CN112898579B - 一种高分子材料、混合胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

一种高分子材料、混合胶束及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物载体和高分子化学技术领域，公开了一种高分子材料及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：S1.将式(1)所示的官能团化聚己内酯、式(2)所示的聚乙烯亚胺与第一溶剂混合，经接枝反应，得到式(3)所示的聚己内酯‑聚乙烯亚胺共聚物；式中，R1为聚己内酯嵌段，m为选自10～100的正整数；S2.将所述聚己内酯‑聚乙烯亚胺共聚物、4‑羧基‑3‑氟苯硼酸、活化剂与第二溶剂混合，经接枝反应，得到所述高分子材料；本发明还公开了包括该高分子材料的混合胶束和复合物，以及高分子材料、混合胶束和复合物的应用；本发明的混合胶束能够依次克服血液屏障、组织屏障和细胞屏障，从而适用于抗原位肿瘤的治疗。

Description

一种高分子材料、混合胶束及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物载体和高分子化学技术领域，具体是一种高分子材料、混合胶束及其制备方法和应用。
背景技术
利用siRNA沉默特定基因的表达，已被证明具有较好的应用前景。但是游离的siRNA应用于体内时，极易在血浆中被核酸酶降解，也易被肝代谢和肾清除，故而在体内的半衰期短，不易到达靶部位；并且siRNA本身为负电性的亲水性大分子，难以穿过细胞膜进入胞质。因此，需要通过载体将其递送到体内靶细胞质中，才有可能发挥沉默基因的作用。
目前，常见的siRNA载体主要包括两类，即病毒载体和非病毒载体。尽管病毒载体的转染效率高，但其潜在的免疫原性和遗传毒性限制了其临床应用。与病毒载体相比，非病毒载体具有免疫原性低、载药量高等优点，已成为siRNA递送载体的研究热点。常见的非病毒载体分为阳离子聚合物和阳离子脂质体，是通过正电性材料与负电性siRNA通过静电作用形成稳定的复合物，用于siRNA的递送。常用的阳离子聚合物主要有：聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)及其衍生物、聚赖氨酸(Poly(L-lysine))和树状聚合物(Dendrimer)。
然而，随着对siRNA递送载体的研究越来越深入，发现即使利用载体，siRNA在体内的递送也需要依次克服血液屏障、组织屏障和细胞屏障，才能到达靶部位发挥基因沉默作用。血液屏障：经静脉注射后，载体与siRNA的复合物立即接触到血液中各种成分(如蛋白质、盐和脂质等)，此时负电性的血浆蛋白易将siRNA从复合物中置换出来，降低复合物的稳定性，导致siRNA的提前释放和降解；或者吸附在载体表面诱导载体的调理素作用，导致载体与siRNA复合物被单核吞噬系统和网状内皮系统快速清除，使siRNA难以到达靶部位发挥作用。组织屏障：由于实体瘤具有复杂的生理和病理特征，包括血管紊乱、致密的细胞外基质以及高的间质压等，使得载体与siRNA的复合物难以将siRNA递送至肿瘤深层，药物在肿瘤组织的分布不均会造成肿瘤治疗不完全，易造成肿瘤复发和转移。细胞屏障：siRNA的作用靶点位于胞质，需要进入胞质才能发挥作用；载体和siRNA复合物一般通过内吞的方式入胞，并随后转运至溶酶体，而溶酶体中富含水解酶的酸性环境会导致siRNA被大量降解，因此只有逃离溶酶体，并在细胞质中释放siRNA，才能有效发挥siRNA的作用。
中国专利申请CN201910283413.8，申请日20190410，名称为：含苯硼酸修饰的高分子材料及其在基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送中的应用，公开了一种高分子材料，包括阳离子聚合物和含苯硼酸的功能基团，所述含苯硼酸的功能基团通过共价键连接在所述阳离子聚合物上；还公开了一种包括该高分子材料的基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送载体。
上述专利申请的递送载体适用于胞内递送，即能够克服细胞屏障，在细胞内递送过程中达到高递送效率、制备成本低、材料细胞毒性小的效果，从而能够有效且安全地将基因编辑核糖核蛋白复合物递送到细胞质中。但是，关于一种能够依次克服血液屏障、组织屏障和细胞屏障，从而适用于抗原位肿瘤的治疗的递送载体则尚未提出。
因此，我们亟需一种能够依次克服血液屏障、组织屏障和细胞屏障，从而适用于抗原位肿瘤的治疗的递送载体。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高分子材料、混合胶束及其制备方法和应用，以达到提供一种能够依次克服血液屏障、组织屏障和细胞屏障，从而适用于抗原位肿瘤的治疗的递送载体的效果。
本发明的目的之一在于提供一种苯硼酸修饰的高分子材料的制备方法。
上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种苯硼酸修饰的高分子材料的制备方法，包括以下步骤：
S1.将式(1)所示的官能团化聚己内酯、式(2)所示的聚乙烯亚胺与第一溶剂混合，经接枝反应，得到式(3)所示的聚己内酯-聚乙烯亚胺共聚物；
Figure BDA0002934432160000021
式中，R1为聚己内酯嵌段，m为选自10～100的正整数；
S2.将所述聚己内酯-聚乙烯亚胺共聚物、4-羧基-3-氟苯硼酸、活化剂与第二溶剂混合，经接枝反应，得到所述高分子材料(PCL-PEI-PBA)。
在某些实施方案中，所述聚己内酯嵌段的结构式如式(4)所示：
Figure BDA0002934432160000031
式中，n为选自10～30的正整数。
在某些实施方案中，S1中，所述官能团化聚己内酯和聚乙烯亚胺的摩尔比为10～1:1，优选为2～1:1。
在某些实施方案中，S1中，所述第一溶剂包括二氯甲烷。
在某些实施方案中，S1中，所述接枝反应的反应温度为0～40℃，优选为20～30℃。
在某些实施方案中，S1中，所述接枝反应的反应时间为2～72h，优选为12～24h。
在某些实施方案中，S2中，所述聚己内酯-聚乙烯亚胺共聚物和4-羧基-3-氟苯硼酸的摩尔比为1:1～20，优选为1:3～6，更优选为1:5。
在某些实施方案中，S2中，所述活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)。
在某些实施方案中，S2中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的摩尔比为1～5:1，优选为3:1。
在某些实施方案中，S2中，所述第二溶剂包括甲醇和二氯甲烷。
在某些实施方案中，S2中，所述甲醇和二氯甲烷的体积比为10～1:1，优选为2:1。
在某些实施方案中，S2中，所述接枝反应的反应温度为25～70℃，优选为30～40℃。
在某些实施方案中，S2中，所述接枝反应的反应时间为2～72h，优选为24～48h。
本发明的目的之二在于提供一种由上述制备方法制备得到的高分子材料。
本发明的目的之三在于提供一种包括上述高分子材料的混合胶束。
上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种混合胶束，包括上述制备方法制备得到的高分子材料，以及聚己内酯-聚乙二醇共聚物(PCL-PEG)或聚己内酯-亚胺-聚乙二醇共聚物(PCL-N-PEG)；
所述聚己内酯-聚乙二醇共聚物(PCL-PEG)的结构式如式(5)所示：
Figure BDA0002934432160000032
式中，x为选自10～30的正整数，y为选自25～300的正整数；
所述聚己内酯-亚胺-聚乙二醇共聚物(PCL-N-PEG)的结构式如式(6)所示：
Figure BDA0002934432160000041
式中，a为选自10～30的正整数，b为选自25～300的正整数。
本发明的目的之四在于提供一种制备上述混合胶束的方法。
上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种混合胶束的制备方法，包括以下步骤：
S1.将所述高分子材料，以及所述聚己内酯-聚乙二醇共聚物或聚己内酯-亚胺-聚乙二醇共聚物溶解于第三溶剂中，得到混合物；
S2.将所述混合物与超纯水混合，经超声处理和旋转蒸发，得到所述混合胶束。
在某些实施方案中，S1中，所述高分子材料，以及所述聚己内酯-聚乙二醇共聚物或聚己内酯-亚胺-聚乙二醇共聚物的质量比为1:1～49，优选为1:4。
在某些实施方案中，S1中，所述第三溶剂包括二氯甲烷。
在某些实施方案中，S2中，所述超声处理的频率为50～300W，优选为100W。
在某些实施方案中，S2中，所述超声处理的时间为0.5～10min，优选为3～5min。
本发明的目的之五在于提供一种复合物，包括上述混合胶束，以及由所述混合胶束携带的基因。
在某些实施方案中，所述基因为siRNA。
在某些实施方案中，所述混合胶束和基因的N/P比为50～1:1，优选为10:1。
应当理解的是，所述混合胶束和基因的N/P比是指所述混合胶束中氮原子N的数量与所述基因中磷原子P的数量的比值。
本发明的目的之六在于提供上述高分子材料或混合胶束或复合物在基因编辑中的应用。
本发明的目的之七在于提供上述高分子材料或混合胶束或复合物在制备基因治疗的药物中的应用。
值得注意的是，本发明的一种所述复合物(由所述高分子材料和聚己内酯-亚胺-聚乙二醇构建的混合胶束，包载siRNA而形成)以混合胶束中长链的聚乙二醇嵌段(PEG)作为保护壳，利用PEG在体循环中的隐形作用，延长所述复合物的体循环时间，从而克服了血液屏障；然后，PEG同胶束疏水片段(PCL)通过酸敏感的亚胺键进行连接而形成的聚己内酯-亚胺-聚乙二醇共聚物(PCL-N-PEG)，在肿瘤的微酸环境中响应性断裂，脱落PEG外壳，暴露所述混合胶束中另一片段(PCL-PEI-PBA)的亲水层聚乙烯亚胺(PEI)和苯硼酸(PBA)，使其在增强的正电荷以及PBA靶向肿瘤细胞表面高表达的唾液酸受体的双重介导下，通过吸附和受体介导跨膜，有效地穿透肿瘤致密的组织，从而克服了肿瘤的组织屏障；最后，通过受体介导入胞的所述复合物，在PEI的“质子海绵效应”下，从溶酶体中逃逸出来，同时在胞内高浓度ATP的作用下，迅速释放出siRNA，高效地发挥RNA干扰的作用，克服了细胞屏障。
而本发明的另一种所述复合物(由所述高分子材料和聚己内酯-聚乙二醇构建的混合胶束，包载siRNA而形成)中，若采用长链的聚乙二醇嵌段(PEG)作为保护壳，降低载体毒性，利用PEG在体循环中的隐形作用，延长所述复合物的体循环时间，从而克服了血液屏障；若采用短链的聚乙二醇嵌段(PEG)，可通过瘤内注射直接作用于浅表肿瘤，利用未被屏蔽的PBA和PEI提高靶细胞摄取，通过吸附和受体介导跨膜，有效地穿透肿瘤致密的组织，从而克服了肿瘤的组织屏障；并且，该复合物进入靶细胞后，在PEI的“质子海绵效应”下，从溶酶体中逃逸出来，同时在胞内高浓度ATP的作用下，迅速释放出siRNA，高效地发挥RNA干扰的作用，克服了细胞屏障。
本发明的所述混合胶束相比于现有的基于苯硼酸的基因混合胶束，具有以下有益效果：
1.所述混合胶束通过PEG的屏蔽作用显著降低载体材料的毒性和体内苯硼酸脱靶效应，可以用于静脉注射给药，实现抗原位肿瘤的治疗。
2.所述高分子材料(PCL-PEI-PBA)中疏水片段PCL的引入，构成两亲性片段，使其在水溶液中就能形成稳定粒径的胶束，且吸附包载siRNA后粒径无显著变化；相比于依靠基因的参与来稳定结构的载体，所构建的混合胶束的结构优化和可调节性更强。
3.所述混合胶束的粒径低于100nm，有利于克服组织屏障进行深层穿透。
4.所述高分子材料(PCL-PEI-PBA)中疏水片段的引入赋予了所述混合胶束包载疏水药物的功能，对于联用siRNA药物和疏水药物治疗策略提供了一体化载体。
附图说明
图1为实施例1中聚己内酯(PCL-OH)的核磁共振氢谱图；
图2为实施例2中官能团化聚己内酯(PCL-NPC)的核磁共振氢谱图；
图3为实施例3中聚己内酯-聚乙烯亚胺共聚物(PCL-PEI)的核磁共振氢谱图；
图4为实施例3中聚己内酯-聚乙烯亚胺共聚物(PCL-PEI)的红外图谱；
图5为实施例4中高分子材料(PCL-PEI-PBA)的核磁共振氢谱图；
图6为实施例4中高分子材料(PCL-PEI-PBA)的红外图谱；
图7为实施例5中聚己内酯-聚乙二醇共聚物(PCL-PEG)的核磁共振氢谱图；
图8为实施例6中醛基封端聚己内酯(PCL-CHO)的核磁共振氢谱图；
图9为实施例6中聚己内酯-亚胺-聚乙二醇共聚物(PCL-N-PEG)的核磁共振氢谱图；
图10为试验例1中各组混合胶束的粒径和电位图；
图11为试验例2中PBS、Triton试剂以及各组复合物的溶血性效果图；
图12为试验例3中各组胶束的细胞毒性效果图；
图13为试验例4中各组混合胶束或复合物克服细胞障碍的效果图，
其中，A为各组混合胶束中PEG释放曲线图，B为各组复合物在pH 6.8孵育时的电位变化图，C为各组复合物在pH 6.8孵育前后的电镜图，D为不同pH环境下4T1细胞摄取情况，E为pH 6.8时，4T1和HUVEC摄取PNB-Cy5siRNA的强度，F为细胞摄取的竞争抑制性实验；
图14为试验例4的第2部分中各组复合物的Cy5siRNA的溶酶体逃逸效果图；
图15为试验例4的第3部分中各组复合物的siRNA响应性释放效果图，
其中，A为各组复合物在不同ATP浓度孵育下的荧光共振能量转移信号，B为各组复合物中siRNA释放速率，C为各组复合物在孵育ATP(5mM)前后释放siRNA的凝胶电泳图，D为漂白前后细胞的荧光图，E为4t1细胞在给药后PD-L1 mRNA的表达定量结果，F为4t1细胞在给药后PD-L1蛋白的表达情况，G为4t1细胞在给药后PD-L1蛋白的表达定量结果；
图16为试验例5的第2部分中各组复合物的肿瘤球穿透效果图；
图17为试验例5的第3部分中各组复合物的肿瘤靶向性和穿透性效果图，
其中，A为主要器官和肿瘤的分布图，B为各组复合物中Cy5siRNA的肿瘤穿透效果图；
图18为试验例5的第4部分中各组复合物的免疫组化(PD-L1)效果图；
图19为试验例6中各组复合物的抗原位肿瘤的治疗效果图，
其中，A为小鼠体重变化图，B为肿瘤增长速率图，C为小鼠生存期，D为小鼠肿瘤的生物发光图。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1聚己内酯的制备，反应路线为：
Figure BDA0002934432160000061
式中，n＝16；
量取ε-己内酯(9mL)，加入氢化钙(0.15g)搅拌24h后，经减压蒸馏(6mm Hg)，收集温度为58～59℃的馏分备用。苯甲醇经减压蒸馏(6mm Hg)后，收集温度为50～51℃的馏分备用。将重蒸后的ε-己内酯(16.04g，140.52mmol)，二乙基己酸亚锡(Sn(Oct)2)(0.1％moles ofε-己内酯)，苯甲醇(1.90g，17.56mmol)加入到50mL的圆底烧瓶中，在氮气保护下，在120℃油浴中搅拌反应24h。反应结束时得到粘稠无色透明的液体，等温度降至室温，该液体变成白色的蜡状固体。将该蜡状固体溶解于二氯甲烷(10mL)中，缓慢滴加到100mL预冷的甲醇中，产生大量白色沉淀，经抽滤漏斗减压抽滤，并用冷甲醇洗涤滤饼三次，收集滤饼于真空干燥12h，得15.93g白色蜡状固体，即为聚己内酯(PCL-OH)，产率为89.49％，结构表征如图1所示。
实施例2官能团化聚己内酯的制备，反应路线为：
Figure BDA0002934432160000071
精密称取实施例1制得的PCL-OH 2.0g(0.73mmol)，氯甲酸对硝基苯酯0.3g(1.5mmol)溶于10mL干燥的二氯甲烷中，在冰浴搅拌下加入100μL吡啶后，于25℃反应24h，通过水浴旋蒸去除二氯甲烷和吡啶。将反应产物溶于20mL二氯甲烷中，用饱和食盐水(30mL)洗两次，收集二氯甲烷溶液，于无水硫酸钠干燥后，将过滤后后的滤液浓缩至3mL左右，然后缓慢滴加到100mL预冷的乙醚中，产生大量白色沉淀。通过过滤收集白色滤饼，将滤饼置于真空干燥12h，得到官能团化聚己内酯(PCL-NPC)，结构表征如图2所示。
实施例3聚己内酯-聚乙烯亚胺共聚物的制备，反应路线为：
Figure BDA0002934432160000072
式中，m＝58；
称取PEI1.8k 1.20g(0.67mmoL)到50mL的圆底烧瓶中，加入6mL二氯甲烷溶解。称取实施例2制得的PCL-NPC 0.20g(0.073mmoL)溶于6mL二氯甲烷中，然后将该溶液以1滴/20s的速度滴加到PEI1.8k的二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应24h。然后通过旋转蒸发去除反应液中的二氯甲烷，剩余反应物呈黄色凝胶状，加入15mL超纯水将其溶解，呈黄色透明溶液，将该溶液置于截留分子量为8000～14000的透析袋中透析至溶液变为无色透明状，经冷冻干燥后得到白色棉花糖状固体，即聚己内酯-聚乙烯亚胺共聚物(PCL-PEI)，结构表征如图3～4所示。
实施例4苯硼酸修饰的高分子材料的制备
称取4-羧基-3-氟苯硼酸(F-PBA)(184mg，1mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(384mg，3mmol)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(115mg，1mmol)，于常温下溶解于4mL混合溶剂(甲醇:二氯甲烷＝2:1，V/V)，于33℃避光搅拌活化1h后加入溶解于混合溶剂的实施例3制得的PCL-PEI(900mg，0.2mmol)4mL，搅拌24h，将反应液置于截留分子量为8000～14000的透析袋48h，冻干后获得高分子材料(PCL-PEI-PBA)，结构表征如图5～6所示。
实施例5聚己内酯-聚乙二醇共聚物的制备，反应路线为：
Figure BDA0002934432160000081
式中，y＝111；
称定实施例2制得的PCL-NPC 0.46g(0.16mmol)，PEG5k 1.00g(0.2mmol)溶于10mL二氯甲烷中，在搅拌下向其加入200μL三乙胺，并将反应液在室温中搅拌反应24h。然后通过旋转蒸发去除反应液中的二氯甲烷和三乙胺，剩余反应物呈黄色凝胶状，加入20mL超纯水将其溶解，呈黄色透明溶液，将该溶液置于截留分子量为8000～14000的透析袋中透析72h，反应液呈无色透明状，经冷冻干燥后得白色絮状固体，即聚己内酯-聚乙二醇共聚物(PCL-PEG)1.21g，结构表征如图7所示。
实施例6聚己内酯-亚胺-聚乙二醇共聚物的制备，反应路线为：
Figure BDA0002934432160000082
式中，b＝111；
将4-羧基苯甲醛(2.5mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(2.5mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(1.5mmol)溶于二氯甲烷:四氢呋喃＝3:1(V/V)的溶液中，30℃反应1h；然后加入实施例1制得的PCL-OH(0.5mmol)反应48h。反应结束后，旋转蒸发除去溶液，用二氯甲烷溶解反应物，过滤除去多余的4-羧基苯甲醛，将剩下的澄清溶液浓缩并倒入冷甲醇中，过滤收集沉淀，真空干燥得到醛基封端的聚己内酯(PCL-CHO)，结构表征如图8所示。
将PCL-CHO(0.5mmol)、PEG-NH2(0.75mmol)和三乙胺(TEA)(2.5mmol)溶解于10mL于DCM中，反应48h；旋转蒸发去除溶液，用四氢呋喃溶解反应物，逐滴滴入超纯水(pH＝7.4)中；用超纯水(pH＝7.4)透析(MWCO＝8kDa)24小时去除未反应的PEG，然后离心去除未反应的PCL-CHO，冻干后得到聚己内酯-亚胺-聚乙二醇共聚物(PCL-N-PEG)，结构表征如图9所示。
实施例7混合胶束和复合物的制备
1.混合胶束的制备：将质量比为4:1的PCL-N-PEG和PCL-PEI-PBA溶解于0.5mL二氯甲烷中；将混合物加入超纯水5mL中，超声处理(5s/5s，100W，5min)；通过旋转蒸发去除二氯甲烷得到混合胶束(PNB)。
2.复合物的制备：将混合胶束与siRNA等体积混合，涡旋15s，静置15min，即得(PNB-siRNA)。
实施例8混合胶束和复合物的制备
1.混合胶束的制备：将质量比为4:1的PCL-PEG和PCL-PEI-PBA溶解于0.5mL二氯甲烷中；将混合物加入超纯水5mL中，超声处理(5s/5s，100W，5min)；通过旋转蒸发去除二氯甲烷得到混合胶束(PB)。
2.复合物的制备：将混合胶束与siRNA等体积混合，涡旋15s，静置15min，即得(PB-siRNA)。
对照例1混合胶束和复合物的制备
1.混合胶束的制备：将质量比为4:1的PCL-N-PEG和PCL-PEI溶解于0.5mL二氯甲烷中；将混合物加入超纯水5mL中，超声处理(5s/5s，100W，5min)；通过旋转蒸发去除二氯甲烷得到混合胶束(PNE)。
2.复合物的制备：将混合胶束与siRNA等体积混合，涡旋15s，静置15min，即得(PNE-siRNA)。
试验例1粒径电位测定
使用激光粒度仪分别测定实施例6～7和对照例1的混合胶束的粒径和电位。如图10所示，混合胶束的粒径分布范围较窄，粒径均匀，平均粒径约为50nm，电位约为8～10mV。
试验例2溶血性考察
取用肝素钠处理后的健康C57BL/6小鼠的血，通过冷冻离心机(3000rpm，5min)离心收集红细胞沉淀，加入PBS溶液离心洗涤5次，然后加入PBS溶液制备2％(V/V)红细胞悬液；分别将PBS、PB-siRNA、PNB-siRNA、PNE-siRNA、Triton试剂等体积加入2％小鼠血红细胞悬液于摇床(37℃，75rpm)孵育2h。然后，每个样品3000rpm离心5min，拍照观察。如图11所示，PB-siRNA和PNB-siRNA无溶血危险，而PNE-siRNA有溶血危险。
试验例3细胞毒性考察
采用MTT法考察胶束材料的细胞毒性：将4T1细胞以1×104个细胞/孔的密度接种于96孔板内，培养24h后，将培养基更换为不同浓度的(以混合胶束中PCL-PEI或PCL-PEI-PBA作为参考值)单一胶束材料(PCL-PEI或PCL-PEI-PBA)或混合胶束(PNB、PNE或PB)继续孵育24h。孵育结束后，去除培养基，向细胞孔内加入含0.5mg/mL的MTT的1640溶液，于37℃条件下孵育4h后，吸去上层培养基，加入200μLDMSO，于恒温空气摇床中振摇30min(37℃，75rpm)后，置于化学发光仪中测定490nm波长处的吸光度值A样品；以无细胞组的吸光度值A空白作为空白对照，以未加药处理的细胞孔同法操作测得的吸光度值，以A阴性作为阴性对照，计算各孔细胞的存活率：存活率(％)＝(A样品-A空白)/(A阴性-A空白)×100％。结果如图12所示，PCL-PEI-PBA的毒性比PCL-PEI的毒性更低，混合胶束PNB、PB和PNE由于有PEG保护层，细胞毒性显著下降，但在高浓度(＞20μg/mL)时，PNB和PB的毒性远低于PNE。
试验例4克服细胞屏障
1.pH响应性增强细胞摄取
1.1PEG外壳响应pH6.8脱落
亚胺键对酸非常敏感，在酸性肿瘤微环境(pH＝6.8)中容易水解，但在生理条件(pH＝7.4)中保持稳定。为确定PCL-N-PEG中亚胺结构的pH敏感性，采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定pH＝7.4和pH＝6.8孵育后PCL-N-PEG的平均分子量(Mn)。
PCL-N-PEG(5mg)分别在pH＝7.4和pH＝6.8的超纯水中孵育4h，冻干后通过凝胶渗透色谱(GPC)检测。结果显示，PCL-N-PEG的Mn值在pH＝6.8的环境孵育4h后(Mn＝10272)，与pH＝7.4(Mn＝8486)相比明显降低，这意味着其分子量降低；而PCL-PEG没有明显变化。
进一步研究了在不同pH下PNB、PB和PNE三种胶束释放PEG的情况：将PNB、PB和PNE在pH＝5.0、pH＝6.5或pH＝7.4的PBS(0.2mg/mL)中孵育；在预定的时间间隔内，样品在10,000g条件下超滤10分钟，以分离胶束和降解PEG。用Dragendorff试剂法测定滤液中降解聚乙二醇的浓度；Dragendorff试剂含5ml BiONO3(16mg/mL)，冰醋酸(0.2mL/mL)和5mL KI(400mg/mL)。滤液0.1mL加入40μL的Dragendorff试剂。15min后，用紫外-可见分光光度计测定吸光度。如图13A所示，PNB在pH＝6.8孵育4h后，释放大约30％的PEG，并在孵育24h后释放约50％的PEG，而在pH＝7.4，孵育4h后，大约3％的PEG从PNB中释放出来；这意味着PNB在血液循环中有较好的稳定性，可以迅速响应肿瘤酸环境脱落PEG。与此同时，PNE中PEG的释放趋势相似，而PB没有响应pH＝6.8释放PEG。
同时，通过激光粒度仪测定孵育前后电位的变化。如图13B所示，载IR780(疏水药物)和PD-L1 siRNA(siP)的PNE和PNB在pH＝6.8孵育4h后，表面电位升高了约10mV，表明PEG在表面的密度降低了。如图13C所示，尽管在24h时约有50％的PEG从PNB和PNE中释放出来，但透射电镜(TEM)未检测到明显的粒径变化，说明PB、PNE和PNB在酸性肿瘤微环境中仍保持稳定的胶束结构。
1.2不同pH环境下细胞摄取情况和机制
将4T1细胞以1×105细胞/孔的密度接种于6孔板内，培养过夜后，每孔细胞中加入pH＝7.4或pH＝6.8的RPMI 1640培养基，培养基中分别加入载Cy5siRNA的胶束或脂质体。将商用和最常见的siRNA转染阳离子脂质体Lipofectamine 2000(Lipo)用作阳性对照。孵育2h后洗涤，离心收集细胞，用PBS重悬，通过流式细胞仪检测细胞摄取强度。结果如图13D所示，所有胶束组的细胞摄取阳性率(～99％)都远高于Lipo组(～65％)。当pH值为6.8时，摄取Cy5siP的强度比pH值为7.4时增加了7.7倍(PNB)和3.6倍(PNE)。在pH 6.8时，PNB组摄取的Cy5siP量比PNE组高1.7倍，比PB组高8.5倍。此外，如图13E所示，与唾液酸(SA)表达较低的HUVEC相比，PNB-Cy5siP可使4T1细胞在pH6.8时对Cy5siP的摄取增加1.0倍。
进一步通过竞争抑制性实验研究参与细胞摄取的机制。在37℃下，用抑制剂(PEI，PBA，阿米洛利，制霉菌素和氯丙嗪)预处理细胞1小时后，将载Cy5siRNA的胶束分别加入培养基(pH＝6.8)中孵育2h后，通过流式细胞仪分析结果。对照组中未添加抑制剂。如图13F所示，数据结果是与对照组相比的相对摄取百分比。PBA和PEI均可降低PNB的内化，但对PB没有影响。而pH＝6.8环境下，PEI仅降低了PNE的内化。同时发现PNB是由巨胞饮、小窝蛋白和网格蛋白介导的多种细胞摄取机制共同介导的细胞摄取，而PNE主要是由巨胞饮和网格蛋白介导的途径介导的细胞摄取，PB主要是由网格蛋白介导的途径介导的细胞摄取。综上所述，在pH6.8的作用下，PEG壳与PNB的分离导致PBA域暴露和正电荷增加，从而促进静电作用介导以及细胞膜上PBA和过表达的SA的结合介导入胞。
2.溶酶体逃逸
4T1细胞与载Cy5siRNA的胶束孵育2h或6h，在结束孵育前30min在每孔加入溶酶体染料(Lysogreen)(1.32μg/mL)。用PBS清洗细胞爬片，4％多聚甲醛固定，DAPI染细胞核后，在CLSM下观察Cy5siRNA和溶酶体的定位情况。结果如图14所示，三种胶束均能有效协助Cy5siRNA从溶酶体中释放出来。
3.siRNA响应ATP释放
3.1细胞外考察siRNA响应ATP释放
用荧光共振能量转移法(FRET)考察siRNA响应ATP的释放情况。Cy5siRNA(受体)和Cy3siRNA(供体)以1:1的摩尔比被包载在胶束PNB、PB和PNE中。与不同浓度的ATP(0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM)于37℃孵育10min后，通过化学发光仪在激发波长为550nm下，记录发射波长在560-750nm的荧光强度。FRET信号定义为在550nm激发下Cy5(662-683nm)与Cy3(560-575nm)的荧光发射强度比。FRET信号越低，说明越多的siRNA从载体中释放出来。如图15A所示，随着ATP浓度的增加，PNB或PB中的FRET信号会降低，说明PNB或PB在胞内(5mM)而非胞外(0.4mM)条件下响应性释放siRNA。
FAM-siRNA包封率测定方法如下：以10mL含ATP(5mM)的DEPC水为释放介质，分别将1mLPNB-siRNA(N/P＝10)、PB-siRNA(N/P＝10)、PNE-siRNA(N/P＝10)添加到透析袋中(MWCO，100kDa)，密封，然后沉浸到释放介质，在摇床中孵育240min(75rpm，37℃)。在预定时间点(5min、10min、20min、30min、60min、120min、240min)取出0.5mL释放介质，并补充加入等温的0.5mL释放介质。最后通过剪开透析袋，振摇平衡后，取样0.5mL，作为完全释放的参照。通过化学发光仪检测的荧光值计算siRNA的释放率。显然，如图15B所示，在10min内，PNB或PB释放了35％或34％的siRNA，且呈持续释放行为。然而，PNE释放的siRNA即使在240分钟内也很有限(～3％)。
siRNA响应性释放可以直观从凝胶电泳时间中观察到。将载siRNA胶束预先在ATP(5mM)孵育10min后，加入6×的核酸上样缓冲液(含10％SYBR GreenI染料)，混合均匀后，取20μL加入含有0.1％SYBR GreenI染料的2％的琼脂糖凝胶的加样孔中。以TAE(Tris-acetate-EDTA)为缓冲液，分离电压100V，电泳时间20min。通过凝胶成像系统(Bio-Rad)进行观察拍照。如图15C中可以看到，PB和PNB组在预先孵育ATP后能有效释放siRNA。
3.2细胞内siRNA的释放情况和PD-L1siRNA在细胞上的沉默效果
利用受体光漂白FRET法通过共聚焦(CLSM)验证对细胞内siRNA的释放，FRET现象是通过漂白受体(Cy5siRNA)和恢复供体的荧光强度(Cy3siRNA)证实。漂白法是基于FRET过程中供体的能量向受体转移，使得受体的荧光强度增强而供体的的荧光强度减弱，当利用高强度的受体激发光照射受试区域后，受体会发生荧光淬灭(即漂白)，当FRET发生则供体的荧光强度将会上升，反之则不变或者下降。
将4T1细胞以1×105细胞/孔的密度接种于6孔板内(预先在6孔板加入洁净盖玻片)，待其贴壁且生长良好。Cy5siRNA(受体)和Cy3siRNA(供体)以1:1的摩尔比被包载在胶束PB、PNB和PNE中。将PB-Cy3siRNA/Cy5siRNA用新鲜培养基稀释后加入孔内(siRNA总浓度为4μg/mL)，孵育2h后，去除培养基，添加新鲜培养基继续培养6h。此时将4T1细胞置于4℃孵育，建立低细胞内ATP浓度模型。培养完毕后，用含0.1％的肝素钠PBS清洗细胞三遍，以去除吸附在细胞表面的阳离子材料，然后每孔加入4％多聚甲醛在室温下固定15min，用抗荧光淬灭剂封片。于共聚焦下观察，图中圆圈区域为实验区域，圈1-8为漂白区，圈9-10为未漂白区作为对照。漂白区用100％强度的激发波长(649nm)照射，以淬灭受体(Cy5siRNA)的荧光，同时记录供体(Cy3siRNA)的在激光(548nm)下的发射光强度变化。
如图15D结果可知，漂白后Cy3siRNA在PB处理的细胞中的荧光强度保持不变或减弱，说明PB和PNB胶束能有效地在细胞质中释放siRNA，而PNE胶束不能，这进一步证明PBA对PEI的修饰可以提高细胞内siRNA的释放。而在细胞的ATP消耗后，细胞内的Cy3siRNA在漂白后荧光信号增强，说明细胞内发生了ATP依赖的siRNA释放。
采用目标PD-L1的siRNA，在4T1细胞上验证所构建载体的siRNA递送效果。通过QPCR和Western blot检测细胞内PD-L1的mRNA和蛋白的表达情况，NC为无意义的siRNA作为阴性对照。结果如图15E-G显示，PNB组在pH＝6.8时能达到最佳的沉默效率。
试验例5克服血液屏障和组织屏障
1.载Cy5siRNA胶束在荷瘤小鼠体内药动学研究
4T1细胞荷瘤小鼠静脉注射游离Cy5siRNA、PB-Cy5siRNA、PNE-Cy5siRNA和PNB-Cy5siRNA(Cy5siRNA:0.75mg/kg)。在预定的时间点，通过眼眶采集血液样本，然后用荧光检测。用酶标仪测定上清的荧光强度，通过DAS系统计算Cy5siRNA的药时曲线下面积(AUC)、体内半衰期(t1/2)和清除率(CL)。结果如下表所示，PNB、PB和PNE都显著延长了Cy5siRNA的体循环时间。
表1游离Cy5siRNA和载Cy5siRNA胶束的体内药动学参数
Figure BDA0002934432160000131
2.肿瘤球穿透
将热琼脂糖溶液(1.5％，w/v)以80μL/孔加入96孔板中，待冷却形成有凹面的光滑琼脂层。随后将4T1细胞以2×103细胞/孔加入有琼脂糖的96孔板中，孵育3天后，形成紧密的多细胞球状体即为人工构建的肿瘤球。加入载IR780/Cy5siP的胶束(IR780:0.5μg/mL,Cy5siP:2μg/mL)分别在pH7.4或pH6.8下孵育4小时。孵育结束后，加入PBS清洗肿瘤球，用4％多聚甲醛固定后，将肿瘤球悬浮在PBS中，通过CLSM成像。结果如图16所示，pH7.4和pH6.8处的PB主要位于肿瘤球的表层，核心区(＞80μm)可见少量红色(Cy5siRNA)或绿色荧光(IR780)。pH7.4时PNE和PNB也缺乏核心摄取，但在pH6.8时PNB和PNE广泛分布在肿瘤球的深部中，这表明PEG的屏蔽作用限制了胶束的穿透能力。与PNE相比，PNB表现出更强的荧光强度，这与PBA-SA介导的肿瘤靶向有关。
3.荷瘤小鼠肿瘤靶向性和肿瘤穿透研究
将1×106个4T1细胞接种于雌性Balb/c小鼠左侧第二乳腺脂肪垫，建立4T1小鼠原位乳腺癌模型。植入后7天，荷瘤小鼠静脉给予PB-IR780/Cy5siP、PNE-IR780/Cy5siP和PNB-IR780/Cy5siP(IR780:1mg/kg,Cy5siP:0.75mg/kg)。给药24h后的小鼠离体组织用IVIS光谱系统成像。为了定量体内分布情况，注射后24小时处死小鼠，收集主要器官和肿瘤，用0.5mLDMSO匀浆，10000g离心15分钟，收集上清通过酶标仪检测荧光强度。并收集肿瘤进行冰冻切片，用CD31和DAPI染色。结果如图17A-B显示，PNB-IR780/Cy5siP显著提高IR780和Cy5siP在肿瘤的蓄积，并且在肿瘤的穿透能力更强。
4.荷瘤小鼠肿瘤中PD-L1的表达
将1×106个4T1细胞接种于雌性Balb/c小鼠左侧第二乳腺脂肪垫，建立4T1小鼠原位乳腺癌模型。植入后7天，荷瘤小鼠静脉给予PBS、PNB-NC、PB-siP、PNE-siP和PNB-siP(siP:0.75mg/kg)。之后每2天给药一次，共给药4次。给药结束48h后收集肿瘤，进行免疫组化染色，结果如图18所示，PNB-siP组PD-L1的表达最低，说明其在胶束靶向肿瘤递送siRNA的效率最高。
试验例6荷瘤小鼠治疗实验
于体外培养表达萤火虫荧光素酶的小鼠乳腺癌细胞(4T1-luc)，采用PBS制成细胞密度为2×106个细胞/mL的细胞悬液，对30只SPF级雌性Balb/c小鼠(5周龄，体重约20g)进行麻醉，刮除身体左侧乳腺毛发，并于每只小鼠左侧第二乳垫下注射1×106个细胞。肿瘤体积达到150mm3左右后，随机平均分成6组，每组5只。其中两组分别静脉注射PBS(对照组)和PNB-IR780/siP32(IR780:1mg/kg,siP:0.32mg/kg)。其余4组分别静脉注射PNB-IR780/NC、PNE-IR780/siP、PB-IR780/siP和PNB-IR780/siP，注射24h后用808nm激光照射肿瘤(0.8W/cm2,5min)。共给药一次。每2天记录小鼠体重和肿瘤体积。同时，用IVIS光谱系统对小鼠进行成像，监测肿瘤生长情况。结果如图19A-D所示，PNB-IR780/siP伴随光照治疗后，体重无明显变化，肿瘤完全消除，小鼠的生存期延长。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种高分子材料的混合胶束，其特征在于，包括高分子材料和聚己内酯-亚胺-聚乙二醇共聚物：
所述高分子材料的制备方法包括以下步骤，
S1.将式(1)所示的官能团化聚己内酯、式(2)所示的聚乙烯亚胺与第一溶剂混合，经接枝反应，得到式(3)所示的聚己内酯-聚乙烯亚胺共聚物；
Figure FDA0003544822690000011
式中，R1为聚己内酯嵌段，m为选自10～100的正整数；
S2.将所述聚己内酯-聚乙烯亚胺共聚物、4-羧基-3-氟苯硼酸、活化剂与第二溶剂混合，经接枝反应，得到所述高分子材料；
所述聚己内酯-亚胺-聚乙二醇共聚物的结构式如式(6)所示：
Figure FDA0003544822690000012
式中，a为选自10～30的正整数，b为选自25～300的正整数。
2.根据权利要求1所述的混合胶束，其特征在于，所述聚己内酯嵌段的结构式如式(4)所示：
Figure FDA0003544822690000021
式中，n为选自10～30的正整数。
3.根据权利要求1所述的混合胶束，其特征在于，S1中，所述官能团化聚己内酯和聚乙烯亚胺的摩尔比为10～1:1；
可选地，S1中，所述第一溶剂包括二氯甲烷；
可选地，S1中，所述接枝反应的反应温度为0～40℃，反应时间为2～72h；
可选地，S2中，所述聚己内酯-聚乙烯亚胺共聚物和4-羧基-3-氟苯硼酸的摩尔比为1:1～20；
可选地，S2中，所述活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺；
可选地，S2中，所述第二溶剂包括甲醇和二氯甲烷；
可选地，S2中，所述接枝反应的反应温度为25～70℃，反应时间为2～72h。
4.制备如权利要求1所述的混合胶束的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将所述高分子材料，以及所述聚己内酯-亚胺-聚乙二醇共聚物溶解于第三溶剂中，得到混合物；
S2.将所述混合物与超纯水混合，经超声处理和旋转蒸发，得到所述混合胶束。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1中，所述高分子材料，以及聚己内酯-亚胺-聚乙二醇共聚物的质量比为1:1～49；
可选地，S1中，所述第三溶剂包括二氯甲烷；
可选地，S2中，所述超声处理的频率为50～300W，时间为0.5～10min。
6.一种包括如权利要求1所述的混合胶束的复合物，其特征在于，还包括由所述混合胶束携带的基因；可选地，所述基因包括siRNA；可选地，所述混合胶束和基因的N/P比为50～1:1。
7.如权利要求1所述的混合胶束或权利要求6所述的复合物在基因编辑中的应用。
8.如权利要求1所述的混合胶束或权利要求6所述的复合物在制备基因治疗的药物中的应用。
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