CN113855802B - 一种仿生纳米诱饵及其制备方法和在脓毒症治疗中应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种仿生纳米诱饵及其制备方法和在脓毒症治疗中应用,于生物医药技术领域。本发明开发了一种由二氧化铈纳米颗粒与光敏剂Ce6修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒,在其表面进行巨噬细胞膜的包覆,制备得到仿生纳米诱饵,其同时兼具清除氧化应激与中和促炎因子的作用。同时,光敏剂Ce6的负载,使得仿生纳米诱饵具有优异的光动力能力,在近红外激光的照射下,产生单线态氧杀死入侵机体的病原菌,从清除病灶方面治疗脓毒症,产生良好的协同作用,从而为脓毒症的治疗提供新的解决策略,因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种仿生纳米诱饵及其制备方法和在脓毒症治疗中应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
脓毒症(sepsis)是由细菌等病原微生物侵入机体引起的全身炎症反应综合征,其特征是全身炎症反应失控。在脓毒症发病过程中往往伴随着心血管功能崩溃、凝血功能障碍等各种并发症,最终导致多器官功能障碍或衰竭。近年来,尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步,但脓毒症的病死率仍高达30%~70%,已经对人类健康造成巨大威胁。因此,寻找一种有效的手段治疗脓毒症是势在必行的。
引起脓毒症最常见的病因是病原菌入侵机体,在病原菌随着血液扩散至全身各组织的过程中,伴随着大量活性氧(ROS)的产生,过量的ROS会加剧炎症级联反应,刺激如巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞分泌更多炎症因子参与全身炎症反应,最终形成炎症因子风暴,造成脓毒性休克甚至多器官衰竭。因此,细菌等病原体感染、过量的ROS生成以及炎症因子分泌是造成脓毒症高死亡率的主要原因。
随着研究的不断深入,越来越多的手段与技术应用到脓毒症的治疗中。如Jong-HoKim与同事通过液相剥离的方法制备了一种2D-TMD纳米片,并用生物相容性聚合物对其进行功能化处理,该纳米片具有清除线粒体和细胞内NO、H2O2、羟自由基和超氧阴离子自由基的活性,在一定程度上对脓毒症的治疗有积极的影响。但发明人发现,脓毒症是一类反应综合征,难以治疗的原因是多方面的(如大量病原菌感染、过量促炎因子分泌等),仅靠单一手段如清除ROS来治疗脓毒症,往往达不到理想的效果,所以找到一种改善脓毒症环境,达到多方面协同治疗脓毒症的手段是当务之急。
发明内容
本发明提供一种仿生纳米诱饵及其制备方法和在脓毒症治疗中应用。本发明开发了一种由二氧化铈(CeO2)纳米颗粒与光敏剂Ce6修饰的介孔二氧化硅(MSNs)纳米颗粒,在其表面进行巨噬细胞膜(MΦ)的包覆,制备得到仿生纳米诱饵,其同时兼具清除氧化应激与中和促炎因子的作用。同时,光敏剂Ce6的负载,使得仿生纳米诱饵具有优异的光动力能力,在近红外激光的照射下,产生单线态氧(1O2)杀死入侵机体的病原菌,从清除病灶方面治疗脓毒症,从而产生良好的协同作用,为脓毒症的治疗提供新的解决策略。
具体的,本发明涉及以下技术方案:
本发明的第一个方面,提供一种仿生纳米诱饵(C/C-M@MΦ),所述仿生纳米诱饵包括介孔二氧化硅纳米颗粒,所述介孔二氧化硅纳米颗粒修饰有二氧化铈纳米颗粒与光敏剂,在其表面包覆有巨噬细胞膜。
由于CeO2纳米颗粒的修饰,C/C-M@MΦ具有多种类酶活性,包括类过氧化氢酶(CAT-like)、类超氧化物歧化酶(SOD-like)以及羟基自由基抗氧化能力(HORAC),从而可以清除体内过量的ROS,从ROS清除方面治疗脓毒症。
与此同时,巨噬细胞膜(MΦ)的包覆赋予了C/C-M@MΦ纳米颗粒清除细菌内毒素(LPS)以及中和炎症因子的能力,从减轻炎症方面治疗脓毒症。
其中,所述光敏剂可以为二氢卟吩e6(Chlorin e6,Ce6),其通常可由脱镁叶绿酸a合成而得,是一种良好的光敏剂,Ce6产生单线态氧的效率很高,从而更有利于杀死入侵机体的病原菌。
本发明的第二个方面,提供上述仿生纳米诱饵的制备方法,所述方法包括:
S1、将二氧化铈纳米颗粒与介孔二氧化硅纳米颗粒混合制CeO2-MSNs纳米颗粒;
S2、将CeO2-MSNs纳米颗粒加入光敏剂溶液中反应得光敏剂修饰的CeO2-MSNs纳米颗粒;
S3、将巨噬细胞膜与步骤S2制得的光敏剂修饰的CeO2-MSNs纳米颗粒混合即得。
本发明的第三个方面,提供上述仿生纳米诱饵在制备全身炎症反应综合征相关疾病药物中应用。
其中,所述全身炎症反应综合征相关疾病包括脓毒症。
本发明的第四个方面,提供一种全身炎症反应综合征相关疾病的药物,所述药物其活性成分包含上述仿生纳米诱饵。
本发明的第五个方面,提供一种全身炎症反应综合征相关疾病治疗系统,所述系统包括:
a)上述仿生纳米诱饵或上述药物;以及,
b)光照装置。
其中,所述光照装置发射光源为近红外光源,具体的,所述光源波长可为660nm,经近红外光源辐照后,光敏剂Ce6产生单线态氧(1O2)杀死入侵机体的病原菌,从清除病灶方面治疗脓毒症。
本发明的第六个方面,提供一种全身炎症反应综合征相关疾病治疗的方法,所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述仿生纳米诱饵、药物或系统。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果:
上述技术方案提供一种仿生纳米诱饵,由二氧化铈纳米颗粒与光敏剂Ce6修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒,在其表面进行巨噬细胞膜(MΦ)的包覆,制备得到仿生纳米诱饵,由于CeO2纳米颗粒的修饰,C/C-M@MΦ具有多种类酶活性,如类过氧化氢酶、类超氧化物歧化酶以及羟基自由基抗氧化能力,可以清除体内过量的ROS,从ROS清除方面治疗脓毒症。与此同时,MΦ的包覆赋予了C/C-M@MΦ纳米颗粒清除细菌内毒素以及中和炎症因子的能力,从减轻炎症方面治疗脓毒症。除此之外,光敏剂Ce6的负载,让C/C-M@MΦ纳米颗粒具有优异的光动力能力,在近红外激光的照射下,产生单线态氧(1O2)杀死入侵机体的病原菌,从清除病灶方面治疗脓毒症,从三个角度协同治疗脓毒症,从而为脓毒症的治疗提供新的解决策略,因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明仿生纳米诱饵的合成示意图及原理机制图;
图2是本发明实施例中MSNs纳米颗粒仿生纳米诱饵的TEM图;其中,a)为MSNs纳米颗粒;b)为仿生纳米诱饵;
图3是本发明实施例中CeO2、MSNs、Ce6以及Ce6/CeO2-MSNs纳米颗粒的紫外可见吸收光谱;
图4为本发明实施例中C/C-M、MΦ及C/C-M@MΦ纳米颗粒的蛋白质印记图;
图5为本发明实施例中MSNs-NH2、CeO2-MSNs、C/C-M、MΦ及C/C-M@MΦ纳米颗粒的zeta电位和水合粒径图;其中,a)为zeta电位图;b)为水合粒径图;
图6为本发明实施例中不同浓度下C/C-M@MΦ纳米颗粒的细胞毒性图;
图7为本发明实施例中不同浓度下C/C-M@MΦ纳米颗粒类酶活性相关图;其中,a)为类过氧化氢酶活性;b)为类超氧化物歧化酶活性;c)为羟基自由基抑制率;
图8为本发明实施例中不同浓度下C/C-M@a-MΦ纳米颗粒对LPS及炎症因子的清除效果;其中,a)为LPS;b)为TNF-α;c)为IL-1β;d)为IL-6;
图9为本发明实施例中C/C-M@a-MΦ纳米颗粒光照前后细菌培养相关图;其中,a)为代表性图片;b)为图a)中相应琼脂板上菌落数的定量;
图10为本发明实施例中各治疗组脓毒症模型小鼠以及阴性对照组小鼠60h内的存活率;
图11为本发明实施例中各治疗组以及阴性对照组小鼠治疗24h后,腹膜渗出液和血液中三种炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)相对含量图;其中,a)为腹膜渗出液;b)为血液;
图12为本发明实施例中各治疗组小鼠及阴性对照组小鼠腹膜渗出液、血液及主要脏器(肾、脾、肝)中细菌培养实验以及各组治疗组琼脂板上菌落数定量图;其中,a)为各治疗组小鼠及阴性对照组小鼠腹膜渗出液、血液及主要脏器(肾、脾、肝)中细菌培养实验;b)为a)中所示各组治疗组琼脂板上菌落数定量。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法,通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件,这种技术和条件在文献中有完整解释。
结合具体实例对本发明作进一步的说明,以下实例仅是为了解释本发明,并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件,通常按照常规条件,或按照销售公司所推荐的条件;实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可通过商业途径购买得到。
如前所述,脓毒症是一类反应综合征,难以治疗的原因是多方面的(如大量病原菌感染、过量促炎因子分泌等),仅靠单一手段如清除ROS来治疗脓毒症,往往达不到理想的效果。
有鉴于此,本发明的一个典型具体实施方式中,提供一种仿生纳米诱饵(C/C-M@MΦ),所述仿生纳米诱饵包括介孔二氧化硅纳米颗粒,所述介孔二氧化硅纳米颗粒修饰有二氧化铈纳米颗粒与光敏剂,在其表面包覆有巨噬细胞膜。
由于CeO2纳米颗粒的修饰,C/C-M@MΦ具有多种类酶活性,包括类过氧化氢酶(CAT-like)、类超氧化物歧化酶(SOD-like)以及羟基自由基抗氧化能力(HORAC),从而可以清除体内过量的ROS,从ROS清除方面治疗脓毒症。
与此同时,巨噬细胞膜(MΦ)的包覆赋予了C/C-M@MΦ纳米颗粒清除细菌内毒素(LPS)以及中和炎症因子的能力,从减轻炎症方面治疗脓毒症。
其中,所述光敏剂可以为二氢卟吩e6(Chlorin e6,Ce6),其通常可由脱镁叶绿酸a合成而得,是一种良好的光敏剂,Ce6产生单线态氧的效率很高,从而更有利于杀死入侵机体的病原菌。
本申请中,所述巨噬细胞膜可以为哺乳动物源巨噬细胞膜;所述哺乳动物可以为人和非人哺乳动物,所述非人哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、猴、猩猩等。
所述巨噬细胞可以为单核巨噬细胞。
本发明的又一具体实施方式中,所述仿生纳米诱饵平均粒径不大于100nm,在本发明的一个具体实施方式中,所述仿生纳米诱饵的平均粒径为75nm。
本发明的又一具体实施方式中,提供上述仿生纳米诱饵的制备方法,所述方法包括:
S1、将二氧化铈纳米颗粒与介孔二氧化硅纳米颗粒混合制CeO2-MSNs纳米颗粒;
S2、将CeO2-MSNs纳米颗粒加入光敏剂溶液中反应得光敏剂修饰的CeO2-MSNs纳米颗粒;
S3、将巨噬细胞膜与步骤S2制得的光敏剂修饰的CeO2-MSNs纳米颗粒混合即得。
本发明的又一具体实施方式中,所述步骤S1中,所述介孔二氧化硅纳米颗粒为氨基修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒;所述氨基修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒,其制备方法包括:
将介孔二氧化硅纳米颗粒分散至有机溶剂中,向其中加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷进行回流即得氨基修饰的MSNs(MSNs-NH2)。
所述有机溶剂可以为乙醇。
所述回流条件为:在60-70℃下回流3-5h,优选为65℃下回流4h。
所述介孔二氧化硅纳米颗粒可采用现有已知方法制备获得,在本发明的一个具体实施方式中,所述介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法包括:
将十六烷基三甲基氯化铵和三乙醇胺溶于水中,在高温下搅拌;接着向混合溶液中加入均三甲苯和正硅酸四乙酯继续反应;反应结束后,离心并洗涤沉淀;去除未反应的十六烷基三甲基氯化铵后离心得介孔二氧化硅纳米颗粒。
十六烷基三甲基氯化铵和三乙醇胺的质量比为50~500:1,优选为100:1;
在高温下搅拌具体条件为在90~100℃搅拌反应0.5~3h,优选为95℃搅拌反应1h。
所述十六烷基三甲基氯化铵、均三甲苯和正硅酸四乙酯的质量体积比为0.5~5:1.5:1.5(g:mL:mL),优选为2:1.5:1.5;
加入均三甲苯和正硅酸四乙酯继续反应,具体的,在90~100℃搅拌反应0.5~3h,优选为95℃搅拌反应1h。
所述去除十六烷基三甲基氯化铵的方法包括用盐酸和乙醇的混合溶液将得到的沉淀在70-90℃下冷凝回流2-5h并重复2-3次。
所述二氧化铈纳米颗粒为羧基修饰的二氧化铈纳米颗粒;更进一步的,所述二氧化铈纳米颗粒为3-马来酰亚胺基丙酸修饰的二氧化铈纳米颗粒,其制备方法包括:将柠檬酸和3-马来酰亚胺基丙酸溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,向其中加入二氧化铈纳米颗粒的三氯甲烷溶液,搅拌过夜,离心即得。
其中,所述二氧化铈纳米颗粒可采用现有已知方法制备获得,在本发明的一个具体实施方式中,所述二氧化铈纳米颗粒的具体制备方法包括:
乙酸铈和油胺溶解于二甲苯中,搅拌使得溶液由乳白色至半透明棕色;在惰性气体氛围下,以1-5℃/min(优选为2℃/min)的速率升温至80-100℃(优选为90℃),过程中搅拌;将水注入至反应溶液中,溶液由棕色变至紫灰色;老化1-4h(优选为3h);冷却、获得沉淀、洗涤即得。
所述乙酸铈和油胺的质量比为0.1~1:3~5,优选为0.43:3.25,搅拌时间控制为10-30h,优选为24h;从而使得溶液由乳白色至半透明棕色。
获得沉淀可采用加入丙酮方式获得。
本发明的又一具体实施方式中,所述步骤S2中,
所述光敏剂为Ce6;具体的,所述光敏剂Ce6溶液的制备方法包括:向光敏剂Ce6中加入EDC和NHS溶液进行反应即得。
所述步骤S3中,具体方法包括:将巨噬细胞膜通过聚碳酸酯膜(孔径为300-500nm,优选为400nm)挤出囊泡状后与步骤S2制得的光敏剂修饰的CeO2-MSNs纳米颗粒混合超声处理,将混合溶液通过聚碳酸酯膜(孔径为100-300nm,优选为200nm)反复挤出6-8次即得。
本发明的又一具体实施方式中,提供上述仿生纳米诱饵在制备全身炎症反应综合征相关疾病药物中应用。
本发明的又一具体实施方式中,所述全身炎症反应综合征相关疾病包括脓毒症。
本发明的又一具体实施方式中,提供一种全身炎症反应综合征相关疾病的药物,所述药物其活性成分包含上述仿生纳米诱饵。
根据本发明,当所述产品为药物时,所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。例如药学上相容的无机或有机酸或碱、聚合物、共聚物、嵌段共聚物、单糖、多糖、离子和非离子型表面活性剂或脂质、药理上无害的盐例如氯化钠、调味剂、维生素例如维生素A或维生素E、生育酚或维生素原、抗氧化剂,例如抗坏血酸,以及用于延长药物活性成分或配方的使用和保存时间的稳定剂和/或防腐剂,和其它现有技术中公知的常用非药物活性成分或助剂和添加剂,以及它们的混合物。
所述药物制剂可以单位剂量形式给药。该处所述的常规剂型比如液体剂型、固体剂型、外用制剂、喷剂等等,比如下列剂型:真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型、片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂等。
本发明的又一具体实施方式中,本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如用于全身递送的制剂,包括例如肠胃外、口服或静脉内递送、或用于局部或局部施用,这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化,如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中,提供一种全身炎症反应综合征相关疾病治疗系统,所述系统包括:
a)上述仿生纳米诱饵或上述药物;以及,
b)光照装置。
其中,所述光照装置发射光源为近红外光源,具体的,所述光源波长可为660nm,经近红外光源辐照后,光敏剂Ce6产生单线态氧(1O2)杀死入侵机体的病原菌,从清除病灶方面治疗脓毒症。
本发明的又一具体实施方式中,提供一种全身炎症反应综合征相关疾病治疗的方法,所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述仿生纳米诱饵、药物或系统。
所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物,优选指哺乳动物,最优选指人。本发明纳米粒用于治疗所需的量随着给药路径、正在治疗的病况的性质以及病人的年龄和病况而变化,且最终由主治医师或临床医师决定。本发明纳米粒给药的有效剂量和路径是常规的。试剂的精确量(有效剂量)因患者不同而变化,取决于例如患者的种类、年龄、重量和一般或临床状态、正在治疗的任何病症的严重性或机理、所用的特定试剂或载体、给药的方法和进度等。治疗有效剂量可通过本领域技术人员已知的常规程序经验地确定。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明,但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
材料:
十六烷基三甲基氯化铵(CTAC),三乙醇胺(TEA),正硅酸四乙酯(TEOS),均三甲苯,3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES),乙酸铈,油胺,二甲苯,柠檬酸,3-马来酰亚胺基丙酸(BMPA),二氢卟吩e6(Ce6),乙二胺四乙酸(EDTA),磷酸盐缓冲盐水(PBS),四甲基氢氧化铵1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC),N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(NHS),Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞计数试剂和2′,7′-二氯二氟荧光素二乙酸盐(DCFH-DA;≥94%)购自Sigma-Aldrich。总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒,过氧化氢(H2O2)测定试剂盒和羟自由基测试试剂盒均购买于南京建成生物工程研究所。TNF-α酶联免疫试剂盒,IL-1β酶联免疫试剂盒,IL-6酶联免疫试剂盒和LPS酶联免疫试剂盒购买于北京博凝生物科技有限公司。活/死细菌生存力试剂盒购自ThermoFisher。所有其他化学品均从Adamasbeta获得,无需进一步纯化即可使用。所有实验均使用去离子(DI)水(Millipore Milli-Q级,18.2MΩ)。
方法:
1、介孔二氧化硅(MSNs)纳米颗粒的制备及修饰:首先称取2g CTAC和0.02g TEA溶于20mL去离子水中,在95℃下剧烈搅拌1h。接着向混合溶液中加入均三甲苯1.5mL和1.5mLTEOS继续反应1h。反应结束后,13000rpm离心15min,并用乙醇洗涤沉淀3次。为了去除CTAC,用盐酸和乙醇的混合溶液将得到的沉淀在80℃下冷凝回流4h并重复3次。回流结束后,13000rpm离心15min得到MSNs沉淀,并分散到20mL的乙醇溶液中。向溶液中加入400μL的APTES,65℃下回流4h。回流结束后用去离子水洗涤沉淀3次得到氨基修饰的MSNs(MSNs-NH2),最终将MSNs-NH2分散到20mL的去离子水中备用。
2、二氧化铈(CeO2)纳米颗粒的制备及修饰:0.43g乙酸铈和3.25g油胺溶解在15mL的二甲苯中,室温下剧烈搅拌24h,溶液由乳白色至半透明棕色。在氩气保护环境下,以2℃/min的固定速率加热至90℃,过程中剧烈搅拌。将1mL去离子水快速注入至反应溶液中,溶液由棕色变至紫灰色。在90℃氩气环境下老化3h。冷却至室温,用100mL丙酮沉淀出纳米颗粒,再用丙酮沉淀洗涤沉淀3次,最终分散在20mL的三氯甲烷中备用。称取柠檬酸0.05g,BMPA0.05g溶于10mL的DMF中,向其中加入制备好的CeO2三氯甲烷溶液,室温下剧烈搅拌过夜。反应完成后,13000rpm离心洗涤沉淀,得到的BMPA-CeO2分散到15mL乙醇溶液中备用。
3、CeO2-MSNs纳米颗粒的制备:5mL MSNs-NH2溶液与5mL修饰完成的BMPA-CeO2溶液混合均匀,室温下剧烈搅拌过夜。反应完成后,13000rpm离心15min,再用乙醇洗涤沉淀,然后用去离子水洗涤沉淀2次,最终分散到10mL的去离子水中备用。
4、Ce6/CeO2-MSNs(C/C-M)纳米颗粒的制备:称取EDC 4.1mg和NHS 4.5mg分别溶于250μL的去离子水中。接着称取1mg Ce6溶于1.5mL水中,向其中加入配制好的EDC和NHS溶液,反应30min。将制备得到的10mL的CeO2-MSNs逐渐滴加到Ce6溶液中。室温下过夜反应后,13000rpm离心15min,沉淀用去离子水洗涤3次。制备得到的C/C-M溶液分散到10mL去离子水中。
5、小鼠单核巨噬细胞膜(MΦ)的提取:小鼠J774单核巨噬细胞用DMEM高糖培养基培养至长满细胞培养皿底部面积的90%。接着用2mM EDTA PBS溶液消化细胞,得到的细胞悬液用PBS清洗三次。将细胞沉淀分散在膜蛋白缓冲溶液中,并冰浴15min。冰浴完成后,才用反复冻融的方法,将细胞悬液至于液氮罐中冰冻5min,再于室温下化冻,如此重复三次。冻融完成的细胞以3200g离心15min,去除大的细胞碎屑。收集上清液,以20000g离心15min得到细胞膜沉淀,最终分散于PBS中,置于-80℃环境中保存备用。
6、仿生纳米诱饵的制备:将得到的MΦ通过400nm的聚碳酸酯膜挤出囊泡状。按照1:1的体积比将MΦ与C/C-M纳米颗粒混合,超声5min。将混合溶液通过孔径为200nm的聚碳酸酯膜反复挤出7次,得到Ce6/CeO2-MSNs@MΦ(C/C-M@MΦ)纳米颗粒。
C/C-M@a-MΦ纳米颗粒的制备:用浓度为50ng/mL的LPS诱导J774巨噬细胞24h,刺激巨噬细胞对LPS的免疫反应。将得到的巨噬细胞收集,通过5中巨噬细胞膜的提取方法,得到诱导后的巨噬细胞膜。再通过上述方法,将细胞膜与C/C-M纳米颗粒1:1混合,通过聚碳酸酯膜反复挤出得到C/C-M@a-MΦ纳米颗粒,分散于去离子水中备用。
7、仿生纳米诱饵的形貌:取100μL的C/C-M@MΦ纳米颗粒,用去离子水稀释至1mL,吸取10μL稀释后的纳米颗粒滴至铜网上,于电子防潮箱中干燥过夜,用透射电子显微镜(TEM)拍摄,观察纳米颗粒的形貌。
8、仿生纳米诱饵的紫外可见吸收光谱:将MSNs、CeO2、Ce6及C/C-M@MΦ纳米颗粒用去离子水稀释至相同浓度。将溶液置于石英比色皿中,用紫外可见分光光度计,在波长范围280nm~1000nm下检测各溶液的紫外可见吸收光谱,并进行对照处理,以验证C/C-M@MΦ纳米颗粒的合成。
9、仿生纳米诱饵的蛋白质印记(Western blot)实验:将C/C-M纳米颗粒,MΦ以及C/C-M@MΦ纳米颗粒进行蛋白质印记实验,验证C/C-M@MΦ纳米颗粒是否能够表达出MΦ具有的目的蛋白(TNF-R1,TLR4,IL-1R1,IL-6α)。若表达出目的蛋白则表明C/C-M@MΦ上成功涂覆MΦ,具有与MΦ相同的性质。
10、仿生纳米诱饵水合粒径及zeta电位的表征:取100μL的C/C-M@MΦ纳米颗粒,用去离子水稀释至2mL,用动态光散射仪检测纳米颗粒在水性环境中的粒径及zeta电位,重复三次,并记录数据。
11、仿生纳米诱饵的细胞毒性测试:通过MTT法分析C/C-M@MΦ纳米颗粒对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(ATCC)的细胞毒性,来评估C/C-M@MΦ纳米系颗粒的生物相容性。简而言之,将细胞接种到96孔板(8000-10000细胞/孔)中并培养过夜。然后用具有不同铁元素浓度(0、25、50、100和200μg/mL)的C/C-M@MΦ处理细胞。培养24小时后,加入MTT,继续培养4小时。用酶标仪评估细胞活力。
12、仿生纳米诱饵的类过氧化氢酶(CAT-like)活性测定:为了检测C/C-M@MΦ纳米颗粒的类过氧化氢酶性质,利用过氧化氢酶活性测定试剂盒(购买于南京建成生物工程研究所),按照试剂盒中提及的方法,检测C/C-M@MΦ纳米颗粒的类过氧化氢酶活性,实验重复三次,记录并分析数据。
13、仿生纳米诱饵的类超氧化物歧化酶(SOD-like)活性检测:为了检测C/C-M@MΦ纳米颗粒的类超氧化物歧化酶性质,利用总超氧化物歧化酶试剂盒(购买于南京建成生物工程研究所),按照试剂盒中提及的方法,检测C/C-M@MΦ纳米颗粒的类超氧化物歧化酶活性,实验重复三次,记录并分析数据。
14、仿生纳米诱饵的羟基自由基抗氧化能力(HORAC):为了检测C/C-M@MΦ纳米颗粒的羟基自由基清除性质,利用羟基自由基测定试剂盒(购买于南京建成生物工程研究所),按照试剂盒中提及的方法,检测C/C-M@MΦ纳米颗粒的羟基自由基清除活性,实验重复三次,记录并分析数据。
15、仿生纳米诱饵内毒素(LPS)的清除能力:LPS检测试剂盒购买于北京博凝生物科技有限公司。首先配制不同浓度的LPS溶液(5、10、25、50ng/mL),按照试剂盒中的方法,测得各浓度LPS溶液表现出的吸光度,并进行标准曲线绘制。将不同浓度的C/C-M@MΦ纳米颗粒(0、25、50、100、200μg/mL)与已知含量的LPS(25ng)孵育,孵育完成后将溶液中的纳米颗粒离心去除,通过试剂盒中的方法检测溶液中剩余LPS的含量,按照标准曲线进行分析,实验重复三次。
16、仿生纳米诱饵炎症因子中和能力的检测:TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子检测试剂盒购买于北京博凝生物科技有限公司。按照试剂盒中方法绘制3种炎症因子质量与吸光度的标准曲线。再将不同浓度的C/C-M@MΦ纳米颗粒与已知浓度的炎症因子(TNF-α25ng、IL-1β50ng、IL-6 15ng)孵育,孵育完成后通过离心的方法将溶液中的纳米颗粒去除,按照试剂盒中的方法分别检测溶液中剩余炎症因子的含量,按照标准曲线进行数据分析,上述实验均重复三次。
17、仿生纳米诱饵的抗菌能力测定:将大肠杆菌培养至OD600值约为1,取1mL菌液,与浓度为200ppm的C/C-M@MΦ纳米颗粒进行孵育。将纳米颗粒与菌液的混合溶液分为2组,其中一组用功率为0.8W/cm2的660nm激光器照射5min,另一组不做光照处理。照射完成后,在温度为37℃,转速为250rpm的恒温摇床中孵育30min,再分别进行稀释涂板。琼脂板于37℃的生化培养箱中培养过夜,观察并对2组琼中板上的细菌计数。上述实验重复三次。
18、小鼠脓毒症模型的建立:小鼠(Balb/c,6周,约40g)购自南京斯科瑞生物技术有限公司,并使其在实验室中适应1周。所有动物实验均按照山东大学实验动物中心批准的规程进行。将大肠杆菌培养至OD600值约为1,小鼠麻醉后,向实验小鼠腹腔部位注射109CFU的大肠杆菌,以构建小鼠脓毒症模型,再进行分组治疗处理。
19、仿生纳米诱饵对脓毒症小鼠的治疗能力:将构建模型成功的实验小鼠分成5组(PBS治疗的小鼠作为阳性对照,C/C-M,C/C-M@MΦ,C/C-M@a-MΦ,C/C-M@a-MΦ+irr)进行治疗处理,并用健康小鼠作为阴性对照,以检测C/C-M@MΦ纳米颗粒对脓毒症小鼠的治疗能力。简而言之,将PBS与浓度均为200ppm的各纳米颗粒分别注射到各组小鼠腹腔中,正常小鼠不作处理进行对照。观察60h内各治疗组小鼠的存活率。24h后取处死部分各治疗组小鼠,取小鼠腹膜渗出液与血液检测炎症因子浓度。再取出小鼠主要脏器(肾、脾、肝)进行涂板细菌培养,再进行定量,通过上述实验检测C/C-M@MΦ纳米颗粒对脓毒症小鼠的治疗能力。各组小鼠数量均≥6只,实验均重复三次以上。
结果:
1、仿生纳米诱饵的形貌表征:如图2a)所示MSNs纳米颗粒尺寸均一,分散性良好,直径大小约为70nm,表面可以观察到明显的介孔形态,证明成功合成了MSNs纳米颗粒。C/C-M@MΦ纳米颗粒形态如图2b)所示,在C/C-M纳米颗粒表面可以明显观察到一层细胞膜形态的涂层包覆,证明成功将MΦ包裹在C/C-M纳米颗粒的表面,得到C/C-M@MΦ纳米颗粒。该纳米颗粒形态稳定,分散性良好,尺寸大小与MSNs纳米颗粒无较大变化,约为75nm。
2、仿生纳米诱饵的紫外可见吸收光谱:如图3所示,C/C-M纳米颗粒在400nm和660nm处表达出光敏剂Ce6的特征峰,且660nm处的特征峰发生一定红移,同时表达出CeO2纳米颗粒在280nm处的特征峰,证明光敏剂Ce6、CeO2成功与MSNs纳米颗粒偶联,得到Ce6/CeO2-MSNs(C/C-M)纳米颗粒。
3、仿生纳米诱饵的蛋白质印记:如图4所示,单纯的C/C-M纳米颗粒不能表达出MΦ具有的目的蛋白(TNF-R1,TLR4,IL-1R1,IL-6α),而将MΦ包覆在C/C-M纳米颗粒表面后,得到的C/C-M@MΦ纳米颗粒也表达出与MΦ相同的目的蛋白,说明MΦ的成功包覆。目的蛋白的表达说明C/C-M@MΦ纳米颗粒具有与MΦ相同的性质,可以有效清除内毒素(LPS)以及中和炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)。
4、仿生纳米诱饵粒径及电位的表征:如图5a)所示,通过逐步修饰与包覆,C/C-M@MΦ纳米颗粒的zeta电位不断变化。与此同时,纳米颗粒的水合粒径也在逐步变大,证明C/C-M@MΦ纳米颗粒的成功制备。
5、仿生纳米诱饵的细胞毒性:如图6所示,即使C/C-M@MΦ纳米颗粒的浓度高达200ppm时,与纳米颗粒孵育的HUVEC细胞依然表现出良好的细胞状态,存活率高达90%以上,证明C/C-M@MΦ纳米颗粒有着良好的体外生物相容性。
6、仿生纳米诱饵的多种类酶活性:C/C-M@MΦ纳米颗粒表现出多重的类酶活性,包括类过氧化氢酶活性(CAT-like)、类超氧化物歧化酶活性(SOD-like)以及羟基自由基抗氧化能力(HORAC)。如图7所示,在C/C-M@MΦ纳米颗粒浓度高达200ppm时,纳米颗粒的CAT-like表现为31%,SOD-like活性为72%,羟基自由基抑制率高达58%。C/C-M@MΦ纳米颗粒高效的类酶活性可以将有害的活性氧(ROS)转化为对人体无害的水和氧气,有利于脓毒症的治疗。
7、仿生纳米诱饵对内毒素清除以及炎症因子中和能力:MΦ上具有与内毒素、炎症因子结合的受体蛋白,由于MΦ的包覆,C/C-M@MΦ纳米颗粒表现出与MΦ相同的内毒素清除以及炎症因子中和能力。将不同浓度(0、25、50、100、200μg/mL)的纳米颗粒与已知浓度的LPS孵育后,再离心去除纳米颗粒,溶液中剩余的LPS如图8a)所示,当纳米颗粒浓度达到200ppm时,LPS清除率达到76%。与此同时,同一浓度下C/C-M@MΦ纳米颗粒对三种炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的中和率分别为:31.8%、40%和75%(图8b、c、d))。这些数据表明C/C-M@MΦ纳米颗粒在体外对细菌内毒素以及炎症因子有高效的清除以及中和效果,为脓毒症的治疗奠定了基础。
8、仿生纳米诱饵的体外光动力抗菌性能评估:如图9a)所示,660nm激光照射前,C/C-M@a-MΦ纳米颗粒对细菌基本无抑制效果;光照处理后,琼脂板上细菌数量明显下降,9b)为a)中琼脂板上相应的细胞数量。表明C/C-M@a-MΦ纳米颗粒有着明显的光动力抗菌效果,对于清除病灶治疗脓毒症有着积极的影响。
9、仿生纳米诱饵对脓毒症模型小鼠治疗效果评估:将建模成功的脓毒症模型小鼠均分为5组,每组数量均不低于8只。分别用PBS(阳性对照),C/C-M,C/C-M@MΦ,C/C-M@a-MΦ,C/C-M@a-MΦ+irr进行治疗,同时健康的小鼠作为阴性对照。如图10所示,C/C-M@a-MΦ+irr治疗组小鼠60h内存活率高达80%,其下依次为C/C-M@a-MΦ治疗组70%,C/C-M@MΦ治疗组50%,C/C-M治疗组30%,治疗效果最差的为PBS治疗组即阳性对照组,存活率为0。C/C-M@a-MΦ纳米颗粒配合光照治疗,从根本上减缓了小鼠体内过多的ROS,并中和大量炎症因子及细菌内毒素,同时配合光动力抗菌清除病灶,使得该治疗组小鼠存活率远远高于其余治疗组小鼠,证明C/C-M@a-MΦ纳米颗粒对体内脓毒症有着良好的治疗效果。
在24h后将各治疗组小鼠与阴性对照组小鼠的腹膜渗出液与血液取出,通过验证各组小鼠腹膜渗出液和血液中炎症因子表达数目来评估治疗效果。如图11a)所示,C/C-M@a-MΦ+irr治疗组小鼠腹膜渗出液中三种炎症因子相对数目均在各治疗组中表达最低,接近于阴性对照组。与此同时,11b)表明,该治疗组小鼠血液中炎症因子的相对表达数目也低于其余4组治疗组。以上结果证明C/C-M@a-MΦ配合光照治疗对脓毒症表现出良好的治疗效果,与图10中存活率结果相对应。
除了验证各治疗组炎症因子的表达之外,腹膜渗出液、血液以及主要脏器(肾、脾、肝)中细菌存活率也是治疗效果的一项重要参考依据。如图12a)所示,C/C-M@a-MΦ+irr治疗组小鼠腹膜渗出液、血液以及主要脏器中细菌存活数量最低,表明C/C-M@a-MΦ配合光照治疗对脓毒症表现出良好的治疗效果。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种仿生纳米诱饵,其特征在于,所述仿生纳米诱饵包括介孔二氧化硅纳米颗粒,所述介孔二氧化硅纳米颗粒修饰有二氧化铈纳米颗粒与光敏剂,在其表面包覆有巨噬细胞膜;
所述二氧化铈纳米颗粒为羧基修饰的二氧化铈纳米颗粒;
所述光敏剂为Ce6;
所述巨噬细胞为单核巨噬细胞;
所述仿生纳米诱饵平均粒径不大于100nm;
所述巨噬细胞用浓度为50ng/mL的LPS诱导J774巨噬细胞24h,刺激巨噬细胞对LPS的免疫反应;
所述仿生纳米诱饵,其制备方法包括:
S1、将二氧化铈纳米颗粒与介孔二氧化硅纳米颗粒混合制CeO2-MSNs纳米颗粒;
S2、将CeO2-MSNs纳米颗粒加入光敏剂溶液中反应得光敏剂修饰的CeO2-MSNs纳米颗粒;S3、将巨噬细胞膜与步骤S2制得的光敏剂修饰的CeO2-MSNs纳米颗粒混合即得;
所述步骤S1中,所述介孔二氧化硅纳米颗粒为氨基修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒;所述氨基修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒,其制备方法包括:
将介孔二氧化硅纳米颗粒分散至有机溶剂中,向其中加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷进行回流即得氨基修饰的MSNs;
所述有机溶剂为乙醇;
所述回流条件为:在60-70℃下回流3-5h;
所述步骤S2中,所述光敏剂为Ce6;具体的,所述光敏剂Ce6溶液的制备方法包括:向光敏剂Ce6中加入EDC和NHS溶液进行反应即得;
所述步骤S3中,具体方法包括:将巨噬细胞膜通过孔径为300-500nm的聚碳酸酯膜挤出囊泡状后与步骤S2制得的光敏剂修饰的CeO2-MSNs纳米颗粒混合超声处理,将混合溶液通过孔径为100-300nm的聚碳酸酯膜,反复挤出6-8次即得。
2.如权利要求1所述一种仿生纳米诱饵,其特征在于,所述回流条件为:在65℃下回流4h。
3.如权利要求1所述一种仿生纳米诱饵,其特征在于,所述二氧化铈纳米颗粒为3-马来酰亚胺基丙酸修饰的二氧化铈纳米颗粒,其制备方法包括:将柠檬酸和3-马来酰亚胺基丙酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中,向其中加入二氧化铈纳米颗粒的三氯甲烷溶液,搅拌过夜,离心即得。
4.如权利要求1所述一种仿生纳米诱饵,其特征在于,所述步骤S3中,具体方法包括:将巨噬细胞膜通过孔径为400nm的聚碳酸酯膜挤出囊泡状后与步骤S2制得的光敏剂修饰的CeO2-MSNs纳米颗粒混合超声处理,将混合溶液通过孔径为200nm的聚碳酸酯膜反复挤出6-8次即得。
5.如权利要求1-4任一项所述仿生纳米诱饵在制备全身炎症反应综合征相关疾病药物中的应用,其特征在于,所述全身炎症反应综合征相关疾病包括脓毒症。
6.一种全身炎症反应综合征相关疾病的药物,其特征在于,所述药物其活性成分包含权利要求1-4任一项所述仿生纳米诱饵。
7.一种全身炎症反应综合征相关疾病治疗系统,其特征在于,所述系统包括:
a)权利要求1-4任一项所述仿生纳米诱饵或权利要求6所述药物;以及,
b)光照装置。
8.如权利要求7所述一种全身炎症反应综合征相关疾病治疗系统,其特征在于,所述光照装置发射光源为近红外光源。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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