CN111632153A - 一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法，尤其是一种肿瘤微环境透明质酸酶触发变构‑电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法。其特点是：是由聚苯乙烯‑聚二甲双胍(PMet)阳离子聚合物共载化学和基因药物，并采用具有CD44受体靶向性和肿瘤微环境透明质酸酶(HAase)敏感性的透明质酸‑巯基(HA‑SH)通过静电结合和硫醇化学交联共组装而成。本发明不仅可以实现肿瘤的低毒、靶向、高效治疗，而且为抗肿瘤研究提供一项基于化学联合基因药物治疗肿瘤的新型多功能纳米载体及制剂应用策略。

Description

一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法，尤其是一种肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法。
背景技术
癌症已成为危害人类健康的最主要疾病之一。目前，化学药物治疗是临床治疗癌症较为广泛的手段。然而，化学药物通常具有毒副作用强，选择性单一和长期使用产生多药耐药等问题，因此单一使用化学药物，往往不能获得最佳疗效。目前，多种药物联合治疗受到越来越多的关注，尤其是化学药物与基因药物的联合治疗，以期达到不同治疗的机制互补、协同作用，从而提高抗肿瘤的效果。
将化学药物与基因药物组合后共同进行靶向递送，使其分别通过不同途径发挥药效，可以使二者达到微观水平上的协同作用，不仅可以提高各自的抗肿瘤疗效，同时还降低药物的毒副作用。然而，基因药物属于核酸类生物大分子，具有较强的亲水性并带有负电荷，与化学药物的物理化学性质截然不同。因此，为实现化学药物与基因药物联合治疗肿瘤的目的，需要开发一种新型的纳米载体，使其能够高效共载化学与基因药物，从而克服单一用药的局限性。
成为化学与基因药物共输送载体，必须具有两种功能：第一，作为基因载体，需要具备高效的基因凝聚能力，保护基因药物不被血清和核酸酶降解，同时应具有高的转染效率，即进入靶细胞后可以促进内涵/溶酶体逃逸，从而使基因药物尽快释放到细胞质中发挥作用；第二，作为疏水化学药物载体，需要具有有效的药物装载能力，使负载的化学药物进入靶细胞后再缓慢释放。
专利CN 109939241 A公开了一种双前药共组装纳米靶向给药系统及其制备方法，其中合成了具有胶束自组装特性的PMet阳离子聚合物前药用于水溶性药物二甲双胍的递送。将其进一步研究发现，PMet聚合物可以通过亲疏水相互作用对疏水化学药物进行物理包载；此外，因其含有大量的阳离子双胍基团，可与带有负电荷的核酸形成稳定的复合物进行基因药物的缩合和传递，并且可以触发“质子海绵效应”提高其内涵/溶酶体逃逸能力，从而进行基因转染。因此，本专利引用CN 109939241 A中PMet聚合物的制备方法，将其创新性应用于化学和基因药物的高效共载，使理化性质截然不同的两药集成于一个纳米体系，为有效的化学药物递送和基因药物转染提供保障。然而，阳离子载体在血液循环过程中更易被网状内皮系统(RES)清除，且易对正常组织产生毒性，使其在临床上的应用受到了极大的限制。因此，平衡化学/基因药物共递送纳米粒子血液循环的稳定性和两药在细胞中有效的释放仍是一种挑战。
基于肿瘤组织与正常组织存在的生理性差异，采用具有CD44受体靶向性和肿瘤微环境HAase敏感性的HA-SH与阳离子共载药纳米粒子通过静电结合和硫醇化学交联共组装，赋予纳米共递药系统血液共递药长效化、CD44受体靶向肿瘤组织，以及肿瘤微环境HAase触发载体变构-电荷翻转等特点，促进化学药物和基因药物共同靶向递送至肿瘤细胞以及从内涵/溶酶体逃逸在胞质内释放可以有效解决上述问题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统，针对协同治疗肿瘤的化学药物和基因药物在体内高效共递送的问题，提供了一种肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统，能够实现化学药物和基因药物在体内的靶向共递送以及胞内同步释放，为抗肿瘤提供了新办法；
本发明的目的之二是以提供一种上述靶向纳米递药系统制备方法。
一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统，其特别之处在于：是由聚苯乙烯-聚二甲双胍(PMet)阳离子聚合物共载化学和基因药物，并采用具有CD44受体靶向性和肿瘤微环境透明质酸酶(HAase)敏感性的透明质酸-巯基(HA-SH)通过静电结合和硫醇化学交联共组装而成。
其中所述纳米递药系统中按重量记化学药物含量为8％-16％，基因药物含量为1％-5％。
其中所述的化学药物包括阿霉素、紫杉醇、多西他赛、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨和克唑替尼中的至少一种。
其中所述的基因药物包括质粒DNA、siRNA、mRNA和反义寡核苷酸中的至少一种。
一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统的制备方法，其特别之处在于，包括如下步骤：利用可逆加成-断裂链转移聚合RAFT聚合合成聚苯乙烯氯，再通过聚苯乙烯氯与二甲双胍的化学反应制备聚二甲双胍PMet；合成具有CD44受体靶向和肿瘤微环境透明质酸酶HAase敏感性能的透明质酸-巯基HA-SH；采用溶剂挥发-静电结合法制备共载化学和基因药物的聚二甲双胍PMet阳离子胶束，然后与透明质酸-巯基HA-SH通过静电结合和硫醇化学交联，制备出肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统。
进一步的，其特征在于：
其中聚二甲双胍PMet和透明质酸-巯基HA-SH的制备方法如下：
(1)聚苯乙烯氯的合成：将4-苯乙烯氯溶于有机溶剂A中，再加入4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸和偶氮二异丁腈，经液氮连续冻融-抽真空2-6次后，反应液在氮气保护下于60-110℃油浴聚合，磁力搅拌反应10-40h后，液氮猝冷以停止反应，加入有机溶剂A纯化沉淀反应液2-5次，真空干燥后得到聚苯乙烯氯；
(2)PMet的合成：将步骤(1)中得到的聚苯乙烯氯、二甲双胍与N,N-二异丙基乙胺溶于有机溶剂A中，在90～160℃油浴条件下反应2-5天，反应结束后，将上述反应产物转移至透析袋中用10-100mmol/L盐酸溶液透析2-5天，再用蒸馏水透析2-5天，冷冻干燥后得到PMet聚合物；
(3)HA-SH的合成：将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶于浓度为10-30mmol/L，pH 6.8-7.4PBS缓冲液中，反应1-4h活化透明质酸的羧基，然后加入胱氨二盐酸盐，室温条件下反应24-48h后用蒸馏水透析2-5天除去未反应物质，冷冻干燥收集；随后，上述产物溶解于蒸馏水中，在避光、磁力搅拌条件下加入过量二硫苏糖醇继续反应2-4h，反应液经蒸馏水透析2-5天、冷冻干燥后得到HA-SH。
其中所述聚二甲双胍PMet中苯乙烯氯的转化率为60％-90％，二甲双胍的聚合度为25-85个；透明质酸-巯基HA-SH的巯基含量为15％-35％；所述有机溶剂为A为四氢呋喃、二甲基亚砜、无水乙醚、石油醚、二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯中的任意一种。
步骤(1)中4-苯乙烯氯、4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸与偶氮二异丁腈的质量比为1:0.005-0.05:0.001-0.01，步骤(2)中聚苯乙烯氯、二甲双胍与N,N-二异丙基乙胺的质量比为1:5-25:10-18，步骤(3)中透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺与胱氨二盐酸盐的质量比为1:0.5-5:0.5-5:1-8。
其中所述的溶剂挥发-静电结合法制备共载化学和基因药物的PMet阳离子胶束，以及PMet胶束通过静电结合和硫醇化学交联与HA-SH共组装的制备方法，具体如下：
(1)将PMet聚合物与化学药物分别溶于有机溶剂B中，混合后缓慢滴加到盛有浓度为10-50mmol/L、pH 7.0-7.5并磁力搅拌的Hepes缓冲溶液中，滴加完后继续磁力搅拌8-12h，使有机溶剂B完全挥发，即得包载化学药物的PMet胶束溶液；
(2)将等体积基因药物溶液加入步骤(1)所得的包载化学药物的PMet胶束溶液中，采用移液枪头轻轻吹打均匀，静置10-40min，即得共载化学与基因药物的胶束复合物溶液；
(3)将等体积HA-SH溶液加入步骤(2)所得的胶束复合物溶液中，采用枪头轻轻吹打，静置10-40min，通过静电结合和硫醇化学交联得到共载化学和基因药物的靶向纳米递药系统。
所述PMet聚合物与化学药物的质量比为5-10:1，PMet聚合物与基因药物的N/P比为0.5-20:1；所述HA-SH与PMet聚合物的质量比为0.5-2.5:1；所述有机溶剂B为甲醇、二氯甲烷、无水乙醇、四氢呋喃和乙腈中的至少一种。
本发明选择阳离子PMet聚合物作为共载化学与基因药物的载体，并基于肿瘤微环境特异性表达的HAase，采用具有CD44受体靶向性和肿瘤微环境HAase敏感性的HA-SH通过静电结合和硫醇化学交联与阳离子聚合物共组装，构建具有肿瘤微环境HAase触发载体变构-电荷翻转的化药/基因纳米共递送体系，不仅可以实现肿瘤的低毒、靶向、高效治疗，而且为抗肿瘤研究提供一项基于化学联合基因药物治疗肿瘤的新型多功能纳米载体及制剂应用策略。
附图说明
图1为本发明中PMet(A)和HA-SH(B)聚合物的核磁氢谱图；
图2为本发明共载化学/基因药物的HA/PMet靶向纳米递药系统的组装示意图；
图3为共载化学/基因药物的靶向纳米递药系统和双前药共组装靶向给药系统的稳定性图；
图4为本发明制备实施例制备的pIL-12/PMet(A)、pIL-12/DOX-PMet(B)、HA/pIL-12/PMet(C)和HA/pIL-12/DOX-PMet(D)在不同N/P下的凝胶阻滞电泳图；
图5为本发明制备实施例制备的pIL-12/PMet(A)和pIL-12/DOX-PMet(B)的粒径及Zeta电位随N/P比的变化图；以及HA/pIL-12/PMet(C)和HA/pIL-12/DOX-PMet(D)的粒径及Zeta电位随HA-SH/PMet质量比的变化图；
图6为本发明制备实施例制备的共载DOX/pIL-12的靶向纳米递药系统在pH 7.4下，10％胎牛血清溶液中孵育的粒径变化图；
图7为本发明制备实施例制备的HA/pIL-12/PMet、HA/DOX-PMet和HA/pIL-12/DOX-PMet在pH为6.5和5.5的HAase孵育下Zeta电位随时间的变化图；
图8为本发明制备实施例制备的共载DOX/pIL-12的靶向纳米递药系统在pH 7.4的PBS缓冲液中不同制剂的累积释药曲线(A)；以及在pH梯度的缓冲液中，HAase触发HA/pIL-12/DOX-PMet的释放情况图(B)；
图9为本发明制备实施例制备的pEGFP/PEI25K、pEGFP/PMet、HA/pEGFP/PMet在不同N/P比下转染4T1细胞细胞后的倒置荧光显微镜图。
具体实施方式
本发明引用专利CN 109939241 A中的PMet聚合物作为化学和基因药物的共输送纳米载体。与专利CN 109939241 A中将其作为前药相比，PMet聚合物作为共载化学和基因药物治疗肿瘤的纳米载体，具有以下优点：(1)PMet聚合物具有良好的稳定性，其内核可以包载疏水小分子化学药物，双胍基团的正电荷可以固定基因；(2)PMet聚合物包载疏水化学药物后，不仅可以提高难溶药物的溶解度，还可以降低其引起的毒副反应；(3)PMet聚合物可以与基因形成稳定的络合物，保护基因药物不被核酸酶降解；(4)PMet聚合物可以触发“质子海绵效应”提高其内涵/溶酶体逃逸能力，促进基因转染；(5)共载的化学和基因药物能够有效地在细胞内释放，从而发挥协同抗肿瘤效果。此外，采用具有CD44受体靶向性和肿瘤微环境HAase敏感性的HA-SH与PMet共载药纳米粒子通过静电结合和硫醇化学交联共组装，赋予纳米共递药系统血液共递药长效化、CD44受体靶向肿瘤组织，以及肿瘤微环境HAase触发载体变构-电荷翻转等特点，促进化学和基因药物共同靶向递送至肿瘤细胞以及在胞质内释放，实现肿瘤的联合、靶向、高效治疗。
本发明公开了一种肿瘤微环境载体变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法。该纳米递药系统是由聚苯乙烯-聚二甲双胍(PMet)阳离子聚合物共载化学和基因药物，并采用具有CD44受体靶向性和肿瘤微环境透明质酸酶(HAase)敏感性的透明质酸-巯基(HA-SH)通过静电结合和硫醇化学交联共组装而成。本发明基于PMet组装共载药-肿瘤微环境载体变构共递药技术，构建的肿瘤微环境HAase触发变构纳米共递药系统兼具血液共递药长效化、CD44受体靶向肿瘤组织和细胞共递药高效化，以及胞内HAase酶解触发载体变构-电荷翻转，引发质子海绵效应介导的内涵/溶酶体逃逸及响应性共释药等优点，可促进化学药物和基因药物有效胞内递送和高效转染，发挥协同治疗肿瘤功效。本发明也为抗肿瘤研究提供一项基于化学联合基因药物治疗肿瘤的新型多功能纳米载体及制剂应用策略。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统，其特征在于该纳米递药系统是由PMet阳离子聚合物共载化学和基因药物，并采用具有CD44受体靶向性和肿瘤微环境HAase敏感性的HA-SH通过静电结合和硫醇化学交联共组装而成。
所述纳米递药系统中，按重量记化学药物含量为8％-16％，基因药物含量为1％-5％。
所述的化学药物包括阿霉素、紫杉醇、多西他赛、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、克唑替尼中的至少一种。
所述的基因药物包括质粒DNA、siRNA、mRNA、反义寡核苷酸中的至少一种。
所述的肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统，其特征在于其工艺步骤包括：利用可逆加成-断裂链转移聚合RAFT聚合合成聚苯乙烯氯，再通过聚苯乙烯氯与二甲双胍的化学反应制备聚二甲双胍PMet；合成具有CD44受体靶向和肿瘤微环境透明质酸酶HAase敏感性能的透明质酸-巯基HA-SH。采用溶剂挥发-静电结合法制备共载化学和基因药物的聚二甲双胍PMet阳离子胶束，然后与透明质酸-巯基HA-SH通过静电结合和硫醇化学交联，制备出肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统。
所述聚二甲双胍PMet、透明质酸-巯基HA-SH聚合物按照如下方法制备：
(1)聚苯乙烯氯的合成：将4-苯乙烯氯溶于有机溶剂A中，再加入4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸和偶氮二异丁腈，经液氮连续冻融-抽真空2-6次后，反应液在氮气保护下于60-110℃油浴聚合，磁力搅拌反应10-40h后，液氮猝冷以停止反应，加入有机溶剂A纯化沉淀反应液2-5次，冷冻干燥后得到聚苯乙烯氯；
(2)PMet的合成：将步骤(1)中得到的聚苯乙烯氯、二甲双胍与N,N-二异丙基乙胺溶于有机溶剂A中，在90～160℃油浴条件下反应2-5天，反应结束后，将上述反应产物转移至透析袋中用10-100mmol/L盐酸溶液透析2-5天，再用蒸馏水透析2-5天，冷冻干燥后得到PMet聚合物；
(3)HA-SH的合成：将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶于浓度为10-30mmol/L，pH 6.8-7.4PBS缓冲液中，反应1-4h活化透明质酸的羧基，然后加入胱氨二盐酸盐，室温下搅拌反应24-48h后用蒸馏水透析2-5天除去未反应物质，冷冻干燥收集。随后，上述产物溶解于蒸馏水中，在避光、磁力搅拌条件下加入过量二硫苏糖醇继续反应2-4h，反应液经蒸馏水透析2-5天、冷冻干燥后得到HA-SH。
步骤(1)中，所述4-苯乙烯氯、4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸与偶氮二异丁腈的质量比为1:0.005-0.05:0.001-0.01，所述聚苯乙烯氯中苯乙烯氯的转化率为60％-90％。
步骤(2)中，所述聚苯乙烯氯、二甲双胍与N,N-二异丙基乙胺的质量比为1:5-25:10-18，所述聚二甲双胍PMet中二甲双胍的聚合度为25-85个。
步骤(3)中，所述透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺与胱氨二盐酸盐的质量比为1:0.5-5:0.5-5:1-8，所述透明质酸-巯基HA-SH的巯基含量为15％-35％。
所述有机溶剂为A为四氢呋喃、二甲基亚砜、无水乙醚、石油醚、二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯中的任意一种。
上述所述的肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统的制备方法，其特征在于：采用溶剂挥发-静电结合法制备共载化学和基因药物的PMet阳离子胶束，然后与HA-SH通过静电结合和硫醇化学交联，制备肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统。
所述制备肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统的步骤如下：
(1)将PMet聚合物与化学药物分别溶于有机溶剂B中，混合后缓慢滴加到盛有浓度为10-50mmol/L、pH 7.0-7.5并磁力搅拌的Hepes缓冲溶液中，滴加完后继续磁力搅拌8-12h，使有机溶剂B完全挥发，即得包载化学药物的PMet胶束溶液；
(2)将等体积基因药物溶液加入步骤(1)所得的包载化学药物的PMet胶束溶液中，采用移液枪头轻轻吹打均匀，静置10-40min，即得共载化学与基因药物的胶束复合物溶液；
(3)将等体积HA-SH溶液加入步骤(2)所得的胶束复合物溶液中，采用枪头轻轻吹打，静置10-40min，通过静电结合和硫醇化学交联得到共载化学和基因药物的靶向纳米递药系统。
所述PMet聚合物与化学药物的质量比为5-10:1，PMet聚合物与基因的N/P比为0.5-20:1；所述HA-SH与PMet聚合物的质量比为0.5-2.5:1。
所述有机溶剂B为甲醇、二氯甲烷、无水乙醇、四氢呋喃和乙腈中的至少一种。
下面通过实施例和对比实施例，对本发明作进一步描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：
PMet和HA-SH聚合物的合成。
1、PMet的合成。
将700μL4-苯乙烯氯溶于2mL无水四氢呋喃中，再加入12mg 4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸和1.5mg偶氮二异丁腈，经液氮连续冻融-抽真空3次后，反应液在氮气保护下于70℃油浴聚合，磁力搅拌反应24h后，液氮猝冷以停止反应，加入石油醚纯化沉淀反应液3次，真空干燥后得到聚苯乙烯氯。
将上述得到的100mg聚苯乙烯氯、1.5g二甲双胍和2mLN,N-二异丙基乙胺溶于5mL二甲基亚砜中，在130℃油浴条件下反应3天，反应结束后，将反应产物转移至透析袋中用30mmol/L的盐酸溶液透析3天，再用蒸馏水透析2天，冷冻干燥后得到PMet聚合物。将其用于实施例3的1-3中，其1H NMR图谱如图1A所示。
2、HA-SH的制备。
将500mg透明质酸、958mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和575mgN-羟基琥珀酰亚胺溶于浓度为10mmol/L，pH 7.4PBS缓冲液中，反应1h活化透明质酸的羧基，然后加入1.686g胱胺二盐酸盐，室温下反应48h后，所得反应液用蒸馏水中透析3天，冷冻干燥收集。随后，上述产物溶解于蒸馏水中，在避光、磁力搅拌条件下加入2.313g二硫苏糖醇继续反应4h，反应液经蒸馏水透析3天，冷冻干燥后得到HA-SH，将其用于实施例3的1-3中。其1H NMR图谱如图1B所示。
实施例2：
PMet和HA-SH聚合物的合成。
1、PMet的合成。
将1.5mL 4-苯乙烯氯溶于5mL无水四氢呋喃中，再加入35mg 4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸和8mg偶氮二异丁腈，经液氮连续冻融-抽真空4次后，反应液在氮气保护下于80℃油浴聚合，磁力搅拌反应36h后，液氮猝冷以停止反应，,加入石油醚纯化反应液5次，真空干燥后得到聚苯乙烯氯。
将上述得到的150mg聚苯乙烯氯、2.8g二甲双胍和3mLN,N-二异丙基乙胺溶于8mL二甲基亚砜中，在140℃油浴条件下反应4天，反应结束后，将反应产物转移至透析袋中用100mmol/L的盐酸溶液透析5天，再用蒸馏水透析3天，冷冻干燥后得到PMet聚合物，将其用于实施例3的4-7中。其1H NMR图谱如图1A所示。
2、HA-SH的制备。
将200mg透明质酸、766.8mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和540.6mg N-羟基琥珀酰亚胺溶于浓度为20mmol/L，pH 6.8PBS缓冲液中，反应2h活化透明质酸的羧基，然后加入617.2mg胱胺二盐酸盐，室温下反应24h后，所得反应液用蒸馏水中透析2天，冷冻干燥收集。随后，上述产物溶解于蒸馏水中，在避光、磁力搅拌条件下加入846.7mg二硫苏糖醇继续反应2h，反应液经蒸馏水透析2天，冷冻干燥后得到HA-SH。将其用于实施例3的4-7中，其1H NMR图谱如图1B所示。
实施例3：
共载化学/基因药物的靶向纳米递药系统的制备。
本发明结合实施例，联合使用免疫治疗基因白介素-12质粒DNA(pIL-12)和细胞毒性药物阿霉素(DOX)，利用DOX诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡，调节免疫抑制微环境，协助pIL-12发挥作用，共同对抗肿瘤。共载DOX/pIL-12的靶向纳米制剂的制备方法如下：
将10mg PMet(由实施例1制备)聚合物与1mg DOX分别溶于甲醇中，二者混合后，缓慢滴加到1mL浓度为10mmol/LpH 7.4并磁力搅拌的Hepes缓冲溶液中，滴加完后继续使用磁力搅拌10h，使有机溶剂完全挥发，即得DOX浓度为1mg/mL的DOX-PMet胶束溶液。
将1mL浓度为0.5mg/mL的pIL-12溶液加入上述DOX-PMet胶束溶液中，采用移液枪头轻轻吹打均匀，静置30min，即得共载化学和基因药物的pIL-12/DOX-PMet胶束复合物溶液。
将2mL浓度为20mg/mL的HA-SH(由实施例2制备)溶液加入上述pIL-12/DOX-PMet胶束复合物溶液中，采用枪头轻轻吹打，静置30min，即得共载化学和基因药物的靶向纳米制剂。图2展示的是共载化学和基因药物的HA/PMet靶向纳米递药系统的组装示意图，即PMet聚合物在水中自组装形成胶束溶液，物理包封化学药物及静电复合基因药物，以及进一步与HA-SH在水中通过静电结合和硫醇化学交联，最终形成共载化学和基因药物的靶向纳米递药系统。
对比例1：
双前药纳米靶向给药系统的制备。
专利CN 109939241A中采用的制备方法为：将10mg PMet前药溶于1mL甲醇中，制成浓度为10mg/mL的PMet的甲醇溶液，有机溶剂经氮气吹干，并真空干燥除去残余有机溶剂，形成聚合物薄膜，加入pH7.2、10mmol/Lhepes缓冲溶液10mL，使其完全溶解并均匀分散，制得浓度为1mg/mL的PMet前药胶束溶液。
将HA-CDDP前药溶于水，制成浓度为1mg/mL的HA-CDDP水溶液，加入上述PMet前药胶束溶液中,用枪头轻轻吹打均匀，静置20min，即得HA-CDDP/PMet双前药共组装纳米靶向给药系统。
对比例2：
双前药纳米靶向给药系统的制备。
专利CN 109939241A中采用的另一制备方法为：将10mg PMet前药溶于二甲基亚砜。置于截留分子量为3500Da的透析袋内，浸入蒸馏水中，透析24h除去有机溶剂和游离药物，收集透析袋内溶液，制得浓度为1mg/mL的PMet前药胶束溶液。
将HA-CDDP前药溶于水，制成浓度为1mg/mL的HA-CDDP水溶液，加入上述PMet前药胶束溶液中,用枪头轻轻吹打均匀，静置40min，即得HA-CDDP/PMet双前药共组装纳米靶向给药系统。
1、共载化学/基因药物的靶向纳米递药系统和双前药共组装靶向给药系统的稳定性。
将本专利实施例3制备的共载化学/基因药物的靶向纳米制剂与对比例1、对比例2中的双前药共组装靶向纳米制剂分别置于4℃，以是否析出沉淀为标准观察稳定性情况。如图3所示，相比于对比例1、对比例2中制备的PMet胶束溶液，采用本专利制备方法制备出的PMet胶束稳定性更高，可达28天，并且包载DOX不影响其稳定性。双前药共组装靶向给药制剂HA-CDDP/PMet在4℃时可稳定7-8天，而共载化学/基因药物的靶向纳米制剂HA/pIL-12/DOX-PMet可稳定12天，稳定性优于HA-CDDP/PMet，表明本专利制备方法制备出的纳米制剂具有更好的稳定性，这可能归因于带有负电荷的基因药物与PMet阳离子聚合物形成更稳定的复合物，并且HA-SH的静电结合和硫醇化学交联作用有助于进一步提高纳米制剂的稳定性。
2、肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统对基因负载能力的考察。
通过凝胶阻滞试验评价纳米递药系统负载基因药物的能力。按照PMet/pIL-12的N/P比为1到20，制备凝聚1μg pIL-12的pIL-12/PMet(A)、pIL-12/DOX-PMet(B)、HA/pIL-12/PMet(C)、HA/pIL-12/DOX-PMet(D)胶束复合物。将新鲜制备的各胶束复合物与上样loading混合均匀，每孔20μL加到0.8％琼脂糖凝胶中，用TAE缓冲液作为电解质，80mV下跑45min，电泳结束后置于凝胶成像系统进行分析。结果如图4A-D所示，当N/P比为1及以上时，基因被成功阻滞，表明基因可以有效地凝聚在阳离子胶束上，并且化学药物包封在胶束中以及HA-SH协同组装对PMet聚合物负载基因的能力没有影响。
3、肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统的表征。
采用动态光散射法及Zeta电位仪对纳米递药系统的粒径及表面电位进行表征，见图5。随着N/P比逐渐增大，pIL-12/PMet(A)和pIL-12/DOX-PMet(B)胶束复合物的粒径减小，Zeta电位由负值变为正值，这表明阳离子胶束与基因的静电相互作用可以诱导更紧密的胶束结构。另一方面，HA-SH协同组装的HA/pIL-12/PMet(C)和HA/pIL-12/DOX-PMet(D)胶束复合物的粒径随着HA-SH量的增加而逐渐减小，在HA-SH/PMet质量比为1/1及以上时，Zeta电位变为负值。
4、肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统的血浆稳定性评价。
将实例3中制备的不同胶束及胶束复合物与10％胎牛血清(v/v)混匀，于37℃孵育。按时间点取混合液，采用动态光散射法测量粒径，考察纳米递药系统的血清稳定性。如图6，PMet和DOX-PMet胶束粒径迅速增大，并与血清组分相互作用产生沉淀。而HA-SH协同组装的胶束复合物粒径没有没有显著改变，说明纳米递药系统具有良好的血浆稳定性。
5、肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统的透明质酸酶响应性评价。
通过检测体外模拟肿瘤细胞外环境(pH 6.5，0.3mg/mL透明质酸酶)和溶酶体环境(pH 5.5，0.3mg/mL透明质酸酶)下纳米递药系统的Zeta电位变化，考察HA-SH在肿瘤细胞外和细胞内溶酶体微环境中的电荷翻转特性(图7)。与透明质酸酶孵育一段时间后，HA-SH协同组装的胶束复合物表面电荷在pH 6.5时逆转至0mV左右，在pH 5.0时逐渐变为正电荷。结果表明，HA-SH在肿瘤细胞外环境中可部分降解，在溶酶体环境中可高度降解。共载药胶束复合物的电荷翻转特性有利于细胞内高效摄取和溶酶体的逃逸，有利于化学和基因药物的释放。
6、肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统的体外释放评价。
采用透析法考察纳米递药系统的体外释放行为。将实例3中制备的不同载药胶束复合物置于截留量为3500的透析袋内和释放介质中。释放介质为存在或不存在透明质酸酶(0.3mg/mL)条件下不同pH值(7.4、6.5、5.0)的PBS缓冲液，37℃恒温摇床摇动。在规定的时间间隔内，采集透析袋外的2ml溶液并补充相同体积的缓冲液。采用高效液相色谱法测定制剂中药物的释放量。如图8A所示，模拟血液循环过程中的生理环境下，HA/DOX-PMet和HA/pIL-12/DOX-PMet胶束复合物中药物的释放非常缓慢，说明共载药胶束复合物在血液循环中稳定，有利于肿瘤组织的高效积累。图8B显示了HA/pIL-12/DOX-PMet胶束复合物在模拟肿瘤微环境下药物的释放行为，其在pH值5.5，透明质酸酶存在情况下释放量最多，该释放行为有利于共载药胶束复合物发挥化学-基因协同抗肿瘤功效。
7、肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统的细胞转染性能。
选取生长良好的4T1细胞接种到12孔培养板中，孵育过夜。吸出培养基并用PBS将细胞表面清洗干净，用不含酚红与血清的培养基稀释pEGFP/PEI25K、pEGFP/PMet和HA/pEGFP/PMet(N/P比10、20、30)并加入到培养孔中，于37℃、5％CO2培养箱中孵育。4h后吸出培养基并加入新鲜培养基继续培养。20h后，置于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的分布与强度。如图9所示，随着N/P比升高，PEI25K能够高效转染细胞，但pEGFP/PEI25K多聚物在N/P比为20及以上时，会引起严重的细胞形态改变和明显的细胞毒性。pEGFP/PMet处理4T1细胞的EGFP蛋白表达也随着N/P比值的增加而显著增强。但也注意到4T1细胞有细胞毒性和形态缺陷，可能导致N/P比为30时基因转染效率下降。HA-SH协同组装的HA/PMet胶束复合物的转染效果与阳离子PMet聚合物相当。进一步增加N/P比至30，转染效率依然提高，并没有明显的细胞毒性。上述基因转染结果表明，HA/PMet可作为基因传递和转染的有效载体。

Claims (10)

1.一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统，其特征在于：是由聚苯乙烯-聚二甲双胍(PMet)阳离子聚合物共载化学和基因药物，并采用具有CD44受体靶向性和肿瘤微环境透明质酸酶(HAase)敏感性的透明质酸-巯基(HA-SH)通过静电结合和硫醇化学交联共组装而成。
2.如权利要求1所述的一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统，其特征在于：所述纳米递药系统中按重量记化学药物含量为8％-16％，基因药物含量为1％-5％。
3.如权利要求1所述的一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统，其特征在于：所述的化学药物包括阿霉素、紫杉醇、多西他赛、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨和克唑替尼中的至少一种。
4.如权利要求1所述的一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统，其特征在于：所述的基因药物包括质粒DNA、siRNA、mRNA和反义寡核苷酸中的至少一种。
5.一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：利用可逆加成-断裂链转移聚合RAFT聚合合成聚苯乙烯氯，再通过聚苯乙烯氯与二甲双胍的化学反应制备聚二甲双胍PMet；合成具有CD44受体靶向和肿瘤微环境透明质酸酶HAase敏感性能的透明质酸-巯基HA-SH；采用溶剂挥发-静电结合法制备共载化学和基因药物的聚二甲双胍PMet阳离子胶束，然后与透明质酸-巯基HA-SH通过静电结合和硫醇化学交联，制备出肿瘤微环境透明质酸酶触发变构-电荷翻转式化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统。
6.如权利要求5所述的一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统的制备方法，其特征在于：
其中聚二甲双胍PMet和透明质酸-巯基HA-SH的制备方法如下：
(1)聚苯乙烯氯的合成：将4-苯乙烯氯溶于有机溶剂A中，再加入4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸和偶氮二异丁腈，经液氮连续冻融-抽真空2-6次后，反应液在氮气保护下于60-110℃油浴聚合，磁力搅拌反应10-40h后，液氮猝冷以停止反应，加入有机溶剂A纯化沉淀反应液2-5次，真空干燥后得到聚苯乙烯氯；
(2)PMet的合成：将步骤(1)中得到的聚苯乙烯氯、二甲双胍与N,N-二异丙基乙胺溶于有机溶剂A中，在90～160℃油浴条件下反应2-5天，反应结束后，将上述反应产物转移至透析袋中用10-100mmol/L盐酸溶液透析2-5天，再用蒸馏水透析2-5天，冷冻干燥后得到PMet聚合物；
(3)HA-SH的合成：将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶于浓度为10-30mmol/L，pH 6.8-7.4PBS缓冲液中，反应1-4h活化透明质酸的羧基，然后加入胱氨二盐酸盐，室温条件下反应24-48h后用蒸馏水透析2-5天除去未反应物质，冷冻干燥收集；随后，上述产物溶解于蒸馏水中，在避光、磁力搅拌条件下加入过量二硫苏糖醇继续反应2-4h，反应液经蒸馏水透析2-5天、冷冻干燥后得到HA-SH。
7.如权利要求6所述的一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统的制备方法，其特征在于：所述聚二甲双胍PMet中苯乙烯氯的转化率为60％-90％，二甲双胍的聚合度为25-85个；透明质酸-巯基HA-SH的巯基含量为15％-35％；所述有机溶剂为A为四氢呋喃、二甲基亚砜、无水乙醚、石油醚、二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯中的任意一种。
8.如权利要求6所述的一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统的制备方法，其特征在于：步骤(1)中4-苯乙烯氯、4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸与偶氮二异丁腈的质量比为1:0.005-0.05:0.001-0.01，步骤(2)中聚苯乙烯氯、二甲双胍与N,N-二异丙基乙胺的质量比为1:5-25:10-18，步骤(3)中透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺与胱氨二盐酸盐的质量比为1:0.5-5:0.5-5:1-8。
9.如权利要求5所述的一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统的制备方法，其特征在于：所述的溶剂挥发-静电结合法制备共载化学和基因药物的PMet阳离子胶束，以及PMet胶束通过静电结合和硫醇化学交联与HA-SH共组装的制备方法，具体如下：
(1)将PMet聚合物与化学药物分别溶于有机溶剂B中，混合后缓慢滴加到盛有浓度为10-50mmol/L、pH 7.0-7.5并磁力搅拌的Hepes缓冲溶液中，滴加完后继续磁力搅拌8-12h，使有机溶剂B完全挥发，即得包载化学药物的PMet胶束溶液；
(2)将等体积基因药物溶液加入步骤(1)所得的包载化学药物的PMet胶束溶液中，采用移液枪头轻轻吹打均匀，静置10-40min，即得共载化学与基因药物的胶束复合物溶液；
(3)将等体积HA-SH溶液加入步骤(2)所得的胶束复合物溶液中，采用枪头轻轻吹打，静置10-40min，通过静电结合和硫醇化学交联得到共载化学和基因药物的靶向纳米递药系统。
10.如权利要求9所述的一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统的制备方法，其特征在于：所述PMet聚合物与化学药物的质量比为5-10:1，PMet聚合物与基因药物的N/P比为0.5-20:1；所述HA-SH与PMet聚合物的质量比为0.5-2.5:1；所述有机溶剂B为甲醇、二氯甲烷、无水乙醇、四氢呋喃和乙腈中的至少一种。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022144812A1 (en) * 2020-12-30 2022-07-07 Biorchestra Co., Ltd. Micellar nanoparticles and uses thereof
WO2022144811A1 (en) * 2020-12-30 2022-07-07 Biorchestra Co., Ltd. Micellar nanoparticles and uses thereof
CN114796491A (zh) * 2022-04-27 2022-07-29 中国药科大学 一种抗体修饰的抗肿瘤靶向递药与联合治疗系统及其制备方法和应用
US11839624B2 (en) 2019-06-26 2023-12-12 Biorchestra Co., Ltd. Micellar nanoparticles and uses thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070225264A1 (en) * 2006-03-20 2007-09-27 Mccourt Mary P Drug delivery means
CN104056275A (zh) * 2014-05-30 2014-09-24 中国药科大学 多功能主动靶向透明质酸-聚乳酸载体合成及其抗肿瘤药物胶束制备方法
CN106265510A (zh) * 2016-08-17 2017-01-04 宁夏医科大学 一种肿瘤细胞内pH触发式释药的多级靶向聚合物胶束及其制备方法
CN109939241A (zh) * 2019-03-27 2019-06-28 宁夏医科大学 一种双前药共组装纳米靶向给药系统及其制备方法
CN110585131A (zh) * 2019-09-20 2019-12-20 宁夏医科大学 共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束、制备方法及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070225264A1 (en) * 2006-03-20 2007-09-27 Mccourt Mary P Drug delivery means
CN104056275A (zh) * 2014-05-30 2014-09-24 中国药科大学 多功能主动靶向透明质酸-聚乳酸载体合成及其抗肿瘤药物胶束制备方法
CN106265510A (zh) * 2016-08-17 2017-01-04 宁夏医科大学 一种肿瘤细胞内pH触发式释药的多级靶向聚合物胶束及其制备方法
CN109939241A (zh) * 2019-03-27 2019-06-28 宁夏医科大学 一种双前药共组装纳米靶向给药系统及其制备方法
CN110585131A (zh) * 2019-09-20 2019-12-20 宁夏医科大学 共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束、制备方法及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘艳华等: "透明质酸聚合物胶束的制备及其内涵体的pH敏感性", 《功能高分子学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11839624B2 (en) 2019-06-26 2023-12-12 Biorchestra Co., Ltd. Micellar nanoparticles and uses thereof
WO2022144812A1 (en) * 2020-12-30 2022-07-07 Biorchestra Co., Ltd. Micellar nanoparticles and uses thereof
WO2022144811A1 (en) * 2020-12-30 2022-07-07 Biorchestra Co., Ltd. Micellar nanoparticles and uses thereof
CN114796491A (zh) * 2022-04-27 2022-07-29 中国药科大学 一种抗体修饰的抗肿瘤靶向递药与联合治疗系统及其制备方法和应用
CN114796491B (zh) * 2022-04-27 2023-01-31 中国药科大学 一种抗体修饰的抗肿瘤靶向递药与联合治疗系统及其制备方法和应用

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