CN109513000A - 一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法，包括以下步骤：1)制备纳米氧化铝粒子；2)制备生物相容性纳米金属粒子；3)制备运载蜂毒肽的纳米载体；4)添加光敏剂得到运载蜂毒肽的光敏性纳米粒子Al2O3@BSA@Melittin@Ce6。本发明的运载蜂毒肽的光敏性纳米载体Al2O3@BSA@Melittin@Ce6应用在制备抗癌药物中。本发明的目的是提供一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法，可解决运载蜂毒肽的光敏性纳米载体的制备问题，同时解决正常细胞对纳米粒子摄取不足的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物纳米医药技术领域，尤其涉及一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法及应用。
背景技术
蜂毒肽(melittin，GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ)是一种两亲性的α螺旋结构的多肽，是蜂毒中的主要活性成分，占其干重的40％-60％。蜂毒肽的活性很高，具有广谱的抗菌功能，能在极短的时间内发挥其作用，其效率是普通抗生素的上百倍。蜂毒肽对于细胞膜结构具有非常高效的破坏性，包括质膜以及胞内一些细胞器的膜结构。其作用机制主要有通过其两亲性的结构嵌入至膜结构中，然后在膜上打孔，致使膜结构发生破裂，膜内外环境的变化最终导致细胞的死亡；也可以通过影响细胞内介导肿瘤增殖的多条信号通路中的关键蛋白，进而引起细胞凋亡因为蜂毒肽在注入血管后会迅速与红细胞结合，破坏细胞膜，以致产生强烈的溶血反应。而且直接将蜂毒肽应用于活体治疗，可能会对机体正常细胞造成破坏，带来极大的毒副作用。另外，蜂毒肽在机体内的半衰期很短，代谢速度很快，并不利于临床的疾病治疗。
纳米运载体作为一种新型的给药方式正逐渐被人们所关注。利用纳米颗粒运载蜂毒肽是一种有效避免其毒副作用的方法。因此，发展一种纳米粒子的稳定运载蜂毒肽的纳米颗粒载药方法，有效地避免蜂毒肽的溶血性和对正常细胞的毒副作用，同时具有特异性富集在病变区域并有效释放蜂毒肽的能力，将会极大地促进蜂毒肽在临床疾病治疗中的应用，并且由于蜂毒肽的破膜作用，能极大促进细胞对纳米粒子的摄取。
光动力疗法(Photodynamic Therapy,PDT)在二十世纪八十年代初就已经被称为“有前景的新型癌症治疗模式”。这可以部分归功于PDT这一有吸引力的概念——三种治疗成份的结合：光敏药物、光和氧。三者本身都是相对无害的，但是三者结合就会产生具有细胞毒性的单线态氧(活氧)对肿瘤进行杀伤且不产生抗药性。光动力疗法是利用药物的光动力效应进行疾病治疗的一种新技术。它采用特定波长的激光激发光敏剂(光动力药物)，激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单线态氧，单线态氧一方面能造成癌瘤中的微血管急性损伤,引起血管阻塞造成局部缺血；另一方面能直接导致肿瘤细胞死亡，从而达到局部治疗肿瘤的目的。尽管，目前光动力治疗结合纳米粒子的研究取得了很大的进展，但取得广泛的应用是还面临很多的问题：由于纳米粒子尺寸和非特异性，所以细胞对纳米粒子的摄取只能达到有限的程度。
因此，如何开发一种运载蜂毒肽载体，该载体又能够增加细胞对其摄取，从而提高光动力治疗的效率，成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供了一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法，可解决运载蜂毒肽的光敏性纳米载体的制备问题，同时解决正常细胞对纳米粒子摄取不足的技术问题。
本发明的目的之一是提供一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法，是通过以下技术手段实现的：
一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法，包括以下步骤：
1)制备纳米氧化铝粒子：将Al3+金属盐溶于水中，逐滴加入碱性试剂，调节pH达到碱性环境，在高温高压条件下进行氧化还原反应，反应完全后，依次经离心分离、洗涤，得到纳米氧化铝粒子；
2)制备生物相容性纳米金属粒子：将所述步骤1)得到的纳米氧化铝粒子在水中超声分散，加入牛血清蛋白BSA，进行吸附反应，反应完全后透析后得到生物相容性纳米金属粒子Al2O3@BSA；
3)制备运载蜂毒肽的纳米载体：将所述步骤2)中得到的生物相容性纳米金属粒子Al2O3@BSA分散在蒸馏水中，加入蜂毒肽，搅拌后静置过夜，依次经洗涤、离心、透析后，得到用于运载蜂毒肽的纳米粒子Al2O3@BSA@Melittin；
4)添加光敏剂：将步骤3)中得到运载蜂毒肽的纳米载体Al2O3@BSA@Melittin分散于去离子水中，加入光敏剂Ce6，搅拌后静置过夜，依次经洗涤、离心、透析后，得到运载蜂毒肽的光敏性纳米粒子Al2O3@BSA@Melittin@Ce6。
所述步骤1)中的碱性试剂为乙二胺，加入所述乙二胺调节溶液使pH值大于7后搅拌。
所述步骤1)中，调节pH达到碱性环境后，放入水热反应釜中，在200℃反应8h，反应完后溶液自然冷却。
所述步骤1)中，洗涤时使用的试剂为乙醇和/或去离子水。
所述步骤2)中，生物相容性纳米金属粒子Al2O3@BSA经超声分散在蒸馏水中，搅拌2小时后，加入BSA溶液在室温下再搅拌24小时，透析3天后，得到生物相容性纳米金属粒子Al2O3@BSA。
所述步骤3)中蜂毒肽的添加方式为，先将部分所述蜂毒肽融入蒸馏水中，再逐滴加入，直至反应完全。
所述步骤4)中Ce6的添加方式为，将所述Ce6溶于二甲基亚砜溶液中，再逐滴加入到分散后的运载蜂毒肽的纳米载体Al2O3@BSA@Melittin溶液中，确保反应充分。
所述步骤3)和步骤4)中搅拌静置过夜的静置时间为24小时。
本发明的目的之二是将运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法用于制备抗癌药物：
运载蜂毒肽的光敏性纳米载体Al2O3@BSA@Melittin@Ce6在制备抗癌药物中的应用。
本发明有以下积极有益效果：
1)本发明提供的一种用于肿瘤光动力治疗的纳米载体的制备方法，步骤2)中，利用价格低廉的牛血清蛋白，赋予材料更加优异的生物相容性，并作为桥梁携带蜂毒肽，极大提高蜂毒肽的包封率。
2)毒副作用低：蜂毒肽作为一种带有正电荷的两亲性多肽可以增加其与牛血清蛋白之间的相互作用，使其埋藏在牛血清蛋白当中，从而避免了与血细胞和正常细胞的直接接触。动物实验研究结果显示，运载蜂毒肽的纳米颗粒治疗组能够明显地抑制肿瘤的生长，且实验小鼠的血液生化指标与对照组之间无显著差异且都在正常值范围内。
3)本发明提供的一种用于肿瘤光动力治疗的纳米载体的制备方法，步骤4)中，加入光敏剂Ce6，在光照条件下，能产生大量活性氧，增强对肿瘤治愈效果。Ce6同时具有荧光成像的功能，可以实现癌症的诊断治疗一体化，有望在恶性肿瘤的治疗中取得好的疗效。
4)本发明提供的一种用于肿瘤光动力治疗的纳米载体的制备方法，通过纳米级的金属氧化铝结构，结合和有机光敏性Ce6的性质，具有合适的尺寸，良好的生物相容性及生物降解性，用于光动力治疗可以提高光敏性物质含量，通过EPR效应赋予肿瘤部位更多的光敏剂；其中EPR效应即实体瘤的高通透性和滞留效应(enhancedpermeabilityandretention effect)指的是，相对于正常组织，某些尺寸的分子或颗粒更趋向于聚集在肿瘤组织的性质。正常组织中的微血管内皮间隙致密、结构完整，大分子和脂质颗粒不易透过血管壁，而实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子类物质和脂质颗粒具有选择性高通透性和滞留性，这种现象被称作实体瘤组织的高通透性和滞留效应，简称EPR效应。EPR效应促进了大分子类物质在肿瘤组织的选择性分布，可以增加药效并减少系统副作用。
5)蜂毒肽与光动力的协同作用：由于蜂毒肽的穿膜作用，能增强细胞对纳米粒子的摄取，从而能增强光动力产生线性氧的作用效果。
附图说明
图1为本发明试验实施例1中纳米载体Al2O3@BSA@Melittin@Ce6的扫描电镜(SEM)图；
图2为本发明试验实施例3中纳米载体的动态激光光散射(DLS)水合粒径图；
图3为本发明试验实施例2中纳米载体Al2O3@BSA@Melittin@Ce6的紫外光谱吸收图；
图4为本发明试验实施例4中纳米载体作用于细胞的毒性检测图；
图5为本发明试验实施例4中纳米颗粒抑制4T1肿瘤在BALB/C鼠体内的生长时间与肿瘤体积的关系曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。
以下实施例仅是为清楚说明本发明所作的举例，而并非对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在下述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，而这些属于本发明精神所引出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法，包括以下步骤：
1)制备纳米氧化铝粒子：将Al3+金属盐溶于水中，逐滴加入碱性试剂，调节pH达到碱性环境，在高温高压条件下进行氧化还原反应，反应完全后，依次经离心分离、洗涤，得到纳米氧化铝粒子；
2)制备生物相容性纳米金属粒子：将所述步骤1)得到的纳米氧化铝粒子在水中超声分散，加入牛血清蛋白BSA，反应完全后透析后得到生物相容性纳米金属粒子Al2O3@BSA；该步骤中，纳米氧化铝粒子和牛血清蛋白的反应原理为由于BSA为一种带负电荷的蛋白质，而纳米氧化铝为一种正电荷较高的纳米粒子，通过正负电荷的相互吸引。
3)制备运载蜂毒肽的纳米载体：将所述步骤2)中得到的生物相容性纳米金属粒子Al2O3@BSA分散在蒸馏水中，加入蜂毒肽，搅拌后静置过夜，依次经洗涤、离心、透析后，得到用于运载蜂毒肽的纳米粒子Al2O3@BSA@Melittin；该步骤中，蜂毒肽作为一种带有正电荷的两亲性多肽可以增加其与牛血清蛋白之间的相互作用，具体原理为：BSA也是一种具有亲疏水性的大分子蛋白质，在于Melittin混合反应后，二者通过亲疏水性的原理，BSA能将Melittin更好地包覆于其复杂结构中，从而在体液循环中，较好减弱Melittin的溶血性。
4)添加光敏剂：将步骤3)中得到运载蜂毒肽的纳米载体Al2O3@BSA@Melittin分散于去离子水中，加入光敏剂Ce6，搅拌后静置过夜，依次经洗涤、离心、透析后，得到运载蜂毒肽的光敏性纳米粒子Al2O3@BSA@Melittin@Ce6。
所述步骤1)中的碱性试剂为乙二胺，加入所述乙二胺调节溶液使pH值大于7后搅拌。
所述步骤1)中，调节pH达到碱性环境后，放入水热反应釜中，在200℃反应8h，反应完后溶液自然冷却。
所述步骤1)中，洗涤时使用的试剂为乙醇和/或去离子水。
所述步骤2)中，生物相容性纳米金属粒子Al2O3@BSA经超声分散在蒸馏水中，搅拌2小时后，加入BSA溶液在室温下再搅拌24小时，透析3天后，得到生物相容性纳米金属粒子Al2O3@BSA。
所述步骤3)中蜂毒肽的添加方式为，先将部分所述蜂毒肽融入蒸馏水中，再逐滴加入，直至反应完全。
所述步骤4)中Ce6的添加方式为，将所述Ce6溶于二甲基亚砜溶液中，再逐滴加入到分散后的运载蜂毒肽的纳米载体Al2O3@BSA@Melittin溶液中，确保反应充分。
所述步骤3)和步骤4)中搅拌静置过夜的静置时间为24小时。
运载蜂毒肽的光敏性纳米载体Al2O3@BSA@Melittin@Ce6在制备抗癌药物中的应用。
本发明中的光敏剂为现有的市售二氢卟吩e6(Chlorin e6)，即权利要求中的Ce6。
所述的纳米颗粒由氧化铝、牛血清蛋白(BSA)、二氢卟吩e6、蜂毒肽(Melittin)通过亲疏水和分子间电荷作用组成。用该方法制备得到的纳米粒子，能够有效降低蜂毒肽对于机体的毒副作用，特异性地在肿瘤等疾变区域发挥作用，由于melittin的破膜作用，能促进纳米粒子进入细胞，极大提高了光动力作用效果。
实施例1
步骤一：在50mL烧瓶内，加入20mL去离子水，将3.7mol的Al3+溶液入到去离子水中，然后取238uL的乙二胺溶液逐滴加入，室温下搅拌30min，之后将混合溶液加入水热反应釜中，保持200℃反应8小时，反应后的溶液自然冷却至室温，经离心分离，依次用乙醇和去离子水洗涤去除残留溶剂，纯化后的纳米粒子在4℃下储存。
步骤二：取步骤一制得的纳米粒子100mg，在去离子水中超声分散2小时，然后在磁力搅拌条件下立刻加入2mL的BSA溶液(0.1mmol/L)，室温下再搅拌24小时，反应后的混合溶液置于透析袋内放置在去离子水中透析，每4小时换一次去离子水，持续三天，得到Al2O3@BSA粒子在4℃下储存备用。
步骤三：取步骤二中制得的Al2O3@BSA粒子25mg，将其分散在10mL去离子水中，置于25mL的烧瓶中，室温下搅拌2分钟后，加入5mg蜂毒肽，搅拌6h；搅拌后的溶液用去离子水透析48小时去除未反应的蜂毒肽，得到纳米粒子Al2O3@BSA@Melittin，置于4℃下保存。
步骤四：取步骤三制得的Al2O3@BSA@Melittin纳米粒子25mg，将其分散在10mL去离子水中，置于25mL的烧瓶中，在室温下搅拌2分钟，加入10mg的Ce6，搅拌6h，搅拌后的溶液用去离子水透析48小时去除未反应的Ce6，得到Al2O3@BSA@Melittin@Ce6，最终得到的溶液置于4℃下保存。
试验实施例1
采用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)对实施例1制得的纳米载体Al2O3@BSA@Melittin@Ce6的形貌进行表征。首先将样品置于无水乙醇中，超声震荡使其分散，将分散液滴于涂油碳膜的小铜网上，晾干。在不同分辨率下对被测样品的形貌进行表征，其结果如图1所示，所得纳米粒子长度在150nm左右。
试验实施例2
本实验利用漫反射紫外光谱检测光敏剂Ce6化合物的特征吸收峰，420nm附近强吸收峰称为Soret带，500～750nm范围的若干个弱吸收称为Q带。本试验实施例检测结果如图3所示。
试验实施例3
分析本发明实施例1提供纳米粒子的表面电荷，在氧化铝纳米粒子表面修饰BSA、蜂毒肽和Ce6后，使纳米粒子表面电荷变为负电荷，增加了纳米粒子的生物相容性。本试验实施例检测结果如图2所示。
试验实施例4
分析本发明实施例1提供纳米粒子的的细胞作用实验，从图4中可以看出，AlNP@BSA@Melittin加光照的实验组取的了最佳作用效果，其效果远远高于单纯光动力的Melittin的作用效果，可以说明蜂毒肽能协同光动力，取得更好的杀伤癌细胞效果。
试验实施例5
建立实施例1中制备得到的运载蜂毒肽的纳米颗粒在体治疗肿瘤模型：
构建4T1皮下肿瘤模型。消化4T1细胞，使用灭菌的PBS漂洗两次后进行细胞计数，最后将细胞浓度定为8×106个/L。麻醉BAlB/C小鼠，将肿瘤细胞溶液注射至鼠右腿根部皮下，注射体积为100μL。接种日期定为第0天，其后的日期分别记做第1、2、3……天。当肿瘤体积到达30mm3时，按照需求对鼠进行分层随机分组，每组建议数量不低于5只。
在肿瘤体积等于30mm3时开始尾静脉注射。注射前先对各鼠进行标记，称取各鼠的质量，在预先制定好的表格中记录。
注射周期为每隔一天注射一次，共4次。在第16天时取血化验并立即处死小鼠进行后续实验操作。使用游标卡尺来测定肿瘤体积。从第5天开始测量，每隔一天测一次，测量数据需及时记录在表格中。体积的计算公式为V＝0.5×L×W2。
参见图5，经过4轮治疗后，相对于其余三种试剂，本发明提供的运载蜂毒肽的纳米颗粒Al2O3@BSA@Melittin@Ce6的抑瘤率最高，达到90％，与对照组相比具有显著的治疗效果。解剖后的肿瘤块对比也很明显地印证了这一效果。
Claims (9)
1.一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备纳米氧化铝粒子：将Al3+金属盐溶于水中，逐滴加入碱性试剂，调节pH达到碱性环境，在高温高压条件下进行氧化还原反应，反应完全后，依次经离心分离、洗涤，得到纳米氧化铝粒子；
2)制备生物相容性纳米金属粒子：将所述步骤1)得到的纳米氧化铝粒子在水中超声分散，加入牛血清蛋白BSA，进行吸附反应，反应完全后透析后得到生物相容性纳米金属粒子Al2O3@BSA；
3)制备运载蜂毒肽的纳米载体：将所述步骤2)中得到的生物相容性纳米金属粒子Al2O3@BSA分散在蒸馏水中，加入蜂毒肽，搅拌后静置过夜，依次经洗涤、离心、透析后，得到用于运载蜂毒肽的纳米粒子Al2O3@BSA@Melittin；
4)添加光敏剂：将步骤3)中得到运载蜂毒肽的纳米载体Al2O3@BSA@Melittin分散于去离子水中，加入光敏剂Ce6，搅拌后静置过夜，依次经洗涤、离心、透析后，得到运载蜂毒肽的光敏性纳米粒子Al2O3@BSA@Melittin@Ce6。
2.如权利要求1所述的一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的碱性试剂为乙二胺，加入所述乙二胺调节溶液使pH值大于7后搅拌。
3.如权利要求1所述的一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，调节pH达到碱性环境后，放入水热反应釜中，在200℃反应8h，反应完后溶液自然冷却。
4.如权利要求1所述的一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，洗涤时使用的试剂为乙醇和/或去离子水。
5.如权利要求1所述的一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，生物相容性纳米金属粒子Al2O3@BSA经超声分散在蒸馏水中，搅拌2小时后，加入BSA溶液在室温下再搅拌24小时，透析3天后，得到生物相容性纳米金属粒子Al2O3@BSA。
6.如权利要求1所述的一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法，其特征在于，所述步骤3)中蜂毒肽的添加方式为，先将部分所述蜂毒肽融入蒸馏水中，再逐滴加入，直至反应完全。
7.如权利要求1所述的一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法，其特征在于，所述步骤4)中Ce6的添加方式为，将所述Ce6溶于二甲基亚砜溶液中，再逐滴加入到分散后的运载蜂毒肽的纳米载体Al2O3@BSA@Melittin溶液中，确保反应充分。
8.如权利要求1所述的一种运载蜂毒肽的光敏性纳米载体制备方法，其特征在于，所述步骤3)和步骤4)中搅拌静置过夜的静置时间为24小时。
9.权利要求1～8中任一方法所制得的运载蜂毒肽的光敏性纳米载体Al2O3@BSA@Melittin@Ce6在制备抗癌药物中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190326 |
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