CN112353948B - 响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种聚合物前药，以该聚合物前药为基础提供了响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束，该载药胶束由所述聚合物前药自组装形成，在人体生理pH值条件下，该载药胶束的表面带负电荷，当该载药胶束所处环境由人体生理pH值条件转变为肿瘤微酸性pH条件时，该载药胶束会发生电荷翻转和粒径减小。本发明可解决现有纳米药物递送系统难以在肿瘤部位实现粒径减小而存在的对肿瘤的穿透能力有限的问题，可打破纳米药物发挥优异抗肿瘤作用的限制条件，使载药胶束具有优异的长循环和聚集到肿瘤部位的能力，同时提高载药胶束向肿瘤深部穿透的能力，可有效改善药物的抗肿瘤效果。

Description

响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束及 其制备方法
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物递送系统领域，涉及聚合物前药，以该聚合物前药为基础的响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束，以及它们的制备方法。
背景技术
癌症是对人类生命健康最大的威胁之一，是世界上造成死亡的第二大原因。传统化疗药物具有以下缺点：水溶性和稳定性差，生物利用度低以及毒副作用大等，限制了其在临床中的应用。纳米药物递送系统由于具有可延长药物在体内的循环时间，毒副作用低，可实现缓释和控释药物等独特优势，近年来得到了广泛的研究。纳米药物递送系统的发展经历了被动靶向，主动靶向，刺激响应性纳米药物递送系统等过程，目前已有不同类型的纳米抗肿瘤药物批准应用于临床。尽管纳米药物递送系统可以减轻传统化疗药物带来的系统毒性，但在提高患者的总体生存期方面的效果仍有待改善。
纳米药物在体内递送需要经历五个过程：血液循环、肿瘤聚集、肿瘤穿透、入胞和药物释放，而肿瘤穿透和入胞被认为是限制纳米药物发挥优异抗肿瘤效果的主要因素。研究显示，纳米药物对肿瘤组织的穿透深度与纳米药物的粒径紧密相关。较大粒径(60-100nm)有利于改善在体内的药代动力学特点，延长体内循环时间，并可通过增强渗透和滞留作用(EPR 效应)实现对肿瘤的被动靶向，但较大的粒径阻碍了其往肿瘤深部穿透。小粒径(10nm) 有利于提高在肿瘤部位的穿透能力，但是容易被网状内皮系统吞噬，在体内快速被清除，并且通过EPR效应被动靶向的能力较差。因此，理想的纳米药物在血液循环中应该保持较大粒径实现长效循环，到达肿瘤部位后快速转变为较小粒径实现深部穿透。
人体组织pH值为7.4，在肿瘤部位由于肿瘤细胞的过度快速增殖导致肿瘤间质pH值降低为6.5-7.0，而细胞内的酸性细胞器溶酶体/内涵体中的pH值则更低，为4.0-5.5。若能基于这些pH值的差异，开发出能在血液循环中可保持较大粒径，同时可响应肿瘤微酸性环境实现粒径变小的纳米药物递送系统，对于提高纳米药物发挥抗肿瘤效果将产生积极的作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束及其制备方法，以解决现有纳米药物递送系统难以在肿瘤部位实现粒径减小而存在的对肿瘤的穿透能力有限的问题，赋予载药胶束长效循环和对肿瘤高效穿透的能力。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种聚合物前药，该聚合物前药是由结构式如式(I)所示的三嵌段聚合物上的醛基与带氨基的抗肿瘤药物上的氨基反应形成，带氨基的抗肿瘤药物通过亚胺键连接到结构式如式 (I)所示的三嵌段聚合物上，该聚合物前药的结构式如式(II)所示，
Figure BDA0002734547300000021
式(I)～(II)中，x为75～85，y为95～105，z为55～65，R-为带氨基的抗肿瘤药物去掉一个氨基后形成的基团。
上述聚合物前药的技术方案中，所述带氨基的抗肿瘤药物根据实际应用需求进行确定，只要该带氨基的抗肿瘤药物的氨基可与结构式如式(I)所示的三嵌段聚合物上的醛基发生反应形成亚胺键将抗肿瘤药物连接到结构式如式(I)所示的三嵌段聚合物上的醛基即可。当带氨基的抗肿瘤药物中含有多个氨基时，只要带氨基的抗肿瘤药物中的一个氨基可与结构式如式(I)所示的三嵌段聚合物上的醛基发生反应形成亚胺键即可。常见的带氨基的抗肿瘤药物包括但不限于阿霉素、表阿霉素、吉西他滨以及丝裂霉素中的任意一种。
上述聚合物前药的技术方案中，聚合物前药中带氨基的抗肿瘤药物的载药量根据实际应用需求进行确定，通常，带氨基的抗肿瘤药物的载药量为1％～70％，例如可以是1％～20％， 1％～10％等。
上述聚合物前药的技术方案中，式(I)和(II)中，x优选为78～82，y优选为98～102，z优选为58～62，进一步优选地，x为80，y为100，z优选为60。
本发明还提供了上述聚合物前药的制备方法，步骤如下：
(1)在氮气保护下将4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸、2-(六甲撑亚胺)乙醇甲基丙烯酸酯和引发剂溶于1，4-二氧六环中并于65～70℃进行聚合物反应，将所得反应液在过量冷己烷中沉淀，固液分离，将所得固相干燥，得到单嵌段聚合物；
(2)在氮气保护下将步骤(1)所得单嵌段聚合物、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和引发剂溶于1，4-二氧六环中并于70～75℃进行聚合物反应，将所得反应液在过量冷己烷中沉淀，固液分离，将所得固相干燥，得到双嵌段聚合物；
(3)在氮气保护下将步骤(2)所得双嵌段聚合物、4-乙烯基苯甲醛和引发剂溶于1，4- 二氧六环中并于70～75℃进行聚合物反应，将所得反应液在过量冷己烷中沉淀，固液分离，将所得固相干燥，得到三嵌段聚合物；
(4)将步骤(3)所得三嵌段聚合物用N，N-二甲基甲酰胺溶解，加入用溶剂溶解的带氨基的抗肿瘤药物，避光充分反应，将所得反应液在N，N-二甲基甲酰胺中充分透析，之后在冷己烷/乙醚混合溶剂中沉淀，固液分离，将所得固相干燥，即得聚合物前药；
步骤(1)～(3)中，2-(六甲撑亚胺)乙醇甲基丙烯酸酯、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、与4-乙烯基苯甲醛与4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸的投料摩尔比为x∶y∶z∶1，其中，x为75～85， y为95～105，z为55～65。
上述聚合物前药的制备方法的技术方案的步骤(4)中，带氨基的抗肿瘤药物的加入量根据实际的载药量需求进行确定，通常，带氨基的抗肿瘤药物的加入量应使三嵌段聚合物与带氨基的抗肿瘤药物的质量比为(0.1～10)∶1，例如，可行的带氨基的抗肿瘤药物的加入量应使三嵌段聚合物与带氨基的抗肿瘤药物的质量比为(4～8)∶1。
上述聚合物前药的制备方法的技术方案的步骤(1)～(3)中，引发剂与4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸的摩尔比为(0.1～0.3)∶1，所述的引发剂可以是偶氮二异丁腈。
上述聚合物前药的制备方法的技术方案的步骤(1)～(3)中，2-(六甲撑亚胺)乙醇甲基丙烯酸酯、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、与4-乙烯基苯甲醛与4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸的投料摩尔比为x∶y∶z∶1，其中，x优选为78～82，y优选为98～102，z优选为58～62，进一步优选地，x为80，y为100，z优选为60。
上述聚合物前药的制备方法的技术方案的步骤(1)～(3)中的聚合物反应时间通常为 20～24h。
本发明还提供了一种响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束，该载药胶束由上述聚合物前药自组装形成，在人体生理pH值条件下，该载药胶束的表面带负电荷，当该载药胶束所处环境由人体生理pH值条件转变为肿瘤微酸性pH条件时，该载药胶束会发生电荷翻转和粒径减小。
上述载药胶束的技术方案中，人体生理pH值条件通常是指pH值约为7.4的条件。由于在肿瘤部位由于肿瘤细胞的过度快速增殖导致肿瘤间质pH值降低为6.5-7.0，而细胞内的酸性细胞器溶酶体/内涵体中的pH值则低至4.0-5.5，因此，通常肿瘤微酸性pH条件是指pH值为4.0～7.0的条件。在本发明中，我们采用了pH＝7.4的磷酸盐缓冲液模拟生理条件，采用了 pH＝6.7的磷酸盐缓冲液模拟肿瘤酸性微环境。
上述载药胶束的技术方案中，当该载药胶束所处环境由人体生理pH值条件转变为肿瘤微酸性pH条件时，该载药胶束的粒径减小至不超过该载药胶束在人体生理pH值条件下粒径的60％。进一步地，当该载药胶束处于人体生理pH值条件下时，该载药胶束的粒径为75～85μm，当该载药胶束处于肿瘤微酸性pH条件时，该载药胶束的粒径为40～45μm。
本发明还提供了上述响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束的制备方法，将前述本发明提供的聚合物前药溶于有机溶剂中形成聚合物前药溶液，在冰浴和超声条件下，将聚合物前药溶液滴加至pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，滴加完毕后继续超声至少 1min，然后透析去除有机溶剂，即得载药胶束。
上述载药胶束的制备方法的技术方案中，在配制聚合物前药溶液时，有机溶剂的用量将聚合物前药恰好溶解即可；pH值为7.4的磷酸盐缓冲液与聚合物前药溶液的体积比为 (10～20)∶1。
与现有技术相比，本发明产生了以下有益的技术效果：
1.本发明提供了一种聚合物前药，并以该聚合物前药为基础提供了一种响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束，该载药胶束由所述聚合物前药自组装形成，在生理pH值条件(pH＝7.4)下，该载药胶束的表面带负电荷，当该载药胶束所处环境由生理pH 值条件转变为肿瘤微酸性pH条件(pH＝6.7)时，该载药胶束会发生电荷翻转和粒径减小，当在pH＝5.0的溶酶体环境下，该载药胶束中的亚胺键断裂，可实现药物的胞内释放。在生理 pH值条件下，载药胶束保持较大的粒径，有利于在血液循环中维持较长的循环时间，并且有助于通过EPR效应充分聚集到实体瘤部位，在肿瘤微酸性pH条件下，载药胶束的粒径可显著缩小，有利于提高载药胶束对实体瘤的穿透能力，穿透进入实体瘤后，在溶酶体环境中可实现胞内释药。以上这些特点都有利于打破纳米药物发挥优异抗肿瘤作用的限制条件，使载药胶束不但具有优异的长循环和聚集到肿瘤部位的能力，而且提高了载药胶束向肿瘤深部穿透的能力，可有效改善抗肿瘤药物的抗肿瘤效果。
2.当本发明提供的载药胶束所处环境的pH值由7.4转变为6.7时，载药胶束的粒径可由 81nm左右显著缩小至40nm左右，同时，载药胶束的表面电荷由负电荷转变为带正电荷，因细胞膜表面带负电荷，载药胶束的电荷翻转能增加与细胞膜之间的相互作用，增强入胞效果。本发明通过体外肿瘤细胞微球模型证实了该纳米胶束对肿瘤细胞微球具有优异的穿透能力。本发明还通过裸鼠MCF-7皮下肿瘤模型证实了载药胶束对肿瘤的具有更强的穿透能力和抑制效果。
3.本发明提供的载药胶束通过响应肿瘤酸性微环境即可实现粒径减小和表面电荷翻转，粒径和表面电荷的翻转无需发生化学反应来引发，也无需引入外部光、热、磁等刺激来引发，将其用于抗肿瘤治疗，具有操作简单方便的优势，有利于推广应用。
4.本发明还提供了上述聚合物前药和载药胶束的制备方法，聚合物前药通过RAFT聚合得到，通过筛选化合物单体的结构、各单体的用量比例、合成条件的控制等，最终得到了在自组装后可以响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束，为纳米药物体系提供了一种新的思路方法。
附图说明
图1是实施例1合成的聚合物前药及各步骤所得产物的核磁谱图。
图2是对比例1合成的聚合物前药及各步骤所得产物的核磁谱图。
图3是实施例1和对比例1在负载药物前后的GPC对比谱图。
图4是实施例2制备载药胶束的粒径和表观形貌表征结果，其中(A)～(C)图分别是TEM图、粒径分布图和AFM图。
图5是对比例3制备载药胶束的粒径和表观形貌表征结果，其中(A)～(C)图分别是TEM图、粒径分布图和AFM图。
图6是以实施例1和对比例1合成的聚合物前药为基础制备的载药胶束在不同pH值条件下的Zeta电位变化情况。
图7是检测载药胶束入胞的实验结果。
图8是检测载药胶束溶酶体逃逸能力的实验结果。
图9是检测载药胶束对肿瘤细胞球的穿透能力的实验结果。
图10是实施例6中载药胶束对实体瘤的穿透能力实验结果。
图11是实施例6中载药胶束的抗肿瘤治疗实验结果。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束及其制备方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于本发明的保护范围。
下述各实施例和对比例中，所使用的各种原料和试剂均为市售商品。1，4-二氧六环在使用前需要重蒸。聚乙二醇甲基丙烯酸酯的分子量约为300。模拟生理条件使用的是pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，模拟肿瘤酸性微环境使用的是pH＝6.7的PBS。pH＝6.7的PBS的配置方法为：(1)配制1/15mol/L的KH2PO4水溶液，即在每升水中溶解9.08g KH2PO4；(2)1/15mol/L的Na2HPO4水溶液，即在每升水中溶解9.47g无水Na2HPO4；(3)将56.5mL步骤(1)配制的溶液与43.5mL步骤(2)配制的溶液混合均匀，即得。pH＝7.4的PBS可采用类似的方法配置得到，调整步骤(3)中两种溶液的添加量即可。
聚合物前药中载药量的测定方法(以负载阿霉素的情况为例，说明载药量的测定方法)：
使用紫外分光光度计在490nm波长处测定不同浓度阿霉素溶液的吸光度来绘制标准曲线。首先将盐酸阿霉素溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，配置成浓度为1mg/mL作为母液，将母液稀释成一系列不同浓度的阿霉素的DMF溶液(10，15，20，25，30，35，40， 50μg/mL)。然后对其吸光度进行检测，以阿霉素浓度为横坐标，相应浓度阿霉素溶液的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。对标准曲线进行拟合得到浓度与吸光度之间的函数关系式： y＝0.021x+0.0111。
然后，称取一定量的负载阿霉素的聚合物前药，溶解在1mL DMF中，在490nm处测定吸光度，根据前述浓度与吸光度之间的函数关系式计算出聚合物前药中负载的阿霉素的含量。
最后，通过下面的公式计算聚合物前药中阿霉素的载药量：
载药量(％)＝聚合物前药中阿霉素的含量/三嵌段聚合物的质量×100％
实施例1
本实施例中，合成聚合物前药，合成路线及步骤如下：
Figure BDA0002734547300000071
(1)将链转移剂4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(CPDB)、2-(六甲撑亚胺)乙醇甲基丙烯酸酯(HEME)单体和引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)溶于重蒸过的1，4-二氧六环(1，4-Dioxane)中，HEME与CPDB的摩尔比为80∶1，AIBN与CPDB的摩尔比为0.2∶1，CPDB在1，4-二氧六环中的浓度为0.02mmol/mL。将所得混合溶液转移至预先除氧的反应瓶中，随后进行冷冻- 抽真空-通氮气循环三次以除尽反应瓶中的氧气，然后通入氮气保护并将反应瓶密封，在65 ℃进行聚合反应，聚合反应24h后，用液氮对反应进行冷冻猝灭，之后向所得反应液中加入二氯甲烷进行稀释并在过量冷己烷中沉淀，固液分离，将所得固相真空干燥，得到单嵌段聚合物PHEME。
(2)将步骤(1)所得PHEME、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)单体和引发剂AIBN溶于1，4-二氧六环中，OEGMA的加入量为步骤(1)中CPDB摩尔量的100倍，AIBN的加入量为步骤(1)中CPDB摩尔量的0.2倍，OEGMA在1，4-二氧六环中的浓度为2mmol/mL。将所得混合溶液转移至预先除氧的反应瓶中，随后进行冷冻-抽真空-通氮气循环三次以除尽反应瓶中的氧气，然后通入氮气保护并将反应瓶密封，在70℃进行聚合反应，聚合反应24h 后，用液氮对反应进行冷冻猝灭，之后向所得反应液中加入二氯甲烷进行稀释并在过量冷己烷中沉淀，固液分离，将所得固相真空干燥，得到双嵌段聚合物PHEME-POGEMA。
(3)将步骤(2)所得PHEME-POGEMA、4-乙烯基苯甲醛(VB)单体和引发剂AIBN 溶于1，4-二氧六环中，VB的加入量为步骤(1)中CPDB摩尔量的60倍，AIBN的加入量为步骤(1)中CPDB摩尔量的0.2倍，VB在1，4-二氧六环中的浓度为1.2mmol/mL。将所得混合溶液转移至预先除氧的反应瓶中，随后进行冷冻-抽真空-通氮气循环三次以除尽反应瓶中的氧气，然后通入氮气保护并将反应瓶密封，在70℃进行聚合反应，聚合反应24h后，用液氮对反应进行冷冻猝灭，之后向所得反应液中加入二氯甲烷进行稀释并在过量冷己烷中沉淀，固液分离，将所得固相真空干燥，得到三嵌段聚合物PHEME-POGEMA-PVB。
(4)将盐酸阿霉素(DOX.HCl)用二甲基亚砜(DMSO)溶解，得到浓度为20mg/mL 的盐酸阿霉素溶液，按照每1mg盐酸阿霉素加入2μL三乙胺的比例，在避光搅拌条件下加入三乙胺并反应2h对盐酸阿霉素进行脱盐酸，之后加入溶解有PHEME-POGEMA-PVB的N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，PHEME-POGEMA-PVB的加入量为盐酸阿霉素5倍(加入量以质量计)，继续在避光搅拌条件下反应24h，将所得反应液在DMF中充分透析，之后在冷己烷 /乙醚混合溶剂中(己烷与乙醚的体积比为1∶1)沉淀，固液分离，将所得固相真空干燥，即得聚合物前药PHEME-POGEMA-PVB-DOX，简称HOV-DOX。该聚合物前药的结构式即为上述合成路线中终产物的结构式，该结构式中，x为80，y为100，z为60。
对比例1
本对比例中，将实施例1中的单体HEME替换为2-环己基甲基丙烯酸酯(CEME)单体，合成聚合物前药，合成路线及步骤如下：
Figure BDA0002734547300000091
(1)将链转移剂CPDB、CEME单体和引发剂AIBN溶于重蒸过的1，4-二氧六环，CEME与CPDB的摩尔比为80∶1，AIBN与CPDB的摩尔比为0.2∶1，CPDB在1，4-二氧六环中的浓度为0.02mmol/mL。将所得混合溶液转移至预先除氧的反应瓶中，随后进行冷冻-抽真空-通氮气循环三次以除尽反应瓶中的氧气，然后通入氮气保护并将反应瓶密封，在65℃进行聚合反应，聚合反应24h后，用液氮对反应进行冷冻猝灭，之后向所得反应液中加入二氯甲烷进行稀释并在过量冷己烷中沉淀，固液分离，将所得固相真空干燥，得到单嵌段聚合物PCEME。
(2)将步骤(1)所得单嵌段聚合物PCEME、OEGMA单体和引发剂AIBN溶于1，4-二氧六环中，OEGMA的加入量为步骤(1)中CPDB摩尔量的100倍，AIBN的加入量为步骤(1 )中CPDB摩尔量的0.2倍，OEGMA在1，4-二氧六环中的浓度为2mmol/mL。将所得混合溶液转移至预先除氧的反应瓶中，随后进行冷冻-抽真空-通氮气循环三次以除尽反应瓶中的氧气，然后通入氮气保护并将反应瓶密封，在70℃进行聚合反应，聚合反应24h后，用液氮对反应进行冷冻猝灭，之后向所得反应液中加入二氯甲烷进行稀释并在过量冷己烷中沉淀，固液分离，将所得固相真空干燥，得到双嵌段聚合物PCEME-POGEMA。
(3)将步骤(2)所得双嵌段聚合物PCEME-POGEMA、VB单体和引发剂AIBN溶于1，4 -二氧六环中，VB的加入量为步骤(1)中CPDB摩尔量的60倍，AIBN的加入量为步骤(1) 中CPDB摩尔量的0.2倍，VB在1，4-二氧六环中的浓度为1.2mmol/mL。将所得混合溶液转移至预先除氧的反应瓶中，随后进行冷冻-抽真空-通氮气循环三次以除尽反应瓶中的氧气，然后通入氮气保护并将反应瓶密封，在70℃进行聚合反应，聚合反应24h后，用液氮对反应进行冷冻猝灭，之后向所得反应液中加入二氯甲烷进行稀释并在过量冷己烷中沉淀，固液分离，将所得固相真空干燥，得到三嵌段聚合物PCEME-POGEMA-PVB。
(4)将盐酸阿霉素(DOX.HCl)用DMSO溶解，得到浓度为20mg/mL的盐酸阿霉素溶液，按照每1mg盐酸阿霉素加入2℃L三乙胺的比例，在避光搅拌条件下加入三乙胺并反应 2h对盐酸阿霉素进行脱盐酸，之后加入溶解有PCEME-POGEMA-PVB的DMF中， PCEME-POGEMA-PVB的加入量为盐酸阿霉素5倍(加入量以质量计)，继续在避光搅拌条件下反应24h，将所得反应液在DMF中充分透析，之后在冷己烷/乙醚混合溶剂中(己烷与乙醚的体积比为1∶1)沉淀，固液分离，将所得固相真空干燥，即得聚合物前药PCEME-POGEMA-PVB-DOX，简称COV-DOX，该聚合物前药的结构式即为上述合成路线中终产物的结构式，该结构式中，a为80，b为100，c为60。
对本实施例1和对比例1各步骤合成的单嵌段聚合物、双嵌段聚合物、三嵌段聚合物和聚合物前药进行核磁氢谱分析，结果分别如图1、2所示。
图1中，4.0-4.5之间的峰位是HEME单体a位氢的特征峰，表明HEME单体的成功聚合；3.0-3.5之间的峰位是OEGMA单体末端甲基g位氢的特征峰，表明OEGMA单体的成功聚合；6.7-7.0和7.0-8.0之间的两个峰位是VB单体的h，j位氢的特征峰，9.0-10.0之间的峰位是VB单体醛基k位氢的特征峰，表明单体VB的成功聚合；～8.0处的峰位是阿霉素上m，n 位氢的特征峰，表明阿霉素成功地结合在了三嵌段聚合物上。
图2中，从上至下的4条曲线分别代表PCEME、PCEME-POGEMA、 PCEME-POGEMA-PVB以及PCEME-POGEMA-PVB-DOX。4.0-4.5之间的峰位是CEME单体的a位氢的特征峰，表明CEME单体的成功聚合；3.0-3.5之间的峰位是OEGMA单体末端甲基g位氢的特征峰，表明单体OEGMA的成功聚合；6.7-7.0和7.0-8.0之间的两个峰位是 VB单体的h，j位氢的特征峰，9.0-10.0之间的峰位是VB单体醛基k位氢的特征峰，表明单体VB的成功聚合；～8.0处的峰位是阿霉素上m，n位氢的特征峰，表明阿霉素成功地结合在了三嵌段聚合物上。
对实施例1制备的PHEME-POGEMA-PVB和HOV-DOX，以及对比例1制备的 PCEME-POGEMA-PVB和COV-DOX进行凝胶渗透色谱(GPC)测试，结果如图3所示。图 3的结果进一步表明聚合物前药的成功合成。
对比例2
本对比例中，合成聚合物前药，其合成方法与实施例1基本相同，不同之处仅在于，步骤(2)中，OEGMA的加入量为步骤(1)中CPDB摩尔量的80倍，OEGMA在1，4-二氧六环中的浓度为1.6mmol/mL。
对实施例1、对比例1～2制备的聚合物前药的载药量，结果如表1所示。
表1实施例1、对比例1～2制备的聚合物前药的载药量
实施例1 对比例1 对比例2
载药量 9.6％ 11.3％ 9.2％
实施例2
本实施例中，以实施例1合成的聚合物前药为基础制备载药胶束，步骤如下：
取3mg实施例1制备的聚合物前药溶解于200μL DMF中形成聚合物前药溶液，在冰浴和功率为200W的超声条件下，将下将聚合物前药溶液缓慢滴入3mL pH＝7.4的PBS中，滴加完毕后，在冰浴条件下继续超声5min，然后转入pH＝7.4的PBS中充分透析除去DMF，即得载药胶束。
取3mg实施例1制备的聚合物前药溶解于200μL DMF中形成聚合物前药溶液，在冰浴和功率为200W的超声条件下，将下将聚合物前药溶液缓慢滴入3mL pH＝6.7的PBS中，滴加完毕后，在冰浴条件下继续超声5min，然后转入pH＝6.7的PBS中充分透析除去DMF，即得载药胶束。
对比例3
本对比例中，以对比例1合成的聚合物前药为基础制备载药胶束，除了采用的聚合物前药为对比例1合成的之外，其他制备条件与实施例2相同。
对比例4
本对比例中，以对比例2合成的聚合物前药为基础制备载药胶束，除了采用的聚合物前药为对比例2合成的之外，其他制备条件与实施例2相同。
实施例3
本实施例中，通过动态光散射测试法(DLS)对实施例2、对比例3～4制备的载药胶束进行粒度进行表征。取实施例2、对比例3～4在不同pH值条件下制备的载药胶束，用相应pH值的PBS配置成浓度为1mg/mL、pH值分别为7.4和6.7的载药胶束溶液，通过动态光散射测试法对载药胶束的粒度进行表征。测定条件：温度25℃，散射角173°，每个样品测定三次。结果如表2所示。
将实施例2、对比例3制备的载药胶束用相应pH值的PBS稀释成浓度为100μg/mL的载药胶束溶液，用透射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)表征载药胶束的粒径和形貌，结果分别如图4、5所示。
表2载药胶束的平均粒径和多分散系数
Figure BDA0002734547300000121
图4、5的(B)图是DLS测定的载药胶束的粒径分布柱状图，图4、5的(B)图清晰地展现了载药胶束的粒径分布情况，结合表2可知，三种载药胶束在pH＝7.4和pH＝6.7条件下的粒径不同，且PDI较小，说明载药胶束胶束的粒径分布均一。通过TEM照片也可以看到，以上三种载药胶束在pH＝7.4和pH＝6.7条件下呈现出大小均匀且规则的球形状。对于实施例2制备的载药胶束而言，在pH＝6.7条件下的粒径要明显小于pH＝7.4条件下的粒径，但对比例3在pH＝7.4和6.7条件下制备的载药胶束的粒径则相差不大，而对比例4制备的载药胶束在pH＝6.7的条件下的粒径则相对于在pH＝6.7条件下制备的载药胶束的粒径更大。特别地，实施例2制备的载药胶束在pH＝7.4条件下的粒径为81nm左右，此粒径有利于在血液循环中维持较长的循环时间，并且有助于通过EPR效应充分聚集到实体瘤部位，在pH＝6.7条件下该载药胶束的粒径发生了显著的缩小，缩小至40nm左右，仅为pH＝7.4条件下的粒径的一半左右，该粒径大小有利于载药胶束对实体瘤的穿透。
实施例4
本实施例中，测试实施例2和对比例3制备的载药胶束在不同pH值条件下的Zeta电位，观察载药胶束是否会发生电荷翻转行为。
1.(1)取10mg实施例1制备的聚合物前药溶解于200μL DMF中形成聚合物前药溶液，在冰浴和功率为200W的超声条件下，将聚合物前药溶液缓慢滴入10mL pH＝7.4的PBS中，滴加完毕后，在冰浴条件下继续超声5min，即得载药胶束，立即测定Zeta电位值。
(2)取3份步骤(1)制备的载药胶束，每份2mL，调整其pH值分别为7.0、6.7、5.0，并立即测定在相应pH值条件下的Zeta电位值，然后将它们转入37℃恒温箱中振荡，在转速为120r/min的条件下振荡，在预设的时间点(0min、10min、20min、30min、1h、2h、6h) 分别测定各样品在不同pH值条件下的Zeta电位。各样品在每个条件下测定三次。
2.取对比例1制备的聚合物前药制备载药胶束并测试Zeta电位，操作同步骤1。
以实施例1和对比例1合成的聚合物前药为基础制备的载药胶束在不同pH值条件下的 Zeta电位变化情况如图6的(A)、(B)图所示。以实施例1合成的聚合物前药为基础制备的载药胶束，在pH＝6.7的条件下，0min时Zeta电位为负，10min时Zeta电位升高至～+5mv，随着时间的延长，电位进一步升高，6h时电位值达到～+8mv，实现了明显的电荷翻转，同样，在pH＝5.0的条件下也出现了电荷翻转现象；以对比例1合成的聚合物前药为基础制备的载药胶束，在pH＝6.7及其他几个pH值条件下，表面Zeta电位始终维持在负电荷状态，未发生电荷翻转。
结合实施例3、4可知，只有当采用的单体的结构和比例适当时，载药胶束从生理pH条件进入肿瘤微酸性pH条件下才会发生电荷翻转和粒径缩小，实现在血液循环中维持较长的循环时间并通过EPR效应充分聚集到实体瘤部位，同时在肿瘤部位具有高穿透能力的效果。
实施例5
本实施例中，通过激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)检测实施例2的载药胶束(HVDMs)的入胞情况、溶酶体逃逸以及对肿瘤细胞球的穿透能力，以和对比例3制备的载药胶束(CVDMs)作为对照组。
1.检测载药胶束的入胞情
将贴壁MCF-7细胞进行消化并计数，按照2×105个细胞/皿的密度接种在玻底皿中，然后将其置于37℃，5％CO2的孵育箱中进行孵育，24h贴壁后，在设计的时间点吸去原有培养基，加入pH值分别为7.4和6.7的含有HVDMs，CVDMs和DOX·HCl(DOX浓度为：5μg/mL) 的新鲜培养基，孵育0.5h，2h，6h，孵育后共同进行下一步处理。处理方法为：吸去培养基，用PBS清洗三次，加入4％的多聚甲醛固定15min，固定后用PBS清洗3次，加入DAPI染液染色15min，弃去染液，再用PBS清洗三次，在激光共聚焦显微镜下观察入胞情况。DAPI 染的细胞核显示蓝色，DOX荧光信号显示红色，激发波长分别是352nm和488nm，发射波长分别是455nm和595nm。
2.检测载药胶束溶酶体逃逸能力
将贴壁MCF-7细胞进行消化并计数，按照2×105个细胞/皿的密度接种在玻底皿中，然后将其置于37℃，5％CO2的孵育箱中进行孵育，24h贴壁后，在设计的时间点吸去原有培养基，加入pH值分别为7.4和6.7的HVDMs(DOX浓度为：5μg/mL)的新鲜培养基，孵育1h和12h，孵育后进行下一步处理：吸去培养基，然后用PBS清洗3次再加入稀释后的溶酶体染液染色30min，弃去染液，用PBS清洗三次后，在激光共聚焦显微镜下观察纳米胶束的胞内定位情况。DOX荧光信号显示红色，溶酶体染色为绿色，激发波长分别是488nm和504nm，发射波长分别是595nm和511nm。
3.检测载药胶束对肿瘤细胞球的穿透能力
通过悬浮培养法培养MCF-7悬浮细胞球，待微球生长至粒径为400-500μm后，以800r/min 的转速离心3min，弃去上清培养液，加入pH值分别为7.4和6.7的2mL含有HVDMs，CVDMs (DOX浓度为5μg/ml)的含药培养基重悬细胞微球，并转移至超低粘附6孔板中继续孵育 6h，然后将每个孔中的细胞微球分别收集在一个离心管中，以800r/min的转速离心3min，弃去上清培养液，用200μL新鲜PBS将细胞微球重悬于玻底皿中央，在激光共聚焦显微镜下进行层扫观察，层间距离为10μm。
图7是检测载药胶束入胞的实验结果，图中的(A)图是HVDMs和CVDMs在pH值分别为7.4和6.7条件下与MCF-7细胞共孵育0.5h，2h，6h后，通过激光共聚焦观察到的DOX 在胞内分布情况，(B)图是共孵育0.5h，2h，6h后胞内阿霉素荧光信号3D重建模型，(C) 图是共孵育0.5h，2h，6h后的荧光信号定量对比图，(C)图中的柱状图，从左至右，每3 个为一组，每组柱状图中，从左至右边依次代表共孵育0.5h，2h，6h。从0.5h，2h，6h三个时间点的入胞情况看，在6h时4个组别的DOX荧光信号都要强于0.5h和2h的荧光信号，说明6h时入胞效果是最佳的；单个时间点入胞效果显示，HVDMs在pH＝6.7时入胞效果要明显强于其在pH＝7.4的入胞效果且明显优于对照组CVDMs在pH＝7.4和6.7的入胞情况，并且在6h时，HVDMs在pH＝6.7的共聚焦结果显示，细胞核中可以观察到较强的DOX荧光信号。由此可知HVDMs在pH＝6.7时入胞效果是最佳的，并且在细胞内溶酶体中可以成功释放药物DOX，然后从溶酶体逃逸进入细胞核发挥抗肿瘤作用。这归因于细胞膜表面带负电荷， HVDMs在肿瘤微酸性条件下发生的快速的电荷翻转，由负电荷翻转为正电荷，从而增加与细胞膜之间的相互作用，增强入胞效果。
图8是检测载药胶束溶酶体逃逸能力的实验结果，图中的1h和12h代表孵育时间为1h 和12h，图中左侧的四组图是通过激光共聚焦观察到的DOX在胞内分布情况，最右侧的一组图是孵育1h和12h后，胞内阿霉素荧光信号3D重建模型。孵育1h时，DOX荧光信号主要分布在细胞质中，与溶酶体染色信号分布相似，说明载药胶束入胞后主要集中分布在溶酶体中。孵育12h时，DOX荧光信号几乎全部集中在细胞核中，说明亚胺键在溶酶体中能够有效水解并释放药物DOX，然后从溶酶体中逃逸进入细胞核发挥抗肿瘤作用。
图9是检测载药胶束对肿瘤细胞球的穿透能力的实验结果，其中的A图是HVDMs和CVDMs在pH值分别为7.4和6.7条件下与肿瘤细胞球共孵育6h后，通过激光共聚焦层扫来检测不同条件下的纳米胶束穿透深度，B图是所有扫描深度的荧光信号进行定量绘制成的三维柱状图，C图是分别对每一层扫描深度的荧光信号进行定量的对比图，该图中，一共有8幅独立的小图，各幅小图中的柱状图，从左至右依次代表HVDMs在pH＝6.7、HVDMs在 pH＝7.4、CVDMs在pH＝7.4、CVDMs在pH＝6.7条件下的荧光信号强度。由图9可知，相比于对比其他几个组，HVDMs在pH＝6.7时，在70μm的肿瘤深处，仍有较强的阿霉素荧光信号，HVDMs在pH＝6.7时的穿透效果最佳。
实施例6
本实施例中，验证实施例2的载药胶束(HVDMs)对实体肿瘤的穿透以及抑制作用，以对比例3制备的载药胶束(CVDMs)作为对照组。建立裸鼠MCF-7皮下肿瘤模型，当肿瘤长到约50-60mm3后进行如下实验。
1.载药胶束对实体瘤的穿透能力实验
将荷瘤小鼠随机分成四组并做好标记，每组小鼠3只，分别将100μL的PBS、盐酸阿霉素溶液(DOX·HCl)、HVDMs和CVDMs溶液通过尾静脉注射的方式注入裸鼠体内，其中阿霉素的给药量均为10mg/kg，阿霉素的浓度为1mg/ml。分别在静脉给药2h和6h后，将裸鼠无痛处死并解剖出肿瘤，进行冰冻切片扫描和定量分析。
结果如图10所示，图中，A图为游离DOX、HVDMs、CVMDs给药2h和6h后，离体肿瘤冰冻切片扫描结果，B图为肿瘤整体扫描图荧光强度半定量分析结果，C图为肿瘤放大扫描图荧光强度半定量分析。由图10可知，在给药2h后，盐酸阿霉素溶液(DOX·HCl)、 HVDMs溶液和CVDMs溶液三个组的DOX荧光信号都较弱，但DOX组荧光信号要稍强于 HVDMs组和CVDMs组；在给药6h后，HVDMs组在肿瘤边缘大量的聚集显示较强的红色荧光强度，并且在中间部位的荧光强度要强于DOX组和CVDMs组，说明HVDMs能有效地穿透实体瘤进入到实体瘤内部。通过放大切片，可以看出在肿瘤深处，HVDMs组仍有较强的荧光信号，而CVDMs组和DOX组的荧光信号明显较弱；并且通过对切片整体和局部的半定量分析也证实了上述结果。表明载药胶束HVDMs对肿瘤的穿透能力更强。
2.采用载药胶束进行抗肿瘤治疗实验
选择肿瘤大小均匀的荷瘤小鼠，随机分为PBS组、DOX·HCl组、HVDMs组、CVDMs 组，每组8只，通过尾静脉注射方式每3天给药一次，总共给药4次，其中阿霉素的给药量为5mg/kg，阿霉素浓度为1mg/mL。第9天时停止给药，治疗周期为15天。每次给药前用天平对每只小鼠的体重进行称量，以及用数显游标卡尺测量每只小鼠的肿瘤大小并做好记录，荷瘤小鼠肿瘤大小的测量方法：肿瘤的长度记为a，肿瘤的宽度记为b，肿瘤体积计算公式：肿瘤体积V(mm3)＝0.5×a×b2。小鼠的相对肿瘤体积计算公式：相对肿瘤体积(％)＝Vn/V0×100％， Vn代表第n天的肿瘤体积，V0代表给药前的肿瘤体积。以时间作为横坐标，相对肿瘤体积作为纵坐标，绘制出每组小鼠的肿瘤变化曲线。实验结束后，将小鼠处死，取肿瘤，称量离体肿瘤质量，计算肿瘤抑制率。
结果如图11所示，图中，A图是治疗过程中的相对肿瘤体积的变化情况，B图是治疗前后小鼠肿瘤大小对比图，C图是治疗结束后各组离体肿瘤实物图，D 图是治疗结束后各组离体肿瘤平均重量，E 图是治疗结束后各组肿瘤抑制率。由图11的A、B图可以看出，经过15天治疗后，CVDMs组小鼠肿瘤只有轻微的抑制作用，HVDMs组小鼠肿瘤基本消失，显示出优异的抗肿瘤效果。由图11的C、D、E图可以看出，相对于，CVDMs组，HVDMs组经过 15天治疗后，肿瘤更小，肿瘤抑制率更高。说明载药胶束HVDMs具有良好的抗肿瘤作用。
实施例7
本实施例中，合成聚合物前药并制备载药胶束，步骤如下：
(1)操作基本同实施例1的步骤(1)，不同之处仅在于HEME与CPDB的摩尔比为75∶1，AIBN与CPDB的摩尔比为0.1∶1，聚合反应温度为70℃。
(2)操作步骤基本同实施例1的步骤(2)，不同之处仅在于OEGMA的加入量为步骤(1)中CPDB摩尔量的95倍，AIBN的加入量为步骤(1)中CPDB摩尔量的0.1倍，聚合反应温度为75℃。
(3)操作步骤基本同实施例1的步骤(3)，不同之处仅在于VB的加入量为步骤(1)中CPDB摩尔量的65倍，AIBN的加入量为步骤(1)中CPDB摩尔量的0.1倍，聚合反应温度为75℃。
(4)操作步骤基本同实施例1的步骤(4)，不同之处仅在于将盐酸阿霉素(DOX.HCl)替换为盐酸表阿霉素。
(5)取步骤(4)制备的聚合物前药溶解于DMF中形成聚合物前药溶液，在冰浴和功率为200W的超声条件下，将下将聚合物前药溶液缓慢滴入20倍聚合物前药体积的pH＝7.4的PBS中，滴加完毕后，在冰浴条件下继续超声1min，然后转入pH＝7.4的PBS中充分透析以除去DMF，即得载药胶束。
实施例8
本实施例中，合成聚合物前药并制备载药胶束，步骤如下：
(1)操作基本同实施例1的步骤(1)，不同之处仅在于HEME与CPDB的摩尔比为85∶1，AIBN与CPDB的摩尔比为0.3∶1。
(2)操作步骤基本同实施例1的步骤(2)，不同之处仅在于OEGMA的加入量为步骤(1)中CPDB摩尔量的105倍，AIBN的加入量为步骤(1)中CPDB摩尔量的0.3倍。
(3)操作步骤基本同实施例1的步骤(3)，不同之处仅在于VB的加入量为步骤(1)中CPDB摩尔量的55倍，AIBN的加入量为步骤(1)中CPDB摩尔量的0.3倍。
(4)操作步骤同实施例1的步骤(4)。
(5)取步骤(4)制备的聚合物前药溶解于DMF中形成聚合物前药溶液，在冰浴和功率为200W的超声条件下，将下将聚合物前药溶液缓慢滴入15倍聚合物前药体积的pH＝7.4的PBS中，滴加完毕后，在冰浴条件下继续超声10min，然后转入pH＝7.4的PBS中充分透析以除去DMF，即得载药胶束。

Claims (10)

1.一种聚合物前药，其特征在于，该聚合物前药是由结构式如式（Ⅰ）所示的三嵌段聚合物上的醛基与带氨基的抗肿瘤药物上的氨基反应形成，带氨基的抗肿瘤药物通过亚胺键连接到结构式如式（Ⅰ）所示的三嵌段聚合物上，该聚合物前药的结构式如式（Ⅱ）所示，
Figure 578243DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）
Figure 392616DEST_PATH_IMAGE002
（Ⅱ）
式（Ⅰ）~（Ⅱ）中，x为75~85，y为95~105，z为55~65，R-为带氨基的抗肿瘤药物去掉一个氨基后形成的基团。
2.根据权利要求1所述聚合物前药，其特征在于，所述带氨基的抗肿瘤药物包括阿霉素、表阿霉素、吉西他滨以及丝裂霉素中的任意一种。
3.权利要求1或2所述聚合物前药的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）在氮气保护下将4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸、2-(六甲撑亚胺)乙醇甲基丙烯酸酯和引发剂溶于1,4-二氧六环中并于65~70℃进行聚合物反应，将所得反应液在过量冷己烷中沉淀，固液分离，将所得固相干燥，得到单嵌段聚合物；
（2）在氮气保护下将步骤（1）所得单嵌段聚合物、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和引发剂溶于1,4-二氧六环中并于70~75℃进行聚合物反应，将所得反应液在过量冷己烷中沉淀，固液分离，将所得固相干燥，得到双嵌段聚合物；
（3）在氮气保护下将步骤（2）所得双嵌段聚合物、4-乙烯基苯甲醛和引发剂溶于1,4-二氧六环中并于70~75℃进行聚合物反应，将所得反应液在过量冷己烷中沉淀，固液分离，将所得固相干燥，得到三嵌段聚合物；
（4）将步骤（3）所得三嵌段聚合物用N,N-二甲基甲酰胺溶解，加入用溶剂溶解的带氨基的抗肿瘤药物，避光充分反应，将所得反应液在N,N-二甲基甲酰胺中充分透析，之后在冷己烷/乙醚混合溶剂中沉淀，固液分离，将所得固相干燥，即得聚合物前药；
步骤（1）~（3）中，2-(六甲撑亚胺)乙醇甲基丙烯酸酯、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、与4-乙烯基苯甲醛与4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸的投料摩尔比为x:y:z:1，其中，x为75~85，y为95~105，z为55~65。
4.根据权利要求3所述聚合物前药的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，带氨基的抗肿瘤药物的加入量应使三嵌段聚合物与带氨基的抗肿瘤药物的质量比为（0.1~10）: 1。
5.根据权利要求3或4所述聚合物前药的制备方法，其特征在于，步骤（1）~（3）中，引发剂与4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸的摩尔比为（0.1~0.3）:1。
6.一种响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束，其特征在于，该载药胶束由权利要求1或2所述聚合物前药自组装形成，在人体生理pH值条件下，该载药胶束的表面带负电荷，当该载药胶束所处环境由人体生理pH值条件转变为肿瘤微酸性pH条件时，该载药胶束会发生电荷翻转和粒径减小。
7.根据权利要求6所述响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束，其特征在于，当该载药胶束所处环境由人体生理pH值条件转变为肿瘤微酸性pH条件时，该载药胶束的粒径减小至不超过该载药胶束在人体生理pH值条件下粒径的60%。
8.根据权利要求7所述响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束，其特征在于，当该载药胶束处于人体生理pH值条件下时，该载药胶束的粒径为75~85nm，当该载药胶束处于肿瘤微酸性pH条件时，该载药胶束的粒径为40~45nm。
9.权利要求6至8中任一权利要求所述响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束的制备方法，其特征在于，将权利要求1或2所述聚合物前药溶于有机溶剂中形成聚合物前药溶液，在冰浴和超声条件下，将聚合物前药溶液滴加至pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，滴加完毕后继续超声至少1min，然后透析去除有机溶剂，即得载药胶束。
10.根据权利要求9所述响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束的制备方法，其特征在于，在配制聚合物前药溶液时，有机溶剂的用量将聚合物前药恰好溶解即可；pH值为7.4的磷酸盐缓冲液与聚合物前药溶液的体积比为（10~20）:1。
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