CN111110658A - 一种淋巴结靶向纳米复合物及制备和应用 - Google Patents

一种淋巴结靶向纳米复合物及制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111110658A
CN111110658A CN202010126916.7A CN202010126916A CN111110658A CN 111110658 A CN111110658 A CN 111110658A CN 202010126916 A CN202010126916 A CN 202010126916A CN 111110658 A CN111110658 A CN 111110658A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stearic acid
histidine
chitosan stearic
modified chitosan
ovalbumin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010126916.7A
Other languages
English (en)
Inventor
胡富强
杨喜琴
孟廷廷
袁弘
曾颖萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN202010126916.7A priority Critical patent/CN111110658A/zh
Publication of CN111110658A publication Critical patent/CN111110658A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5176—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明提供一种淋巴结靶向纳米复合物及制备和应用。在1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N‑N‑羟基琥珀酰亚胺催化及酸性条件下，组氨酸与壳聚糖硬脂酸发生化学键合，生成组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸，组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸在水性介质中自聚集形成胶束，具有良好的酸环境响应性，与抗原卵白蛋白及成熟树突状细胞膜复合后形成淋巴结靶向纳米复合物。成熟树突状细胞膜的复合可提高纳米复合物对淋巴结树突状细胞的靶向性，可实现纳米复合物对树突状细胞溶酶体酸环境的响应性，以增强抗原呈递并诱导产生细胞免疫，提高肿瘤免疫治疗疗效。本发明纳米复合物具有优良淋巴结靶向性及酸环境响应性，可应用于肿瘤免疫治疗。

Description

一种淋巴结靶向纳米复合物及制备和应用
技术领域
本发明属制药领域，涉及一种组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸及制备和应用，是组氨酸与壳聚糖硬脂酸的化学键合、成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的制备，以及组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸在制备淋巴结靶向纳米复合物中的应用，所述复合物用于肿瘤免疫治疗。
背景技术
肿瘤免疫治疗是通过激发或增强机体免疫功能来治疗恶性肿瘤，具有高特异性、低毒性、克服肿瘤耐药性等优点。虽然免疫检查点抑制剂等免疫治疗药在治疗恶性肿瘤方面已经取得了很多突破性成果，但许多患者自身产生的免疫细胞数量不足，导致无法从中受益。因此，如何最大化的激发免疫系统进行具有广泛适用性的免疫治疗是目前研究者最为关心的问题。肿瘤疫苗是利用肿瘤特异性抗原来激活抗原提呈细胞，从而启动抗原特异性细胞免疫和体液免疫。这种方式可用于治疗对其他免疫治疗无反应或缺乏靶标的患者，适用性更广。但目前很多疫苗由于不能诱导或增强细胞免疫效应，所以免疫治疗疗效不如人意。
随着纳米技术的发展，越来越多的抗原递送载体不断涌现。借助抗原递送载体可改变抗原在免疫细胞内的呈递途径，诱导产生特定的免疫反应，如促进抗原从溶酶体逃逸至胞浆后通过MHC-Ⅰ途径交叉呈递，诱导机体产生抗原特异的细胞免疫反应，尤其是细胞毒性T淋巴细胞反应，从而实现更高效的肿瘤免疫治疗疗效。
淋巴结是机体重要的免疫器官。与外周组织相比，淋巴结中含有更多的树突状细胞，且淋巴结树突状细胞的抗原呈递效率比外周组织树突状细胞的抗原呈递效率高。因此，直接将抗原靶向递送至淋巴结树突状细胞，可诱导产生更强的免疫效应。
组氨酸是一种具有咪唑官能团的碱性氨基酸，可快速供出或接受质子，且其具有一定的膜融合作用，在溶酶体的酸性环境下带正电，并与溶酶体膜产生静电相互作用，诱导水和离子进入导致溶酶体破裂。壳聚糖硬脂酸具有毒性低、生物相容性好等优点，通过组氨酸上的羧基与壳聚糖硬脂酸中壳聚糖的游离氨基化学键合，得到组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸。组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸在水性介质中自聚集形成的胶束具有良好的酸环境响应性，与带负电的抗原卵白蛋白复合后，再与成熟树突状细胞膜复合，可增强淋巴结树突状细胞的靶向摄取，促使抗原实现溶酶体逃逸，诱导产生很强的细胞免疫反应，实现高效肿瘤免疫治疗。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种淋巴结靶向纳米复合物，由成熟树突状细胞膜、组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸、卵白蛋白组成，其中组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸与卵白蛋白质量比为1：1～5：1，成熟树突状细胞膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸质量比为0.25：1～5：1(纳米复合物中成熟树突状细胞膜的量是根据成熟树突状细胞膜蛋白与其他成分的质量比确定的)。其中组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸具有代表性的结构通式为：
Figure BDA0002394678370000021
式中n为硬脂酸的化学修饰比例，范围为7.14％～7.70％，m为组氨酸的化学修饰比例，范围为6.58％～8.26％。
本发明的第二个目的是提供所述的淋巴结靶向纳米复合物，通过以下步骤制备：取组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸，溶于去离子水，制备浓度为0.5～1.0mg/mL的溶液。取卵白蛋白，加去离子水超声溶解，制备浓度为0.5～1.0mg/mL的溶液。将适量卵白蛋白加入组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸溶液，使得组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸与卵白蛋白质量比为1：1～5：1(其中最优比为3：1)，涡旋，静置，得到组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物。提取成熟树突状细胞的细胞膜，将细胞膜蛋白浓度调整为0.5～1.0mg/mL。取一定体积的细胞膜溶液，与一定量的组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白的复合物溶液混合，使得成熟树突状细胞膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸质量比为0.25：1～5：1(其中最优比为2：1)(纳米复合物中成熟树突状细胞膜的量是根据成熟树突状细胞膜蛋白与其他成分的质量比确定的)。用脂质体挤出器来回挤压，得到成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物。
本发明的第三个目的是提供所述组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的制备方法，通过以下步骤实现：
取组氨酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-N-羟基琥珀酰亚胺(摩尔比为1：1.3：1～1：1.4：1)，加去离子水,水浴超声溶解后室温条件下搅拌活化1.0～1.5小时；取壳聚糖硬脂酸溶于pH＝6.0醋酸盐缓冲液，探头超声，制备浓度为13.7～14.0mg/mL的溶液；向壳聚糖硬脂酸溶液中加入上述活化液(壳聚糖硬脂酸与组氨酸摩尔比为1：1～1：3)，室温缓慢搅拌反应22～24小时，将反应液置于透析袋中透析，透析液冷冻干燥，得组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸。其中的壳聚糖硬脂酸制备方法如下：取处方量硬脂酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶于乙醇，60℃搅拌活化1小时，另取500mg壳聚糖，溶于去离子水，将两种溶液混合，60℃搅拌反应20小时后将反应液于透析袋中透析，透析液冷冻干燥，得组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸。
合成路线：
Figure BDA0002394678370000031
式中n为硬脂酸的化学修饰比例，范围为7.14％～7.70％，m为组氨酸的化学修饰比例，范围为6.58％～8.26％。
本发明的第四个目的是提供淋巴结靶向纳米复合物在制备抗肿瘤疫苗中的应用，所述肿瘤为黑色素瘤。组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸通过静电吸引与负电性抗原卵白蛋白复合，然后再与负电性成熟树突状细胞膜复合，并利用脂质体挤出器挤压后得到淋巴结靶向纳米复合物。选用黑色素瘤为肿瘤模型，皮内注射纳米复合物，考察纳米复合物对黑色素瘤的免疫治疗疗效，结构显示可提高对淋巴结树突状细胞的靶向性，促进抗原呈递，增强免疫效应，达到免疫治疗的目的。
本发明利用壳聚糖硬脂酸上的氨基与组氨酸的羧基在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-N-羟基琥珀酰亚胺催化及酸性条件下发生化学键合，合成组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸。组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸与抗原卵白蛋白通过静电复合后，再与负电性成熟树突状细胞膜复合，以提高淋巴结树突状细胞对纳米复合物的摄取，促进抗原溶酶体逃逸，进而增加抗原交叉呈递，提高肿瘤免疫治疗疗效。本发明已证明组氨酸的修饰可实现纳米复合物在酸性条件下对抗原的响应性释放，并在动物水平证明成熟树突状细胞膜的复合可提高淋巴结树突状细胞对纳米复合物的摄取，以及淋巴结靶向纳米复合物具有显著的肿瘤免疫治疗疗效。
本发明的有益之处是：(1)提供的功能性组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸，是一种酸环境响应性纳米载体。利用这种载体，可用于抗原卵白蛋白的酸环境响应性释放，提高免疫治疗疗效。(2)本发明中，将成熟树突状细胞膜与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白进行组合，组成的复合物可提高对淋巴结树突状细胞的靶向性，促进抗原呈递，增强免疫效应，达到免疫治疗的目的。
附图说明
图1为壳聚糖(A)、硬脂酸(B)、壳聚糖硬脂酸(C)、组氨酸(D)、组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸(E)的核磁共振氢谱。
图2为组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸与卵白蛋白不同质量比条件下，组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物中卵白蛋白的含量。
图3为成熟树突状细胞膜膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸不同质量比条件下，成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的平均粒径。
图4为成熟树突状细胞膜膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸不同质量比条件下，成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的电位。
图5为壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白(A)、组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白(B)、成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白(C)在pH＝5.0磷酸盐缓冲液中卵白蛋白的释放。
图6为卵白蛋白(A)、壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白(B)、组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白(C)、成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白(D)被淋巴结树突状细胞摄取的情况。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
(1)组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的合成
取19.0mg组氨酸、33.0mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、14.0mg N-N-羟基琥珀酰亚胺，加2mL去离子水,水浴超声溶解后室温条件下搅拌活化1.0小时；取27.0mg壳聚糖硬脂酸(该嫁接物为国家发明专利ZL200610051601.0所公开)，溶于pH＝6.0醋酸盐缓冲液，探头超声；向壳聚糖硬脂酸溶液缓慢加入上述活化液，室温缓慢搅拌22小时，将反应液置于透析袋中透析，透析液冷冻干燥，得组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸。图1为壳聚糖(A)、硬脂酸(B)、壳聚糖硬脂酸(C)、组氨酸(D)、组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸(E)的核磁共振氢谱，由图可确定组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的结构。
(2)组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的理化性质
三硝基苯磺酸法测定组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的氨基取代度。配制1.0mg/mL壳聚糖储备液，取一系列体积梯度的壳聚糖储备液，加去离子水定容后，加入NaHCO3溶液及三硝基苯磺酸溶液，37℃避光孵育2h。加入盐酸并水浴超声后于344nm波长处测定不同浓度壳聚糖溶液吸光度值。取组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸溶液，同法操作，测定该溶液344nm处吸光度值，按标准曲线计算组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的氨基取代度为14.84±0.56％。
将芘作为荧光探针，采用荧光分光光度法，测定组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度。分别精密移取0.5mL芘丙酮溶液至玻璃试管中，待试管中的丙酮完全挥发后，加入一系列不同浓度的组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸溶液，室温下避光水浴超声，使用荧光分光光度计扫描样品的激发光谱和发射光谱，记录第一个峰值(I1＝374nm)和第三个峰值(I3＝385nm)的比值(I1/I3)，以I1/I3为纵坐标，浓度的log值为横坐标作图，计算组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为77.66±2.44μg/mL。
精密称定10mg的组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸，将其溶于20mL的去离子水中，探头超声20次，得到0.5mg/mL溶液。取适量的组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸溶液，用微粒粒度与表面电位测定仪(Zetasizer)测定组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的粒径为105.41±2.61nm，Zeta电位为18.57±1.40mv。
实施例2
(1)组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的合成
取19.2mg组氨酸、33.3mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、14.2mg N-N-羟基琥珀酰亚胺，加2mL去离子水,水浴超声溶解后室温条件下搅拌活化1.0小时；取27.2mg壳聚糖硬脂酸(该嫁接物为国家发明专利ZL200610051601.0所公开)，溶于pH＝6.0醋酸盐缓冲液，探头超声；向壳聚糖硬脂酸溶液缓慢加入上述活化液，室温缓慢搅拌22小时，将反应液置于透析袋中透析，透析液冷冻干燥，得组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸。
(2)组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的制备
取卵白蛋白，溶于去离子水，制备1.0mg/mL卵白蛋白溶液。取组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸，加去离子水探头超声溶解，制备1.0mg/mL溶液。将卵白蛋白溶液加至组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸溶液中，使得组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸与卵白蛋白的质量比为1：1、2：1、3：1、4：1、5：1。涡旋30秒后静置30分钟，得不同质量比的组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物。
(3)组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的理化性质
BCA法测定上述制备的组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物中卵白蛋白的含量。分别取适量不同质量比的组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物于超滤离心管中，8000转离心10分钟，收集离心管下层溶液，并按照BCA蛋白测定试剂盒操作流程测定下层溶液中卵白蛋白含量，并计算复合物中卵白蛋白含量。图2为组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸与卵白蛋白不同质量比条件下，组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物中卵白蛋白的含量，由图可确定当组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸与卵白蛋白的质量比为3：1时，组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物中卵白蛋白的含量最高。
取适量组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸与卵白蛋白质量比为3：1的复合物溶液，用微粒粒度与表面电位测定仪(Zetasizer)测定组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的粒径为151.11±12.11nm，Zeta电位为7.63±0.81mv，卵白蛋白含量为21.66±0.21％。
实施例3
(1)组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的合成
取19.3mg组氨酸、33.4mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、14.3mg N-N-羟基琥珀酰亚胺，加2mL去离子水,水浴超声溶解后室温条件下搅拌活化1.5小时；取27.4mg壳聚糖硬脂酸(该嫁接物为国家发明专利ZL200610051601.0所公开)，溶于pH＝6.0醋酸盐缓冲液，探头超声；向壳聚糖硬脂酸溶液缓慢加入上述活化液，室温缓慢搅拌24小时，将反应液置于透析袋中透析，透析液冷冻干燥，得组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸。
(2)组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的制备
取卵白蛋白，溶于去离子水，制备1.0mg/mL卵白蛋白溶液。取适量组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸，加去离子水探头超声溶解，制备1.0mg/mL溶液。将卵白蛋白溶液加至组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸溶液中，使得组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸与卵白蛋白的质量比为3：1。涡旋30秒后静置30分钟，得不同质量比的组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物。
(3)成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的制备
提取成熟树突状细胞膜，水浴超声，制备蛋白浓度为0.5mg/mL的细胞膜溶液。取不同体积质量比为3：1的组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物溶液加至树突状细胞膜溶液中，使得膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的质量比为0.25：1、0.5：1、1：1、2：1、4：1、5：1，将混合溶液用脂质体挤出器来回挤压，得成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物。
(4)成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的理化性质
用微粒粒度与表面电位测定仪(Zetasizer)测定膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸质量比不同的成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的粒径和Zeta电位。图3为成熟树突状细胞膜膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸不同质量比条件下，成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的平均粒径，由图可确定当成熟树突状细胞膜膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸质量比为2：1时，成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的粒径最小。图4为成熟树突状细胞膜膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸不同质量比条件下，成熟树突状细胞膜/氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的电位，由图可确定当树突状细胞膜膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸质量比为2：1时，成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的电位适中。
取适量成熟树突状细胞膜膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸质量比为2：1的复合物溶液，用微粒粒度与表面电位测定仪(Zetasizer)测定成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的粒径为149.93±7.85nm，Zeta电位为-5.63±0.31mv，卵白蛋白含量为21.03±0.05％。
取壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白、组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白、成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物，13000转离心10分钟，弃去上清液，沉淀用pH＝5.0磷酸盐缓冲液分散，用于考察复合物在树突状细胞溶酶体pH条件下的抗原释放情况。将分散液置于恒温箱中恒温振荡(37℃,60rpm)，于1、2、4、8、12、24小时定时取样，BCA法测定样品中卵白蛋白浓度，根据标准曲线计算复合物中卵白蛋白的累积释放百分率。图5为壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白(A)、组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白(B)、树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白(C)在pH＝5.0磷酸盐缓冲液中卵白蛋白的释放，由图可确定组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合、成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物可响应溶酶体pH释放抗原，从而促使抗原实现溶酶体逃逸。
实施例4
(1)组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的合成
取19.5mg组氨酸、33.6mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、14.5mg N-N-羟基琥珀酰亚胺，加2mL去离子水,水浴超声溶解后室温条件下搅拌活化1.5小时；取27.4mg壳聚糖硬脂酸(该嫁接物为国家发明专利ZL200610051601.0所公开)，溶于pH＝6.0醋酸盐缓冲液，探头超声；向壳聚糖硬脂酸溶液缓慢加入上述活化液，室温缓慢搅拌24小时，将反应液置于透析袋中透析，透析液冷冻干燥，得组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸。
(2)组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的制备
取卵白蛋白，溶于去离子水，制备1.0mg/mL卵白蛋白溶液。取适量组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸，加去离子水探头超声溶解，制备1.0mg/mL溶液。将卵白蛋白溶液加至组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸溶液中，使得组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸与卵白蛋白的质量比为3：1。涡旋30秒后静置30分钟，得不同质量比的组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物。
(3)成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的制备
提取成熟树突状细胞膜，水浴超声，制备蛋白浓度为0.5mg/mL的细胞膜溶液。取质量比为3：1的组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物溶液加至树突状细胞膜溶液中，使得膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的质量比为2：1，将混合溶液用脂质体挤出器来回挤压，得成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物。
(4)淋巴结树突状细胞对成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的摄取
本发明选用C57BL/6小鼠，以黑色素瘤为肿瘤模型，左侧腹股沟皮内注射卵白蛋白、壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白、组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白、成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白，48小时后，提取小鼠腹股沟淋巴结并制备成单细胞悬浮液，抗体标记树突状细胞，用流式细胞术考察淋巴结树突状细胞对抗原的摄取。图6为卵白蛋白(A)、壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白(B)、组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白(C)、成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白(D)被淋巴结树突状细胞摄取的情况，由图可确定树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物可明显促进树突状细胞对抗原的摄取，有利于增强树突状细胞的抗原呈递。
实施例5
(1)组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的合成
取19.6mg组氨酸、33.8mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、14.6mg N-N-羟基琥珀酰亚胺，加2mL去离子水,水浴超声溶解后室温条件下搅拌活化1.5小时；取27.6mg壳聚糖硬脂酸(该嫁接物为国家发明专利ZL200610051601.0所公开)，溶于pH＝6.0醋酸盐缓冲液，探头超声；向壳聚糖硬脂酸溶液缓慢加入上述活化液，室温缓慢搅拌24小时，将反应液置于透析袋中透析，透析液冷冻干燥，得组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸。
(2)组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的制备
取一定量卵白蛋白，溶于去离子水，制备1.0mg/mL卵白蛋白溶液。取适量组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸，加去离子水探头超声溶解，制备1.0mg/mL溶液。将卵白蛋白溶液加至组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸溶液中，使得组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸与卵白蛋白的质量比为3：1。涡旋30秒后静置30分钟，得不同质量比的组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物。
(3)成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物的制备
提取成熟树突状细胞膜，水浴超声，制备蛋白浓度为0.5mg/mL的细胞膜溶液。取质量比为3：1的组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物溶液加至树突状细胞膜溶液中，使得膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的质量比为2：1，将混合溶液用脂质体挤出器来回挤压，得成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物。
(4)成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物对黑色素瘤免疫治疗疗效
本发明以黑色素瘤为肿瘤模型，将组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸首先通过静电吸引与负电性生物大分子卵白蛋白复合，然后再与负电性成熟树突状细胞膜复合，并利用脂质体挤出器挤压后形成成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物，考察该复合物对黑色素瘤的免疫治疗疗效，结果参见表1。
表1不同制剂对黑色素瘤的肿瘤抑制率
制剂组 肿瘤抑制率(％±)
卵白蛋白 39.47±13.78
壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白 73.22±8.49
组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白 78.02±5.60
成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白 85.80±5.64
由表1可确定成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物具有显著的抗黑色素瘤治疗作用。

Claims (8)

1.一种淋巴结靶向纳米复合物，其特征在于，由成熟树突状细胞膜、组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸、卵白蛋白组成，其中组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸与卵白蛋白质量比为1：1～5：1，成熟树突状细胞膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸质量比为0.25：1～5：1。
2.根据权利要求1所述的一种淋巴结靶向纳米复合物，其特征在于，所述的组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的结构通式为：
Figure FDA0002394678360000011
式中n为硬脂酸的化学修饰比例，范围为7.14％～7.70％，m为组氨酸的化学修饰比例，范围为6.58％～8.26％。
3.权利要求1所述的一种淋巴结靶向纳米复合物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：取组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸，溶于去离子水，制备浓度为0.5～1.0mg/mL的溶液，取卵白蛋白，加去离子水超声溶解，制备浓度为0.5～1.0mg/mL的溶液，将卵白蛋白加入组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸溶液，使得组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸与卵白蛋白质量比为1：1～5：1，涡旋，静置，得到组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物，提取成熟树突状细胞的细胞膜，将细胞膜蛋白浓度调整为0.5～1.0mg/mL，取细胞膜溶液，与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白的复合物溶液混合，使得成熟树突状细胞膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸质量比为0.25：1～5：1，用脂质体挤出器来回挤压，得到成熟树突状细胞膜/组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸/卵白蛋白复合物。
4.根据权利要求3所述的一种淋巴结靶向纳米复合物，其特征在于，组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸与卵白蛋白的质量比为3：1。
5.根据权利要求3所述的一种淋巴结靶向纳米复合物，其特征在于，成熟树突状细胞膜蛋白与组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的质量比为2：1。
6.权利要求1或2所述的一种淋巴结靶向纳米复合物中的组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
取组氨酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-N-羟基琥珀酰亚胺，加去离子水,水浴超声溶解后室温条件下搅拌活化1.0～1.5小时；取壳聚糖硬脂酸，溶于pH＝6.0醋酸盐缓冲液，探头超声，制备浓度为13.7～14.0mg/mL的溶液；向壳聚糖硬脂酸溶液中加入上述活化液，室温缓慢搅拌反应22～24小时，将反应液置于透析袋中透析，透析液冷冻干燥，得组氨酸修饰壳聚糖硬脂酸。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，组氨酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1.3：1～1：1.4：1，壳聚糖硬脂酸与组氨酸摩尔比为1：1～1：3。
8.根据权利要求1所述的一种淋巴结靶向纳米复合物在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
CN202010126916.7A 2020-02-28 2020-02-28 一种淋巴结靶向纳米复合物及制备和应用 Pending CN111110658A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010126916.7A CN111110658A (zh) 2020-02-28 2020-02-28 一种淋巴结靶向纳米复合物及制备和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010126916.7A CN111110658A (zh) 2020-02-28 2020-02-28 一种淋巴结靶向纳米复合物及制备和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111110658A true CN111110658A (zh) 2020-05-08

Family

ID=70493219

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010126916.7A Pending CN111110658A (zh) 2020-02-28 2020-02-28 一种淋巴结靶向纳米复合物及制备和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111110658A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016210103A1 (en) * 2015-06-26 2016-12-29 Advanced Bionutrition Corporation Composition for delivery of active agents to an animal
CN106309369A (zh) * 2016-08-22 2017-01-11 李因传 一种dc细胞膜仿生脂质体药物载体、制作方法及其应用
CN107778378A (zh) * 2017-10-26 2018-03-09 浙江大学 甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物及制备和应用
CN109265579A (zh) * 2018-11-12 2019-01-25 昆明理工大学 一种具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒及其制备方法和应用
CN110124044A (zh) * 2019-06-20 2019-08-16 中国海洋大学 基于壳聚糖的两亲性自组装纳米载体及其制备方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016210103A1 (en) * 2015-06-26 2016-12-29 Advanced Bionutrition Corporation Composition for delivery of active agents to an animal
CN106309369A (zh) * 2016-08-22 2017-01-11 李因传 一种dc细胞膜仿生脂质体药物载体、制作方法及其应用
CN107778378A (zh) * 2017-10-26 2018-03-09 浙江大学 甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物及制备和应用
CN109265579A (zh) * 2018-11-12 2019-01-25 昆明理工大学 一种具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒及其制备方法和应用
CN110124044A (zh) * 2019-06-20 2019-08-16 中国海洋大学 基于壳聚糖的两亲性自组装纳米载体及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JI SUN PARK, ET AL.,: "N-acetyl histidine-conjugated glycol chitosan self-assembled nanoparticles for intracytoplasmic delivery of drugs: endocytosis, exocytosis and drug release", 《J CONTROL RELEASE》 *
RONNIE H FANG, ET AL.,: "Cancer Cell Membrane-Coated Nanoparticles for Anticancer Vaccination and Drug Delivery", 《NANO LETT》 *
XIQIN YANG,ET AL.,: "pH-Responsive Biomimetic Polymeric Micelles as Lymph Node-Targeting Vaccines for Enhanced Antitumor Immune Responses", 《BIOMACROMOLECULES》 *
YANG, XIQIN, ET AL.,: "Immune Adjuvant Targeting Micelles Allow Efficient Dendritic Cell Migration to LymphNodes for Enhanced Cellular Immunity", 《ACS APPL MATER INTERFACES》 *
陈彰旭: "组氨酸改性壳聚糖材料在仿生合成和蛋白分离的应用研究", 《医药卫生科技辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ding et al. A prodrug hydrogel with tumor microenvironment and near-infrared light dual-responsive action for synergistic cancer immunotherapy
Song et al. Self-assembled polymeric nanocarrier-mediated co-delivery of metformin and doxorubicin for melanoma therapy
Zhang et al. Modified Fe 3 O 4 magnetic nanoparticle delivery of CpG inhibits tumor growth and spontaneous pulmonary metastases to enhance immunotherapy
Yang et al. A new concept of enhancing immuno-chemotherapeutic effects against B16F10 tumor via systemic administration by taking advantages of the limitation of EPR effect
Song et al. Overcoming blood–brain barrier by HER2-targeted nanosystem to suppress glioblastoma cell migration, invasion and tumor growth
Zhang et al. Cytomembrane‐Mediated Transport of Metal Ions with Biological Specificity
JPWO2005087196A1 (ja) 免疫応答システムを利用したドラッグデリバリーシステム
CN102973512B (zh) 负载阿霉素并具有叶酸受体靶向功能的白蛋白纳米粒子制剂及其制备方法
CN114259477A (zh) 一种促渗透、缓解肿瘤缺氧并能靶向肿瘤细胞的纳米递送体系及其制备方法和应用
CN109513000A (zh) 一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法及应用
CN113350524B (zh) 一种肿瘤微环境响应的铁封堵磁性纳米药物及制备方法与应用
Song et al. Core-shell tecto dendrimer-mediated cooperative chemoimmunotherapy of breast cancer
CN111110658A (zh) 一种淋巴结靶向纳米复合物及制备和应用
CN114225029B (zh) 一种声敏响应的纳米颗粒及其应用
CN110354276B (zh) 一种前药及其制备方法和应用
CN112375158A (zh) 壳聚糖基纳米药物载体及其制备方法
CN115252828B (zh) 一种负载棉酚的团簇型超小四氧化三铁纳米粒及其制备和应用
Rodponthukwaji et al. Facile synthesis of magnetic silica-mannan nanocomposites for enhancement in internalization and immune response of dendritic cells
CN110325221B (zh) 用于对癌细胞的选择性荧光标记的纳米载体及其制备方法
US20080193547A1 (en) Polymeric nanoparticles by ion-ion Interactions
CN112535739B (zh) 一种基于肿瘤自身微环境提高基因转染效率的纳米颗粒及其制备方法和应用
CN115708808B (zh) 一种超分子手性聚合物胶束及其应用
CN107778378A (zh) 甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物及制备和应用
CN108904811A (zh) 一种基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载质粒的多功能纳米药物的制备及其应用
Guo et al. β-glucan-modified nanoparticles with different particle sizes exhibit different lymphatic targeting efficiencies and adjuvant effects

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200508

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication