射电子显微镜观察浓度为0.4mg/mL时,纳米颗粒的形态,见图4。可以看到纳米颗粒都呈现规整的球形结构,粒径约为30nm,且大小分布相对均一。
4、纳米颗粒的生物相容性
将浓度为5mg/mL的纳米颗粒溶液稀释至不同浓度(1μg/mL至1000μg/mL),通过MTT方法分别测定不同浓度纳米颗粒的生物相容性。测定时采用MCF-7细胞(购自ATCC公司,HTB-22)以PEI80(购自sigma)和PEI25000(sigma,产品目录号为9002-98-6)作为对照。试验设置三次重复,结果取平均值。
图5为不同浓度的纳米颗粒与MCF-7细胞共培养72小时后的细胞活力。结果表明:随着浓度从1μg/mL增大到1000μg/mL,纳米颗粒对细胞活力没有明显的影响,细胞活力一直维持在100%左右,该三嵌段共聚物具有良好的生物相容性。
二、载药纳米颗粒(以下简称NP/Dox)的制备
疏水性阿霉素溶液(10mg/mL)的制备:10mg阿霉素盐酸盐(浙江海正药业股份有限公司)溶于水,将pH调至9.6后,冻干后溶解于1mL的二甲亚砜。
通过溶剂挥发法制作包载疏水性阿霉素的胶束纳米颗粒;将10mg实施例1制备的mPEG45-PCL100-PEI12三嵌段共聚物溶解在1.0mL四氢呋喃中,然后再向其中加入0.4μL(或20μL)疏水性阿霉素溶液(阿霉素质量∶聚合物质量=0.0004或0.02)。将10mL超纯水逐滴加入上述溶液中,在室温下搅拌1小时后用真空泵将四氢呋喃除掉并且抽去一部分水,当剩余2mL液体时停止抽真空。取出胶束纳米颗粒溶液,然后以5000g离心除去游离的阿霉素。得到浓度为5mg/mL,阿霉素质量∶聚合物质量=1∶2500的载药纳米颗粒溶液。得到浓度为5mg/mL,阿霉素质量∶聚合物质量=1∶50的载药纳米颗粒溶液。
三、纳米颗粒的粒径和zeta电势
将浓度为5mg/mL的纳米颗粒溶液稀释50倍,得到溶液A;将浓度为5mg/mL的载药纳米颗粒溶液(阿霉素质量∶聚合物质量=1∶50)稀释50倍,得到溶液B。通过型号为Malvern Zetasizer Nanao ZS90的动态光散射仪检测溶液A和溶液B中纳米颗粒的粒径和粒径分布。设置三次重复试验,结果取平均值。
图6(A)为纳米颗粒的粒径,图6(B)为纳米颗粒的zeta电势。包载阿霉素和不包载阿霉素的聚合物纳米颗粒粒径差距不大,电势差距也不大。颗粒的平均直径为45nm,粒径分散度为0.08,zeta电势为45mV。
需要指明的是,利用动态光散射测量的粒径比透射电子显微镜的结果偏大,这主要是因为动态光散射测量的是纳米粒在水溶液中的流体动力学半径,而透射电镜测量的是纳米颗粒在脱水状态的粒径。但是不管哪种测量方法均显示上述三嵌段聚合物的纳米颗粒都具有均匀的粒径分布。
实施例3、纳米颗粒作为载体的性能评价
用实施例1制备的mPEG45-PCL100-PEI12三嵌段共聚物进行如下试验。
一、载siRNA纳米颗粒(以下简称NP/siRNA)的制备
载siRNA纳米颗粒的制备方法如下:将不同浓度siRNA溶液与纳米颗粒溶液混合,室温放置20分钟。
固定纳米颗粒的终浓度为0.1mg/ml,通过改变siRNA的量改变正负电荷比(N/P比),制备体积一致(125μl)但不同N/P比的载siRNA纳米颗粒,检测载siRNA纳米颗粒的粒径和zeta电势。试验设置三次重复,结果取平均值。
当N/P比为1∶0,即只有纳米颗粒时,复合物粒径为46.5±0.246nm;当N/P比为1.5∶1时,复合物粒径最大(212±5.10nm);随着N/P比的增加,复合物粒径先增大然后变小,并接近N/P比为1∶0时的粒径;图7(A)为N/P比分别为1、1.5、2.5、5、10、25、50、100时的复合物的粒径变化。在N/P为1∶0时,复合物的表面电位最大(45mV);当N/P比为1.5∶1时,复合物表面电位降低到-18±0.8mV,表明mPEG45-PCL100-PEI12纳米粒通过电荷相互作用与siRNA结合形成了复合物;图7(B)为N/P比分别为1、1.5、2.5、5、10、25、50、100时的复合物的表面电位变化。
固定siRNA的终浓度为1.6μM,通过改变纳米颗粒的量来改变N/P比,制备体积一致但不同N/P比的载siRNA纳米颗粒。分别进行非变性PAGE,上样时保持体积一致(25μl)。当二者完全结合时,凝胶上不会有条带出现。
图8为N/P比分别为1、2.5、5、7.5、10、15的复合物的非变性SDS-PAGE图。结果表明,N/P比为10时完全结合。
二、载药载siRNA纳米颗粒(以下简称NP/siRNA/Dox)的性能评价
1、NP/siRNA/Dox的细胞吞噬的激光共聚焦结果
制备NP/siRNA/Dox的方法如下:
将载药纳米颗粒溶于Opti-MEM,室温5分钟;将FAM-siRNA(上海吉玛公司)溶于Opti-MEM;将混匀的载药纳米颗粒于FAM-siRNA混合后室温放置20分钟。
制备250μl N/P=30的NP/siRNA/Dox溶液,其中共聚物终浓度为3mg/mL,阿霉素终浓度为60μg/mL,FAM-siRNA终浓度为2μM。
将NP/siRNA/Dox溶液与MCF-7细胞(5×105细胞/孔)在37℃共同培养0.5小时(或4小时)后,用Hoechst 33342对细胞核进行染色,然后用4%甲醛溶液室温固定细胞30分钟,用激光共聚焦显微镜进行观察。结果见图9,(A)培养时间为0.5小时,(B)培养时间为4小时。图9中,细胞内绿色的部分是FAM标记的siRNA,细胞内红色的部分是包载阿霉素的纳米颗粒,细胞内蓝色的部分是细胞核。通过三种颜色叠加的结果可以看出4小时后,纳米颗粒与siRNA在细胞内已经分离,而且纳米颗粒并没有进入细胞核,siRNA主要分布在细胞胞浆中。表明mPEG45-PCL100-PEI12纳米颗粒能够有效的将siRNA运输到细胞内,并能够与siRNA分离,使siRNA发挥基因沉默的作用。
2、NP/siRNA/Dox的细胞吞噬的流式细胞检测结果
将MCF-7乳腺癌细胞(5×105细胞/孔)接种于6孔细胞培养板,并进行如下处理,每个处理设置3个复孔:
处理1(对照组):不处理细胞。
处理2(NP/Dox组):用载药纳米颗粒溶液处理细胞,纳米颗粒的终浓度为375μg/mL,阿霉素的终浓度为7.5μg/mL。
处理3(NP/siRNA组):用载siRNA纳米颗粒溶液处理细胞,纳米颗粒的终浓度为375μg/mL,FAM-siRNA的终浓度为0.25nM。
处理4(NP/siRNA/Dox组):用载药载siRNA纳米颗粒溶液处理细胞,纳米颗粒的终浓度为375μg/mL,阿霉素的终浓度为7.5μg/mL,FAM-siRNA的终浓度为0.25nM。
处理5(NP/Dox+NP/siRNA组):用体积比为1∶1的载药纳米颗粒溶液和载siRNA纳米颗粒共同处理细胞,纳米颗粒的终浓度为750μg/mL,阿霉素的终浓度为7.5μg/mL,FAM-siRNA的终浓度为0.25nM。
将不同处理的细胞均在37℃进行培养。
图10为0.5小时(A)和4小时(B)后,细胞中阿霉素和FAM标记的siRNA的变化。从图10中可以看出,纳米颗粒同时输送阿霉素和siRNA进入细胞,而且随时间的延长细胞中荧光强度明显增大。
实施例4、载药载siRNA纳米颗粒的应用
用实施例1制备的mPEG45-PCL100-PEI12三嵌段共聚物进行如下试验。纳米颗粒的制备方法同实施例2和实施例3。
一、NP/siRNA/Dox对乳腺癌细胞内蛋白表达的作用
将MCF-7细胞以5×105/孔的密度接种于六孔板中24小时后,分别进行如下处理,每个处理设置3个复孔:
处理1(对照组):不处理细胞。
处理2(NP组):用纳米颗粒溶液处理细胞,纳米颗粒的终浓度为375μg/mL。
处理3(NP/Dox组):用载药纳米颗粒溶液处理细胞,纳米颗粒的终浓度为375μg/mL,阿霉素的终浓度为0.15μg/mL。
处理4(Dox组):用阿霉素溶液处理细胞,阿霉素的终浓度为0.2μg/mL。
处理5(Bcl2 siRNA组):用Bcl2 siRNA溶液处理细胞,Bcl2 siRNA的终浓度为0.25nM。
处理6(lipo组):用载Bcl2 siRNA的Lipofectamine 2000溶液处理细胞,Bcl2siRNA终浓度为0.2nM,Lipofectamine 2000所用体积为10μl。
处理7(NP/N.C siRNA组):用载杂序siRNA的纳米颗粒溶液处理细胞,杂序siRNA的终浓度为0.25nM,纳米颗粒终浓度为375μg/mL。
处理8(NP/Bcl2 siRNA组):用载Bcl2 siRNA的纳米颗粒溶液处理细胞,纳米颗粒的终浓度为375μg/mL,Bcl2 siRNA的终浓度为0.25nM。
处理9(NP/Bcl2 siRNA/Dox组):用载药载siRNA纳米颗粒溶液处理细胞,纳米颗粒的终浓度为375μg/mL,阿霉素的终浓度为0.2μg/mL,Bcl2 siRNA的终浓度为0.25nM。
处理10(NP/Dox+NP/Bcl2 siRNA组):用体积比为1∶1的载药纳米颗粒溶液和载siRNA纳米颗粒共同处理细胞,纳米颗粒的终浓度为750μg/mL,阿霉素的终浓度为0.2μg/mL,Bcl2 siRNA的终浓度为0.25nM。
在细胞经过以上几种条件处理48小时后,用细胞裂解液处理细胞,将细胞裂解液收集后用BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自Thermo公司,产品目录号为23225)测定各样品的蛋白浓度。每个样品取75μg蛋白在12%SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳,然后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%牛血清白蛋白封闭PVDF膜2小时后,用膜清洗液(溶解0.05%Tween 20的磷酸盐缓冲液PBS)清洗膜两次,然后用β-actin(内参)或者Bcl2的一抗孵育PVDF膜2小时,然后用膜清洗液清洗膜两次后用带有辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗孵育膜1小时。通过ECL显色反应将蛋白条带曝光在底片上。
Western Blot结果见图11。图11中。1:对照组;2:NP组;3:NP/Dox组;4:Dox组;5:Bcl2 siRNA组;6:lipo组;7:NP/N.C siRNA组;8:NP/Bcl2 siRNA组;9:NP/Bcl2 siRNA/Dox;10:NP/Dox+NP/Bcl2 siRNA组。不转染Bcl2 siRNA的对照实验组细胞中的Bcl2蛋白表达量均较高,经过Lipofectamine 2000转染Bcl2 siRNA的实验组细胞中的Bcl2蛋白表达量有明显的下降。Bcl2表达明显下调的结果在NP/siRNA/Dox和NP/Dox+NP/siRNA实验组中也观察到,但是单纯的纳米粒对细胞中的Bcl2蛋白表达没有明显的影响。
二、NP/siRNA/Dox对细胞增殖的影响
采用3H标记胸腺嘧啶检测细胞增殖的方法检测经过下述处理48小时后的MCF7细胞的增殖水平。
将MCF-7细胞以7×103/孔的密度接种于96孔板中24小时后,分别进行如下处理,每个处理设置3个复孔:
处理1(对照组):不处理细胞。
处理2(NP组):用纳米颗粒溶液处理细胞,纳米颗粒的终浓度为0.6mg/mL。
处理3(NP/Dox组):用载药纳米颗粒溶液处理细胞,纳米颗粒的终浓度为0.6mg/mL,阿霉素的终浓度为0.24μg/mL。
处理4(Dox组):用阿霉素溶液处理细胞,阿霉素的终浓度为0.2μg/mL。
处理5(siRNA组):用Bcl2 siRNA溶液处理细胞,Bcl2 siRNA的终浓度为0.4nM。
处理6(lipo组):用载Bcl2 siRNA的Lipofectamine 2000溶液处理细胞,Bcl2siRNA终浓度为0.4nM,Lipofectamine 2000的体积为1μl。
处理7(NP/siRNA组):用载siRNA纳米颗粒溶液处理细胞,纳米颗粒的终浓度为0.6mg/mL,Bcl2 siRNA的终浓度为0.4nM。
处理8(NP/siRNA/Dox组):用载药载siRNA纳米颗粒溶液处理细胞,纳米颗粒的终浓度为0.6mg/mL,阿霉素的终浓度为0.24μg/mL,Bcl2 siRNA的终浓度为0.4nM。
处理9(NP/Dox+NP/siRNA组):用体积比为1∶1的载药纳米颗粒溶液和载siRNA纳米颗粒共同处理细胞,纳米颗粒的终浓度为1.2mg/mL,阿霉素的终浓度为0.24μg/mL,Bcl2 siRNA的终浓度为0.4nM。
经上述条件处理的MCF-7细胞在37℃5%培养箱中培养42小时,然后每孔中加入20μL含有0.5μCi 3H-TdR的PBS,再继续培养6小时后,用多头细胞收集器将每孔培养物分别吸收于直径24mm的玻璃纤维滤纸上,抽气过滤并用蒸馏水充分洗涤。将滤纸片放在80℃烘干约1h,然后将滤纸片浸于加了10ml脂溶性闪烁液(5.0g 2,5-二苯基恶唑(PPO),0.3g 1,4-双-2-15-苯基恶唑苯(POPOP)溶解于200mL无水乙醇和800mL甲苯中)的闪烁杯中,置于β-液体闪烁计数器中测定每个样品的每分钟脉冲数(cpm值)。将各组数据取平均值,然后以处理1的数值为1,其他各组对其做归一化处理。
结果见图12。从实验结果可以看出,用mPEG45-PCL100-PEI12胶束纳米粒同时输送Bcl2 siRNA和阿霉素能够显著抑制MCF-7细胞的增殖能力,效果和混合NP/Dox与NP/siRNA处理细胞相当,而胶束纳米粒自身对细胞的增殖能力没有影响。
Claims (9)
1.聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物;
所述三嵌段共聚物为mPEG45-PCL100-PEI12。
2.一种合成聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物的方法,是将聚乙二醇单甲醚-聚己内酯两嵌段聚合物与低分子量聚乙烯亚胺偶联得到三嵌段共聚物;
所述聚乙二醇单甲醚-聚己内酯两嵌段聚合物是以聚乙二醇单甲醚作为引发剂,以异辛酸亚锡为催化剂,引发己内酯单体聚合得到的;
所述低分子量聚乙烯亚胺是以对甲基苯磺酸甲酯作为引发剂,引发2-甲基-2-噁唑啉经阳离子开环聚合,再在酸性条件下脱去乙酰基得到的。
3.一种纳米颗粒,它由权利要求1所述的三嵌段共聚物制成。
4.如权利要求3所述的纳米颗粒,其特征在于:所述纳米颗粒进行了化学修饰或配体修饰。
5.一种药物载体,它的活性成分为权利要求3或4所述纳米颗粒。
6.如权利要求5所述的药物载体,其特征在于:所述药物为siRNA药物和/或化疗药物。
7.权利要求5或6所述药物载体在制备抑制肿瘤细胞增殖和/或治疗癌症的药物中的应用。
8.一种抑制肿瘤细胞增殖和/或治疗癌症的药物,它的活性成分是权利要求1所述共聚物负载siRNA药物和/或化疗药物形成的纳米颗粒。
9.如权利要求8所述的药物,其特征在于:所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞;所述癌症为乳腺癌;所述siRNA为Bcl2基因的siRNA;所述化疗药物为阿霉素。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2008102467198A CN101768276B (zh) | 2008-12-26 | 2008-12-26 | 聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2008102467198A CN101768276B (zh) | 2008-12-26 | 2008-12-26 | 聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101768276A CN101768276A (zh) | 2010-07-07 |
CN101768276B true CN101768276B (zh) | 2011-11-30 |
Family
ID=42501394
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2008102467198A Expired - Fee Related CN101768276B (zh) | 2008-12-26 | 2008-12-26 | 聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101768276B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104310828A (zh) * | 2014-09-28 | 2015-01-28 | 华中师范大学 | 以多酚接枝聚乙烯亚胺为转晶剂制备α-半水石膏的方法 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103897182B (zh) * | 2012-12-27 | 2017-06-09 | 张昊 | 聚合物、其制备方法和应用 |
CN104419004B (zh) * | 2013-08-30 | 2016-09-07 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 改性聚乙烯亚胺及其制备方法和基因转染试剂及其应用 |
DE102013016750A1 (de) * | 2013-10-02 | 2015-04-02 | Friedrich-Schiller-Universität Jena | Neue Poly(ethylenimin) basierte Copolymere zur Anbindung und Freisetzung von genetischem Material, insbesondere von DNA/RNA, sowie Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung |
CN104403101B (zh) * | 2014-11-11 | 2016-08-24 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 改性聚乙烯亚胺及其制备方法和基因转染试剂及其应用 |
WO2017075760A1 (zh) * | 2015-11-03 | 2017-05-11 | 中国科学技术大学 | 桥联的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物、其制备方法、中间体和用途 |
CN108404823B (zh) * | 2018-05-11 | 2021-01-05 | 江南大学 | 一种静电纺丝制备高吸水3d纳米纤维气凝胶的方法及其所得材料 |
CN114601934B (zh) * | 2022-03-10 | 2023-06-13 | 北京大学第三医院(北京大学第三临床医学院) | 负载小干扰rna的可电荷反转光热纳米粒子及其制备和应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007142579A1 (en) * | 2006-06-05 | 2007-12-13 | Bactiguard Ab | A polymer matrix, uses thereof and a method of manufacturing the same |
WO2008030473A2 (en) * | 2006-09-05 | 2008-03-13 | University Of Wyoming | Process for forming nanoparticles by micellization of blocky copolymers in subcritical and supercritical solvents |
-
2008
- 2008-12-26 CN CN2008102467198A patent/CN101768276B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007142579A1 (en) * | 2006-06-05 | 2007-12-13 | Bactiguard Ab | A polymer matrix, uses thereof and a method of manufacturing the same |
WO2008030473A2 (en) * | 2006-09-05 | 2008-03-13 | University Of Wyoming | Process for forming nanoparticles by micellization of blocky copolymers in subcritical and supercritical solvents |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
蒋刚彪等.《聚合物纳米粒子作为抗肿瘤药物载体的应用》.《中草药》.2007,第38卷(第8期),全文. * |
赵湘云等.《用于基因传输的聚合物载体研究进展》.《中国医药工业杂志》.2007,第38卷(第12期),全文. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104310828A (zh) * | 2014-09-28 | 2015-01-28 | 华中师范大学 | 以多酚接枝聚乙烯亚胺为转晶剂制备α-半水石膏的方法 |
CN104310828B (zh) * | 2014-09-28 | 2016-07-27 | 华中师范大学 | 以多酚接枝聚乙烯亚胺为转晶剂制备α-半水石膏的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101768276A (zh) | 2010-07-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101768276B (zh) | 聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物及其应用 | |
Qian et al. | Star-branched amphiphilic PLA-b-PDMAEMA copolymers for co-delivery of miR-21 inhibitor and doxorubicin to treat glioma | |
Li et al. | Reversing multidrug resistance by multiplexed gene silencing for enhanced breast cancer chemotherapy | |
Daniels et al. | Sterically stabilized siRNA: gold nanocomplexes enhance c-MYC silencing in a breast cancer cell model | |
Yin et al. | Overcoming chemoresistance in cancer via combined microRNA therapeutics with anticancer drugs using multifunctional magnetic core–shell nanoparticles | |
Mukerabigwi et al. | Polymersome nanoreactors with tumor pH-triggered selective membrane permeability for prodrug delivery, activation, and combined oxidation-chemotherapy | |
Iyer et al. | Nanodelivery systems for nucleic acid therapeutics in drug resistant tumors | |
Gao et al. | Reversal of multidrug resistance by reduction-sensitive linear cationic click polymer/iMDR1-pDNA complex nanoparticles | |
Zhang et al. | Autocatalytic Delivery of Brain Tumor–Targeting, Size‐Shrinkable Nanoparticles for Treatment of Breast Cancer Brain Metastases | |
Xu et al. | Creatine based polymer for codelivery of bioengineered MicroRNA and chemodrugs against breast cancer lung metastasis | |
Li et al. | Development of a reactive oxygen species (ROS)-responsive nanoplatform for targeted oral cancer therapy | |
US20190292549A1 (en) | Poly(ethylene glycol) brushes for efficient rna delivery | |
Wu et al. | A silica–polymer composite nano system for tumor-targeted imaging and p53 gene therapy of lung cancer | |
Lee et al. | Apoptotic epidermal growth factor (EGF)-conjugated block copolymer micelles as a nanotechnology platform for targeted combination therapy | |
Chen et al. | Enhanced sensitivity of cancer stem cells to chemotherapy using functionalized mesoporous silica nanoparticles | |
CN111437258B (zh) | 基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米佐剂及其制备方法与应用 | |
Wang et al. | Peptide decoration of nanovehicles to achieve active targeting and pathology-responsive cellular uptake for bone metastasis chemotherapy | |
Liu et al. | A synergistic polyphosphoester-based co-delivery system of the anticancer drug doxorubicin and the tumor suppressor gene p53 for lung cancer therapy | |
CN113633625B (zh) | 一种杂膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物及其制备方法 | |
CN104098777B (zh) | 一种三嵌段聚合物及其制备方法 | |
Kalva et al. | Degradable pH-responsive polymer prodrug micelles with aggregation-induced emission for cellular imaging and cancer therapy | |
CN111632153A (zh) | 一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法 | |
Shao et al. | Tumor-triggered personalized microRNA cocktail therapy for hepatocellular carcinoma | |
CN106215191A (zh) | 一种脑胶质瘤靶向递药系统及其制备方法和用途 | |
Li et al. | Combinatorial miRNA-34a replenishment and irinotecan delivery via auto-fluorescent polymeric hybrid micelles for synchronous colorectal cancer theranostics |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20111130 Termination date: 20161226 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |