CN112843244B - 一种尺寸可变的智能化载药纳米簇系统及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种尺寸可变的智能化载药纳米簇系统及其制备方法和应用。该载药纳米簇由外层生物相容性良好的网状宿主载体和内部的小尺寸寄生载体组成。所述纳米簇具备良好的安全和长循环特性，高效蓄积在肿瘤部位后，在肿瘤微环境刺激下智能调节尺度，释放小尺寸载药胶束穿透致密的肿瘤基质，实现深层递药，从而增强药物渗透性与杀伤力，降低毒副作用。所述纳米簇是一类灵活的载药平台，在纳米药物治疗实体瘤领域具有重大的实用价值。

Description

一种尺寸可变的智能化载药纳米簇系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种尺寸可变的智能化载药纳米簇系统及其制备方法和应用。
背景技术
化学疗法在抗癌治疗中扮演着非常重要的角色，但因选择性较差所带来的毒副作用仍然是临床上常用的小分子化疗药物普遍存在的问题。EPR效应(实体瘤的高通透性和滞留效应)的发现使纳米递药系统快速发展，但其临床与产业转化率较低，这与纳米药物在体内的复杂代谢过程密切相关：纳米药物在给药后至少会经历血液循环、肿瘤聚集、肿瘤渗透、细胞内化以及药物释放五个过程，且每一步的效率都会决定药物最终的抗肿瘤活性。其中肿瘤组织异常的脉管系统、致密的细胞外基质以及较高的肿瘤间质液压使得纳米药物无法渗透到肿瘤组织深处，导致纳米药物无法进一步的被肿瘤细胞内化发挥抗肿瘤活性，不仅降低了纳米药物的抗肿瘤活性，也是造成肿瘤转移及复发的重要原因。
粒径是决定制剂能否在肿瘤组织高效聚集和渗透的关键因素，小粒径(<20nm)的纳米制剂肿瘤组织渗透性好，但易于被清除，无法有效到达肿瘤组织；粒径～100nm的制剂具有较好的被动靶向作用，可大量富集在肿瘤组织，但难以渗透进入肿瘤深部。
目前的纳米制剂并不能很好地平衡循环稳定性和肿瘤深层渗透之间的矛盾，因此，构建一种可连续克服体内生物屏障，尤其是同时满足循环稳定性和肿瘤渗透性能的纳米载药制剂至关重要。
发明内容
本发明的目的是针对现有纳米制剂难以克服体内系列生物屏障的技术问题，提供一种肿瘤渗透型多阶纳米簇递药平台，即尺寸可变的智能化载药纳米簇系统，该智能化纳米簇能根据肿瘤微环境的刺激对其理化特性进行自适应性调整，克服连续的生物屏障，渗透致密的肿瘤胞外基质，实现肿瘤深层递药。可有效解决现有抗肿瘤药物靶向性差、毒副作用大及现有纳米制剂功能单一、难以克服体内诸多连续的生物屏障等问题。
本发明的另一目的是提供该尺寸可变的智能化载药纳米簇系统的制备方法和应用。
本发明的又一目的是提供在尺寸可变的智能化载药纳米簇系统中使用的含有PEG的“梳状”聚合物PPCD。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种尺寸可变的智能化载药纳米簇系统，其特征在于：该载药纳米簇系统由网状宿主载体和内部的用于包载药物的小尺寸寄生载体组成；所述的网状宿主载体尺寸为30-500nm,所述的小尺寸寄生载体尺寸为5-20nm。
网状宿主载体通过肿瘤微环境可激活的动态化学键掩蔽在外层，以提供保护和长循环功能，使纳米簇安全高效的富集在目标肿瘤组织。小尺寸寄生载体具有高效的载药量并可成功渗透进入肿瘤深部，快速被肿瘤细胞摄取并特异性释放药物发挥抗肿瘤活性。基于此，该载药纳米簇可克服体内连续的生物屏障，高效精准的渗透进入肿瘤组织发挥作用。
进一步的，所述的网状宿主载体骨架选自生物相容性良好的亲水性聚合物，包括但不限于 PEG或PEG衍生物、两性离子、透明质酸、透明质酸衍生物、葡聚糖、葡聚糖衍生物、低分子量肝素或其衍生物。
进一步的，所述的网状宿主载体为含有PEG的“梳状”聚合物长链，由主链和支链组成；其主链由生物相容性良好的PEG及对肿瘤组织高表达的基质金属蛋白酶2(MMP-2)敏感的肽链构成，包括但不限于CPLGLAGG、GPLGVRGG、PLGLVG、PVGLIGK，支链含有肿瘤微酸环境敏感的响应键，包括但不限于2-丙酸-3-甲基马来酸酐酰胺键、腙键、缩醛键，并在支链的末端接入环辛炔，为后续的无铜点击反应引入反应位点。
进一步的，所述的网状宿主载体为PPCD，结构如式I所示：
其中，m代表PEG的聚合度，m选自40～120中的任意整数；n代表主链的聚合度，n选自80～120中的任意整数；R1、R3分别代表响应于肿瘤微环境的连接臂或动态化学键，可响应于肿瘤微环境断裂；R2为C5-15的的烷基链；
所优选的，R1为响应于肿瘤微环境高表达的MMP-2的肽段PVGLIGK或PLGLVG；R2 为C6-11的的烷基链，进一步优选C6或C11的烷基链；R3为响应于肿瘤微酸环境的2-丙酸-3-甲基马来酸酐酰胺键。
小尺寸寄生载体选自树形分子、树形分子胶束、聚合物胶束、脂质体、金纳米粒、二氧化硅粒子、病毒等，尺寸为5-20nm。
所优选的，小尺寸寄生载体由两亲性树形分子AmD自组装形成胶束AmDM。AmD由一个G 3.0代的聚酰胺-胺(PAMAM)树状结构作为亲水端，烷基链作为疏水端。该两亲性树形分子独特的树枝状亲水末端可以有效增加内部包载药物的空间，从而大大提高药物的载药量；所优选通过薄膜分散发制备得到的载药纳米胶束尺寸均一，粒径分布在7-12nm范围内，具有优异的渗透能力；此胶束表面带大量正电荷，有利于被肿瘤组织快速摄取；当载药纳米制剂通过内吞作用进入肿瘤细胞后，在溶酶体酸性条件下，树形分子内部叔胺发生质子化，使得整个纳米制剂通过质子海绵效应逃逸进入细胞质，释放药物发挥疗效。
所述的两亲性树形分子AmD与药物的质量比为1:0.01～1:1。
所述的两亲性树形分子AmD结构图图2所示。
在图2中，AmD的疏水端P1选自P1-1时，AmD为AmD 1详见“Proc.Natl.Acad.Sci.USA2015,112(10):2978-2983”、AmD的疏水端P1选自P1-2时，AmD为AmD 2详见“Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,8478–8484”。
所优选的选用AmD 1两亲性树形分子构建本次发明的小尺寸寄生载体胶束AmDM。
所优选的，将AmD、C18-PEG1000-N3、X(药物)按照一定比例混合，得到表面有叠氮基团的载药纳米胶束N3/AmDM/X，其可通过温和的无铜点击反应被覆裹在网状宿主载体“梳状”聚合物长链PPCD内部。
作为本发明的一种优选，网状宿主载体骨架为包含PEG的“梳状”聚合物长链，粒径70-110nm；小尺寸寄生载体为树形分子胶束AmDM，粒径7-12nm。
所述药物为疏水性药物，选自阿霉素及其衍生物、Beta-Lapachone或其衍生物、喜树碱或其衍生物、紫杉醇或其衍生物、万古霉素或其衍生物等。
本发明所述的智能化载药纳米簇系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备含有叠氮基团的载药制剂N3/AmDM/X：将疏水性药物溶液与两亲性树形分子AmD、 C18-PEG1000-N3溶液混合均匀，其中AmD与C18-PEG1000-N3的质量比为1:0.1～1:1，AmD与药物的质量比为1:0.01～1:1，通过真空旋转蒸发仪将有机溶剂去除使其在瓶底形成一干燥的药物薄膜；加入水化浓度＝0.5～2mg/mL的PBS缓冲液将该药物薄膜溶解，并在水浴中超声水化，水化温度：20～60℃；超声频率：10～50Hz；超声时间：10～60min；将水化后的溶液经过0.22 微米孔径的聚碳酸酯膜,滤过后的样品室温透析，得到载药的纳米胶束N3/AmDM/X溶液；
(2)制备网状宿主载体PPDC：由带有羧基末端的PEG(COOH-PEG2000～5000-COOH)、包含MMP-2 酶切位点且带有分支结构的聚合物单体MMP-敏感肽-(C5-15-OAc)，通过缩聚反应得到聚合度n＝80～120的主链结构，脱去支链末端的羟基保护基，进一步与2-丙酸-3-甲基马来酸酐反应，并通过2-丙酸-3-甲基马来酸酐的酸酐与末端为氨基修饰的环辛炔的反应得到网状宿主载体 PPCD；
(3)通过无铜点击反应将N3/AmDM/X偶联到PPCD的支链末端：取PPCD加入到N3/AmDM/X 的PBS溶液中，PPCD与N3/AmDM/X的摩尔比＝1:1～4:1,，氮气保护避光环境中，室温反应 4-12h，超速离心除去未反应原料，冻干，得到PADNc@X纳米簇；
其中,X代表疏水性药物。
本发明所述的智能化载药纳米簇系统在制备肿瘤化疗药物中的应用。
一种含有PEG的“梳状”聚合物PPCD，结构如式I所示：。
本发明所述的含有PEG的“梳状”聚合物PPCD的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：
由带有羧基末端的PEG(COOH-PEG2000～5000-COOH)、包含MMP-2酶切位点且带有分支结构的聚合物单体MMP-2敏感肽-(C5-15-OAc)，通过缩聚反应得到具有一定聚合度(聚合度n＝80-120)的主链结构。脱去支链末端的羟基保护基，进一步与2-丙酸-3-甲基马来酸酐反应，并通过2-丙酸-3-甲基马来酸酐的酸酐与末端为氨基修饰的环辛炔的反应得到网状宿主载体 PPCD。
本发明所述的含有PEG的“梳状”聚合物PPCD在制备智能化载药纳米制剂中的应用。
有益效果：本发明设计自适应载药纳米簇，成功穿越体内生物屏障。网状宿主载体提供的掩蔽层赋予载药系统良好的安全和长循环特性，生理条件下避免与组织作用，增强对肿瘤的选择性从而实现在肿瘤靶部位的高效蓄积；到达肿瘤组织后，在肿瘤微环境刺激下智能调节尺度，释放小尺寸寄生载药胶束穿透致密的肿瘤基质，实现深层递药；载药纳米簇在增强抗肿瘤活性的同时可降低抗肿瘤药物的全身毒性，是治疗肿瘤中药物制剂上的创新。
与现有技术相比，本发明有如下优点：
1.本发明为设计多功能递药系统提供创新思路：
(1)小尺寸寄生载体可以为任何渗透性能良好但由于尺寸过小而存在清除风险的制剂，更有益的是，在其表面可通过方便温和的点击反应按需修饰功能性基团，使系统获得主动靶向、诊断等功能，具有灵活的功能拓展能力；
(2)网状宿主载体的存在一方面可提高安全性、延长血液循环时间，又可根据内源性肿瘤特异性信号或者外源性刺激按需调整响应位点，使药物精准可控释放；
(3)本发明中的小尺寸载药胶束可实现对多种抗肿瘤药物的包载，基于此种设计的理念可根据肿瘤特定的发病机制，按需调整药物种类，昭示了此纳米制剂广阔的应用前景。
2.树形分子结构精确可控，赋予载药纳米胶束优异的批次可重复性能和稳定可控的质量；且得益于其独特的树枝状末端，赋予制剂高效的载药量，实用性强。
附图说明
图1为载药纳米簇的制备流程示意图；
图2两亲性树形分子AmD结构图
图3为实施例1中载药纳米簇PADNc@DOX的流体动力学粒径分布图和电镜图；
图4为实施例2中载药纳米簇PADNc@DOX酸和酶孵育后的粒径变化图；
图5为实施例3中载药纳米簇PADNc@DOX在不同pH条件下随时间变化的药物释放曲线；
图6为实施例4中载药纳米簇PADNc@DOX在体外MCF-7R 3D瘤球上的渗透情况；
图7为实施例5中载药纳米簇MCF-7R 3D瘤球水平上的抗肿瘤活性考察；
图8为实施例6中载体的体内安全性考察，分为溶血毒性和肝肾病理检测；
图9为实施例7中载药纳米簇的体内药物半衰期考察；
图10为实施例8中载药纳米簇在体内不同器官的分布考察；
图11为实施例9中载药纳米簇的体内渗透性能，具体为与肿瘤血管的分布情况；
图12为实施例10中载药纳米簇体内抗肿瘤活性研究中的肿瘤体积及治疗期间小鼠体重变化；
图13为实施例10中荷瘤小鼠经过药物处理后肿瘤组织切片的H&E染色。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明
实施例1：载药纳米簇PADNc@DOX的制备及表征，如图1，图2所示
1.1小粒径载药胶束AmDM/DOX的制备
以下实施例中使用的AmDM为AmD1，制备方法在“Wei,T.；Chen,C.；Liu,J.；Liu,C.；Posocco,P.；Liu,X.；Cheng,Q.；Huo,S.；Liang,Z.；Fermeglia,M.；Pricl,S.；Liang,X.-J.；Rocchi,P.； Peng,L.Anticancer Drug Nanomicelles Formed by Self-AssemblingAmphiphilic Dendrimer to Combat Cancer Drug Resistance.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2015,112,2978–2983,DOI: 10.1073/pnas.1418494112”中有详细记载。DOX代表相应的阿霉素。
采用薄膜分散法制备包载疏水性药物的小粒径纳米粒，具体制备方法如下：
(1)将盐酸阿霉素溶解在混合溶剂(氯仿：甲醇＝1:1，v/v)中。加入三乙胺(三乙胺与阿霉素的摩尔比＝3:1)将盐酸阿霉素脱盐酸化得到疏水性阿霉素。
(2)将2mg疏水性阿霉素与3mg AmD混合均匀(氯仿：甲醇＝1:1，v/v)，通过真空旋转蒸发仪将有机溶剂去除使其在瓶底形成一干燥的药物薄膜；加入3mL PBS缓冲液将该药物薄膜溶解，并在水浴中超声水化(水化温度：60℃；超声频率：20Hz；超声时间：60min)；将水化后的溶液经过0.22微米孔径的聚碳酸酯膜过滤去除未被包裹的疏水性阿霉素，滤过后的水溶液样品透析袋(MWCO＝2000Da)室温透析，得到载阿霉素的纳米胶束AmDM/DOX溶液。通过此方法所制备的载药胶束可实现对阿霉素的有效包载，载药量可高达40％。同样的，将AmD 1换为AmD 2，可制备得到不同的载药制剂。
负载的疏水性药物可以是阿霉素或其衍生物、Beta-Lapachone或其衍生物、喜树碱或其衍生物、紫三醇或其衍生物、万古霉素或其衍生物等。
1.2 N3/AmDM/DOX制备
制备N3/AmDM/DOX，将AmD、DOX与带有叠氮基团的C18-PEG1000-N3混合(其中AmD 与C18-PEG1000-N3的质量比＝2:1，AmD与疏水性阿霉素的质量比＝3:2)，经过实施例1.1所述的步骤后，得到N3/AmDM/DOX，用于后续载药纳米粒的制备。
1.3纳米簇PADNc@DOX的制备
(1)在一种优选方案中，设计合成一种生物相容性良好的PEG“梳状”聚合物长链PPCD，在聚合物的主链与支链中分别引入了肿瘤微环境敏感的化学键,响应于肿瘤微环境的细微环境变化包括但不限于肿瘤的酸性微环境、异常的氧化还原环境、特殊或者高表达的酶和乏氧环境等)或者外部刺激(如光、超声等)，本发明优选相应于肿瘤微酸环境和高表达的MMP-2酶作为刺激因素，触发内部小粒径载药纳米粒特异性高效释放；随后在支链的末端接入环辛炔，为后续的无铜点击引入反应位点。
(2)具体的，由带有羧基末端的PEG(COOH-PEG5000-COOH)、包含MMP-2酶酶切位点且带有分支结构的聚合物单体PVGLIGK(C6-OAc)，通过缩聚反应得到具有一定聚合度(聚合度n＝120)的主链结构。脱去支链末端的羟基保护基，进一步与2-丙酸-3-甲基马来酸酐反应，并通过2-丙酸-3-甲基马来酸酐的酸酐与末端为氨基修饰的环辛炔的反应得到网状宿主载体 PPCD，结构如下所示:
(3)通过无铜点击将多个小粒径N3/AmDM/DOX偶联到上述合成的PPCD的支链末端。取 PPCD加入到N3/AmDM/DOX(PPCD与N3/AmDM/DOX的摩尔比＝3:1)的PBS溶液中，氮气保护避光环境中，室温反应4h，室温超速(2000rpm)离心10min除去未反应原料。冻干，得到PADNc@DOX纳米簇。在制备过程中不加入药物，相似的方案制备载体PADNc。
1.4纳米簇的表征
(1)采用Brookhaven多角度粒度及Zeta电位分析仪测定纳米胶束AmDM/DOX和纳米簇 PADNc@DOX的流体动力学粒径分布。如图3所示，AmDM/DOX胶束和PADNc@DOX的流体动力学粒径分布分别在7-12nm和70-110nm，表明小粒径载药纳米胶束成功包覆在支链 PPCD之中，得到的纳米簇粒径增大了近十倍。
(2)采用透射电子显微镜(TEM)观察PADNc@DOX的形貌，如图3所示，PADNc@DOX 纳米簇形态规整，圆整均一，且与其流体动力学粒径范围相符。
实施例2：载药纳米簇PADNc@DOX的响应性分析
2.1酸敏感性实验
(1)将载药纳米簇溶液的pH调节至6.5，置于37℃恒温摇床中孵育，采用激光粒度仪监测其粒径变化。如图4所示，在微酸性条件迅速减小，表明在模拟肿瘤微酸的情况下，外层网状 PPCD会断裂，证明纳米簇可成功响应于肿瘤微酸环境，释放小粒径载药纳米粒。
(2)将载药纳米簇溶液的pH调节至6.5，置于37℃恒温摇床中孵育，透射电子显微镜观察其自组装形态。TEM图像说明PPCD与载药纳米胶束之间的酸敏感键断裂，小粒径载药纳米胶束逐渐被释放，PPCD逐渐缠绕形成图中黑色团聚体，与上述流体动力学的粒径变化相符。
2.2酶敏感性实验
(1)将PADNc@DOX的冻干粉末加入已经激活的MMP-2酶，置于37℃恒温摇床中孵育，采用激光粒度仪测定其粒径，观察其粒径变化。如图4所示，酶孵育后，PADNc@DOX的粒径下降，证明PADNc@DOX可成功响应于肿瘤微环境高表达的MMP-2酶。
(2)TEM检测PADNc@DOX的酶敏感性。按照上述相同的操作，将混合液滴加到TEM透射电镜铜网表面，透射电子显微镜观察其自主装形态。TEM图像可以观察到酶孵育后出现粒径20～30nm的不规则球体，提示纳米簇可成功响应于肿瘤微环境高表达的MMP-2酶，从而加速内部小粒径载药纳米胶束的释放。
实施例3：载药纳米簇PADNc@DOX的药物释放分析
采用多功能酶标仪(BioTek)测定在不同时间不同环境下药物的释放情况。将一定量的药物(PADNc@DOX)加入到透析袋(MWCO＝10000Da)中，将其置于装有含有不同pH(pH7.4、pH 5.0)溶液的离心管中，置于恒温摇床中孵育。于0-48h不同时间点取透析外液，并补充相同量的PBS，测定不同时间点透析外液的浓度。如图5所示，释放动力学曲线表明外层网状保护层PPCD的引入可以增加纳米制剂在生理条件下的稳定性，防止药物的泄漏。在酸性环境中，药物可达到快速释放，在48h内可释放60％，远高于在7.4条件下的10％。说明制剂在循环生理条件下可保持稳定，在肿瘤酸性的溶酶体中快速释放药物。
实施例4：制剂在多细胞瘤球中的渗透性能表征
采用共聚焦激光扫描显微镜观察PADNc@DOX在多细胞3D瘤球MCF-7R中的渗透情况。 96孔板中每孔加入70μL 1.5％(wt/v)的琼脂糖凝胶溶液，每孔接种2000个MCF-7R细胞，将96孔板放入细胞培养箱中培养，选择直径100～200μm的球体用于后续实验。将PADNc@DOX置于不同环境的培养基中进行孵育。激光共聚焦显微镜进行双光子逐层扫描，扫描间隔为10μm。如图6所示，经酸和酶处理的载药纳米簇，扫描深度为40μm时，此组别在整个瘤球中仍呈现出很强的荧光信号，可达到与小粒径纳米制剂相似的渗透效果。酸响应键与酶响应键的引入均可在一定程度上提高纳米簇在深部肿瘤中的渗透，表明此肿瘤微环境响应的载药纳米簇可渗透深层肿瘤的良好性能。
实施例5：CCK-8法评估载药纳米簇的体外抗肿瘤活性
通过实施例4的方法培育多细胞3D瘤球，并将之与游离药物和不同环境中的载药纳米簇孵育(DOX＝4μM)，用完全培养基处理的3D瘤球作为阴性对照。在显微镜下观察并拍照并加入CCK-8监测球体的生存状态，使用多模式酶标仪在450nm波长处测量吸光度。如图7所示，制剂组均对瘤球的生长起到一定水平的抑制作用，其中提前在酸中孵育以及在酶与酸条件下共孵育的PADNc@DOX可裂解球体发挥显著的抗肿瘤作用。这与其在3D瘤球中的渗透能力密切相关，其发生尺寸变化后释放出的小粒径载药纳米胶束能够深入到肿瘤组织中，将携载的DOX递送到肿瘤核心细胞内部，杀死肿瘤细胞，瓦解肿瘤结构。
同样的，本发明包载其他抗肿瘤药物时均能达到优异的抗肿瘤效果，包载PTX及CPT的载药纳米簇PADNc@PTX、PADNc@CPT均能响应于肿瘤微环境高效释放小粒径载药纳米粒，从而发挥优异的抗肿瘤效果。
实施例6：评估载体体内安全性
溶血毒性检测：收集新鲜血液，室温离心收集血细胞，除去上清液。用PBS洗涤直至上清液无色。将红细胞悬液与不同浓度(1-50μM)的载体PADNc溶液混合后。测量540nm处的吸光度。如图7所示，在不同PADNc浓度下，直接观察和定量分析均显示PADNc没有明显的溶血作用。说明其在体内系统给药的安全性良好。
病理检测：小鼠尾静脉注射等体积的PBS、PADNc。眼眶取血收集血液，收集血清，并通过全自动生化分析仪检测肝肾指标。如图8所示，，用PADNc治疗的小鼠，肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)以及肾功能指标尿素(UREA)和肌酐(CREA)均未出现异常变化。表明PADNc在体内并未对肝肾造成损伤，显示其在体内运用的安全性。
实施例7：评估载药纳米制剂体内药物代谢动力学行为
将小鼠随机分为3组，尾静脉注射DOX或PADNc@DOX(DOX＝5mg/kg)。以不同的时间间隔将血样收集到肝素化管中，室温离心，取上清血浆与乙腈混合沉淀所有蛋白。离心后收集有机层。浓缩后使用高效液相色谱(Waters1525,US)测定DOX荧光(荧光检测器设置在480nm激发光，590nm发射光)并分析药物血浆浓度。结果如图9所示，生物相容性良好的 PEG网状结构保护的载药纳米簇可明显提高药物的血液循环时间，将药物的表观半衰期延长了3.4倍，表明PEG的引入可保护药物在循环中的稳定性，延长血液循环时间，从而使药物有更大的几率到达目标肿瘤部位。
实施例8：评估载药纳米制剂的体内靶向性
按照实施例1同样的方法制备载有近红外荧光染料的纳米制剂AmDM/DiR、PADNc@DiR。对荷瘤小鼠尾静脉注射载有DiR的纳米制剂(DiR＝1mg/kg)，24h后，处死小鼠并剥离出主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤组织，进行近红外成像，并用活体成像软件对目标区域进行分析并定量在不同脏器分布的DiR平均荧光强度。如图10所示，得益于载药纳米簇延长的血液循环时间，使其能够有效靶向肿瘤组织。PADNc@DiR的平均荧光强度分别是游离DiR和AmDM/DiR的26和2倍。说明载药纳米簇可明显提高药物在肿瘤组织的富集，具有良好的肿瘤靶向性。
实施例9：评估载药纳米制剂的体内渗透性能
对荷瘤小鼠尾静脉注射DiR标记的制剂(AmDM/DOX、PADNc@DOX,DiR＝5mg/kg)，24h后，处死小鼠，剥离出肿瘤组织，对肿瘤组织冷冻切片，肿瘤组织切片中的肿瘤血管通过FITC标记的CD31抗体进行染色标记，将切片置于激光共聚焦显微镜下观察载药纳米簇在肿瘤组织血管的渗透情况。如图11所示，游离DOX在肿瘤部位的聚集很少；载药纳米簇处理后，在肿瘤部位可观察到很强的荧光信号，除了部分荧光信号共定位在肿瘤血管部位外，荧光信号在肿瘤血管附近的肿瘤组织中分布也很多。表明载药纳米簇成功响应于肿瘤微酸环境酸及微环境中高表达的MMP-2酶，释放出小粒径的纳米胶束，后者能有效的渗透进入肿瘤深部。
实施例10：评估载药纳米制剂的体内抗肿瘤活性
构建难渗透BXPC-3荷瘤小鼠模型以考察载药纳米制剂的抗肿瘤活性，将荷瘤小鼠随机分为4组用于体内抗癌分析。分别尾静脉注射DOX、AmDM/DOX、PADNc@DOX(DOX＝5mg/kg)的生理盐水溶液，一周给药两次，给药四周。28天后，处死小鼠，剥离肿瘤组织，进行石蜡包埋切片并进行H&E染色以考察载药制剂的体内毒性。如图12所示，PADNc@DOX显示出优异的抗肿瘤增殖效果，抑制率达到92％，显著高于游离药物DOX的53％，表明载药纳米制剂相较于游离药物具有更优异的抗肿瘤作用。更重要的是制剂可显著降低DOX的毒性，游离DOX可引起小鼠体重下降。如图13所示，游离DOX造成心肌纤维损伤和空泡化，而载药制剂组小鼠状态良好，未见明显损伤。这些结果有力的证实了此载药纳米簇是一种安全有效的体内治疗肿瘤的纳米药物。

Claims (13)

1.一种尺寸可变的智能化载药纳米簇系统，其特征在于：该载药纳米簇系统由网状宿主载体和内部的用于包载药物的小尺寸寄生载体组成；所述的网状宿主载体尺寸为30-500nm, 所述的小尺寸寄生载体尺寸为5-20 nm;所述的网状宿主载体为PPCD，结构如式I所示：
，
其中，m代表PEG的聚合度，m选自40~120中的任意整数；n代表主链的聚合度，n选自80~120中的任意整数；R1为响应于肿瘤微环境高表达的MMP-2的肽段PVGLIGK；R2为C5-15的烷基链；R3为响应于肿瘤微酸环境的2-丙酸-3-甲基马来酸酐酰胺键；所述的小尺寸寄生载体选自树形分子胶束、脂质体、金纳米粒、二氧化硅粒子或病毒中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的智能化载药纳米簇系统，其特征在于：R2为C6-11的的烷基链。
3.根据权利要求2所述的智能化载药纳米簇系统，其特征在于：R2为C6或C11的烷基链。
4.根据权利要求1所述的智能化载药纳米簇系统，其特征在于：所述的包载药物的小尺寸寄生载体为含叠氮基团的AmDM 载药胶束，所述的AmDM由一个低代数的PAMAM树状结构作为亲水端、烷基链作为疏水端，用于包载药物；所述的低代数为G1.0~G3.0。
5.根据权利要求3所述的智能化载药纳米簇系统，其特征在于：所述的包载药物的小尺寸寄生载体为含叠氮基团的AmDM 载药胶束是将药物溶液与两亲性树形分子AmD、C18-PEG1000-N3溶液经薄膜分散法制备得到。
6.权利要求1所述的智能化载药纳米簇系统，其特征在于：所述药物为疏水性药物，选自阿霉素及其衍生物、Beta-Lapachone或其衍生物、喜树碱或其衍生物、紫杉醇或其衍生物、万古霉素或其衍生物。
7.一种权利要求1所述的智能化载药纳米簇系统的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）制备含有叠氮基团的载药制剂N3/AmDM/X：将疏水性药物溶液与两亲性树形分子AmD、C18-PEG1000-N3溶液混合均匀，其中AmD与C18-PEG1000-N3的质量比为1:0.1 ~1:1，AmD与药物的质量比为1:0.01~1:1，通过真空旋转蒸发仪将有机溶剂去除使其在瓶底形成一干燥的药物薄膜；加入水化浓度=0.5~2 mg/mL的PBS缓冲液将该药物薄膜溶解，并在水浴中超声水化，水化温度：20~60 ℃；超声频率：10~50 Hz；超声时间：10~60 min；将水化后的溶液经过0.22微米孔径的聚碳酸酯膜, 滤过后的样品室温透析，得到载药的纳米胶束N3/AmDM/X溶液；
（2）制备网状宿主载体PPCD：由带有羧基末端的PEG、包含MMP-2酶切位点且带有分支结构的聚合物单体MMP敏感肽-（C5-15 -OAc），通过缩聚反应得到聚合度n=80~120的主链结构，脱去支链末端的羟基保护基，进一步与2-丙酸-3-甲基马来酸酐反应，并通过2-丙酸-3-甲基马来酸酐的酸酐与末端为氨基修饰的环辛炔的反应得到网状宿主载体 PPCD; 所述的带有羧基末端的PEG为COOH-PEG2000~5000-COOH；
（3）通过无铜点击反应将N3/AmDM/X偶联到PPCD的支链末端：取PPCD加入到N3/AmDM/X的PBS溶液中，PPCD与N3/AmDM/X的摩尔比=1:1~4:1,，氮气保护避光环境中，室温反应4-12 h，超速离心除去未反应原料，冻干，得到PADNc@X纳米簇;
其中,X代表疏水性药物。
8.权利要求1-6中任一项所述的智能化载药纳米簇系统在制备肿瘤化疗药物中的应用。
9.一种含有PEG的“梳状”聚合物PPCD，结构如式I所示：
，
其中，m代表PEG的聚合度，m选自40~120中的任意整数；n代表主链的聚合度，n选自80~120中的任意整数；R1为响应于肿瘤微环境高表达的MMP-2的肽段PVGLIGK，R2为C5-15的的烷基链；R3为响应于肿瘤微酸环境的2-丙酸-3-甲基马来酸酐酰胺键。
10.根据权利要求9所述的含有PEG的“梳状”聚合物PPCD，其特征在于：R2为C6-11的的烷基链。
11.根据权利要求9所述的含有PEG的“梳状”聚合物PPCD，其特征在于：R2为C6或C11的烷基链。
12.权利要求9所述的含有PEG的“梳状”聚合物PPCD的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：
由带有羧基末端的PEG、包含MMP-2酶切位点且带有分支结构的聚合物单体MMP-敏感肽-（C5-15 -OAc），通过缩聚反应得到聚合度n=80~120的主链结构，脱去支链末端的羟基保护基，进一步与2-丙酸-3-甲基马来酸酐反应，并通过2-丙酸-3-甲基马来酸酐的酸酐与末端为氨基修饰的环辛炔的反应得到网状宿主载体 PPCD; 所述的带有羧基末端的PEG为COOH-PEG2000~5000-COOH。
13.权利要求9所述的含有PEG的“梳状”聚合物PPCD在制备智能化载药纳米制剂中的应用。
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