CN108126189B - 分级组装的纳米复合载体递药系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分级组装的纳米复合载体递药系统并将其用于递送抗肿瘤蛋白药物，该递药系统包括二级载体和包载二级载体的一级载体；所述二级载体的粒径为5‑20 nm；包载了二级载体的一级载体粒径为50‑1000 nm。本发明的纳米复合载体递药系统通过被动靶向和主动靶向到达肿瘤位点后，一级载体在肿瘤细胞外基质的弱酸性环境下降解，释放出小粒径的二级载体，包载了抗肿瘤蛋白药物的二级载体可以渗透到肿瘤组织深层，随后在胞内信号刺激下响应释放出具有肿瘤细胞杀伤能力的活性蛋白药物，从而起到清除肿瘤细胞的作用。

Description

分级组装的纳米复合载体递药系统及其应用
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及分级组装的纳米复合载体递药系统及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的最主要疾病之一，目前临床上针对恶性肿瘤的最常用治疗手段主要是化疗。抗肿瘤小分子化疗药物由于缺乏肿瘤组织特异性，水溶性差，活性低，具有严重的毒副作用等缺点，限制了其在临床上的应用。蛋白药物（例如酶、抗体、细胞因子和转录因子等）由于其高特异性生物活性和副作用小等显著优点，在生物医学和药物发展领域中发挥着重要作用。虽然许多蛋白药物显示出强有效的抗肿瘤活性，已应用于临床前和临床试验中的癌症治疗。然而，蛋白药物的低稳定性，易被血液中的酶降解及较差的细胞膜渗透性等缺点，极大地限制了其在临床上的应用。因此，研制开发新剂型以提高蛋白药物在体内的稳定性及改善药效十分必要。
发明内容
解决的技术问题：本发明的目的是解决现有蛋白药物的纳米载体递送系统稳定性及递送效果差的技术问题，提供一种分级组装的纳米复合载体递药系统及其制备方法和应用，该递药系统能根据肿瘤相关信号自适应改变粒径大小，反转电荷，克服诸多生理屏障，控制释放原型蛋白药物，保持其结构和功能的完整性，实现抗肿瘤作用。
技术方案：
分级组装的纳米复合载体递药系统，包括二级载体和包载二级载体的一级载体；所述二级载体的粒径为5-20 nm，包载二级载体的一级载体粒径为50-1000 nm。
上述分级组装的纳米复合载体递药系统在递送蛋白药物中的应用。
荷载抗肿瘤蛋白药物的纳米复合载体递药系统，包括抗肿瘤蛋白药物、包载蛋白药物的二级载体、包载二级载体的一级载体；所述二级载体具有肿瘤细胞胞内响应性释药特性，粒径为5-20nm，一级载体具有肿瘤微环境响应性释药特性，包载了二级载体的一级载体粒径为50-1000 nm。
进一步地，所述二级载体选自树形分子、金纳米粒、磁性纳米粒、纳米凝胶或聚合物纳米粒。
进一步地，所述一级载体选自脂质体、胶束、囊泡、无机纳米粒、纳米凝胶或聚合物纳米粒。
进一步地，所述二级载体为5-20 nm的纳米凝胶，所述一级载体为50-1000 nm的纳米凝胶。
进一步地，在一级载体外壳连有靶向配体，可与肿瘤细胞膜表面受体特异性结合。
一种荷载核糖核酸酶A的纳米复合载体递药系统，包括核糖核酸酶A、包载核糖核酸酶A的二级载体和包载二级载体的一级载体；
包载核糖核酸酶A的二级载体粒径5-20nm，由丙烯酰胺、N-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺和N, N’-双（丙烯酰）胱胺聚合而成；
包载二级载体的一级载体粒径为50-200nm，由丙烯酰胺、N-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺、N-2-叠氮乙基丙烯酰胺和二甲基丙烯酸甘油酯聚合而成；
在一级载体表面还修饰有包含二苯并环辛炔基团的透明质酸衍生物构成的外壳。
有益效果：本发明基于肿瘤微环境和生理环境的不同pH，构建了肿瘤微环境酸响应释放的一级载体；基于肿瘤细胞内的还原条件构建了小粒径的二级载体，一级载体将二级载体包载，并在一级载体外层化学修饰透明质酸外壳，形成完整的纳米复合载体。纳米复合载体通过被动靶向和主动靶向的协同到达肿瘤位点后，一级载体在肿瘤细胞外基质的弱酸性环境下降解，释放出小粒径的二级载体，包载了抗肿瘤药物的二级载体可以渗透到肿瘤组织深层，随后在胞内信号刺激下响应释放出具有肿瘤细胞杀伤能力的活性蛋白药物，从而起到清除肿瘤细胞的作用。
附图说明
图1为实施例1中R-rNC和RNase A的流体动力学粒径分布图；
图2为实施例1中R-rNC的流体动力学粒径分布图和电镜图；
图3为实施例1中R-rNC和RNase A的圆二色谱图；
图4为实施例1中R-rNC和R-nNC与不同浓度的谷胱甘肽（GSH）孵育2 h后的粒径变化；
图5为实施例1中R-rNC/aNG的流体动力学粒径分布图和电镜图；
图6为实施例1中在有无透明质酸酶（HAase）的不同pH条件下Rho-R从Rho-R-rNC/aNG中随时间变化的释放曲线；
图7为实施例1中不同罗丹明荧光标记的制剂与人源乳腺癌MDA-MB-231的多细胞3D瘤球孵育8h后的肿瘤球渗透激光共聚焦显微成像图；
图8为实施例1中在不同pH下释放出的Rho-R-rNC在不同时间点被MDA-MB-231细胞内吞的效率；
图9为实施例1中在不同pH下释放出的Rho-R-rNC在不同时间点在MDA-MB-231细胞中的胞内转运；
图10为实施例1中对MDA-MB-231细胞用不同蛋白胶处理48 h后的细胞活力；
图11为实施例1中荷瘤小鼠尾静脉注射Cy5.5-aNG和Cy5.5-R-rNC 24 h后Cy5.5在不同脏器的平均荧光强度；
图12为实施例1中荷瘤小鼠尾静脉注射Rho-R-rNC/aNG和Rho-R-rNC/nNG 24 h后Rho-R-rNC在肿瘤血管的分布情况；
图13为实施例1中荷瘤小鼠分别用生理盐水和R-rNC/aNG处理后肿瘤组织切片的HE染色。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
在不断发展的纳米技术的推动下，很多纳米递送系统如脂质体、聚合物纳米粒、纳米凝胶和无机纳米载体等都被用于递送蛋白药物以提高其稳定性和有效性。肿瘤组织血管具有异质性，含有大量孔隙，当纳米载体粒径小于200 nm时，能穿透这些孔隙渗出血管，到达肿瘤组织。此外，由于肿瘤组织中的淋巴回流系统缺失，可以增强纳米载体在肿瘤组织中的滞留，即实体瘤的增强渗透滞留效应（EPR效应）或称为被动靶向。鉴于此，可设计满足尺寸要求的纳米递送系统，通过EPR效应递送至肿瘤组织。此外，研究者可以对纳米载体进行某些特异性修饰，通过与肿瘤组织高表达的受体特异性结合，使纳米载体具有主动靶向能力，最终实现纳米载体对药物的靶向递送，进一步增强纳米载体的肿瘤靶向性。此外，利用肿瘤组织微环境与正常组织的生理学差异，可以设计和构建肿瘤相关刺激响应的纳米载体，在肿瘤组织或肿瘤细胞内的信号刺激下，改变其结构和性质，响应释放药物。目前存在着多种纳米递药系统：如树状聚合物（树形分子）、脂质体、胶束、无机纳米材料、磁性纳米粒、纳米凝胶、聚合性纳米粒等，通过对其进行表面改性（如大小、电荷、化学修饰等），以实现靶向递送，增强疗效。如pH敏感、酶敏感、还原敏感的药物递送系统以及响应外部刺激（光、电、磁等）的纳米递送系统。纳米载体介导的药物递送需要克服连续的生理屏障，包括血液循环、肿瘤部位蓄积、肿瘤渗透、细胞膜、内涵体/溶酶体和胞内释放等过程，最终才能杀死靶细胞。转运过程中的每一个阶段都会显著影响药物的疗效。粒径为100 nm左右及表面带负电荷更有利于纳米载体通过EPR效应在肿瘤血管外渗并在肿瘤位点蓄积。但对于更深层的肿瘤渗透和细胞内吞过程而言，大粒径（~100 nm）反而成为了其主要限制。相反，小尺寸纳米粒（＜10 nm）由于其较低的扩散阻力显示出优越的肿瘤穿透能力，但是由于其粒径过小易遭受肾脏清除，极少得以在肿瘤部位蓄积。阳离子纳米载体一方面能与负电荷的细胞膜产生静电吸附作用增强细胞内吞，另一方面也很容易与血浆中的负电荷蛋白发生静电吸附加速单核巨噬系统的清除。
为了解决上述矛盾并提高蛋白药物递送的稳定性和有效性，需要构建一种精巧的能根据肿瘤相关刺激改变粒径大小（从大到小）和电荷反转（从正到负）的纳米复合载体，由于蛋白药物难以直接通过细胞膜，首先纳米复合载体需要响应肿瘤微环境的信号在肿瘤组织降解释放出包载有蛋白药物的二级载体，通过小粒径的二级载体在肿瘤组织的深层渗透，进而被肿瘤细胞摄取，进一步在肿瘤细胞内信号触发下释放原型活性蛋白药物，从而发挥其抗肿瘤作用。
本发明提供了一种分级组装的纳米复合载体递药系统，包括二级载体和包载二级载体的一级载体；所述二级载体的粒径为5-20 nm；包载了二级载体的一级载体粒径为50-1000 nm。
上述的分级组装的纳米复合载体递药系统可用于递送蛋白药物，特别是抗肿瘤蛋白药物，如多肽、酶、抗体、细胞因子、转录因子、激素类等。基于肿瘤微环境和生理环境的不同pH，一级载体需具有肿瘤微环境响应性释药特性，可以是脂质体、胶束、囊泡、无机纳米粒、纳米凝胶、聚合物纳米粒等，一级载体的粒径在50-1000nm，优选50-200nm。另外，考虑到肿瘤细胞内的内源性环境构建了小粒径的二级载体，二级载体具有肿瘤细胞内响应性释药特性，可以是树形分子、金纳米粒、磁性纳米粒、纳米凝胶、聚合物纳米粒等，二级载体的粒径在5-20nm。由此，构成了肿瘤递药系统，一级载体将二级载体包载，二级载体负载抗肿瘤蛋白药物。当纳米复合载体递药系统到达肿瘤微环境时，一级载体在肿瘤微环境的信号触发下发生降解，释放出载有抗肿瘤蛋白药物的二级载体；二级载体入胞后发生降解，释放出抗肿瘤蛋白药物。
在本发明的一个实施例中，选择具有较强细胞毒性的核糖核酸酶A（RNase A）作为模型蛋白药物；基于一级载体在肿瘤微环境的酸性环境下响应断键及对二级载体的稳定性和包封率，选择纳米凝胶作为一级载体，粒径在50-200nm，由可水解降解的聚合物交联得到，其主链包含悬挂的酯官能团；基于二级载体对蛋白药物的稳定性和包封率，选择在蛋白表面可原位聚合形成的单分子蛋白胶囊作为二级载体。
具体地，由RNase A、丙烯酰胺（AAm）、N-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺（APMAAm）和N, N’-双（丙烯酰）胱胺（BAC）在过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）的引发下发生自由基聚合交联形成单分子蛋白胶囊（R-rNC），作为二级载体。由丙烯酰胺（AAm）、N-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺（APMAAm），包含叠氮基团（为化学修饰透明质酸外壳提供作用位点）的单体N-2-叠氮乙基丙烯酰胺（AAm-N3）和酸敏感交联剂二甲基丙烯酸甘油酯（GDA）在表面活性剂多库酯钠盐（AOT）和聚氧乙烯月桂醚（Brij 30）的作用下，通过单乳化法，以APS和TEMED作链引发剂先形成酸敏感纳米复合载体核心，再与包含二苯并环辛炔基团（可与叠氮基迅速发生化学偶联形成稳定的三氮唑结构）的透明质酸衍生物（HA-DBCO）在温和条件下发生化学点击形成有透明质酸外壳的具有壳核结构的一级载体，增加制剂的稳定性。一级载体包载二级载体R-rNC后最终形成完整的纳米复合载体R-rNC/aNG。该纳米复合载体通过被动靶向（EPR效应）和主动靶向（与乳腺癌细胞表面高表达的CD44受体特异性结合）到达肿瘤位点后，先在肿瘤细胞外基质的弱酸性环境下降解，释放出核糖核酸酶A蛋白胶囊（R-rNC），R-rNC渗透到肿瘤深层后，通过内吞途径入胞，在肿瘤细胞内的还原条件下（较高浓度GSH）降解释放出完整的原型蛋白RNase A，催化降解肿瘤细胞的RNA发挥其抗肿瘤作用。
实施例1
1. RNase A单分子蛋白纳米胶囊（R-rNC）的制备及表征
1 mg RNase A溶于1 mL碳酸盐缓冲液，4℃搅拌下依次加入AAm、APMAAm、BAC、APS和TEMED，4℃搅拌1 h。超滤（10 K MWCO, Millipore）离心（3500 rpm）洗涤四次，PBS置换原缓冲液，得到R-rNC。用不可降解的交联剂N, N’-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）代替还原性降解的BAC制备而得不可降解的单分子纳米胶囊（R-nNC）作为对照组。
采用马尔文粒径仪（Malvern Nano ZS90）测定R-rNC和RNase A的流体动力学粒径分布。如图1所示：R-rNC和RNase A的流体动力学粒径分别为8 nm和3 nm，表明在RNase A的外层形成了一层聚合物壳，使得R-rNC的粒径增大了将近2倍。
采用透射电子显微镜（Hitachi HT7700）观察R-rNC的形貌，如图2所示，纳米胶囊形态圆整，大小均一，且与其流体动力学粒径相近。
采用圆二色谱仪（Jasco J-810）测定R-rNC和RNase A的圆二色谱，如图3所示，定性图相一致，表明在制备蛋白胶的过程中RNase A的蛋白二级结构得以完整保留，未受到破坏。
为了验证R-rNC的还原响应性，将R-rNC与不同浓度的GSH（10 μM、1 mM、10 mM）于37℃下孵育2 h，测其粒径大小。如图4所示，R-rNC在GSH浓度高于1 mM（肿瘤细胞内平均GSH水平）时粒径减小，但在10 μM GSH（肿瘤细胞外液的GSH水平）时保持稳定。而R- nNC在同样条件下粒径稳定，基本无变化。
2. 载药纳米复合载体R-rNC/aNG的制备及表征
称取178 mg AOT和344 mg Brij 30溶于5 mL正己烷。将AAm、APMAAm、AAm-N3和GDA溶于0.5 mL R-rNC的PBS溶液（AAm:APMAAm:AAm-N3:GDA=10:3:0.33:5），再加入30 μL APS，混匀后滴加入上述正己烷混合液中，然后加入20 μL TEMED引发聚合。2 h后，旋蒸除去正己烷。无水乙醇离心（15455 × g）洗涤，真空干燥后，即得包载R-rNC的酸响应纳米复合载体核心，将该纳米复合载体核心与HA-DBCO（5:1, mg:mg）在温和的水相条件下迅速化学偶联形成具有透明质酸外壳的具有壳核结构的完整的纳米复合载体R-rNC/aNG。用不可降解的交联剂N, N’-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）代替GDA制备而得的不可降解的纳米复合载体（R-rNC/nNG）作为对照组。
采用马尔文粒径仪测定R-rNC/aNG的流体动力学粒径分布。采用透射电子显微镜观察R-rNC/aNG的形貌。如图5所示，从流体动力学粒径分布图可以看出，R-rNC/aNG的粒径大小在~100 nm，纳米粒形态均一，圆整，流体动力学粒径分布图与电镜图相一致。
采用多功能酶标仪（Tecan Infinite M1000 Pro）测定在不同时间间隔下不同pH（pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+HAase）下罗丹明标记的核糖核酸酶A纳米胶囊（Rho-R-rNC）从纳米复合载体Rho-R-rNC/aNG中的释放动力学曲线。在特定的时间间隔，取样离心（30 KMWCO，Millipore），并补足相应pH的新鲜缓冲液，对滤液进行荧光强度的测定（激发波长552nm，发射波长585 nm）。如图6所示，释放动力学曲线表明：在pH 6.5时，48小时内释放出约60%的Rho-R-rNC，远高于在pH 7.4时释放的33%，而透明质酸酶（HAase）的加入由于对R-rNC/aNG的透明质酸外壳具有降解作用，更加促进了在pH 6.5条件下的释放。
3. 罗丹明标记的不同制剂在肿瘤组织的渗透及胞内转运情况
采用共聚焦激光扫描显微镜观察Rho-R-rNC在MDA-MB-231多细胞3D瘤球的渗透情况。在96孔细胞培养板中事先加入100 μL用DMEM培养基配制并事先预热的无菌琼脂糖（2%,w:v）溶液，冷却后每孔加入5 × 103个MDA-MB-231细胞，振摇5 min，培养14天后，选择直径超过200 μm的3D瘤球，将培养好的肿瘤细胞球小心取出，加入到24孔细胞培养板中，分别与不同罗丹明标记的制剂Rho-R-rNC、Rho-R-rNC/aNG和Rho-R-rNC/nNG共孵育8h，PBS洗三次，在共聚焦显微镜（Zeiss LSM700）下，从瘤球边缘起，扫描至中部，扫描间隔为10 μm。如图7所示，瘤球荧光强度和面积表明：扫描深度为30 μm时，观察到Rho-R-rNC整个瘤球截面分布着很强的红色荧光，渗透率约为30%。Rho-R-rNC/aNG呈现出相似的渗透效果，可能是因为aNG在肿瘤球的酸性环境下响应降解释放出Rho-R-rNC，Rho-R-rNC继续渗透至瘤球深层。与之相反，在相同扫描深度下，非降解的Rho-R-rNC/nNG则只在瘤球边缘分布着红色荧光信号，呈现较差的肿瘤渗透性。
考察在不同pH下从Rho-R-rNC/aNG中释放出来的Rho-R-rNC被MDA-MB-231细胞随时间变化的内吞效率。将Rho-R-rNC/aNG在不同pH（pH 7.4、pH 6.5）下孵育6 h后，收集释放出的Rho-R-rNC，与MDA-MB-231细胞共孵不同时间（1 h、3 h、6 h）后测定细胞的荧光强度，考察制剂的内吞效率。如图8所示，释放出来的Rho-R-rNC可以被MDA-MB-231细胞有效的摄取，且呈时间依赖性。在pH 6.5下释放出来的Rho-R-rNC的内吞效率显著高于在pH 7.4下释放出来的Rho-R-rNC的内吞效率，表明R-rNC/aNG在肿瘤组织的酸响应降解可以有效促进R-rNC的释放。
采用共聚焦激光扫描显微镜观察MDA-MB-231细胞对Rho-R-rNC的胞内转运情况。将胰蛋白酶消化下来的MDA-MB-231细胞接种在共聚焦皿中，37℃下培养过夜。 然后，将细胞与Rho-R-rNC（0.4 μM）在37℃下共孵育一定时间，用PBS洗涤细胞三次，然后与溶酶体探针LysoTracker（50 nM）孵育1 h，再与Hoechst 33342（1 μg/ mL）孵育10 min。 PBS洗涤3次后，用共聚焦激光扫描显微镜观察胞内转运情况。如图9所示，从图中可以看出，1小时后，红色荧光标记的Rho-R-rNC被MDA-MB-231细胞内吞至溶酶体（绿色荧光），Rho-R-rNC与溶酶体共定位呈现黄色荧光。随着孵育时间延长到3 h，在MDA-MB-231细胞中观察到Rho-R-rNC和LysoTracker荧光信号大部分分离，发生了Rho-R-rNC的溶酶体逃逸，这证实了大部分内吞的R-rNC是能够从溶酶体小室逃逸到细胞质，从而进一步在还原性GSH介导的降解作用下释放RNase A。
4. 使用MTT测定法评估RNase A、R-rNC、R-nNC对MDA-MB-231的细胞毒性
将MDA-MB-231细胞（5×103个/孔）接种在96孔板中24 h，随后与不同浓度的RNaseA、R-nNC、R-rNC共孵育48 h。 然后，将细胞与MTT溶液（0.5 mg/mL）共孵育4小时。用DMSO溶解细胞后，使用酶标仪在570 nm的波长处测定吸光度。 细胞活力计算为处理后制剂的吸光度与不经处理的吸光度之比。如图10所示，细胞活力曲线表明：即使在较高浓度下，RNase A和R-nNC均对MDA-MB-231细胞几乎无杀伤作用，而R-rNC在浓度为40 nM时，就足以杀死超过80%的MDA-MB-231细胞，其IC50值约为16.4 nM。证明了RNase A难以被肿瘤细胞摄取，非降解性的R-nNC在胞内高浓度GSH条件下，难以降解释放出细胞毒的RNase A，而R-rNC不仅易被肿瘤细胞摄取，并且能在胞内高浓度的GSH作用下降解释放出RNase A，发挥有效的肿瘤细胞杀伤作用。
5. 考察R-rNC/aNG的体内靶向性
将制备好的R-rNC/aNG溶于碳酸盐缓冲液（pH 8.5），4℃搅拌下加入近红外荧光染Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺活性酯（Cy5.5-NHS, 1:1, mol:mol），继续在4℃下反应8 h后在PBS中透析24 h除掉过量的Cy5.5-NHS，得到Cy5.5标记的R-rNC/aNG（Cy5.5-aNG）。同样方法用Cy5.5对R-rNC标记得Cy5.5-R-rNC。对荷瘤小鼠尾静脉注射Cy5.5标记的制剂（Cy5.5-aNG、Cy5.5-R-rNC、HA+Cy5.5-aNG）24 h后，处死小鼠并剥离出主要脏器（心、肝、脾、肺、肾及肿瘤组织），进行近红外成像，并用活体成像软件对感兴趣区域（ROI）进行分析及定量在不同脏器分布的Cy5.5的平均荧光强度。如图11所示，由于Cy5.5-aNG能够有效靶向肿瘤组织，Cy5.5-aNG在肿瘤组织的平均荧光强度分别是Cy5.5-R-rNC和HA+Cy5.5-aNG的约17.8倍和2.6倍。说明Cy5.5-aNG具有肿瘤靶向性，HA对其具有竞争性抑制作用（HA可竞争性结合肿瘤细胞表面的特异性CD44受体），而Cy5.5-R-rNC由于粒径过小，易被肾脏快速清除难以靶向到肿瘤部位。
6. 考察R-rNC/aNG的体内肿瘤渗透性。
对荷瘤小鼠尾静脉注射罗丹明标记的制剂（Rho-R-rNC/aNG和Rho-R-rNC/nNG）24h后，处死小鼠，剥离出肿瘤组织，对肿瘤组织进行切片，并对肿瘤组织血管进行CD31免疫荧光染色，PBS洗三次后与Hoechst 33342（10 μg/mL）孵育10 min。PBS洗三次后，将切片置于激光共聚焦显微镜下观察Rho-R-rNC在小鼠肿瘤组织血管的渗透情况。如图12所示，可以看到血管（绿色荧光）远端的肿瘤组织分布了大量的Rho-R-rNC，对照组则分布极少，表明Rho-R-rNC/aNG能够响应肿瘤微环境低pH，释放小粒径的Rho-R-rNC，后者能够有效的渗透进入肿瘤组织。
7. 考察R-rNC/aNG的体内抗瘤活性。
将肿瘤细胞悬液以1×107个/只的密度接种在雌性裸鼠（BALB/c-nu，18-22g）的背部，约两至三周左右成瘤。将裸鼠分为2组，分别尾静脉注射生理盐水（saline）和R-rNC/aNG，隔天给药一次，共给药6次。在第22天处死裸鼠，剥离出肿瘤组织，进行石蜡包埋切片，进行H＆E染色，考察R-rNC/aNG对肿瘤细胞杀伤情况。如图13所示，生理盐水组肿瘤组织切片分布着大量且密集的肿瘤细胞，细胞核形态完整；而R-rNC/aNG的肿瘤组织切片显示大量肿瘤细胞核减少，细胞间质大大增加，且不呈现病理学形态，表明大量肿瘤细胞的死亡。

Claims (1)

1.荷载核糖核酸酶A的纳米复合载体递药系统，其特征在于：包括核糖核酸酶A、包载核糖核酸酶A的二级载体单分子蛋白胶囊和包载二级载体的一级载体纳米凝胶；
该递药系统采用以下步骤制备得到：
步骤1，取1 mg 核糖核酸酶A溶于1 mL碳酸盐缓冲液，4℃搅拌下依次加入丙烯酰胺、N-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺、N ,N’-双（丙烯酰）胱胺、过硫酸铵和四甲基乙二胺，4℃搅拌1h，超滤离心洗涤四次，PBS置换原缓冲液，得到粒径为8nm的二级载体单分子蛋白胶囊R-rNC；
步骤2，取178 mg 多库酯钠盐和344 mg聚氧乙烯月桂醚Brij 30溶于5 mL正己烷，然后将丙烯酰胺、N-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺、N-2-叠氮乙基丙烯酰胺、二甲基丙烯酸甘油酯溶于0.5 mL R-rNC的PBS溶液，丙烯酰胺、N-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺、N-2-叠氮乙基丙烯酰胺、二甲基丙烯酸甘油酯的用量比为10:3:0.33:5，再加入30 μL 过硫酸铵，混匀后滴加入上述正己烷混合液中，再加入20 μL 四甲基乙二胺引发聚合，2 h后旋蒸除去正己烷，无水乙醇离心洗涤，真空干燥后即得包载R-rNC的酸响应纳米复合载体核心，将该纳米复合载体核心与透明质酸衍生物HA-DBCO按质量比5:1在温和的水相条件下化学偶联，即可得到粒径在100nm的纳米复合载体递药系统。
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