CN113975244B - 一种仿生磁靶向阳离子脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种仿生磁靶向阳离子脂质体及其制备方法和应用。所述仿生磁靶向阳离子脂质体包括阳离子脂质体和细胞膜，且所述仿生磁靶向阳离子脂质体为所述细胞膜包覆在所述阳离子脂质体的表面的核壳结构；其中所述阳离子脂质体包括磁性纳米粒和阳离子高分子化合物，所述磁性纳米粒负载在所述阳离子高分子化合物上。本发明的仿生磁靶向阳离子脂质体，具有肿瘤‑磁双靶向性，可以在外部磁场及细胞膜的同源靶向或肿瘤趋向性作用下，精准靶向肿瘤部位，可用于体内示踪和肿瘤靶向治疗。

Description

一种仿生磁靶向阳离子脂质体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物制剂技术领域，具体涉及一种具有肿瘤-磁双靶向性的仿生磁靶向阳离子脂质体及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤一直是危害全世界人类生命健康的首要疾病之一，且术后复发率及转移率高，许多肿瘤患者预后差，生存质量低，严重危害肿瘤患者的身心健康[Bray F,et al.CACancer JClin,2018.68(6):394-424]。现有的治疗手段难以根治，且绝大多数药物毒副作用大，药物难以在肿瘤部位达到蓄积浓度[Zugazagoitia J,et al.Clin Ther,2016.38(7):1551-1566]。因此，亟需开发新的治疗手段，提高肿瘤治疗药物的靶向性和敏感性，改善患者的生存及预后。
本发明提供一种仿生磁靶向阳离子脂质体，具有肿瘤-磁双靶向性，可用于药物靶向递送及肿瘤靶向治疗。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提供了一种仿生磁靶向阳离子脂质体，具有肿瘤-磁双靶向性，可以在外部磁场及细胞膜的同源靶向或肿瘤趋向性作用下，精准靶向肿瘤部位，可用于体内示踪和肿瘤靶向治疗。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
本发明提供了一种仿生磁靶向阳离子脂质体，所述仿生磁靶向阳离子脂质体包括阳离子脂质体和细胞膜，且所述仿生磁靶向阳离子脂质体为所述细胞膜包覆在所述阳离子脂质体的表面的核壳结构；其中所述阳离子脂质体包括磁性纳米粒和阳离子高分子化合物，所述磁性纳米粒负载在所述阳离子高分子化合物上。
可选地，在一些实施例中，所述磁性纳米粒的材料选自二氧化锰、磁性氧化铁、铁、钴、镍中的一种或多种组合。
可选地，在一些实施例中，所述磁性纳米粒为油酸修饰的磁性纳米粒。优选地，所述磁性纳米粒可以为油酸修饰的超顺磁性Fe3O4纳米粒(OA@Fe3O4)。
可选地，在一些实施例中，所述阳离子脂质体和所述细胞膜的质量比为10～1：1；更优比例为5～1：1；最优比例为2：1。
可选地，在一些实施例中，所述阳离子高分子化合物选自阳离子有机胺、阳离子杂环化合物、阳离子多肽、脂肽、阳离子脂质、聚乙烯亚胺中的一种或多种。具有阳离子基团的高分子化合物。
可选地，在一些实施例中，优选地，所述磁性纳米粒的粒径为5～50nm。
可选地，在一些实施例中，所述仿生磁靶向阳离子脂质体的粒径在50～300nm之间。
可选地，在一些实施例中，所述仿生磁靶向阳离子脂质体的Zeta电位在-5～-40mV之间；与细胞膜电位相当。
可选地，在一些实施例中，所述阳离子脂质体的制备原料包括磁性纳米粒、阳离子高分子化合物；以及所述阳离子脂质体的制备原料还可以包括甾醇、磷脂和PEG脂质中的至少一种。例如，所述阳离子脂质体的制备原料包括阳离子高分子化合物、甾醇、磷脂、PEG脂质，或包括阳离子高分子化合物、甾醇、磷脂，或阳离子高分子化合物、甾醇、PEG脂质，或阳离子高分子化合物、磷脂、PEG脂质，或阳离子高分子化合物、甾醇，或阳离子高分子化合物、磷脂，或阳离子高分子化合物、PEG脂质，或阳离子高分子化合物。
可选地，在一些实施例中，磁性纳米粒：阳离子高分子化合物：甾醇：磷脂：PEG脂质的摩尔比为10～40：20～80：20～60：5～15：0.5～3。更优比例为20～30：40～60：30～40：7.5～12.5：1～2。最优比例为25：50：38.5：10：1.5。
可选地，在一些实施例中，所述甾醇选自动物甾醇、植物甾醇和菌类甾醇中的一种或多种。例如，胆固醇、岩藻甾醇、麦角固醇、谷甾醇等。
可选地，在一些实施例中，所述磷脂为两亲性磷脂。
可选地，在一些实施例中，所述磷脂选自二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)、1,2-二硬脂酸-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二月桂酰基卵磷脂(DLPC)、高纯氢化卵磷脂(HSPC)、二癸酰基卵磷脂(DDPC)、二肉豆蔻酰基卵磷脂(DMPC)、二硬脂酰基卵磷脂(DSPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二芥酰基卵磷脂(DEPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基卵磷脂(MPPC)、1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基卵磷脂(MSPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基卵磷脂(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂(PSPC)、1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基卵磷脂(SMPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基卵磷脂(SPPC)、1-肉豆蔻酰基-2-油酰基卵磷脂(MOPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)、1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂(SOPC)中的一种或多种。
可选地，在一些实施例中，所述PEG脂质为聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。例如，PEG-DSPE、PEG-DMG、P-428化合物、PEG2000-C-DMG、PEG-DOPE等。
可选地，在一些实施例中，所述细胞膜具有肿瘤趋向性或靶向性。优选地，所述细胞膜选自实体瘤的细胞膜、血液瘤的细胞膜。
可选地，在一些实施例中，所述仿生磁靶向阳离子脂质体具有肿瘤-磁双靶向性，在外部磁场及细胞膜的同源靶向或肿瘤趋向性作用下，精准靶向肿瘤部位，可用于体内示踪和肿瘤靶向治疗。
本发明还提供一种仿生磁靶向阳离子脂质体的制备方法，包括如下步骤：
将磁性纳米粒、阳离子高分子化合物、甾醇、磷脂、PEG脂质与有机溶剂混合，混合均匀后除去所述有机溶剂，得到预混合物；其中所述磁性纳米粒、阳离子高分子化合物、甾醇、磷脂、PEG脂质的摩尔比为10～40：20～80：20～60：5～15：0.5～3；
向所述预混合物中加入纯水或缓冲液进行水化，后进行乳化处理，纯化，得到阳离子脂质体；
将所述阳离子脂质体和细胞膜按10～1：1的质量比混合，分别过200nm、100nm的聚碳酸酯膜，得到仿生磁靶向阳离子脂质体。
可选地，在一些实施例中，所述细胞膜的制备方法选自反复冻融法、超声破碎法、细胞膜蛋白提取法、微型挤出器挤出法和梯度离心法中的一种或多种。
可选地，在一些实施例中，所述纯化的过程包括：通过100k MWCO的超滤管1000～8000rpm离心超滤5～30min，或5000D的透析带于纯水中透析24h以上进一步纯化，得纯化的阳离子脂质体。
本发明还提供一种上述的仿生磁靶向阳离子脂质体在药物输送载体中的应用。可用于治疗各类实体瘤和血液瘤，包括但不限于前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胆管癌、口腔癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胃肠癌、肾癌、喉癌、甲状腺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、骨肉瘤、骨髓瘤等。
本发明还提供一种药物组合物，包含上述的仿生磁靶向阳离子脂质体，以及负载于所述仿生磁靶向阳离子脂质体上的药物。
可选地，在一些实施例中，所述药物组合物的包封率为50～95％；所述药物组合物的载药量为10～50％。
可选地，在一些实施例中，所述药物选自基因药物、小分子药物及脂类药物中的一种或多种。
可选地，在一些实施例中，所述基因药物选自质粒、DNA、mRNA、lincRNA、siRNA、miRNA、shRNA、sgRNA、piRNA、hnRNA和snRNA中的一种或多种。
可选地，在一些实施例中，所述小分子药物包括小分子放化疗药物；所述小分子药物的分子量小于1000。
本发明的有益效果在于：
1)本发明所构建的仿生磁靶向阳离子脂质体具有肿瘤-磁双靶向性，可在外部磁场力和细胞膜对肿瘤的主动趋向性作用下，精准地将药物递送至肿瘤部位，可为肿瘤的预防、治疗及诊断提供有效的手段。
2)本发明所构建的仿生磁靶向阳离子脂质体所包载的磁响应物质可选自含铁、钴、镍、锰等第VIII族元素具有磁性的单质或化合物，具有高度的选择性和响应性。
3)本发明所构建的仿生磁靶向阳离子脂质体其内核的脂质体主要采用阳离子高分子化合物，还可以与甾醇、磷脂、PEG脂质按比例混合制成，可根据要包载的药物调整配方，具有高度的可适性。
4)本发明所构建的仿生磁靶向阳离子脂质体其外核选用的细胞膜可按需选择，如同源的肿瘤细胞膜具有同源肿瘤靶向性；免疫细胞来源的细胞膜具有肿瘤-炎症趋向性，可靶向肿瘤免疫微环境；红细胞、血小板等血细胞可增加仿生磁靶向阳离子脂质体的长循环作用，延长仿生磁靶向阳离子脂质体在体内作用时间，增加仿生磁靶向阳离子脂质体在肿瘤部位的蓄积；干细胞来源的细胞膜如间充质干细胞膜，肿瘤干细胞膜具有肿瘤-炎症归巢作用，可在归巢作用下将仿生磁靶向阳离子脂质体输送至肿瘤部位。
5)本发明所构建的仿生磁靶向阳离子脂质体具有良好的安全性和稳定性。
6)本发明所构建的仿生磁靶向阳离子脂质体可用于包载多种药物，包括基因药物、脂类药物和小分子药物等。
7)本发明所构建的仿生磁靶向阳离子脂质体及其药物组合物，其应用于各类血液瘤和实体瘤的预防、治疗及诊断，包括但不限于前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胆管癌、口腔癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胃肠癌、肾癌、喉癌、甲状腺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、骨肉瘤、骨髓瘤等。
8)本发明所构建的仿生磁靶向阳离子脂质体制备工艺简单，重现性较好。
本发明的仿生磁靶向阳离子脂质体具有以上优点，表明其具有广阔的临床应用价值和前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例4中的仿生磁靶向阳离子脂质体的粒径电位结果。
图2是本发明实施例5中的超顺磁纳米粒、阳离子脂质体ML和仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML的透射电镜图。
图3是本发明实施例6中的仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML的包封率与载药量结果。
图4是本发明实施例7中的仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML的稳定性考察结果。
图5是本发明实施例8中的仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML体外细胞转染考察结果。
图6是本发明实施例9中的仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML转染毒性考察结果。
图7是本发明实施例10中的仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML激光共聚焦显微镜细胞内共定位结果。
图8是本发明实施例11中的仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML在BALB/c裸小鼠体内成像结果及各脏器荧光分布结果；
图9是本发明对比例1中的MMZr的分散性考察结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本发明的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。本发明的各种实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
磁靶向制剂是常见的一种物理-化学靶向制剂，通常利用含铁、钴、镍、锰等第VIII族元素具有磁性的单质或化合物作为磁响应物质制备成磁靶向制剂，其可响应外部磁场作用力，将制剂输送至靶向部位。磁靶向制剂靶向效率高，对身体伤害小[Zhou Z,et al.ACSNano,2020.14(1):7-11]。而进一步将磁靶向制剂制备成超顺磁纳米粒，可进一步提高纳米粒在靶向部位的蓄积，且安全性与普通纳米粒相当，不会增加毒性[Xiao Y,et al.J MaterChem B,2020.8(3):354-367]。
脂质体或脂质纳米颗粒是常用的药物递送载体，载药量高，稳定性好，可用于递送多种药物，包括脂类药物、小分子疏水性药物、基因药物等[Ickenstein LM,et al.ExpertOpin Drug Deliv,2019.16(11):1205-1226]。此外，脂质体还是经典的mRNA载体，尤其是新冠疫情爆发后，Pfizer-BioNTech和Moderna分别开发的两款mRNA新冠疫苗(BNT162b2和mRNA-1273)在疫情的预防和控制中发挥了重要作用，这两款疫苗均采用脂质体作为药物载体，足以说明脂质体作为基因药物尤其是mRNA等长链核酸药物的载体的优越性和可行性[Khurana A,et al.Nano Today,2021.38:101142]。
细胞膜涂覆技术是近年来新兴的一种仿生技术，其利用提取的细胞膜包覆在纳米粒表面，形成经典的核壳型纳米粒子，可根据不同类型细胞赋予纳米粒不同的功能[ZhaiY,et al.Theranostics,2017.7(10):2575-2592]。如癌细胞膜可赋予纳米粒靶向同源肿瘤的能力[Zhu J,et al.Nano Lett,2016.16(9):5895-5901；Kroll AV,et al.Adv Mater,2017.29(47):e1703969；Yang R,et al.ACS Nano,2018.12(6):5121-5129]，红细胞膜和血小板膜可赋予纳米粒长循环作用且可避免纳米粒被肝脏巨噬细胞吞噬系统吞噬降解[HuQ,et al.Adv Mater,2016.28(43):9573-9580；Dehaini D,et al.Adv Mater,2017.29(16):e1606209；Liu W,et al.Small,2018.14(38):e181754]，免疫细胞膜可赋予纳米粒免疫激活作用和肿瘤-炎症趋向效应[Krishnamurthy S,et al.Nanoscale,2016.8(13):6981-6985；Yu G,et al.Adv Funct Mater,2018.28(37):1801389；Zhou X,et al.Small,2019.15(17):e1900558]，间充质干细胞膜可赋予纳米粒肿瘤-炎症归巢效应[Furman NET,et al.Nano Lett,2013.13(7):3248-3255；Gao C,et al.Small,2016.12(30):4056-4062；Chen J,et al.Theranostics,2020.10(4):1619-1632]等。此外，细胞膜包覆的仿生纳米粒生物相容性良好，可减轻纳米粒的毒副作用，制备相对简单，具有良好的安全性和应用前景[Fang RH,et al.Adv Mater,2018.30(23):e1706759]。
本发明实施例提供一种仿生磁靶向阳离子脂质体及其制备方法和应用。以下分别进行详细说明。
本发明实施例提供了一种仿生磁靶向阳离子脂质体，且仿生磁靶向阳离子脂质体为核壳结构，具有内核和外壳，其中内核为阳离子脂质体，外壳为细胞膜，也就是说，所述细胞膜包覆在所述阳离子脂质体的表面形成核壳结构。具体地，所述阳离子脂质体由负载磁性纳米粒的阳离子高分子化合物构成。
由于所述细胞膜具有肿瘤趋向性或靶向性，所述仿生磁靶向阳离子脂质体包含细胞膜及磁性纳米粒，使得其具有肿瘤-磁双靶向性，可用于药物递送及肿瘤治疗。
在一些实施例中，所述磁性纳米粒的材料选自二氧化锰、磁性氧化铁、铁、钴、镍中的一种或多种组合。此外所述磁性纳米粒也可用其他具有磁性纳米粒替代。进一步地，所述磁性纳米粒为油酸修饰的磁性纳米粒。例如，所述磁性纳米粒可以为油酸修饰的超顺磁性Fe3O4纳米粒(OA@Fe3O4)。
进一步地，所述磁性纳米粒的粒径为5～50nm。例如，所述磁性纳米粒的粒径可以为5nm、8nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm或50nm。
在一些实施例中，所述阳离子脂质体和所述细胞膜的质量比可以为10～1：1；例如，所述阳离子脂质体和所述细胞膜的质量比可以为10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。优选地，在本发明的仿生磁靶向阳离子脂质体中，所述阳离子脂质体和所述细胞膜的质量比可以为5～1：1；更优选地，所述阳离子脂质体和所述细胞膜的质量比可以为2：1。
在一些实施例中，所述阳离子脂质体的制备原料主要包括磁性纳米粒和阳离子高分子化合物；在另一些实施例中，所述阳离子脂质体的制备原料在磁性纳米粒和阳离子高分子化合物的基础上，还可以包括甾醇、磷脂和PEG脂质中的一种或多种。所述磁性纳米粒、阳离子高分子化合物、甾醇、磷脂及PEG脂质的摩尔比为10～40：20～80：20～60：5～15：0.5～3。也就是说，磁性纳米粒：阳离子高分子化合物：甾醇：磷脂：PEG脂质的具体摩尔比为10～40：20～80：20～60：5～15：0.5～3。更进一步地，所述磁性纳米粒与所述阳离子高分子化合物的摩尔比为10～40：20～80；所述磁性纳米粒、所述阳离子高分子化合物、所述甾醇的摩尔比为10～40：20～80：20～60；所述磁性纳米粒、阳离子高分子化合物、磷脂的摩尔比为10～40：20～80：5～15；所述磁性纳米粒、阳离子高分子化合物、PEG脂质的摩尔比为10～40：20～80：0.5～3；等等，以此类推，可以获得采用不同原料时的原料之间的摩尔比。优选地，所述磁性纳米粒、阳离子高分子化合物、甾醇、磷脂及PEG脂质的摩尔比可以为20～30：40～60：30～40：7.5～12.5：1～2。更优选地，所述磁性纳米粒、所述阳离子高分子化合物、所述甾醇、所述磷脂及所述PEG脂质的摩尔比可以为25：50：38.5：10：1.5。可选地，所述磁性纳米粒优选为油酸修饰的超顺磁性Fe3O4纳米粒(OA@Fe3O4)，上述摩尔比依旧适用。显然，所述仿生磁靶向阳离子脂质体的内核(即阳离子脂质体)包载有磁性物质，使得其可以在外部磁场的作用下精准靶向递送，进而有效用于药物递送及肿瘤治疗。
在一优选实施例中，所述阳离子脂质体的制备原料为油酸修饰的超顺磁性Fe3O4纳米粒(OA@Fe3O4)、阳离子高分子化合物、甾醇、磷脂及PEG脂质。所述OA@Fe3O4：阳离子高分子化合物：甾醇：磷脂：PEG脂质的具体摩尔比为10～40：20～80：20～60：5～15：0.5～3；更优比例为20～30：40～60：30～40：7.5～12.5：1～2；最优比例为25：50：38.5：10：1.5。
进一步地，所述阳离子高分子化合物为具有阳离子基团的高分子化合物，选自但不限于阳离子有机胺、阳离子杂环化合物、阳离子多肽、脂肽、阳离子脂质、聚乙烯亚胺中的一种或多种。
进一步地，所述甾醇选自动物甾醇、植物甾醇和菌类甾醇中的一种或多种；例如，胆固醇、岩藻甾醇、麦角固醇、谷甾醇等。
进一步地，所述磷脂为两亲性磷脂；进一步地，磷脂选自但不限于二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)、1,2-二硬脂酸-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二月桂酰基卵磷脂(DLPC)、高纯氢化卵磷脂(HSPC)、二癸酰基卵磷脂(DDPC)、二肉豆蔻酰基卵磷脂(DMPC)、二硬脂酰基卵磷脂(DSPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二芥酰基卵磷脂(DEPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基卵磷脂(MPPC)、1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基卵磷脂(MSPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基卵磷脂(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂(PSPC)、1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基卵磷脂(SMPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基卵磷脂(SPPC)、1-肉豆蔻酰基-2-油酰基卵磷脂(MOPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)、1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂(SOPC)中的一种或多种。
进一步地，所述PEG脂质为聚乙二醇(PEG)修饰的脂质；例如，PEG-DSPE、PEG-DMG、P-428化合物、PEG2000-C-DMG、PEG-DOPE等。
本发明的所述细胞膜具有肿瘤趋向性或靶向性。进一步地，所述细胞膜选自但不限于实体瘤的细胞膜、血液瘤的细胞膜。例如，所述细胞膜选自但不限于前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胆管癌、口腔癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胃肠癌、肾癌、喉癌、甲状腺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、骨肉瘤、骨髓瘤等，同时也包括间充质干细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、血小板、红细胞、白细胞、髓源抑制细胞、肿瘤干细胞、CAR-T细胞、TCR细胞、NK细胞、CAR-NK细胞、树突状细胞等来源的细胞膜。例如，所述仿生磁靶向阳离子脂质体中的细胞膜采用前列腺癌的细胞，则所述仿生磁靶向阳离子脂质体可以靶向前列腺癌的细胞，利用其同源靶向或肿瘤趋向性作用而实现。
本发明的所述仿生磁靶向阳离子脂质体的粒径在50～300nm之间。例如，所述仿生磁靶向阳离子脂质体的粒径可以为50nm、60nm、80nm、100nm、150nm、200nm、250nm、280nm或300nm。
本发明的所述仿生磁靶向阳离子脂质体的Zeta电位与细胞膜电位相当。进一步地，所述仿生磁靶向阳离子脂质体的Zeta电位在-5至-40mV之间。又例如，所述仿生磁靶向阳离子脂质体的Zeta电位可以为-5mV、-10mV、-15mV、-20mV、-25mV、-30mV、-35mV或-40mV。
本发明的所述仿生磁靶向阳离子脂质体在30天内于冷藏条件(4℃)下稳定性良好，可见其具有良好的稳定性，储存条件易实现。
本发明的所述仿生磁靶向阳离子脂质体具有肿瘤-磁双靶向性，在外部磁场及细胞膜的同源靶向或肿瘤趋向性作用下，精准靶向肿瘤部位，可以用于体内示踪和肿瘤靶向治疗。
本发明还提供一种仿生磁靶向阳离子脂质体的制备方法，包括如下步骤：
将磁性纳米粒、阳离子高分子化合物、甾醇、磷脂、PEG脂质与有机溶剂混合，混合均匀后除去所述有机溶剂，得到预混合物；其中所述磁性纳米粒、阳离子高分子化合物、甾醇、磷脂、PEG脂质的摩尔比为10～40：20～80：20～60：5～15：0.5～3；
向所述预混合物中加入纯水或磷酸盐缓冲液进行水化，后进行乳化处理，纯化，得到阳离子脂质体；
将所述阳离子脂质体和细胞膜按10～1：1的质量比混合，分别过200nm、100nm的聚碳酸酯膜，得到仿生磁靶向阳离子脂质体。
具体地，所述阳离子脂质体的具体制备方法可以为：将磁性纳米粒、阳离子高分子化合物、甾醇、磷脂、PEG脂质按比例加入至一定体积的无水乙醇或适合的有机溶剂中，室温条件下搅拌4h以上，利用氮吹仪或旋转蒸发仪挥干有机溶剂；加入一定体积的纯水或磷酸盐缓冲液水化，利用超声细胞破碎仪以100～400W的功率超声乳化0.1～3min，得到阳离子脂质体的。
具体地，将前述制备好的阳离子脂质体内核和提取好的细胞膜按10～1：1的质量比混合，利用微型挤出器分别过200nm、100nm的聚碳酸酯膜来回20次以上，得到仿生磁靶向阳离子脂质体。
更进一步地，所述纯化的过程可以为：通过100k MWCO的超滤管1000～8000rpm离心超滤5～30min，或5000D的透析带于纯水中透析24h以上进一步纯化，得到纯化后的阳离子脂质体。
在一些实施例中，所述细胞膜的制备方法选自但不限于反复冻融法、超声破碎法、细胞膜蛋白提取法、微型挤出器挤出法和梯度离心法中的一种或多种。进一步地，本发明提取好的细胞膜可以存储于-20℃以下的环境，备用。进一步地，所述细胞膜来源于实体瘤的细胞膜、血液瘤的细胞膜，具有肿瘤趋向性或靶向性。例如，所述细胞膜可以是前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胆管癌、口腔癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胃肠癌、肾癌、喉癌、甲状腺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、骨肉瘤、骨髓瘤等来源的细胞膜，同时也可以为是间充质干细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、血小板、红细胞、白细胞、髓源抑制细胞、肿瘤干细胞、CAR-T细胞、TCR细胞、NK细胞、CAR-NK细胞、树突状细胞等来源的细胞膜。
本发明的仿生磁靶向阳离子脂质体可作为脂质体溶液存储于磷酸盐缓冲液、纯水或适宜的溶液体系中，4℃冷藏保存。另外，所述仿生磁靶向阳离子脂质体也可通过冷冻干燥的方法制备成冻干粉于4℃冷藏保存或-20℃～-80℃冷冻保存或存储于液氮中。
本发明还提供一种上述的仿生磁靶向阳离子脂质体在药物输送载体中的应用。具体地，本发明的仿生磁靶向阳离子脂质体可用于治疗各类实体瘤和血液瘤，包括但不限于前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胆管癌、口腔癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胃肠癌、肾癌、喉癌、甲状腺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、骨肉瘤、骨髓瘤等的药物输送。
本发明还提供一种药物组合物，包含上述的仿生磁靶向阳离子脂质体，以及负载于所述仿生磁靶向阳离子脂质体上的药物。具体地，所述药物组合物的包封率为50～95％；例如，所述药物组合物的包封率可以为50％、60％、70％、80％、90％或95％。所述药物组合物的载药量为10～50％；例如，所述药物组合物的载药量为10％、20％、30％、40％或50％。
在一些实施例中，所述药物选自基因药物、小分子药物及脂类药物中的一种或多种。由于所述仿生磁靶向阳离子脂质体具有肿瘤-磁双靶向性，所述药物可以随着药物组合物在外部磁场及细胞膜的同源靶向或肿瘤趋向性作用下，精准靶向肿瘤部位，用于体内示踪和肿瘤靶向治疗。
进一步地，所述基因药物选自但不限于质粒、DNA、mRNA、lincRNA、siRNA、miRNA、shRNA、sgRNA、piRNA、hnRNA和snRNA中的一种或多种。所述小分子药物包括小分子放化疗药物；所述小分子药物的分子量<1000。脂类药物包括但不限于有成药可能性的各类脂质。
本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
实施例1
本实施例提供一种仿生磁靶向阳离子脂质体，所述仿生磁靶向阳离子脂质体的制备方法包括如下步骤：
取1mg的阳离子脂质材料Dlin-MC3-DMA、0.25mg的二硬脂酰基卵磷脂(DSPC)、0.46mg的胆固醇和0.13mg的DSPE-PEG2000，即摩尔比为50:10:38.5:1.5，同时取1mg粒径为10nm的OA@Fe3O4，共溶于1mL的无水乙醇中，室温避光搅拌8h，N2吹干有机溶剂，得脂质薄膜。取1mL PBS水化脂质薄膜，利用超声破碎机以400W功率冰浴超声30s，得具有磁靶向作用的阳离子脂质体内核，并利用5000D的透析袋于1L纯水中透析纯化24h，得纯化的阳离子脂质体。可以选择存储于4℃冰箱或冻干保存于-20～-80℃冰箱。
取107个PC-3人前列腺癌细胞，离心沉淀，去除上清。加入5mL 4℃预冷的pH 7.4的Tris缓冲液，利用微型挤出器来回挤出20次破碎细胞。破碎的细胞于2000rpm离心10min去除细胞内容物。取上清于10000rpm离心30min，得细胞膜沉淀。所得细胞膜沉淀用含0.25M的4℃预冷的pH 7.4的Tris缓冲液洗1遍，继续于10000rpm离心30min，得纯化的细胞膜沉淀，利用BCA法测定细胞膜膜蛋白含量，存储于-80℃冰箱备用。
取1mL上述所制备的阳离子脂质体(1mg/mL)与含0.5mg膜蛋白的PC-3细胞膜混合均匀，利用微型挤出器分别过200nm、100nm的聚碳酸酯膜，各来回20次，得仿生磁靶向阳离子脂质体，并利用5000D的透析袋于1L纯水中透析纯化24h，得纯化的仿生磁靶向阳离子脂质体。
实施例2
本实施例提供一种仿生磁靶向阳离子脂质体，所述仿生磁靶向阳离子脂质体的制备方法包括如下步骤：
取1.25mg乙二胺封端的聚乙烯亚胺(en-PEI,Mr＝～800)，0.25mg DSPC，0.46mg胆固醇，0.13mg DSPE-PEG2000，即摩尔比为50:10:38.5:1.5，同时取1mg粒径为10nm的MnO2，共溶于1mL的无水乙醇中，室温避光搅拌8h，旋转蒸发除去有机溶剂。取1mL PBS水化脂质薄膜，利用超声破碎机以400W功率冰浴超声30s，得具有磁靶向作用的阳离子脂质体内核，并利用5000D的透析袋于1L纯水中透析纯化24h，得纯化的阳离子脂质体。存储于4℃冰箱或冻干保存于-20～-80℃冰箱。
取107个4T1小鼠乳腺癌细胞，离心沉淀，去除上清。加入1mL PBS缓冲液，置于-80℃冰箱冷冻2h，而后取出于室温融解，反复5次后于1500g离心5min去除细胞内容物。取上清于10000g离心30min，得细胞膜沉淀，利用BCA法测定细胞膜的膜蛋白含量，存储于-80℃冰箱备用。
取1mL上述所制备的阳离子脂质体(1mg/mL)与含0.5mg膜蛋白的4T1细胞膜混合均匀，于超声清洗机中超声5min，得仿生磁靶向阳离子脂质体，并利用5000D的透析袋于1L纯水中透析纯化24h，得纯化的仿生磁靶向阳离子脂质体。
实施例3
本实施例提供一种仿生磁靶向阳离子脂质体，所述仿生磁靶向阳离子脂质体的制备方法包括如下步骤：
取10mg乙二胺封端的聚乙烯亚胺(en-PEI,Mr＝～800)，2.00mg DSPC，3.68mg胆固醇，即摩尔比为50:10:40，同时取1mg粒径为10nm的OA@Fe3O4纳米粒，共溶于1mL无水乙醇中，室温避光搅拌8h，N2吹干有机溶剂。取5mL PBS水化脂质薄膜，利用超声破碎机以400W功率冰浴超声30s，得具有磁靶向作用的阳离子脂质体内核。将制得的阳离子脂质体于3000rpm离心10min去除不溶物，取上清利用100kMWCO超滤管于3000rpm离心10min去除未包载上的药物和脂质材料，得纯化的阳离子脂质体ML。存储于4℃冰箱或冻干保存于-20～-80℃冰箱。
取108个C4-2B人前列腺癌细胞，离心沉淀，去除上清。利用微型挤出器来回挤出20次破碎细胞。破碎的细胞于2000g离心10min去除细胞内容物。取上清于12000g离心30min，得细胞膜沉淀，利用BCA法测定细胞膜的膜蛋白含量，存储于-80℃冰箱备用。
取5mL上述所制备的阳离子脂质体(1mg/mL)与含2.5mg膜蛋白的C4-2B细胞膜混合均匀，于超声清洗机中超声5min，得仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML。将制得的t-ML于3000rpm离心10min去除不溶物，取上清利用100kMWCO超滤管于3000rpm离心10min去除未包载上的药物和脂质材料，得纯化的仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML。
实施例4
取实施例3所制得的仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML，利用动态光散射仪考察其粒径电位分布，结果如图1所示。
根据图1可知，仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML的粒径为92.05±0.85nm，多分散系数(PDI)为0.242±0.013，表明粒径分布均匀且大小在100nm，利于肿瘤的滞留后增强效应即EPR效应。此外，仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML的Zeta电位为13.03±0.66mV，(n＝3，即平行测定了3次)，与细胞膜电位相当，且带负电可降低纳米粒的毒性。
实施例5
取实施例3中的OA@Fe3O4及所制得的阳离子脂质体ML和仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML，制备透射电镜样品，并于透射电镜下观察拍照，结果如图2所示。
根据图2可知：
OA@Fe3O4超顺磁纳米粒为规则的正方体、四面锥或类球形，粒径在10nm左右(标尺：20nm)。阳离子脂质体ML则为类球形，粒径在100nm左右(标尺：50nm)，可以看见其内散在多个10nm左右的小圆点，即OA@Fe3O4超顺磁纳米粒，表明ML很好地将OA@Fe3O4超顺磁纳米粒包覆住，且粒径形态较好。仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML则为不规则的球体，粒径在100nm左右，其内散在多个10nm左右的小圆点即OA@Fe3O4超顺磁纳米粒，放大图可见t-ML外层可见一层明显的膜结构(虚线：细胞膜，标尺：100nm)，表明t-ML可将OA@Fe3O4超顺磁纳米粒包覆于内核，同时外壳拥有一层仿生细胞膜，可赋予其肿瘤-磁双靶向性。
实施例6
本实施例提供一种仿生磁靶向阳离子脂质体，所述仿生磁靶向阳离子脂质体的制备方法包括如下步骤：
取10mg乙二胺封端的聚乙烯亚胺(en-PEI,Mr＝～800)，2.00mg DSPC，3.68mg胆固醇，即摩尔比为50:10:40，同时取1mg粒径为10nm的OA@Fe3O4纳米粒，5mg二高-γ-亚麻酸(DGLA)共溶于1mL无水乙醇中，室温避光搅拌8h，N2吹干有机溶剂。取5mL PBS水化脂质薄膜，利用超声破碎机以400W功率冰浴超声30s，得具有磁靶向作用的阳离子脂质体内核。将制得的阳离子脂质体于3000rpm离心10min去除不溶物，取上清利用100kMWCO超滤管于3000rpm离心10min去除未包载上的药物和脂质材料，得纯化的阳离子脂质体ML@DGLA。存储于4℃冰箱或冻干保存于-20～-80℃冰箱。
取5mL上述所制备的ML@DGLA(1mg/mL)与含2.5mg膜蛋白的C4-2B细胞膜混合均匀，于超声清洗机中超声5min，得仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML@DGLA。将制得的t-ML@DGLA于3000rpm离心10min去除不溶物，取上清利用100kMWCO超滤管于3000rpm离心10min去除未包载上的药物和脂质材料，得纯化的t-ML@DGLA。
取200μL上述制得的t-ML@DGLA，其中DGLA理论浓度为0.2mg/mL，用乙腈稀释至1mL，超声处理10min。利用0.45μm的尼龙滤头过滤样品，取续滤液进行HPLC分析。HPLC测定条件如下：流动相A(0.1％H3PO4):流动相B(乙腈)＝45:55，流速1.0mL/min，进样量50μL，波长＝254nm，运行时间＝25min，柱温＝30℃，样品盘温度＝30℃。外标法测定DGLA浓度，计算得t-ML@DGLA对DGLA的包封率和载药量，结果如图3所示。
根据图3可知，t-ML@DGLA对DGLA的包封率达87.14％±14.94％，载药量达22.73％±3.90％(n＝3)，具有较高的包封率和载药量。可见，本发明的仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML对脂类药物二高-γ-亚麻酸具有良好的包封率和载药量。
实施例7
取实施例3制得的仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML冻干粉1mg，分别溶解于1mL PBS缓冲液(磷酸盐缓冲盐溶液)和1mL纯水中，存储于4℃冰箱中。分别于第1天、3天、5天、7天、11天、17天、26天、42天利用动态光散射仪测定t-ML的粒径和多分散系数(PDI)，考察其稳定性，结果如图4所示，图4为1～42天内仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML分别在PBS缓冲液和水中粒径及PDI的稳定性考察(n＝3)。
根据图4可知，仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML在PBS和水溶液体系中均较稳定，42天内粒径无明显变化，维持在90-110nm之间，且PDI<0.3，表明粒径均一度良好。
实施例8
取实施例3制得的阳离子脂质体ML分别与0.5μg EGFP质粒按N/P比分别为10、20、30、40共孵育30min，之后与C4-2B细胞膜按质量比2:1的比例混合，于超声清洗机中超声5min，并利用100kMWCO超滤管离心纯化，制得包载有EGFP质粒的t-ML。同时，取经典的阳离子材料en-PEI和Lipo2000作为对照，以HEK-293T细胞为模型细胞，考察t-ML的基因转染效率。结果如图5所示。
图5以HEK-293T细胞为模型细胞，EGFP质粒为基因药物模型药，分别考察阳离子材料Lipo2000，en-PEI，ML，t-ML与EGFP质粒N/P比在10，20，30，40条件下与HEK-293T细胞共孵育48h后HEK-293T细胞绿色荧光蛋白转染表达效果(EGFP质粒：0.5μg，标尺：50μm)。
根据图5可知，t-ML，en-PEI以及Lipo2000分别与HEK-293T细胞共孵育48h后，在N/P比为40时，t-ML的转染效率明显高于Lipo2000和en-PEI，表明t-ML是一个良好的基因转染材料，可用于基因药物的包载和递送。
实施例9
取实施例3制得的阳离子脂质体ML和仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML，同时选取en-PEI和Lipo2000作为对照材料，分别用空白培养基稀释成0，9.375，18.75，37.5，75，150，300，600，1200μg/mL浓度梯度的溶液，与HEK-293T细胞共孵育48h，考察不同转染材料的毒性。结果如图6所示，图6以HEK-293T细胞为模型细胞，分别考察阳离子材料Lipo2000，en-PEI，ML，t-ML在0～1200μg/mL浓度范围内与HEK-293T细胞共孵育48h后CCK-8细胞毒性结果(n＝3,*P<0.05)。
根据图6可知，ML和t-ML的毒性明显小于传统的阳离子材料en-PEI和Lipo2000，更进一步地，t-ML的毒性小于ML，这是因为仿生细胞膜生物相容性高，安全性好。表明本发明构建的仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML具有良好的安全性。
实施例10
以尼罗红(Nile)为小分子药物或脂类药物的模型药，FAM标记的siRNA(siFAM)为基因药物的模型药，参照实施例6和实施例8的方法制备ML@Nile/siFAM和t-ML@Nile/siFAM。C4-2B细胞按105个/孔的浓度接种于铺有小圆片的24孔板中，孵育过夜。分别加入游离的Nile+siFAM，ML@Nile/siFAM和t-ML@Nile/siFAM(Nile：100ng，siFAM：500ng)，共孵育1.5h。去除培养基，PBS洗2～3遍，4％的多聚甲醛固定30min，取出小圆片，分别用10μL含DAPI染料的封片剂染色30min，晾干固定，于激光共聚焦显微镜镜下观察拍照。结果如图7所示。图7以尼罗红(Nile)红色荧光物质为小分子药物模型药，FAM绿色荧光标记的siRNA(siFAM)为基因药物模型药，分别与游离Nile+siFAM，ML@Nile/siFAM，t-ML@Nile/siFAM共孵育1.5h，DAPI蓝色荧光染细胞核，利用激光共聚焦显微镜拍摄细胞内共定位结果图(Nile：100ng，siFAM：500ng，标尺：18.1μm)。
根据图7可知，游离组siFAM几乎无荧光，Nile在胞内荧光弱，这主要是因为游离药物尤其是基因药物易被细胞内外的酶体系吞噬降解；ML@Nile/siFAM组在细胞核周即胞质内具有较强的绿色荧光和红色荧光，表明两药均被细胞摄取且主要定位在胞质中；t-ML@Nile/siFAM组胞质内的绿色荧光和红色荧光则进一步增强，并在融合图上可见强烈的橘色荧光，表明Nile和siFAM被大量摄取。细胞内共定位实验结果表明，t-ML用于包载基因药物和小分子药物或脂类药物可被细胞摄取并定位于胞质中，不易被溶酶体系统吞噬降解，可用于基因药物和小分子药物或脂类药物的递送。
实施例11
以DiR为模型药物，参照实施例6制备t-ML@DiR。取5～6周龄的BALB/c裸小鼠若干，C4-2B细胞以5×105个/只的浓度接种于小鼠右后肢皮下，一周左右成瘤。模型建立后，将DiR和t-ML@DiR分别以1mg/kg(DiR)的浓度尾静脉注射进入小鼠体内，并在t-ML@DiR小鼠肿瘤部位绑缚赋予0.3T磁场力的小圆磁铁，即t-ML@DiR+M组。分别于0，2，4，9，24h利用小动物活体成像仪观察拍照两组小鼠DiR的荧光分布，并于24h后处死所有小鼠，取其心、肝、脾、肺、肾、肿瘤，于小动物活体成像仪观察拍照，进一步考察各组织脏器内DiR的荧光分布。结果如图8所示。
图8以DiR深红色荧光染料为模型药，考察DiR和t-ML@DiR在0.3T外部磁场作用力下(t-ML@DiR+M)在0～24h在BALB/c裸小鼠体内荧光分布情况以及24h后小鼠心、肝、脾、肺、肾、肿瘤等各脏器内荧光分布情况(DiR：1mg/kg)。
根据图8可知，相较于游离DiR组，t-ML@DiR+M组小鼠在2h即在肿瘤部位有特定分布，且一直维持到24h无明显削弱倾向，且在其他脏器区域内无明显分布，荧光较弱；而游离DiR组在0-24h内在肿瘤部位未观察到明显分布，主要集中在肝、脾、肺及肾脏部位。离体脏器荧光分布实验进一步表明游离DiR主要分布在肝、脾、肺，而在肿瘤部位仅有微弱的荧光分布；而t-ML@DiR+M组在肿瘤部位有强烈的荧光分布，此外在肝脏部位有较多蓄积。因此，t-ML@DiR在外部磁场力及自身的肿瘤靶向作用下，可精准地靶向肿瘤部位，具有良好的靶向作用和长循环效应。
对比例1
参见发明文件[CN112957469A]所述的pH响应性磁性纳米核壳载药体系MMZr合成步骤如下：
步骤1：通过化学共沉淀法制备超顺磁性四氧化三铁纳米粒子，首先称取2.7gFeCl3·6H2O和1.20g FeCl2·4H2O于500mL的圆底烧瓶中，在氮气环境中加入200mL去氧去离子水，在油浴锅中加热到80℃并让其恒温反应10min，随后迅速加入25％的氨水12mL，并利用pH试纸测试pH范围，调节pH值在10～11，液体立刻变成黑色，搅拌转速提高至4.0krp/min；待反应30min后停止反应，冷却至室温，利用磁性进行吸附分离，用乙醇和去离子水交替洗涤制得的磁性纳米粒子三遍，最后添加40mL去离子水封存，并从中取1mL样品于一试管中，用差量法测定其浓度。
步骤2：Fe3O4@ZrO2的制备，吸取200mg步骤1浊液于烧杯中，用去离子水清洗3次后将用140mL无水乙醇将纳米微粒分散于500mL三口烧瓶中并加入60mL去离子水，在室温下剧烈搅拌，往三口烧瓶中迅速加入25％的浓氨水2mL，反应20min后，再往其中滴加0.1mol/L氯氧化锆溶液0.06mL，反应24小时后利用磁性吸附静置分离出黑色纳米微球，用乙醇和蒸馏水交替洗涤3次，以除去多余的反应物。再将洗涤后的纳米微球分散在含有350mg CTAB的70mL乙醇与70mL水混合溶液中，加入25％氨水2mL，超声分散均匀后在室温剧烈搅拌下反应20min，然后逐滴加入0.1mol/L氯氧化锆溶液1mL，反应24小时，反应结束后，在外加磁场的作用下分离出磁性纳米粒子，用乙醇和水交替洗涤3次，得到Fe3O4@ZrO2纳米微球。
步骤3：MMZr的纳米载体制备，将步骤2含CTAB模板剂的Fe3O4@ZrO2的纳米粒子，超声分散在200mL硝酸钙-无水乙醇(10mg/mL)中，将其转移到500mL的三口烧瓶中，搅拌转速为4.0krp/min，把烧瓶置于80℃的油浴锅中加热回流6h，静置至室温后在磁性作用下用去离子水洗涤磁性纳米粒子2～3次，以保证完全洗掉CTAB，用20mL去离子水封存，并取1mL于试管中用差量法测定其浓度。
步骤4：先取步骤3中的纳米载体5mg于试管中，加入浓度为1.0mg/mL的DNM溶液4mL。稍微振后，经过磁性吸附静置，吸取上清液0.2mL，作为0h的样品，然后将试管放置在恒温摇床(150rp/min，30℃)避光振摇，固载24h、48h后取0.5mL的上清液，用紫外分光光度计测出上清液浓度，计算固载量。48h回收固载后的上清液，用pH＝7.40的PBS缓冲溶液清洗纳米微球，得到固载药物的磁性纳米微球。
对比例1中的MMZr在无磁场情况下仅在0-300s内维持良好的分散性，请参考图9。
而本发明的仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML可在42天内在PBS和纯水体系中维持良好的分散性。因此可见本发明的仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML纳米粒稳定性优于发明[CN112957469A]的纳米微球。
对比例2
参见发明文件[CN101693011B]所述的磁载药纳米粒子制备方法如下：
步骤1：通过化学键在磁性纳米粒子的表面修饰有机小分子，使磁性纳米粒子的表面富集可供偶联抗癌药物的氨基或羧基官能团。然后在EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二酰亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的作用下，将含有羧基或氨基的抗癌药以酰胺键的形式偶联在磁性颗粒的表面。
步骤2：用浓度为1mg/mL的磁载药纳米粒子的水分散液与一定量的醇液超声混合，滴入一定量的浓氨水后搅拌，然后慢慢加入30～300μL的硅源进行水解，室温条件下反应24～72h。反应结束后离心分离，依次用水和乙醇洗数遍后超声分散在水中。
步骤3：向步骤2得到的核壳型磁载药纳米粒子的水分散液中，加入3～6g的一定分子量的PEG，搅拌均匀后回流4～12h，PEG与载药粒子的投料摩尔比>5:1。
步骤4：冷却至室温后，加入0.1g/mL的无机碱液刻蚀15～200min，得到多孔道的磁载药纳米粒子，产物经离心水洗后置于真空干燥箱内室温干燥。
由于发明文件[CN101693011B]中PEG与载药粒子的投料摩尔比>5:1且PEG投料量远大于磁载药纳米粒子，可推测该发明所述的纳米粒载药量应远低于本发明所述的10％～50％。因此，本发明具有高载药量的优势。
对比例3
参见发明文件[CN111939269A]所述是磁靶向性细胞膜修饰配体，其结构通式如式(1)中I系列或者II系列所示：
Figure GDA0003438295940000181
发明文件[CN111939269A]所述磁靶向性细胞膜修饰配体，其制备方法如下：
步骤1：化合物1与炔丙胺反应，制备得到中间体2；
步骤2：中间体2脱去Fmoc保护基得到中间体3；
步骤3：中间体3与香豆素类化合物5反应得到中间体6；
步骤4：中间体6脱Boc保护基得到中间体7；
步骤5：中间体7与3-马来酰亚胺丙酸或硫辛酸反应分别制备得到关键中间体9-1或10-1；
步骤6：9-1或10-1与表明修饰有叠氮基的四氧化三铁纳米粒子反应制备得到磁靶向性细胞膜修饰配体9-1-Li或10-1-Li；
步骤7：或者，中间体3分别与拉帕替尼衍生物或四价铂衍生物反应得到中间体11或12；
步骤8：11或12脱保护基得13或14；
步骤9：13或14与3-马来酰亚胺丙酸或硫辛酸反应，然后与表明修饰有叠氮基的四氧化三铁纳米粒子反应制备得到磁靶向性细胞膜修饰配体9-2-Li、9-3-Li、10-2-Li或10-3-Li；
具体反应路线分别如下所示：
Figure GDA0003438295940000191
或者
Figure GDA0003438295940000201
发明[CN111939269A]的纳米粒在72h内的粒径情况如下表所示：
Figure GDA0003438295940000202
可见，发明[CN111939269A]所述纳米粒合成过程较为复杂，且合成的纳米粒在3天内粒径绝大部分增加20nm左右。而本发明的仿生磁靶向阳离子脂质体t-ML纳米粒合成工艺简单，所需材料易得，且在42天内稳定，分散性良好。
综上所述，可见本发明构建的仿生磁靶向阳离子脂质体具有肿瘤-磁双靶向性，且具有良好的安全性和稳定性。本发明的仿生磁靶向阳离子脂质体可用于包载基因药物、小分子药物及脂类药物，包封率、载药量高，抑瘤效果明显，显著延长荷瘤小鼠的生存期，可为肿瘤靶向治疗提供新的思路和方法。本发明的仿生磁靶向阳离子脂质体包载基因药物具有良好的基因转染效率，且具有溶酶体逃逸功能。本发明的仿生磁靶向阳离子脂质体作为载体或药物组合物可用于治疗各类血液瘤和实体瘤，包括但不限于前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胆管癌、口腔癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胃肠癌、肾癌、喉癌、甲状腺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、骨肉瘤、骨髓瘤等，应用范围广泛。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上对本发明实施例所提供的一种仿生磁靶向阳离子脂质体及其制备方法和应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；但本发明创造并不限于上述具体实施例，熟悉本专业技术领域的人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种等同的变型和替换，这些等同的变型和替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (5)

1.一种仿生磁靶向阳离子脂质体，其特征在于，所述仿生磁靶向阳离子脂质体包括阳离子脂质体和细胞膜，且所述仿生磁靶向阳离子脂质体为所述细胞膜包覆在所述阳离子脂质体的表面的核壳结构；其中所述阳离子脂质体包括磁性纳米粒和阳离子高分子化合物，所述磁性纳米粒负载在所述阳离子高分子化合物上；
所述阳离子脂质体和所述细胞膜的质量比为4：1、3：1、2：1或1：1；所述阳离子高分子化合物为聚乙烯亚胺；所述阳离子脂质体的制备原料包含聚乙烯亚胺、二硬脂酰基卵磷脂和胆固醇；聚乙烯亚胺、二硬脂酰基卵磷脂和胆固醇的摩尔比为50:10:40；
所述磁性纳米粒为油酸修饰的磁性氧化铁，所述细胞膜为前列腺癌细胞膜，所述磁性纳米粒的粒径为10nm；
所述仿生磁靶向阳离子脂质体的粒径在50～300nm之间；所述仿生磁靶向阳离子脂质体的Zeta电位在-5至-40mV之间。
2.一种根据权利要求1所述的仿生磁靶向阳离子脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将磁性纳米粒、聚乙烯亚胺、二硬脂酰基卵磷脂和胆固醇与有机溶剂混合，混合均匀后除去所述有机溶剂，得到预混合物；其中聚乙烯亚胺、二硬脂酰基卵磷脂和胆固醇的摩尔比为50:10:40；
向所述预混合物中加入纯水或缓冲液进行水化，后进行乳化处理，纯化，得到阳离子脂质体；
将所述阳离子脂质体和细胞膜按4：1、3：1、2：1或1：1的质量比混合，分别过200nm、100nm的聚碳酸酯膜，得到仿生磁靶向阳离子脂质体；
所述磁性纳米粒为油酸修饰的磁性氧化铁，所述细胞膜为前列腺癌细胞膜，所述磁性纳米粒的粒径为10nm；
所述仿生磁靶向阳离子脂质体的粒径在50～300nm之间；所述仿生磁靶向阳离子脂质体的Zeta电位在-5至-40mV之间。
3.根据权利要求2所述的仿生磁靶向阳离子脂质体的制备方法，其特征在于，所述细胞膜的制备方法选自反复冻融法、超声破碎法、细胞膜蛋白提取法、微型挤出器挤出法和梯度离心法中的一种或多种；和/或
所述纯化的过程包括：通过100k MWCO的超滤管1000～8000rpm离心超滤5～30min，或5000D的透析带于纯水中透析24h以上，得纯化的阳离子脂质体。
4.一种药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的仿生磁靶向阳离子脂质体和负载于所述仿生磁靶向阳离子脂质体上的药物；以及
所述药物组合物的包封率为50～95％；所述药物组合物的载药量为10～50％。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物选自基因药物、小分子药物及脂类药物中的一种或多种；和/或
所述基因药物选自质粒、DNA、mRNA、lincRNA、siRNA、miRNA、shRNA、sgRNA、piRNA、hnRNA和snRNA中的一种或多种；和/或
所述小分子药物包括小分子放化疗药物，所述小分子放化疗药物的分子量小于1000。
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