CN109200021A - 一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒及其制备方法与应用 - Google Patents

一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，公开了一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒，包括由碳酸钙中的钙离子Ca2+与阿霉素DOX螯合形成的阿霉素钙复合物Ca‑DOX簇，所述阿霉素钙复合物Ca‑DOX簇的表面上连接有蚕丝蛋白。本发明能够使更多的纳米粒通过细胞内吞进入到溶酶体内，提高了纳米粒在肿瘤区域的聚集度和有效载药量，并在溶酶体内加速了纳米粒的分解，使其释放出Ca2+及CO2，促使溶酶体破裂，使阿霉素能够从溶酶体内释放出来，并进入到细胞核内发挥抗肿瘤作用，有效地提高了对肿瘤的杀伤力，从而达到肿瘤治疗的效果，对肿瘤的临床治疗研究提供了新的方向。

Description

一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及了一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒及其制备方法与应用。
背景技术
癌症目前仍是影响人类健康的最主要疾病之一。据美国肿瘤统计数据显示仅2013年就有1660290例新发病例和580350例死亡病例。目前临床上对于肿瘤的治疗仍以化疗为主，但由于化疗药物的剂量限制性毒性及不稳定性，使得化疗效果较差，不能满足临床需求。因此开发高效的药物载体，使化疗药物进入肿瘤细胞后快速释放，达到杀伤肿瘤细胞的目的，从而发挥抗肿瘤作用。
近年来，纳米载药体系逐渐被应用于肿瘤化疗，但由于其在肿瘤部位药物的低效聚集以及有效载药量较低，使得化疗效果仍不尽如人意。此外，当载药纳米粒通过静脉注射进入体内，到达肿瘤部位被细胞内吞后，禁锢于溶酶体内，其内包裹的化疗药物不能被有效释放入胞内发挥抗肿瘤效果，导致化疗效果进一步降低。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒，以解决现有技术中由于纳米粒的低效聚集与有效载药量较低而造成肿瘤化疗效果不佳的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒，包括由碳酸钙中的钙离子Ca2+与阿霉素DOX螯合形成的阿霉素钙复合物Ca-DOX簇，所述阿霉素钙复合物Ca-DOX簇的表面上连接有蚕丝蛋白。
进一步，外形呈球形，粒径为182±5nm。
进一步，pH为7.4时，纳米粒的电位为-10.1mV。
进一步，pH为6.5时，纳米粒的电位为-12.9mV。
进一步，pH为5.5时，纳米粒的电位为-21.2mV。
进一步，阿霉素的载药量为7.4％，包封率为92.13％。
进一步，溶于蒸馏水时，在545nm和585nm处分别具有特征性紫外-可见光吸收谱波峰。
进一步，溶于稀盐酸时，在475nm和495nm处分别具有特征性紫外-可见光吸收谱波峰。
以上均为本发明溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒的性质及确认。
本发明的溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒，由碳酸钙中的钙离子Ca2+与阿霉素DOX螯合形成阿霉素钙复合物Ca-DOX簇，然后阿霉素钙复合物Ca-DOX簇的碳酸根CO3 2-与蚕丝蛋白的氨基-NH2进行化学键连接，最终形成碳酸钙蚕丝蛋白纳米粒。透射电子显微镜检测结果显示，该纳米粒呈球形，大小均一，形态规则，分散性好；马尔文粒径分析仪测得本发明的纳米粒粒径182±5nm，本发明的纳米粒能够穿过肿瘤毛细血管内皮间隙100-780nm，所以能够满足本发明对其粒径的要求，马尔文粒径分析仪测得，随着pH增大，该纳米粒的电位逐渐增大。纳米粒从蒸馏水到稀盐酸中时，其特征性紫外-可见光吸收谱波峰发生蓝移，且与游离阿霉素的紫外吸收谱类似，表明DOX成功与Ca2+螯合；此外，该纳米粒在275nm处也可见蚕丝蛋白的特征性紫外吸收谱，表明蚕丝蛋白SF成功与阿霉素钙复合物Ca-DOX簇化学连接，所制备出的碳酸钙蚕丝蛋白纳米粒CaCO3-DOX-SF成功负载了阿霉素DOX及蚕丝蛋白SF。
与现有技术相比，本发明的原理及有益效果为：
1、采用具有pH敏感性的碳酸钙作为载体，负载阿霉素及蚕丝蛋白制备出具有溶酶体靶向的酸敏感生物纳米粒，其粒径小，分散度好，适宜静脉全身给药，具有很好的临床适用价值；其中，蚕丝蛋白通过化学键连接在纳米粒的表面，能够增加纳米粒的稳定性，使纳米粒能够更好地靶向到肿瘤部位，提高肿瘤区域纳米粒的聚集度和有效载药量。
2、将该纳米粒通过尾静脉注射入体内，随着血液循环通过EPR效应到达肿瘤区域；在肿瘤酸性微环境中该纳米粒的粒径逐渐变小，使更多的纳米粒能够通过细胞内吞进入到溶酶体内，提高了纳米粒在肿瘤处的聚集度和有效载药量，从而达到更佳的肿瘤化疗效果；由于溶酶体内pH值更低，加速了纳米粒的分解，使其释放出Ca2+及CO2，一方面溶酶体内Ca2+增多，将发生质子海绵效应，另一方面溶酶体内CO2增多，将导致溶酶体内压强增大，从两方面促使溶酶体破裂，使阿霉素能够从溶酶体内释放出来，并进入到细胞核内发挥抗肿瘤作用，有效地提高了对肿瘤的杀伤力，从而达到肿瘤治疗的效果，对肿瘤的临床治疗研究提供了新的方向。
本发明的目的之二是提供一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备蚕丝蛋白液
将蚕茧在Na2CO3碳酸钠(0.02M)溶液中煮沸1h，然后换新鲜Na2CO3溶液再次煮沸1h，随后将蚕茧浸泡在去离子水中，中间换水4-5次，以洗掉蚕茧表面的丝胶蛋白；然后将脱胶的蚕丝蛋白溶解于60℃的溴化锂LiBr(9.2M)溶液里，5h后转移至去离子水中透析3天，去除杂质及其他离子，最后过滤收集蚕丝蛋白液，冷冻干燥备用；
(2)制备纳米粒
先将5mg阿霉素溶解于0.5ml去离子水中，取10mg冷冻干燥的蚕丝蛋白溶解于4ml去离子水中，将200mg二水氯化钙溶解于100ml无水乙醇中，随后向上述乙醇溶液中加入事先已溶解的5mg阿霉素，磁搅拌2h，然后再向乙醇溶液中缓慢加入已溶解的蚕丝蛋白液，再搅拌0.5h；接着，将装有上述混合液的烧杯放入真空干燥箱内，烧杯周围摆放若干装有碳酸氢铵的玻璃皿，将烧杯及玻璃皿均覆盖上锡箔纸，并扎若干小孔，在密闭环境内反应2天后，将烧杯中的混合液离心(8000rpm，5min)，润洗，收集沉淀，得到纳米粒。
本发明溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒的制备方法，以蚕茧、碳酸钠、阿霉素及二水氯化钙为原料，通过生物矿化方法制备出具有溶酶体靶向的pH敏感性碳酸钙蚕丝蛋白载阿霉素DOX纳米粒CaCO3-DOX-SF。采用透射电子显微镜及马尔文粒径分析仪对纳米粒CaCO3-DOX-SF的粒径、电位、表面形态等进行检测；采用紫外-可见分光光度计检测纳米粒CaCO3-DOX-SF的载药量和包封率。成功制备出球形、大小均一、形态规则、分散性好、性质稳定的靶向溶酶体的纳米粒CaCO3-DOX-SF。该纳米粒在肿瘤酸性微环境中该纳米粒的粒径逐渐变小，能够更多地进入到肿瘤细胞内，增大了该纳米粒在肿瘤部位的聚集量，同时通过在溶酶体内分解释放出Ca2+及CO2使溶酶体破裂的方式，释放出阿霉素DOX，并进入到细胞核内发挥抗肿瘤作用，达到对肿瘤的有效治疗，具有良好的肿瘤靶向和治疗能力。
本发明的目的之三是提供一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒在用于制备抗癌药物中的应用。利用碳酸钙的pH敏感性以及溶酶体内的酸性环境，使该纳米粒具有pH敏感性，首先能够很好地进入到肿瘤细胞内，然后能够迅速地使溶酶体破裂，释放出抗癌药物，发挥抗肿瘤作用，对肿瘤进行治疗。本发明中的纳米粒应用于肿瘤药物的制备，能够有效地增强阿霉素DOX对肿瘤的药效，提高抗癌效果，减小副作用。
附图说明
图1为本发明实施例中纳米粒CaCO3-DOX-SF形成的过程示意图；
图2为本发明实施例中纳米粒CaCO3-DOX-SF的透射电镜图及粒径分布图；
图3为本发明实施例中纳米粒CaCO3-DOX-SF在不同pH下的电位变化图；
图4为本发明实施例中不同溶液的紫外-可见分光光谱图；
图5为本发明实施例中纳米粒CaCO3-DOX-SF在不同pH下的释药曲线图；
图6为本发明实施例中纳米粒CaCO3-DOX-SF在不同pH下粒径随时间的变化图；
图7为本发明实施例中纳米粒CaCO3-DOX-SF的细胞毒性测试图；
图8为本发明实施例中纳米粒CaCO3-DOX-SF的溶酶体靶向性检测图；
图9为本发明实施例中各组裸鼠相对肿瘤体积大小随治疗周期的时间变化图；
图10为本发明实施例中各组裸鼠体重随治疗周期的时间变化图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
一、本发明的溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备蚕丝蛋白液
将蚕茧在Na2CO3碳酸钠(0.02M)溶液中煮沸1h，然后换新鲜Na2CO3溶液再次煮沸1h，随后将蚕茧浸泡在去离子水中，中间换水4-5次，以洗掉蚕茧表面的丝胶蛋白；然后将脱胶的蚕丝蛋白溶解于60℃的溴化锂LiBr(9.2M)溶液里，5h后转移至去离子水中透析3天，去除杂质及其他离子，最后过滤收集蚕丝蛋白液，冷冻干燥备用；
(2)制备纳米粒
先将5mg阿霉素溶解于0.5ml去离子水中，取10mg冷冻干燥的蚕丝蛋白溶解于4ml去离子水中，将200mg二水氯化钙溶解于100ml无水乙醇中，随后向上述乙醇溶液中加入事先已溶解的5mg阿霉素，磁搅拌2h，然后再向乙醇溶液中缓慢加入已溶解的蚕丝蛋白液，再搅拌0.5h；接着，将装有上述混合液的烧杯放入真空干燥箱内，烧杯周围摆放若干装有碳酸氢铵的玻璃皿，将烧杯及玻璃皿均覆盖上锡箔纸，并扎若干小孔，在密闭环境内反应2天后，将烧杯中的混合液离心(8000rpm，5min)，润洗，收集沉淀，得到纳米粒。
所制得的本发明的溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒，如图1所示，先由碳酸钙中的钙离子Ca2+与阿霉素DOX螯合形成阿霉素钙复合物Ca-DOX簇，然后阿霉素钙复合物Ca-DOX簇的碳酸根CO3 2-与蚕丝蛋白的氨基-NH2进行化学键连接，使阿霉素钙复合物Ca-DOX簇的表面上连接有蚕丝蛋白，最终形成碳酸钙蚕丝蛋白纳米粒CaCO3-DOX-SF。
二、溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒CaCO3-DOX-SF的一般特性、阿霉素的载药量及包封率、体外释药实验
1、溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒CaCO3-DOX-SF的一般特性
(1)采用透射电子显微镜观察纳米粒CaCO3-DOX-SF的表面形态和结构特点。
(2)采用马尔文粒径分析仪检测纳米粒CaCO3-DOX-SF的大小、分布及电位。
(3)采用紫外-可见分光光度计检测纳米粒CaCO3-DOX-SF的吸光光谱。
检测结果：
(1)如图2所示，透射电子显微镜下检测到制得的纳米粒CaCO3-DOX-SF外形呈球形，大小均一，形态规则，分散性好。
(2)如图2所示，马尔文粒径分析仪检测到纳米粒CaCO3-DOX-SF的粒径为182±5nm。如图3所示，马尔文粒径分析仪检测到在不同pH下，纳米粒CaCO3-DOX-SF具有不同的电位，即：pH为7.4时，纳米粒的电位为-10.1mV；pH为6.5时，纳米粒的电位为-12.9mV；pH为5.5时，纳米粒的电位为-21.2mV。
(3)如图4所示，紫外-可见分光光度计检测纳米粒CaCO3-DOX-SF在蒸馏水中的特征性紫外-可见光吸收谱波峰为545nm和585nm，当溶解于稀盐酸后，波峰蓝移至475nm和495nm，与游离阿霉素的紫外吸收谱类似，表明DOX成功与Ca2+螯合。此外，碳酸钙蚕丝蛋白纳米粒在275nm处也可见蚕丝蛋白的特征性紫外吸收谱，表明SF成功与与阿霉素钙复合物Ca-DOX簇化学连接。
2、溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒CaCO3-DOX-SF阿霉素的载药量及包封率
取2mg冷冻干燥的纳米粒CaCO3-DOX-SF溶于10mL稀盐酸中，用紫外-可见分光光度计定量检测阿霉素的含量，随后计算载药率。
按照以上纳米粒CaCO3-DOX-SF制球过程，将5mg阿霉素加入溶液中，最终离心掉纳米粒，测定上清液中多余的阿霉素含量，用总投药量减去上清液中阿霉素含量，得到实际包载药物量。载药率与包封率按照以下公式计算：
包封率(％)＝(实际包载药物量)/(实际投药量)×100％；
载药率(％)＝(实际包载药物量)/(总纳米粒量)×100％。
检测结果：
纳米粒CaCO3-DOX-SF中阿霉素的载药量为7.4％，包封率为92.13％。
3、溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒CaCO3-DOX-SF体外释药实验
将制得的纳米粒CaCO3-DOX-SF分成3组，在37℃下分散于不同pH(pH5.5，6.5和7.4)的醋酸缓冲液中，120rpm的速度搅拌。在预定的时间点分别从溶液中取2ml液体，离心收集上清液，并检测。此外，纳米粒在不同pH(pH5.5，6.5和7.4)缓冲液里随时间变化的粒径大小也被粒径仪记录。
检测结果：
(1)如图5所示，纳米粒CaCO3-DOX-SF中阿霉素在不同pH(pH5.5，6.5和7.4)下体外24h内的释药曲线可以看出，pH为5.5时，纳米粒CaCO3-DOX-SF中阿霉素释放速度最快且最多，而pH为7.4时，纳米粒CaCO3-DOX-SF中阿霉素释放速度最慢且最少；当在pH5.5缓冲液内反应24h后，接近93.2％阿霉素从纳米粒CaCO3-DOX-SF中释放出来，而在pH6.5及pH7.4下分别62.7％和17.7％阿霉素从纳米粒阿霉素中释放出来；结果表明，纳米粒CaCO3-DOX-SF的释药呈酸敏感性。
(2)如图6所示，随着时间增加，纳米粒的粒径逐渐变小，尤其是在pH 5.5缓冲液中，纳米粒粒径变小速度更快。结果表明，在生理条件(pH7.4)下，纳米粒CaCO3-DOX-SF能够保持相对稳定。
三、溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒CaCO3-DOX-SF的细胞毒性、溶酶体靶向能力
1、溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒CaCO3-DOX-SF的细胞毒性
实验分为3组，分别为游离阿霉素组、纳米粒重悬于pH7.4无血清培养基组、纳米粒重悬于pH6.5无血清培养基组。在96孔细胞培养板中加入100μL含5000个乳腺癌4T1细胞的细胞悬浮液，在37℃、5％CO2孵箱中培养24h，随后将不同浓度的纳米粒CaCO3-DOX-SF与细胞共培养24h。随后倒掉细胞内废弃液，加入CCK-8检测细胞毒性。
检测结果：
如图7所示，通过对纳米粒的CCK-8毒性检测，发现随着纳米粒的浓度越高，细胞活力越低，表明纳米粒杀伤肿瘤细胞能力越强。
2、溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒CaCO3-DOX-SF的溶酶体靶向能力
实验分为3组，分别为游离阿霉素组、纳米粒重悬于pH7.4无血清培养基组、纳米粒重悬于pH6.5无血清培养基组。将乳腺癌4T1细胞以1×105个/孔的密度接种于共聚焦皿中，每孔加入1mL含有10％FBS和1％青链霉素的1640培养基，置于5％CO2的培养箱中37℃培养24h。随后加入血清培养基重悬的纳米粒溶液(阿霉素DOX浓度为5μg/mL)共培养2h，弃去废液用PBS清洗数次，用DAPI染细胞核，用Lysotracker Green染溶酶体，随后用共聚焦显微镜观察靶向情况。
检测结果：
如图8所示，由共聚焦显微镜观察到，阿霉素DOX呈红色，DAPI标记的细胞核呈蓝色，Lysotracker Green标记的溶酶体呈绿色。检测结果发现，纳米粒重悬于pH6.5无血清培养基组的阿霉素DOX荧光与溶酶体共定位区域最多，相反，游离阿霉素组的阿霉素DOX荧光与溶酶体共定位区域最少。这说明纳米粒在酸性环境下逐渐变小，更有利于细胞内吞摄取更多纳米粒，且该纳米粒对溶酶体有特异性靶向作用。
综上：溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒CaCO3-DOX-SF具有良好的靶向乳腺癌4T1细胞的能力，为后续体内靶向实验和进一步靶向肿瘤成像和治疗提供了实验基础和理论依据。
四、溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒在用于制备抗癌药物中的应用。
1、溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒的体内抗肿瘤作用
将该纳米粒用生理盐水重悬，配制成注射液，设计4个实验组，即生理盐水对照组；游离阿霉素组；CaCO3-DOX组及CaCO3-DOX-SF组，分别经尾静脉注入荷瘤裸鼠模型中(给药剂量为：5mg/kg阿霉素，每隔5天给药一次，共计4次)。每隔两天分别记录各组裸鼠的体重和肿瘤体积，评估纳米粒的抗肿瘤效果。
治疗21天后，如图9所示，生理盐水组肿瘤体积较前明显增长6.3倍，CaCO3-DOX组体积增长3.5倍，游离DOX组体积增长3.9倍；由于游离阿霉素体内不稳定，很快被清除，在肿瘤局部蓄积较少，因而其抗肿瘤作用弱于CaCO3-DOX组；相比之下，CaCO3-DOX-SF组肿瘤体积较前增长了2.5倍，显著提高了肿瘤抑制作用，表明蚕丝蛋白的包覆大大增加了碳酸钙纳米粒的稳定性，使更多的纳米粒进入了肿瘤内部，从而发挥抗肿瘤作用。此外，如图10所示，游离阿霉素治疗组的裸鼠体重明显下降，而其余三组裸鼠体重均无明显变化，表明了制备的碳酸钙蚕丝蛋白纳米粒能显著降低药物的副作用，展现了其极佳的生物相容性及安全性。
综上：溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒具有良好的生物安全性，具有化疗的效果，可杀死肿瘤细胞，结合其靶向作用，可以靶向肿瘤部位，减少全身化疗的毒副作用，最大程度的杀伤肿瘤细胞，为后续体内综合治疗打下了坚实的实验基础。

Claims (10)

1.一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒，其特征在于：包括由碳酸钙中的钙离子Ca2+与阿霉素DOX螯合形成的阿霉素钙复合物Ca-DOX簇，所述阿霉素钙复合物Ca-DOX簇的表面上连接有蚕丝蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒，其特征在于：外形呈球形，粒径为182±5nm。
3.根据权利要求2所述的一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒，其特征在于：pH为7.4时，纳米粒的电位为-10.1mV。
4.根据权利要求2所述的一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒，其特征在于：pH为6.5时，纳米粒的电位为-12.9mV。
5.根据权利要求2所述的一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒，其特征在于：pH为5.5时，纳米粒的电位为-21.2mV。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒，其特征在于：阿霉素的载药量为7.4％，包封率为92.13％。
7.根据权利要求6所述的一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒，其特征在于：溶于蒸馏水时，在545nm和585nm处分别具有特征性紫外-可见光吸收谱波峰。
8.根据权利要求6所述的一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒，其特征在于：溶于稀盐酸时，在475nm和495nm处分别具有特征性紫外-可见光吸收谱波峰。
9.根据权利要求5所述的溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)制备蚕丝蛋白液
将蚕茧在Na2CO3碳酸钠(0.02M)溶液中煮沸1h，然后换新鲜Na2CO3溶液再次煮沸1h，随后将蚕茧浸泡在去离子水中，中间换水4-5次，以洗掉蚕茧表面的丝胶蛋白；然后将脱胶的蚕丝蛋白溶解于60℃的溴化锂LiBr(9.2M)溶液里，5h后转移至去离子水中透析3天，去除杂质及其他离子，最后过滤收集蚕丝蛋白液，冷冻干燥备用；
(2)制备纳米粒
先将5mg阿霉素溶解于0.5ml去离子水中，取10mg冷冻干燥的蚕丝蛋白溶解于4ml去离子水中，将200mg二水氯化钙溶解于100ml无水乙醇中，随后向上述乙醇溶液中加入事先已溶解的5mg阿霉素，磁搅拌2h，然后再向乙醇溶液中缓慢加入已溶解的蚕丝蛋白液，再搅拌0.5h；接着，将装有上述混合液的烧杯放入真空干燥箱内，烧杯周围摆放若干装有碳酸氢铵的玻璃皿，将烧杯及玻璃皿均覆盖上锡箔纸，并扎若干小孔，在密闭环境内反应2天后，将烧杯中的混合液离心(8000rpm，5min)，润洗，收集沉淀，得到纳米粒。
10.根据权利要求6所述的溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒在用于制备抗癌药物中的应用。
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