CN106309369A - 一种dc细胞膜仿生脂质体药物载体、制作方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶向性的、个性化的DC细胞膜仿生脂质体药物载体及其制备方法和应用。所述DC细胞膜仿生脂质体药物载体，其特征在于，(1)该脂质体药物载体具有细胞膜蛋白组分；(2)该脂质体药物载体能够体外装载药物，用于细胞靶向融合释放；(3)该脂质体所具有的细胞膜蛋白组分来自于永生化的自体细胞。本发明的优点：可用于药物或者抗原的体内DC细胞的靶向性输送，提高DC细胞的抗原提呈能力，提高特异性免疫力。

Description

一种DC细胞膜仿生脂质体药物载体、制作方法及其应用
技术领域
本发明属于细胞治疗和脂质体药物精准输送技术领域，涉及一种DC细胞膜仿生脂质体药物载体，还涉及一种上述细胞膜仿生脂质体药物载体的制备方法，还涉及一种上述细胞膜仿生脂质体药物载体的应用，可用于精确靶向体内树突细胞(DC)。
背景技术
当前药物的靶向给药系统包括脂质体、乳剂、微球、纳米粒等，其中脂质体给药系统是将药物装载在由脂类分子包裹(脂质体)的超微球状囊泡中，内部为水性空间，可以装载亲水性药物，外层脂质分子为亲脂性药物装载的空间，大小一般在几个nm到几个μm，分为被动和主动靶向脂质体两种。目前人们已经发明的各类脂质体对靶细胞的融合随机性比较大，特异性相对较低，限于脂质体膜上的有限的蛋白的介导，脂质体的融合概率相对较低，由于脂质体脂质种类和修饰以及缺乏蛋白因子的介导，造成其表面成分与靶细胞表面成分之间存在较大的差异，造成了这种人工脂质体与靶细胞间的融合概率相对较低，与非靶细胞的非特异性融合增大，另外，传统脂质体易被体内的网状内皮系统所吞噬而被清理，导致药物的半衰期和有效性大大降低。设计针对特定细胞类型的脂质体是该领域的一个重要发展目标。
细胞的膜融合存在同型融合和异型融合方式，均需要细胞膜上的特殊蛋白介导，其中同型细胞膜间的融合较容易发生，如果这些细胞膜蛋白用于制作脂质体，在理论上将会模拟同类型细胞间的融合，而具有特定细胞的靶向作用，而且可以降低被视为外援物质而被网状内皮系统吞噬的可能性。而传统脂质体的制作并未对细胞膜蛋白仿生脂质体作充分的重视，首先，不同类型的细胞表面存在的膜受体及膜融合相关的蛋白种类有差异，通用化运用较难，尤其是一些细胞特异的膜融合蛋白；再者，参与细胞膜融合的蛋白种类较多，不易做相关蛋白的分离和脂质体膜的整合操作；由于大部分膜蛋白是经过内质网、高尔基体的糖基化修饰，重组蛋白一般缺失这些糖基化修饰，酵母表达的蛋白存在过度糖基化，使用酵母源的重组蛋白存在产生抗体的风险，而且多种细胞膜蛋白的重组表达也将是一个较大的工作量，上述种种困难，阻碍了人们开发细胞膜仿生脂质体的开发。
树突细胞(Dendritic cell，DC)是体内功能强大的专职抗原提呈细胞，其自身具有免疫刺激能力，能够激活未致敏初始型T细胞，DC不仅能够以抗原特异的形式启动T细胞，识别和杀伤肿瘤细胞，也可以激发免疫记忆保护，当宿主再次受到肿瘤细胞攻击时发挥保护作用。PBMC(指外周血中具有单个核的细胞)可以在特定细胞因子下诱导形成树突细胞。
发明内容
本发明的目的解决上述技术问题，基于同型细胞膜融合的脂质体药物载体的设计，提供一种靶向性的、个性化的DC细胞膜仿生脂质体药物载体及其制备方法和应用，用于药物或者抗原的体内靶向DC细胞，提高DC细胞的抗原提呈能力，提高免疫力，也可以提高免疫耐受。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种DC细胞膜仿生脂质体药物载体，其特征在于，(1)该脂质体药物载体具有细胞膜蛋白组分；(2)该脂质体药物载体能够体外装载药物，用于细胞靶向融合释放；(3)该脂质体所具有的细胞膜蛋白组分来自于永生化的自体树突细胞。
进一步地，装载的药物可以为普通化学药物、siRNA药物、mRNA药物、DNA药物、蛋白药物、多肽类药物、免疫增强剂、免疫抑制剂、免疫佐剂中的一种或多种的混合，其中的普通化学药物可以为亲水、疏水性药物或双亲性化学药物。
所述DC细胞膜仿生脂质体药物载体作为DC疫苗的应用：(1)该疫苗可包封多肽，如MUC1的胞外短重复序列；(2)该疫苗可包封多肽，如K-Ras的G12突变短肽序列；(3)该疫苗可包封肿瘤相关或者肿瘤特异抗原的编码序列，如编码MUC1的胞外短重复序列，编码K-ras的G12突变短肽序列；(4)该疫苗除含有抗原编码序列外，还含有共同表达的DC激活基因序列，DC激活基因编码元件包括分泌性的CD40L细胞外结构域和FLT3LG的分泌性细胞外结构域，以及GM-CSF的编码序列；(5)该疫苗除含有抗原编码序列外，还含有共同表达的DC激活基因序列，如CD80、CD86等共激活基因的编码序列，以及GM-CSF的编码序列；(6)该疫苗可共同包封多肽、抗原编码序列和DC激活基因序列；(6)该疫苗还含有卡介苗或单磷酰基脂质A(MPLA)等免疫佐剂；(7)该疫苗所用的质粒，还含有S/MAR等基因组非整合性DNA元件。
所述DC细胞膜仿生脂质体药物载体在治疗癌症、细菌性炎症、病毒性炎症、过敏性炎症、自身免疫性疾病或者皮肤疾病的应用。如用永生化的DC制作的仿树突细胞脂质体，用于包裹抗肿瘤药物，抗肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原TAA；如用于质量K-ras突变的肿瘤等，又如用于MUC1糖基化不足的肿瘤等。
一种上述DC细胞膜仿生脂质体药物载体的制备方法，包括以下步骤：(1)原代细胞的永生化诱导，以获得永生化能力；(2)进一步诱导成为未成熟型或成熟型DC细胞，或者诱导成为免疫激活型或者免疫抑制型的DC细胞；(3)提取DC细胞的细胞膜蛋白，整合入人工脂质体膜中；(4)细胞膜脂质体制备和药物装载。
其具体方案如下：
1.原代DC细胞的永生化诱导
本发明借助传统的细胞永生化方法进行细胞的处理，主要采用hTERT、SV40大T抗原、EB病毒、c-MYC等方法处理，上述方法的单独处理和/或组合应用。优先采用hTERT(GenBank:NM_198253或者NM_001193376)、SV40大T抗原(GenBank:J02400.1)和/或C-MYC共(GenBank:NM_002467)共同刺激细胞的永生化，hTERT、SV40大T抗原(SV40-LT)和/或hC-MYC的表达质粒，由一个质粒共同编码，本发明优先采用hTERT、SV40大T抗原和C-MYC由同一个质粒编码的方式，三者之间采用2A自切肽间隔，用于同一个编码框下的彼此的独立表达，可采用来自猪捷申病毒P2A,或者来自四体病毒的T2A,马鼻炎A病毒的E2A，手足口病毒F2A，细胞质多角体病毒的BmCPV2A或者家蚕传染性软化病病毒BmIFV2A，优先采用P2A；表达载体为非病毒载体或者病毒载体，优先采用病毒载体，比如慢病毒载体，用于慢病毒的包装感染，该载体除5’-LTR外，还有内置启动子CMV等，用于启动插入的编码框的高效表达，表达框如图1。该方法提高对原代细胞的感染效率和有效稳定表达。可采用我们构建的基因组整合型或基因组非整合型病毒载体，用于病毒的包装和感染。该载体可以含有筛选标志，比如抗生素筛选标志，本实验优先采用带嘌呤霉素筛选标志的载体进行后续的稳定表达细胞的抗性筛选。
分选的原代PBMC细胞进行病毒感染。编码hTERT和SV40大T抗原的慢病毒感染细胞24-48小时后，除去病毒，继续培养，根据实验需要，可以适当用抗生素筛选，比如加0.3-2ug/ml的嘌呤霉素筛选细胞，以除去未感染病毒的细胞。
2.永生化PBMC细胞的进一步分化
由于某些高度分化的细胞较难作永生化处理，比如外周血的PBMC细胞，经过永生化处理后，可以进一步作分化诱导处理，诱导成为未成熟型和成熟型树突细胞，也可以诱导为免疫激活型和免疫耐受型DC，上述不同类型的DC细胞膜可以用于不同的仿生DC细胞膜脂质体的制作，DC仿生脂质体疫苗优先未成熟型DC细胞膜制作，某些情况下也可以用成熟、免疫激活型的DC细胞制作仿生脂质体，比如用IL-4、GM－CSF和IFN-α、LPS诱导可以获得免疫激活型DC；IL-4、GM－CSF和TNFa诱导，可以获得免疫耐受型的DC。DC细胞的诱导：永生化PBMC进一步采用IL-4、GM－CSF和/或IFN-α和/或sCD40L进行诱导刺激DC细胞的分化和进一步的成熟，提取细胞膜用于仿生脂质体的制作。而已经永生化的某些细胞系可直接用于细胞膜的提取，用于制作仿生脂质体。
3.细胞膜蛋白的提取
细胞膜的低渗和超速离心提取法，细胞数量在1×108-2×109个细胞的细胞膜的提取，一般采用低渗法处理细胞，机械破碎膨胀的细胞膜，然后通过低速离心(500-1500g)除去较大细胞器，如线粒体和细胞核，将上清收集后进一步采用超高速离心法分离细胞膜，超高速离心常采用蔗糖梯度或者Percoll梯度密度离心，或者二者混合梯度离心，细胞膜一般分布在上层区、低密度区(38％层上和43-53％密度交界层)。该法的细胞膜蛋白回收率在40-70％，混有少量的细胞器膜。收集的细胞膜沉淀可以放置-80℃冰箱一个月，液氮罐蒸汽中可以放置3个月到3年，可用于后续的细胞膜脂质体的制备，该法提取的蛋白混有来自内质网的膜蛋白的污染，少量高尔基体和线粒体的膜蛋白污染。
植物凝集素磁珠法提取细胞膜：利用细胞膜蛋白具有很高的糖基化原理，可以使用一些特殊的糖基结合蛋白来纯化细胞膜，使用植物凝集素来吸附细胞膜，比如WGA、刀豆蛋白A(ConA)等。把植物凝集素ConA偶联到磁珠后，就可以使用磁珠沉淀细胞膜，最后用过量的甘露糖、葡萄糖竞争性与磁珠的ConA结合，可把结合的细胞膜蛋白置换，从而洗脱细胞膜蛋白。细胞的裂解可采用低渗法和等渗法，采用电动或者手动匀浆器匀浆，低速离心后的细胞膜上清液直接进行细胞膜的提取，细胞膜的回收率在25-75％，平均为30-40％左右，但细胞膜的纯度是梯度密度分离法所不能比拟的，大大减小了细胞器膜污染细胞膜的机会，优先采用植物凝集素磁珠法提取细胞膜用于细胞膜仿生脂质体的膜蛋白来源。
1×107-1×108个细胞的细胞膜的小量提取，可采用植物凝集素磁珠试剂盒提取，相关产品有Qproteome质膜蛋白分离试剂盒(Qiagen)或者类似分离机制的试剂盒MinuteTM质膜蛋白分离试剂盒(Invent Biotechnologies)。
4.细胞膜脂质体制备和药物装载
可以采用逆向蒸发法、薄膜法、梯度反向装载法、超声法和双乳化法等，本专利优先采用薄膜法进行制备细胞膜脂质体，由于该法具有相对较小的脂质体粒径和较高的药物包封率。另外为了除去较大粒径的脂质体，制作的脂质体还要经过高分子膜过滤、挤压等方法，获得粒径更小的脂质体。为了增加细胞膜蛋白脂质体的稳定性，降低调理作用,减少肝脏巨噬细胞的吞噬，表面可作特殊化学修饰，如聚乙二醇(PEG)修饰，在制作脂质体薄膜的时候添加偶联PEG的脂分子。
可溶性药物：包括抗肿瘤药物、抗炎症药物、治疗自身免疫性的药物、化学小分子、中药活性成份、siRNA或者miRNA药物以及一些佐剂成份，另外一些编码的特定调控基因、毒性蛋白、编码shRNA的质粒，也可以包装入DC仿生脂质体。
脂溶性药物：上述方法可以制得装载可溶性药物的细胞仿生脂质体，也可以制作脂溶性药物的细胞仿生脂质体，也可以制作二者的混合型细胞仿生脂质体。
编码肿瘤相关抗原或者肿瘤特异性抗原的基因，如AFP2、WT1、hTERT、Her2、Her3、IDH1、IDH2、TP53、EGFR、EGFRvIII、EGFR(T790M)、EGFR(L858R)、EGFR(L861Q)、EGFR(A767-C775)、K-Ras、N-RAS、EML4-ALK、HER3(V104R)、B-RAF(V600E)、BRCA1、BRCA1、BRCA2、c-Kit、c-MYC、PDGFRA、cMET、MAP2K4、CETN3、SKP1、CDK12、PAK1、PTK2、RIPK2、TLK2、PIK3CA、GNAS,GNAI2、GNAQ、MRE11、APC、MLL1、MLL2、MLL3、RASA1、DPC4、ATM、CDKN2A、EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、PALB2、PMS2、STK11、PRSS1、SPINK1、ARID1A、VCAM1、CDK14、JAK1、β-Catenin、VHL、CEA、MEN1、Ret、BRG1、CDH1、SOX4、PTEN、MLH1、RB1、RUNX3、E2F-1、CRTC1、H-RAS、PRKCA、CDK4、TSHR、AIP、BAP1、BCL-XL、PRAME、FLT3-ITD、JAK2、NPM1、TK、DNMT3A、CEBPA、PTPN11、PRPS1、SEMA3B、SEMA3F、KLF6、XRCC4、ATMPI3K、TP73、TP63、SMAD4、ING1、PBRM1、CDKN2B、CDKN1A、PAK1等基因的相关突变，但不仅限于上述肿瘤相关基因及突变构建的质粒或者多肽均可用于DC仿生脂质体的装载；也可以共同表达可溶性CD40L、可溶性FLT3LG、GM-CSF、共刺激分子CD80、CD86和CD83等，以提高抗原的敏感性；DC仿生脂质体装载物可以是病人肿瘤细胞的肿瘤抗原提取物、肿瘤细胞系的提取物或者细胞反复冻融产物、紫外照射后的细胞产物、超声波破碎的肿瘤细胞产物、弱酸洗脱的肿瘤细胞表面提呈多肽；为增加抗原的致敏能力和DC的提呈能力，常规的免疫佐剂也可以装载到仿生脂质体内，如卡介苗、正霍乱毒素的B亚单位CTB、单磷酰基脂质A(MPLA)、KLH、左旋咪唑、Detox和短小棒状杆菌佐剂等；编码病毒的RNA也可以作为一类特殊免疫佐剂装载DC仿生脂质体内；化学免疫调剂也可装载如脂质体中，增加DC细胞的免疫活性，比如黄芪多糖、灵芝多糖、姜黄素、人参皂苷、丹皮酚、雷公藤甲素、Poly I:C等。这种仿生脂质体的治疗方法省去了DC细胞的体外致敏过程，可以灵活多样的针对病人进行多种仿生DC脂质体疫苗的治疗操作，可以多次、多种类型的DC疫苗的强化免疫，以提高病人的抗肿瘤细胞的CTL能力。该类DC仿生脂质体可用于治疗特定肿瘤和慢性炎症。一些脂质体可以添加磁性纳米颗粒，增加靶向性。
肺部吸入型的DC疫苗，可以增加胆固醇的比例，以增加脂质体的韧性和防止药物渗漏，如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、胆固醇，如比例(5:1:2:3或者5:1:2:4或者5:1:2:5)溶于氯仿：甲醇(3:1或者2:1或者1:1，V/V)。
附图说明
图1为细胞永生化质粒读码框模式图；
图2为DC仿生脂质体包封质粒的读码框模式图；
图3为未包封药物的仿生DC脂质体的粒径图；
图4为脂质体的细胞膜整合蛋白测定；
图5为DC仿生脂质体药物包封率测定；
图6为不同K-ras仿生脂质体疫苗药物诱导DC细胞的体外分化和成熟(标志CD83的流式细胞测定)；
图7为不同K-ras仿生脂质体疫苗药物诱导DC细胞的体外分化和成熟(标志CD86的流式细胞测定)；
图8为不同K-ras仿生脂质体疫苗诱导的DC细胞所致敏的效应T淋巴细胞的细胞毒性测定(IL-12的分泌测定)；
图9为不同K-ras仿生脂质体疫苗诱导的DC细胞所致敏的效应T淋巴细胞的细胞毒性测定(IFN-γ的分泌测定)；
图10为不同K-ras仿生脂质体疫苗诱导的DC细胞所致敏的效应T淋巴细胞的细胞毒性测定(TNF-α的分泌测定)；
图11为MUC1仿生脂质体疫苗诱导的DC细胞的分化和成熟测定(标志CD86的流式细胞测定)；
图12为MUC1仿生脂质体疫苗诱导的DC细胞所致敏的效应T淋巴细胞的细胞毒性测定(IFN-γ的分泌测定)；
图13为S/MAR序列对仿生脂质体疫苗质粒的影响(T细胞毒性IFN-γ的分泌测定)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
(1)血液单核细胞PBMC的分离、培养
10ml注射器用肝素抗凝处理，抽取患者或者健康者5-10ml血。将PBS或生理盐水与血1：1混合；取10ml FICOLL加入另一50ml离心管，将PBS或生理盐水与血的混合液沿管壁缓慢加入，速度要轻，保证两者之间有清晰界面。摇摆转头1300-1800rpm离心30min，巴氏管或者毛细管缓慢吸取白色细胞层，转入另一个15ml离心管，加入3-5ml PBS或生理盐水，1000-1500rpm离心10min。弃上清液，加入10ml PBS，混匀后1400rpm离心10min；再弃上清液，加入10ml PBS，混匀后1400rpm离心10min，如此重复3次；计数细胞，1-5X106细胞/ml接种，接种于培养瓶中，置37℃，5％CO2培养箱培养4h后吸出培养基，用37℃预热的培养基清洗3遍，除去未贴壁的细胞，贴壁细胞即为单核细胞，培养基为完全的RPMI-1640和双抗，并添加10％人AB血清或者1％的Nutridoma-SP(Sigma或者Invitrogen)。
(2)慢病毒的包装
带有抗性筛选基因的慢病毒表达载体，与第二代或者第三代慢病毒包装载体按比例混合，转染293T细胞，如阳离子脂质体或者阳离子聚合物类型的转染试剂，转染48小时和72小时后分别收集上清，混合，离心除去细胞碎片，测定病毒的效价，短期放4℃待用或者-80℃冻存备用；病毒可经过60000-120000g于4℃超高速离心1-6小时，沉淀用无钙镁的缓冲液PBS溶解备用或者-80℃冻存。
(3)hTERT、SV40-LT和/或c-MYC的质粒图和PBMC的永生化
构建P2A等间隔的hTERT(GenBank:NM_198253)、SV40大T抗原(GenBank:J02400.1)和/或C-MYC(GenBank:NM_002467)共表达质粒，如图1，质粒可选用病毒表达载体，优先选用慢病毒表达载体或者腺病毒表达载体，病毒采用第三代病毒包装系统，转染细胞为293T，收集转染后48小时和72小时后的上清液，离心处理，经过初步的1：3-1:20的稀释，感染HELA细胞，1μg/ml嘌呤霉素筛选法，确定病毒的最佳稀释倍数为1:3-5。2X106PBMC使用RPMI-1640完全培养基和双抗培养，培养贴壁后的第二天或者第三天，接种1:6稀释的病毒进行感染，并添加10％人AB血清或者1％的Nutridoma-SP(Sigma或者Invitrogen)。24小时后，细胞开始使用0.4-1μg/ml嘌呤霉素筛选，最初的几天嘌呤霉素的添加采取间隔1-2天的方式添加，防止细胞死亡过多而影响细胞的生长状态。稳定生长的细胞克隆，可以采用枪头吸附法，逐一吸取到24孔板中继续放大培养，并作表面标志的鉴定，DC细胞通常的细胞表面标志为CD11c+、CD1c+、CD123-，而CD80、CD86、CD83的表达上调和CD14的表达下调是其成熟标志。
(4)DC细胞的质粒抗原的构建：
以pUC来源的质粒为基础，带有一个病毒或者人的基因强启动子，如带有CMV、SV40、EF-1、α-actin、β-actin、UBC、PGK等启动子元件，也可以用于shRNA启动的U6等启动子，其中优选CMV启动子，该质粒还含有一个较强的终止子，如牛生长激素的终止子BGH-PA，启动子和终止子之间的多克隆位点连有基因编码序列或者编码多肽疫苗的DNA序列。其中编码序列包括抗原提呈和DC成熟相关的共激活因子的序列、激活因子、细胞因子编码序列、以及编码抗原相关的DNA序列。共激活因子和激活因子包括CD80(GenBank：NM_005191)、CD86(GenBank：NM_175862)的全长分子，以及编码CD40L的细胞外可溶性结构域(ECD)编码框(aa113-261)(Seq ID No.5)和FLT3LG(GenBank：NM_001204502)的细胞外结构域(ECD)的编码框(aa1-168)(Seq ID No.4)，细胞因子如GM-CSF(GenBank：NM_000758)等；另外肿瘤相关的抗原，我们选择了K-ras(G12)位点突变，如G12V的突变多肽序列(aa5-17)，另外选择MUC1(GenBank：J05582.1,Uniprot：P15941-1)的细胞外重复序列，如编码aa101-160的核酸序列Seq ID No.8，以及根据MUC1重复序列而人工合成的MUC1短肽，如序列和Seq ID No.6和Seq ID No.7。这些序列之间插入自切肽的编码序列，如编码P2A的自切肽序列(Seq IDNo.1)。分泌性sCD40LG序列除去了CD40LG的跨膜区和胞内区，只保留了aa113-261，为了能够分泌，添加了一个信号肽，本序列使用了CD8的信号肽，如Seq ID No.5。所有序列均采用人工合成片段和拼接的方法获得全长片段，将片段插入载体。
作为一种优选，为了增加靶质粒的长时间表达，添加基因组非整合元件S/MAR。
以上质粒的编码和调控序列设计如图2。
(5)DC细胞的诱导
永生化的细胞克隆，鉴定CD11c和CD1c阳性的细胞克隆，并放大培养，使用RPMI-1640完全培养基和双抗培养，并添加10％人AB血清或者1％的Nutridoma-SP(Sigma或者Invitrogen)培养，常用的诱导方法是先用GM-CSF和IL-4诱导成为不成熟DC细胞，然后使用LPS、IFN-γ进一步诱导成熟。第一天PBMC加入2000IU/mL IL-4、2000IU/mL GM-CSF，第3天再加2000IU/mL IL-4和2000IU/mL GM-CSF，第4天开始诱导DC成熟，加入100ng/mL LPS和1000IU/mL IFN-γ，诱导1-2天，2mM EDTA-PBS冰上消化细胞。也可使用IL-1β(25ng/ml)、IFN-α(1000IU/ml)、IFN-γ(1000IU/ml)和PGE2(1μg/ml)诱导1-2天。
(6)未成熟型DC细胞的细胞膜提取(植物凝集素ConA磁珠法)：
取1ml链霉亲和素磁珠，放磁力架上，除去其缓冲液，1XPBS洗涤，取150-250μg生物素化的刀豆蛋白A，溶于200μl PBS，将上述磁珠和生物素化的刀豆蛋白A混合，室温震荡孵育1-2小时，PBS洗涤一次，PBS(含1％Triton X-100)洗涤一次，PBS洗涤3次。磁珠悬于50-200μl PBS备用。0.1-10x108细胞经细胞刮刮取，离心，PBS洗涤，用低渗溶液(20mM tris、1.5mM的MgCl2、10mM NaCl、pH6.0-6.8，加入适量蛋白酶抑制剂)处理5-10分钟，离心细胞，将细胞重悬于冷的1XPBS(含蛋白酶抑制剂)，立即匀浆，电动匀浆(1500转/分钟)或者特氟龙匀浆器手动匀浆30-60次。1000g离心10分钟，收集含细胞膜上清，除去细胞核和细胞器碎片沉淀。将上述制备好的磁珠与细胞膜上清液混合，4℃震荡孵育1-2小时，放置磁力架上，除去上清液，用PBS洗涤1-3次，细胞膜用200μl洗脱液(0.25M甲基-β-D-甘露糖苷溶于1XPBS)孵育10-20分钟，再重复洗脱1-2次，取5-10μl溶于含去污剂的蛋白裂解液中，用于测定蛋白浓度。
(7)DC仿生脂质体的制作和药物包封
薄膜法：二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、胆固醇(Avanti Polar Lipids)，按一定比例(6:1:2:3)溶于氯仿：甲醇(3:1或者2:1或者1:1，V/V)，脂溶性的药物可在此步骤中加入，然后在旋转蒸发器中蒸发溶剂，形成薄层。然后脂质薄层复水，从细胞中提取的膜蛋白(溶于PBS)以1:100-1:800比例(蛋白：膜脂)加入到薄层中，复水过程中加入亲水性的药物、肿瘤提取物、细菌病毒抗原、mRNA、siRNA、质粒及免疫佐剂。40-65℃加热涡旋处理2-6分钟，重复2-5次。蛋白在40-65℃下挤过200nm孔径的醋酸纤维素滤膜或者聚碳酸酯膜，反复进行10-20次，以降低脂质体的孔径和提高脂质体的粒径均匀度，所获的单层脂质体膜泡经过半透膜透析过夜纯化，或者经过SephadexG-50柱或者类似凝胶柱纯化，以除去游离的未整合蛋白和杂质。对照脂质体的制作，除不添加细胞膜提取物外，其他步骤、工艺和内容物均相同。
脂质体装载药物主要为表达特异性肿瘤抗原的质粒、mRNA、多肽、肿瘤细胞提取物和siRNA等。对于质粒类装载成份，为了增强体内DC细胞的成熟，质粒还可以同时编码CD40L胞外区(ECD)、FLT3LG胞外区和GM-CSF的非整合型质粒，以增强靶细胞的抗原提呈能力，质粒也可以含CD40L_ECD和FLT3LG_ECD的表达；为增强DC细胞的成熟和抗原提呈能力，可以在质粒中表达共激活受体分子CD80、CD86及细胞因子GM-CSF；
Kras突变的表达序列可以是全长分子，也可以是包括G12突变位点的左侧和右侧多个氨基酸片段的编码序列，该片段优选围绕G12突变位点的7-25个氨基酸的多肽片段，如Seq ID No.2，也可以是该短肽片段的多次重复，比如2-10次重复，也可以是几种K-RAS的突变短肽的串联，人工合成短肽则是围绕G12突变的7-25个氨基酸的多肽片段，如Seq IDNo.3，该多肽可以与免疫佐剂共同包装DC仿生脂质体，装载50-500μg/ml的最终浓度；
该仿生脂质体可以是人工合成的多肽片段和质粒的混合物，比如合成的7-25个氨基酸的Kras(G12V)突变肽和编码质粒共同装载仿生脂质体，还可以添加免疫佐剂；MUC1的胞外区在多种肿瘤中存在糖基化不完全的特点，是一个难得的肿瘤特异性抗原分子，其疫苗可以使用编码胞外区重复序列(不含信号肽)的序列，比如从第101个氨基酸开始的胞外区，含有重复序列1-10次的区域用于制作表达质粒；也可以是人工合成的MUC1重复序列短肽，比如10-20个aa的短肽，50-500μg/ml的最终装载浓度。
靶向MUC1的仿生脂质体中，还可以加入一些佐剂，比如卡介苗或MPLA，以增加抗原提呈能力。对照脂质体为不装载药物的DC仿生脂质体或者装载质粒空载体(Empty)的仿生脂质体。
该仿生脂质体可以装载化学药物小分子或者中药提取物，如黄芪多糖(100-1000μg/ml)。
(8)DC仿生脂质体的平均粒径和Zeta电位
包被的DC仿生脂质体，使用激光粒度分析仪测定其粒径和电位，未包封药物的仿生DC脂质体的粒径图见图3，平均粒径和Zeta电位见表1。
表1
Empty 多肽 质粒 多肽/质粒 黄芪多糖
平均粒径 129 127 124 122 131
Zeta电位 -14.9 -14.6 -13.7 -13.9 15.4
(9)膜蛋白整合脂质体的荧光密度测定
1μg/ml Alexa Fluor555偶联的WGA溶于1X PBS，测定仿生脂质体膜上的糖蛋白，空白脂质体作为对照，室温孵育10-20分钟，然后通过透析除去游离的WGA，然后荧光光度法(540-560nm)测定荧光强度，见图4，显示细胞膜蛋白整合进入了脂质体。
(10)DC仿生脂质体的包封率检测
载药量的计算是通过计算总的药物量减去上清中游离药物量后除以总量的百分比来计算，通过12000g-20000g离心10-30分钟，获得脂质体离心后的上清液中的游离药物；也可以计算沉淀中的药物量，除以总量的百分比，非仿生脂质体包被的药物作为对照。
质粒的包封率，18000g离心20分钟后，分别取上清和沉淀，利用酚/氯仿抽提法处理，18000g离心20分钟后取上清，加1/10-1/203M醋酸锂-20℃沉淀1小时，18000g离心30分钟，收集沉淀，溶于1X TE溶液中，测定A260比值，计算DNA含量，包封率计算：初始总量减去上清中的DNA总量后除以总量的百分比。
黄芪多糖仿生脂质体1ml，12000g-20000g离心10-30分钟，沉淀为黄芪多糖脂质体，稀释至2ml，采用蒽酮法测定上清液和/或沉淀物的吸光度，包封率为加入药物总量减去上清药物总量后的结果除以药物总量的百分率。
质粒、多肽、黄芪多糖的包封率见图5，结果显示DC仿生脂质体的包封率较非仿生脂质体略低，但是均达到50％以上，显示了较少的包封率。
(11)装载编码肿瘤特异性的抗原和激活因子的质粒的DC仿生脂质体的体外提呈
第一天PBMC加入2000IU/mL IL-4、2000IU/mL GM-CSF(Peprotech)，第3天再加2000IU/mL IL-4和2000IU/mL GM-CSF，第4天开始诱导DC成熟，事先准备好装载质粒或者质粒/短肽或者质粒/短肽/佐剂的DC仿生脂质体，未装载药物的仿生脂质体作为对照，将诱导的DC细胞中加入K-RAS(G12V)短肽装载的DC细胞膜仿生脂质体37℃孵育1小时，然后加入20ng/ml可溶性CD40L(sCD40L)继续诱导24小时，备用。从健康志愿者体内抽血，分离T淋巴细胞，跟上述抗原致敏的DC细胞混合培养，效靶比5-20:1，本实验优选10:1，添加10ng/mlIL-17，继续培养5天，再加入20U/ml IL-2培养2天，收获效应性T细胞备用，成熟的DC细胞则用于测定细胞表面成熟标志CD83(FITC-anti-CD83，BD Pharmingen)和CD86(PE-anti-CD86，BD Pharmingen)，见图6-图7，结果显示K-RAS(G12V)短肽激活了DC，提高了CD83和CD86的表达，而卡介苗或MPLA进一步增强了突变体短肽的抗原提呈能力，而短肽、编码短肽的质粒和卡介苗等佐剂的联合应用对DC的激活具有增效作用。
(12)ELISA检测K-Ras(G12V)抗原提呈后的效应T细胞的细胞毒性：
1x105-5x105K-RAS(G12V)致敏的效应T细胞以及对照致敏的T细胞，分别加入事先接种K-RAS(G12V)突变细胞株PANC-1的96孔板中，37℃培养12小时，收集上清，人IL-12/P70ELISA试剂盒(eBioScience)、IFN-γ(PeproTech)、TNF-αELISA检测试剂盒(PeproTech)检测K-Ras(G12V)抗原提呈的效应T细胞的细胞因子释放，ELISA步骤按生产商提供的说明书操作，结果见图8-图10，结果显示结果显示K-RAS(G12V)短肽激活了DC，提高了CD83和CD86的表达，而卡介苗或MPLA进一步增强了对T细胞致敏能力和细胞毒性，而短肽、编码短肽的质粒和卡介苗等佐剂的联合应用对DC的激活和T细胞的致敏具有增效作用。
(13)MUC1仿生脂质体的抗原提呈和T细胞活化分析
第一天PBMC加入2000IU/mL IL-4、2000IU/mL GM-CSF，第3天再加2000IU/mL IL-4和2000IU/mL GM-CSF，第4天开始诱导DC成熟，事先准备好装载质粒或者质粒/短肽或者质粒/短肽/佐剂的DC仿生脂质体，未装载药物的仿生脂质体作为对照，将诱导的DC细胞中加入装载MUC1细胞外重复区编码质粒的仿生脂质体，37℃孵育3小时，然后加入20ng/ml可溶性CD40L(sCD40L)继续诱导24小时，备用。从健康志愿者体内抽血，分离T淋巴细胞，跟上述抗原致敏的DC细胞混合培养，效靶比5-20:1，本实验优选10:1，添加10ng/ml IL-17，继续培养5天，再加入20U/ml IL-2培养2天，收获效应性T细胞备用，收集DC细胞用于测定表面标志CD86(图11)。与MUC1阳性的人胰腺癌肿瘤PanC1细胞孵育，96孔板中加入1x104MUC1阳性的靶肿瘤细胞PanC1贴壁后，加入P2、P4、P6质粒或者与MUC1短肽2共同包封脂质体致敏的1x105致敏的T效应细胞，效靶比10:1，孵育12小时后，收集上清液，EILSA检测上清液中的IFN-γ含量(图12)。结果显示MUC1胞外区重复序列短肽激活了DC，提高了DC细胞的CD86的表达，编码重复区序列的质粒进一步增强了对T细胞致敏能力和细胞毒性，而短肽、编码短肽的质粒的联合应用对DC的激活和T细胞的致敏具有增效作用。
(13)S/MAR元件对抗原提呈的影响
第一天PBMC加入2000IU/mL IL-4、2000IU/mL GM-CSF，第3天再加2000IU/mL IL-4和2000IU/mL GM-CSF，第4天开始加入仿生脂质体，包括包封P5、P5SM、P6、P6SM和包未装载药物的仿生脂质体作为对照，37℃孵育3小时，细胞继续培养5天；然后加入20ng/ml可溶性重组CD40L(sCD40L)继续诱导24小时，备用。从健康志愿者体内抽血，分离T淋巴细胞，跟上述抗原致敏的DC细胞混合培养，效靶比10:1，添加10ng/ml IL-17，继续培养5天，再加入20U/ml IL-2培养2天，收获效应性T细胞备用。96孔板中加入1x104靶肿瘤细胞PanC1，贴壁后，加入的1x105致敏的T效应细胞，效靶比10:1，孵育12小时后，收集上清液，EILSA检测上清液中的IFN-γ含量(图13)。结果显示带有S/MAR序列的质粒随着细胞的增殖，依然表现了较强的DC细胞激活能力，而无S/MAR的质粒，随着细胞的传代，激活DC细胞的能力降低和致敏T细胞的能力降低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种DC细胞膜仿生脂质体药物载体，其特征在于，(1)该脂质体药物载体具有细胞膜蛋白组分；(2)该脂质体药物载体能够体外装载药物，用于细胞靶向融合释放；(3)该脂质体所具有的细胞膜蛋白组分来自于永生化的自体树突细胞DC。
2.根据权利要求1所述的DC细胞膜仿生脂质体药物载体，其特征在于，装载的药物为普通化学药物，或siRNA药物，或mRNA药物，或DNA药物，或蛋白药物，或多肽类药物，或免疫增强剂，或免疫抑制剂，或免疫佐剂，或上述药物中的一种或多种的混合；所述普通化学药物为亲水、疏水性药物或双亲性化学药物。
3.一种权利要求1-2中任一项所述的DC细胞膜仿生脂质体药物载体在治疗癌症、细菌性炎症、病毒性炎症、过敏性炎症、自身免疫性疾病或者皮肤疾病中的应用。
4.一种权利要求1-2中任一项所述的DC细胞膜仿生脂质体药物载体在治疗K-ras突变的肿瘤或MUC1发生脱糖基化肿瘤中的应用。
5.一种权利要求1-2中任一项所述的DC细胞膜仿生脂质体药物载体作为DC疫苗的应用。
6.根据权利要求5所述的DC细胞膜仿生脂质体药物载体作为DC疫苗的应用，其特征在于，该疫苗可包封多肽，或包封肿瘤相关或者肿瘤特异抗原的编码序列，也可共同包封多肽、抗原编码序列和DC激活基因序列。
7.根据权利要求5所述的DC细胞膜仿生脂质体药物载体作为DC疫苗的应用，其特征在于，该疫苗除含有抗原编码序列外，还含有共同表达的DC激活基因序列，DC激活基因编码元件包括分泌性的CD40L细胞外结构域和FLT3LG的分泌性细胞外结构域，以及GM-CSF的编码序列。
8.根据权利要求5所述的DC细胞膜仿生脂质体药物载体作为DC疫苗的应用，其特征在于，该疫苗还含有共同表达的DC激活基因序列；该疫苗还含有免疫佐剂；该疫苗所用的质粒，还含有基因组非整合性DNA元件。
9.一种权利要求1-2中任一项所述的DC细胞膜仿生脂质体药物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)原代细胞的永生化诱导，以获得永生化能力；(2)进一步诱导成为未成熟型或成熟型DC细胞，或者诱导成为免疫激活型或者免疫抑制型的DC细胞；(3)提取DC细胞的细胞膜蛋白，整合入人工脂质体膜中；(4)细胞膜脂质体制备和药物装载。
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